Papadopoulos, Sarantos: Untersuchungen genomischer Veränderungen von Mammakarzinomzellen mittels Random Amplified Polymorphic DNA

13

Kapitel 2. Material und Methoden

2.1 Material und Geräte

2.1.1 Feste Chemikalien

Agarose : GIBCO/BRL Life Technologies

Borsäure : Merck

EDTA : Merck

DMSO : Merck

Natriumacetat : Merck

Natriumchlorid : Merck

Natriumhydroxid : Riedel-de-Haën

Trehalose : Sigma

Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris) : Merck

Betaine : Sigma

2.1.2 Flüssige Chemikalien

Aqua ad injectabilia : Braun

Chloroform (reinst) : Merck

2´-Desoxynukleotid-5´-triphosphate (100 mM) : Pharmacia Biotech

Essigsäure (99,8 %) : Riedel-de-Haën

Ethanol (98 %) : Baker

Ethanol (70 %) : Baker

Formamid : Merck

Isopropanol : Merck

Methanol : Baker

Paraffin-Öl : Sigma

Phenol (in TE äquilibriert; pH 8,0) : Roth, Karlsruhe

Salzsäure, rauchend (37 %) : Merck

Salzsäure (1 M) : Riedel-de-Haën

Triton-X-100 : Merck


14

2.1.3 Standardpuffer und Lösungen

Gelbeladungspuffer (5x)

0,25 % Bromphenolblau

0,25 % Xylencyanol

15 % Ficoll

TBE-Elektrophoresepuffer (10x)

900 mM Borsäure

900 mM Tris

20 mM EDTA

TE (1x)

10 mM Tris/HCL (pH 8,0)

1 mM EDTA

autoklavieren

PBS

0,85 % (w/v) NaCl

66 mM NaPO4 (pH 7,0)

autoklavieren


15

2.1.4 Biochemikalien, Enzyme und Standards

Proteasen:

20 mg/ml Proteinase K, gelöst in 20 mM TE (pH 7,5)

Enzyme

Tabelle 1

Kommerzieller Name

Quelle/ Bakterium

Anbieter

Taq DNA Polymerase

Thermus aquaticus

Amersham

Tth DNA Polymerase

Thermus thermophilus

Amersham

Tub DNA Polymerase

Thermus ubiquitous

Amersham

Ampli Taq

Thermus aquaticus

Perkin Elmer

Stoffel Fragment

Thermus aquaticus

Perkin Elmer

Taq DNA Polymerase

Thermus aquaticus

Promega

Taq DNA Polymerase

Thermus aquaticus

Stratagene

Taq Plus DNA Polymerase

Thermus aquaticus

Stratagene

Pfu

Pyrococcus furiosus

Stratagene

Taq DNA Polymerase

Thermus aquaticus

Takara

Ex Taq DNA Polymerase

Thermus aquaticus

Takara

LA Taq DNA Polymerase

Thermus aquaticus

Takara

Taq DNA Polymerase

Thermus aquaticus

Qiagen

Taq DNA Polymerase

Thermus aquaticus

Appligene oncor

Taq DNA Polymerase

Thermus aquaticus

Gibco/ Life Technologies

Goldstar

Unbekannt

Eurogentec

Dap DNA Polymerase

( mehrere Enzyme, darunter eins mit 3´- 5´

proofreading Aktivität)

Unbekannt

Eurogentec

Kommerzieller Name

Quelle/ Bakterium

Anbieter

Pwo

Pyrococcus woesei

Eurogentec

Replitherm DNA Polymerase

Unbekannt

Epicentre

Tth DNA Polymerase

Thermus thermophilus

Epicentre

Taq DNA Polymerase

Thermus aquaticus

MBI Fermentas

Tth DNA Polymerase

Thermus thermophilus

MBI Fermentas

Taq DNA Polymerase

Thermus aquaticus

Pharmacia

Tth DNA Polymerase

Thermus thermophilus

Pharmacia

Vent

Thermococcus litoralis

New England Biolabs


16

Vent exo

( ohne 3´- 5´

proofreading Aktivität)

Thermococcus litoralis

New England Biolabs

Deep Vent

Pyrococcus spec. (GB - D)

New England Biolabs

Deep Vent exo

( ohne 3´- 5´

proofreading Aktivität)

Pyrococcus spec. (GB - D)

New England Biolabs

Taq DNA Polymerase

Thermus aquaticus

Boehringer Mannheim

Tth DNA Polymerase

Thermus thermophilus

Boehringer Mannheim

Expand High Fidelity PCR System

Thermus aquaticus + Pwo

Boehringer Mannheim

Super Taq Plus

( mehrere Enzyme, darunter eins mit 3´- 5´

proofreading Aktivität)

Thermus aquaticus

Weitere Enzyme
unbekannt

Mobitec

Mobitaq ( k )

Thermus aquaticus

Mobitec

Invitaq

Thermus aquaticus

Invitek

Klentaq

Thermus aquaticus

Invitek

Combipol Taq DNA Polymerase

( mehrere Enzyme mit 3´- 5´

proofreading Aktivität)

Thermus aquaticus

Weitere Enzyme
unbekannt

Invitek

DNA-Längenstandard

1Kb DNA-Leiter von GibcoBRL

100bp DNA-Leiter von GibcoBRL mit einem zusätzlichen 2,96kb Fragment eines

mit EcoRI geschnittenen Phagemid Bluescript

Primer

Die Primer wurden von der Firma Biotez GmbH synthetisiert.

2.1.5 Gebrauchsfertige Kits

Qiaquick PCR Purification Kit : Qiagen GmbH

Qiaquick Gel-Extraction Kit : Qiagen GmbH

Qiaamp Blood Kit : Qiagen GmbH

Qiaamp Tissue Kit : Qiagen GmbH

Qiaex II Kit: Qiagen GmbH

Invitek DNA/RNA twin prep Isolierungskit, Invitek GmbH

ABI PRISM Big Dye Sequencing Kit : Perkin Elmer


17

AlkPhos Direct : Amersham Pharmacia Biotech

2.1.6 Verbrauchsmaterial

Blue Max 15 ml-Tubes : Falcon

Blue Max 50 ml-Tubes : Falcon

Polaroid Pola Pan 52 : Polaroid

Reaktionsgefäße, 1,5 ml : Sarstedt

Reaktionsgefäße, 0,2 ml : Perkin Elmer

Reaktionsgefäße mit Schraubdeckel, 2,0 ml : Sarstedt

Röntgenfilm, Hyperfilm-MP : Amersham

Save-Lock 0,5 ml Tubes : Eppendorf

Reaktionsgefäße, 0,5 ml : Landgraf


18

2.1.7 Humanes Gewebe

Das frisch eingefrorene Tumorgewebe und das heparinisierte Blut von Mamma-Ca. Patientinnen wurde freundlicherweise von Herrn Prof. Richter, Pathologisches Institut, Marienstrasse, Hannover, zur Verfügung gestellt.

2.1.8 Geräte

Gelaire BSB 3A Sterilbank : Flow Labortechnik GmbH

Gene Power Supply GPS 200/400 : Pharmacia

Heraeus Biofuge A : Heraeus

Heraeus Biofuge 13 : Heraeus

Heraeus Variofuge 20 RS : Heraeus

Horizontalgelelektrophorese System H4 : GIBCO/BRL Life Technologies

Horizontalgelelektrophorese System H5 : GIBCO/BRL Life Technologies

Kodak x Omatic Cassette/Regular Screen : Kodak

Mikrowelle Whirlpool 625 : Philips

Omnilab (Magnetrührer und Heizer) MR 2002 : Heidolph

Pipetman Variopipetten (20, 100, 200, 1000 ml) : Gilson

pH-Meter/portable : Harma Instruments

Power Supply ECPS 3000/150 : Pharmacia

Test Tube Heater SHT 1 : Stuart Scientific

Thermocycler Varius V : Landgraf

Thermocycler 2400 und 9600 : Perkin Elmer

Thermocycler Trio-Thermoblock : Biometra

Thermocycler Crocodile : Appligene

Thermocycler ATAQ Controller : Pharmacia

Thermocycler 100PTC, 150PTC : MJR

Wasserbad : Gesellschaft für Labortechnik

Zeiss Spektralphotometer PMQ 3 : Zeiss

Zentrifuge 3200 : Eppendorf

Sequencer 310 : Perkin Elmer


19

2.2 METHODEN

2.2.1 Aufarbeitung von DNA aus EDTA behandeltem Vollblut

Um aus EDTA behandeltem Vollblut DNA zu Isolieren, wurden hier drei verschiedene Methoden angewandt:

2.2.2 Proteinase K/Phenol/Chloroform-Methode

Bei dieser Methode wurden die Zellen lysiert und die Zellkerne der kernhaltigen Blutzellen pelletiert. Es folgte eine Lyse der Kerne und eine Proteinase K-Behandlung. Um die Nukleinsäuren, in erster Linie DNA, rein darzustellen, wurden die Proben einer Phenol/Chloroform Extraktion unterworfen. Die DNA wurde durch eine Ethanolfällung konzentriert. Die DNA-Konzentration wurde durch eine Messung der Optischen Dichte bei einer Wellenlänge von 260 nm bestimmt.

Spezielle Lösungen:

0,2 M EDTA (pH 7,5)

Lysepuffer:

0,32 M Saccharose

0,1 M Tris/HCl (pH 7,5)

1% (w/v) Triton X-100

STE:

100 mM NaCl

50 mM Tris/HCl (pH 7,5)

1 mM EDTA

10% (w/v) SDS

Es wurden 4 ml Blut intravenös entnommen und mit 400 µl 0,2 M EDTA (pH 8,0) als Antikoagulans versetzt. Das so behandelte Blut wurde in ein 50 ml Falcon-Röhrchen überführt und 36 ml (9 Volumenteile) Lysispuffer zugefügt. Nach dem Verschliessen wurde das Gefäss kräftig geschüttelt.

Es schloss sich eine Inkubation von 15 min. auf Eis an. Nach dieser Zeit wurde die Probe bei 2000 x g und RT für 30 min. zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig dekantiert und das zumeist rote Sediment mit 40 ml Lysispuffer gewaschen. Es folgte eine erneute Zentrifugation unter den zuvor beschriebenen Bedingungen.

Nach dem Abgiessen der Waschlösung wurde das inzwischen klare Sediment in ein 15 ml Falcon-Röhrchen überführt und mit 5 ml STE-Puffer versetzt. Das Sediment wurde anschliessend in der STE-Lösung mit einer Pipettenspitze zerkleinert und durch Zu-gabe von 250 µl 10% (w/v) SDS-Lösung der für die anschliessende Proteinase K Behandlung komplette Reaktionspuffer hergestellt.

Zuletzt wurden der Mischung 25 µl einer Proteinase K-Lösung mit der Konzentration von 20 mg/ml zugesetzt. Die Probe wurde gut gemischt und über Nacht bei 50 - 55°C inkubiert.

2.2.3 Phenolextraktion

Am nächsten Tag wurde die klare Lösung zum Entfernen von Kondenswasser kurz anzentrifugiert. Um die Proteine vollständig abzutrennen, schloss sich dem Verdau durch die Proteinase K eine Phenolextraktion an.

Dazu wurden der nukleinsäurehaltigen Lösung 4 ml in TE-Puffer äquilibriertes Phenol und 4 ml Chloroform zugefügt. Die Probe wurde vorsichtig für 6 min. geschüttelt. Dabei war darauf zu achten, dass es zur Durchmischung der wässrigen und der organischen Phase kam.

Zum Beschleunigen der Phasentrennung wurde die Probe für 10 min. bei RT und 3000 x g zentrifugiert. Die untere, organische Phase wurde mit einer Pasteurpipette entnommen und verworfen.


20

Dieser Vorgang wurde zwei weitere Male durchgeführt. Nach der dritten Extraktion wurde die wässrige Phase mit einer 1 ml Pipette, der mit einer sterilen Schere die Pipettenspitze entfernt worden war, in ein frisches 15 ml Falcon-Röhrchen überführt. Hier war besonders darauf zu achten, dass die Interphase, der Bereich zwischen organischer und wässriger Phase, im alten Falcon-Röhrchen verblieb. In diesem Bereich befanden sich viele der durch das Phenol denaturierten Proteine.

Um das Phenol möglichst quantitativ zu entfernen, wurde die wässrige Phase anschliessend zweimal mit 8 ml Chloroform ausgeschüttelt.

2.2.4 Präzipitieren von DNA

Spezielle Lösungen:

3 M Natriumacetat (pH 6,0)

Die wässrige Phase wurde auf eine Natriumacetatkonzentration von 0,2 M eingestellt und mit 2,5 Vol. eiskaltem Ethanol (98%) versetzt. Nach kurzem Mischen präzipitierte die DNA im allgemeinen sofort. Zur Entfernung des Salzes wurde sie in ein Reaktionsgefäss mit 1 ml 70% Ethanol überführt und nach mehrmaligem Schütteln durch Zentrifugation bei 5000 x g für 5 min. sedimentiert. Die Waschflüssigkeit wurde dekantiert. Dieser Waschschritt wurde zweimal wiederholt. Nach dem letzten Dekantieren wurde das Gefäss erneut für 2 min. bei 5000 x g zentri-fugiert, der Ethanol mit einer Pipette abgenommen und das DNA Sediment an die Wandung des Gefässes gezogen.

Zur Trocknung der DNA wurde das Gefäss für 10 min. geöffnet. Je nach Grösse des DNA-Sedimentes wurde die Probe in 200 - 600 µl TE-Puffer aufgenommen.

2.2.5 Rapid-Methode zur DNA Isolation

Lahiri &Nurnberger, 1991

Spezielle Lösungen:

Puffer TKM1:

10 mM Tris/HCl (pH 7,6)

10 mM KCl

10 mM MgCl2

2 mM EDTA

Puffer TKM2:

10 mM Tris/HCl (pH 7,6)

10 mM KCl

10 mM MgCl2

0,4 M NaCl

2 mM EDTA

NaCl, gesättigt (konz. > 6 M)

5 ml intravenös entnommenes Blut wurde mit EDTA zur Verhinderung der Gerinnung behandelt und in ein 15 ml Falcon-Röhrchen überführt. Der Probe wurden 5 ml des Puffers TKM1 und 125 µl Nonidet P-40 zugegeben. Durch mehrfaches Schwenken wurde die Probe gemischt. Es folgte eine Zentrifugation bei RT und 2000 x g für 30 min.. Der Überstand wurde vorsichtig abgegossen und das Pellet am Boden erneut mit 5 ml TKM1 Puffer gewaschen. Es schloss sich eine Zentrifugation unter den zuvor genannten Bedingungen an.

Nach dem Dekantieren wurde das Pellet in 800 µl TKM2 sus-pendiert und in ein 1,5 ml Reaktionsgefäss überführt. Der Suspension wurden 50 µl einer 10% SDS-Lösung zugesetzt und


21

die gesamte Mischung durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren vermengt. Es folgte eine Inkubation bei 55°C für 10 min. und anschliessend die Zugabe von 300 µl einer gesättigten Kochsalzlösung.

Nach einer weiteren, kurzen Inkubation wurde die Probe für 5 min. bei 13000 x g und RT zentrifugiert. Der Überstand, der die Nukleinsäuren enthielt, wurde in ein Becherglas überführt. Der Probe wurde nun das zweifache Volumen an 98% Ethanol bei RT zugesetzt. Das Becherglas wurde geschwenkt und die Nukleinsäuren präzipitierten. Anschliessend wurden sie aus dem Glas in ein 1,5 ml Reaktionsgefäss, das 1 ml eiskalten 70% Ethanol enthielt, überführt. In diesem wurden sie durch mehrmaliges Schütteln gewaschen. Anschliessend folgte eine Zentrifugation für 5 min. bei 13000 x g und 4°C. Die DNA wurde nach dem Dekantieren des Ethanols und einer Trocknung von 10 min. an der Luft, in 200 - 600 µl 1x TE-Puffer aufgenommen.

2.2.6 Bestimmung der DNA-Konzentration

Der gelösten DNA wurden 20 µl entnommen und mit 980 µl Wasser gemischt. Anschliessend wurde die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 260 nm gegen das Lösungsmittel, also Wasser, in einem Zeiss-Spektralphotometer bestimmt. Bei einer Schichtdicke von 1 cm entsprach ein OD260-Wert von 1 einem DNA-Gehalt von 50 µg/ml. Die Konzentration der DNA-Probe berechnete sich, unter Berücksichtigung der Verdünnung, wie folgt:

E260 x 50 µg/1000 µl x V.F. = Konzentration der DNA in µg/µl

( V.F. = Verdünnungsfaktor )

2.2.7 Chelex ®(Biorad)

Walsh, Metzger, &Higuchi, 1991

Chelex ist ein chelatbildendes Harz das eine hohe Aktivität für polyvalente Metallionen aufweist. Das Harz besteht aus Styrene-Divinylbenzene Kopolymere die Iminodiazetationen beinhalten, welche als komplexbildende Gruppen fungieren.

Die DNA-Extraktion aus Vollblut (frisches oder eingefrorenes) mit Chelex erfolgt folgendermassen: 1 ml steriles destilliertes Wasser wird in einem sterilen 1,5 ml Eppendorfreaktionsgefäss gegeben. Dazu werden 3 µl Vollblut addiert. Das Gemisch wird für 15-30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und mehrmals geschüttelt. Das Eppendorfhütchen wird für 2 Minuten bei 10000-15000 x g zentrifugiert. Der Überstand ausser 20-30 µl wird dekantiert. Dazu werden 5% Chelex addiert bis zu einem Endvolumen von 200 µl. Es erfolgt die Inkubation für 15 - 30 Minuten bei 56°C. Nach 5 - 10 Sekunden Vortexen wird das Eppendorfhütchen in ein Wasserbad mit kochendem Wasser für 8 Minuten inkubiert. Nach erneutem Vortexen steht eine Zentrifugation für 2 Minuten bei 10000-15000 x g an. Die Lösung ist jetzt für den PCR-Prozess fertig. Nur 5 - 20 µl des Überstandes werden für eine Amplifikation benutzt. Die übrige Lösung wird bei +4°C oder bei -20°C aufbewahrt.

2.2.8 Pulsed Field Gel Electrophoresis(PFGE)

Barlow, 1992

Lösungen

SE

75 mM NaCl

25 mM EDTA, PH 7,5

ES

0,5 M EDTA

0,5 % w /v N-Lauroylsarkosin, PH 7,5

Proteinase K-Lsg.

Die DNA für PFGE sollte in der Grössenordnung von 20 kb sein. Weil die Anfälligkeit der langen DNA-Moleküle gegenüber Scherkräften gross ist und die Nukleasen, die die DNA degradieren, ubiquitär sind, versucht man, die DNA von den in low-melting Agarose eingebetteten Zellen zu


22

präparieren.

Die Gelgiessformen werden in den Kühlschrank gestellt, um sie auf +4°C zu kühlen.

Die Leukozytensuspension wird in einem Eppendorfgefäss überführt und für 15 Minuten bei +4°C oder Raumtemperatur bei 8000 x g abzentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Pellet in 400 µl SE resuspendiert. 100 µl davon werden 1:10 mit SE verdünnt und die OD (optische Dichte) wird bei 578nm gegen SE als Leerwert bestimmt. Die restlichen 300 µl Leukozytensuspension werden mit SE auf OD578 =1,8 eingestellt.

Ein Wasserbad wird auf 42 - 45°C vorgeheizt. 2% (w/v ) low-melting Agarose in SE werden in der Mikrowelle aufgekocht bis keine Schlieren mehr sichtbar sind (ca 4 - 5 Minuten). Verkochtes Wasser wird bis zum Ausgangsgemisch wieder aufgefüllt. Im Wasserbad wird die Agarose danach abgekühlt.

Die Lymphozytensuspension wird mit gleichem Volumen flüssiger low-melting Agarose versetzt, mit einer Pasteurpipette gemischt ohne das Luftblasen entstehen und in die Gelgiessformen gegeben. Die Gelgiessformen werden danach für 1 Stunde in den Kühlschrank (+4°C) gestellt.

Die Blöckchen werden mit einem Skalpell und / oder Rührspatel auf eine Petrischale gebracht und gedrittelt oder gesechstelt, je nachdem was für eine DNA-Menge für die Reaktionen eingesetzt werden soll. Die geteilten Blöckchen werden in ein Eppendorfreaktionsgefäss mit vorgelegten 0,8 ml Puffer überführt und 20 µl Proteinase k (C = 20 mg/ml) dazupipettiert. Die Blöckchen werden DNA über Nacht bei 50 - 55 °C im Wasserbad inkubiert.

Am nächsten Tag werden die Eppendorfgefässe auf Raumtemperatur abgekühlt. Der Puffer wird mit einer Pasteurpipette abgenommen und verworfen, während die Blöckchen mindestens 3 mal mit TE und mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur gewaschen und anschliessend in TE bei +4°C gelagert werden.

2.2.9 Isolation von Lymphozyten

Spezielle Lösungen:

Lymphozyten-Isolationsmedium:

5,9% (w/v) Ficoll

9% Natriumdiatrizoat

In ein 50 ml Falcon Gefäss wurden 15 ml Lymphozyten-Isolations-medium vorgelegt. 10 ml EDTA behandeltes Vollblut wurden mit 10 ml PBS gemischt. Dieses wurde nun vorsichtig mit einer Kanüle auf das Isolationsmedium gegeben. Es war darauf zu achten, dass es nicht zu einer Durchmischung der Schichten kam. Es schloss sich eine Zentrifugation bei 600 x g für 20 min. bei Raumtemperatur an. Der Rotor musste nach diesen 20 min. ohne Bremse auslaufen, damit eine Verwirbelung der Grenzschicht verhindert wurde.

Danach wurden mit einer Pasteurpipette die Lymphozyten, die sich als scharfe gelblich gefärbte Bande über dem Ficollkissen erkennen liessen, entnommen. Die Zellen wurden in frischen 50 ml Falcon-Röhrchen aufgenommen und mit 20 ml PBS durchmischt. Es schloss sich eine weitere Zentrifugation von 10 min. bei 400 x g an. Der Überstand wurde vorsichtig dekantiert und der Waschschritt wiederholt.

Schliesslich wurden die Zellen in 1 ml PBS suspendiert und auf vier 1,5 ml Reaktionsgefässe verteilt. Die Proben wurden erneut bei 400xg für 10 min. zentrifugiert, das Lösungsmittel dekantiert und das Zellsediment in 250 µl GIT-Puffer aufgenommen.

2.2.10 Aufarbeitung von DNA aus Vollblut und Gewebe

Um DNA-Sequenzen aus venösem Blut und Tumorgewebe zu vergleichen, mussten aus diesen DNA isoliert werden. Dies erfolgte mit den kommerziell erhältlichen Qiaamp Blood and Tissue Kits von Qiagen nach Angaben des Herstellers.

2.2.11 Die Polymerasekettenreaktion (PCR)

Die Polymerasekettenreaktion dient der spezifischen Vermehrung von DNA Abschnitten, d.h. sie ist praktisch eine in vitro Klonierung. Die Abschnitte müssen sich zwischen zwei bekannten


23

Sequenzbereichen befinden. An diese lagern sich die synthetisch hergestellten Oligonukleotide als Startmoleküle (Primer) für die eingesetzte Polymerase, an. Da dieses nur bei denaturierter, also einzelsträngiger DNA möglich ist, müssen die DNA-Stränge der Vorlage (Template) im ersten Schritt dieser Reaktion durch Erhöhung der Temperatur auf 94°C separiert werden.

Im nächsten Schritt findet die Anlagerung der Oligonukleotide an die einzelsträngige DNA statt. Dieses wird erreicht, indem der Reaktionsansatz schnell auf die, für die verwendeten Oligonukleotide gemeinsame, Anlagerungstemperatur abgekühlt wird.

Die Synthese der DNA-Abschnitte erfolgt nach Erhöhung der Inkubationstemperatur auf 72°C. Durch eine erneute Temperaturerhöhung auf 94°C werden die synthetisierten DNA-Stränge wiederum getrennt und ein weiterer Reaktionszyklus beginnt.

In diesem zweiten Zyklus kann der neu synthestisierte DNA-Abschnitt ebenfalls als kopierbares Template dienen. Die Anzahl der kopierbaren DNA-Moleküle hat sich nach dem ersten Zyklus (bei 100%iger Effizienz) verdoppelt.

Im folgenden dritten Reaktionszyklus entstehen die ersten längendefinierten DNA-Fragmente.

Da ihre Vermehrung im Idealfall exponentiell verläuft, erhält man nach 30 - 40 Reaktionszyklen in einer nachfolgenden gelelektrophoretischen Analyse eine Fragmentbande, mit einer vorhersagbaren Länge. Durch die Etablierung von hitzebeständigen Polymerasen konnte diese Methode automatisiert werden.

2.2.12 Durchführung der Polymerasekettenreaktion

Die PCR Mischung wurde auf das Gesamtvolumen von 25 oder 50 µl aufgefüllt und abschliessend mit drei Tropfen Paraffinöl überschichtet.

Sollten viele PCR-Ansätze mit gleichen Primern, aber verschiedenen DNA-Proben bearbeitet werden, wurde ein sogenannter „Mastermix“ pipettiert. Er enthielt ein durch die Anzahl der verschiedenen DNA-Proben resultierendes Vielfaches eines Einzelansatzes.

Die jeweiligen Konzentrationen der Reagentien sowie die Temperaturprofile der PCR Reaktionen werden unter Kapitel 3 (Resultate) angegeben.

Am Ende wurde der letzte Programmschritt, die Kettenverlängerung, auf 600 Sek. bei 72°C verlängert. Abschliessend erfolgte eine langsame Abkühlung auf 15°C. Bei dieser Temperatur verblieb der Ansatz, da die PCR zumeist über Nacht erfolgte.

Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit, d.h. in der Optimierung der Methode wurden 2 Primer benutzt : SPAP5(TCA CGC TGC G) und SP3(TGC TCA GTC GAT).

2.2.13 Agarosegelelektrophorese

Die Analyse von PCR-Fragmenten erfolgte in einem 2,0%igen (w/v) Agarosegel in einer Horizontalelektrophorese. Je nach Gelgrösse und gewünschter Agarosekonzentration wurde die notwendige Menge des Agarosepulvers in einem Erlenmeyerkolben eingewogen und das entsprechende Volumen an 1x TBE-Puffer hinzugefügt. Um die Agarose in Lösung zu bringen, musste der Gelansatz in der Mikrowelle mehrmals aufgekocht werden. Der heissen Gellösung wurde so viel Ethidiumbromidlösung (c = 2,5 mg/ml) zugefügt, dass die Konzentration im Gel 0,5 mg/ml betrug. Die gewünschte Gelform wird an den offenen Seiten mit Klebeband verschlossen und je nach gewünschter Trennstrecke ein oder zwei Taschenformer (auch als „Kämme“ bezeichnet) in der Gelform plaziert. Mit einer Wasserwaage wurde die Form ausgerichtet. Die etwas erkaltete Agaroselösung wurde in die vorbereitete Gelform gegossen. Kleinere Luftblasen, die beim Giessvorgang entstanden waren, wurden mit einer Kanüle an den Gelrand gezogen.

Nach dem Erkalten wurden das Klebeband und die Kämme entfernt. Das angefertigte Agarosegel wurde in die Elektrophoreseapparatur gelegt. Diese wurde so mit 1x TBE-Puffer gefüllt, dass das Gel komplett bedeckt war. Die zu applizierenden Proben wurden mit 5x Gelbeladungspuffer versetzt, so dass eine einfache Pufferkonzentration resultierte. Durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren wurde die Probe gemixt und in die geformten Taschen des Gels gefüllt. Das aufgetragene Probenvolumen lag bei etwa 13 µl. Um die Länge der Fragmente abzuschätzen, erfolgte der Auftrag eines Längenstandards.


24

Während der Elektrophorese war anhand der Farbstoffe Bromphenolblau des Gelbeladungspuffers die zurückgelegte Strecke zu beobachten. Die Elektrophorese wurde bei einer Spannung von 90 V für 4 - 5 h, je nach gewünschter Trennstrecke, durchgeführt.

2.2.14 Analyse des Gels

Nach Beendigung der Elektrophorese wurde das Gel unter UV-Licht einer Wellenlänge von 302 nm auf einem Transilluminator betrachtet. Zur Dokumentation wurde das Gel mit einer Sofortbildkamera (Belichtung: 8 sec. bei Blende 4,5 und einer Filmempfindlichkeit von 400 ASA) durch einen Gelbfilter fotografiert. Zusätzlich wurde das Fotodokumentationssystem “Eagle Eye“ von Stratagene benutzt.

2.2.15 Klonierung und Sequenzierung der Fragmente

Nach der Photodokumentation erfolgte unter kurzer UV-Belichtung und mithilfe eines Skalpels die Exzision eines TBE Gelstücks, das die gewünschte DNA Banden enthält. Die Isolierung der DNA aus der Agarosematrix erfolgt mit dem Qiagen QIAEX II Kit nach den Anweisungen des Anbieters. Die eluierten DNA Fragmente wurden erneut amplifiziert. Diese zweite PCR wurde mit den selben Primer durchgeführt wie die erste und erstreckte sich über 35 Zyklen. Alle Reagentien hatten die gleiche Konzentrationen wie in der ersten Reaktion. Es folgte die erneute Trennung der PCR Produkte auf Agarosegelen und die Wiederholung der Fragmentisolierung.

Für die Klonierung der RAPD Banden wurde der pGEM-T Vektor von Promega benutzt. Die Transformation der DH5a E.coli Bakterien mittels Elektroporation, die Kultivierung der Bakterien und insgesamt die Klonierung der RAPD Fragmente, wurde wie bei Sambrook et al. durchgeführt. Die Plasmid DNA wurde aus den Kulturen mit dem Qiagen Plasmid Mini Kit isoliert und danach durch Restriktionsverdau auf das Vorhandensein von Insertionen überprüft. Die Sequenzierung der Plasmid DNA wurde mittels cycle sequencing und dem ABI Prism Big Dye Sequenzierungskit von Perkin Elmer durchgeführt. Die Sequenzierungsreaktion fand in einem Perkin Elmer PCR Thermocycler 2400 statt und setzte sich aus 30 Zyklen mit folgendem Profil zusammen: 96°C für 10 Sek., 45°C für 5 Sek. und 60°C für 4 Min.. Die entstandenen Produkte wurden mit dem Sequencer 310 von Perkin Elmer analysiert. Zur Sequenzierung wurden synthetische Oligonukleotide verwendet. Die gewonnenen Sequenzen wurden mit dem Programm Sequencher 3.0 von Gene Codes Corporation bearbeitet.

2.2.16 DNA Analyse

Für die weitere DNA Analyse, also dem PCR-Blot, wurden die RAPD Produkte auf einem 2% Agarose Gel aufgetrennt Zum Depurinisieren wurde das Gel für 20 min in 0,25M HCl inkubiert. Anschließend wurde das Gel für je 20 min in Denaturierungslösung (0,5 M NaOH; 1,5 M NaCl), Neutralisierungslösung (1,5 M NaCl; 0,5M Tris HCl pH 7,5) und in 20 x SSC geschwenkt. Im Anschluß daran wurde die DNA durch Kapillartransfer mit 20 x SSC auf einen Nylonfilter übertragen. Die Fixierung der DNA an die Membran erfolgte durch Inkubation der Filter für 2 Stunden bei 85°C. Als Labelling Kit wurde das AlkPhos Direct von Amersham Pharmacia Biotech benutzt und die Hybridisierung erfolgte nach den Empfehlungen des Anbieters.

2.2.17 CAA(Chloracetaldehyd)

Die auf 50 mM Natriumazetat eingestellten PCR-Produkte werden mit steigenden CAA-Konzentrationen (0, 4, 6, 8, 10, 20 mM) versetztund für 2 Stunden bei 37 °C inkubiert. Danach wurden die Proben wie im 3.11. beschrieben 2 % Agarosegel aufgetragen und für 4 Stunden bei einer Spannung von 80 Volt elektrophoretisch aufgetrennt.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.

DiML DTD Version 2.0
Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML - Version erstellt am:
Wed Sep 5 16:50:29 2001