Papadopoulos, Sarantos: Untersuchungen genomischer Veränderungen von Mammakarzinomzellen mittels Random Amplified Polymorphic DNA

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Kapitel 4. Diskussion

4.1 Zyklen

Die ersten Amplifikationen wurden mit 50 Zyklen unternommen. Die Serie von Versuchen wurde durchgeführt um die kleinste Anzahl von Zyklen zu bestimmen, bei der das Fragmentmusterstabil bleibt. Mit 35 Zyklen ist dieses Ziel erreicht, was die Dauer der PCR erheblich reduziert. Experimente mit immer grösserer Anzahl von Zyklen haben gezeigt, dass wie auch bei der Standard-PCR Bell &DeMarini, 1991 der Schmier, also unspezifische hochmolekulare Banden die aus der Verlängerung der schon vorhandenen Produkten stammen, zunahm. Im Gegensatz dazu wird in der Standard-PCR eine Verringerung der Menge des Produkts oder sogar völlige Abwesenheit registriert.

4.2 DNA Konzentration

Die DNA Konzentration Variierungsversuche haben gezeigt, dass sehr niedrige oder sehr hohe DNA Konzentrationen zu grossen Problemen in Bezug auf die Reproduzierbarkeit führen können, was ein Hinweis darauf ist , dass die DNA/Primer Ratio eine wichtige Rolle im "Random Priming" spielt. Die Tatsache, dass 0,1 ng und 1 ng humaner DNA den DNA Ge-halt von 15 und 150 Zellen entsprechend representieren (eine menschliche Zelle beinhaltet 6 pg DNA), weist darauf hin dass man RAPD mit sehr geringen Mengen durchführen kann. Es konnte festgestellt werden, dass für eine Konzentrationsspanne von 50 bis 550 ng konstante Resultate erzielt werden. Die Empfehlung ist in diesem Konzentrationsspektrum zu bleiben, wenn RAPD Experimente mit humaner DNA durchgeführt werden. Eine Alternative wäre am Anfang der Experimente eine kleine Verdünnungsreihe von 50 bis 500 ng oder mindestens zwei Konzentrationen in diesem Spektrum anzusetzen um diese Empfehlung zu bestätigen. Für diese anfänglichen Versuche sollte ein Primer oder ein Primerpaar benutzt werden, der kein sehr komplexes Fingerprintermuster produziert, so dass der Vergleich vereinfacht wird. Unterschiede zwischen den verschiedenen Konzentrationen können auch auf Mängel der DNA Qualität zurückgehen. Als DNA Isolierungsmethode wurde hier die Phenol/Chloroform/Proteinase k Methode benutzt, die für eine sehr gute DNA-Qualität bekannt ist. Dieser Punkt wird später noch kommentiert. Die anfänglich zufällig gewählte Menge von 100 ng ist in diesem Spektrum und hat beständige Resultate erbracht.

Für die weiteren Experimente wurde diese Menge beibehalten und nicht erhöht um etwa in die Mitte des Spektrums zu gelangen um DNA zu sparen. Die Beobachtung, dass kleine DNA Konzentrationsunterschiede das Bandenmuster nicht verändern lässt die Benutzung der zugeschnittenen DNA des Bakteriophagen für die Konzentrationsbestimmung der DNA-Proben zu, vor allem wenn ihre Menge sehr nierdrig ist.

4.3 DNA Isolierungsmethoden

Alle DNA Isolierungsmethoden ausser der Chelex Methode haben reproduzierbare und identisch miteinander Resultate produziert. Es wurden Methoden benutzt die zu einer Gewinnung von hochmolekularer DNA führten, wie die PFGE und die Chloroform/Phenol/Proteinase K Methode, und auch Methoden die wegen der Scherkräfte niedermolekulare DNA produzierten z.B. die Kit Systeme.Die Uniformität der Ergebnisse beweisst die Robustheit des random priming. Interessanterweise konnte mit dem Harz Chelex, das in der forensische Medizin angewandt wird keine Gleichmässigkeit der Muster erzielt werden, trotz des Versuches den Isolierungsprozess mit Proteinase K zu unterstützen, was dafür spricht dass spezifische Primer eine schlechte DNA Qualität tolerieren als random Primer. Auch die Amplifikation aus Vollblut war unbefriedigend da nur sehr kleine Banden produziert wurden.Im Gegensatz dazu sind schon Fragmente bis 900kb lang mittels spezifische Primer amplifiziert worden.

Die Mischung von humaner mit bakterieller DNA sowie die Mischung von DNA zweier Individuen hatte als Ziel eine Kontamination zu simulieren. Die Ergebnisse weisen daraufhin dass schon geringe Mengen fremder DNA das Muster verändern können. Bei beiden Experimenten genügten 5-10ng humaner oder entsprechender bakterieller DNA, was ein Beweis für die Anwendung der RAPD in der molekularen Onkologie spricht. Ein Gewebe das auch nur zu 5-10% von Tumor durchsetzt ist, kann im Vergleich zum gesundem Gewebe durch die Abwesenheit oder Anwesenheit von Fragmenten differenziert werden.


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4.4 Mg+2 -, Primer - und KCl Konzentrationen

Die optimale Mg +2 Konzentration wurde durch folgende Kriterien festgelegt: a) Konsistente Reproduzierbarkeit von PCR-Produkten und b) maximale Anzahl von RAPD PCR Banden.

Die Tests mit unterschiedlicher Mg+2 Konzentration haben gezeigt, dass Mg+2 grossen Einfluss auf die PCR hat, dass 4mM der Umschlagpunkt ist und dass danach das Fragmentmuster sich kaum mehr verändert. Im Gegensatz dazu war das Muster bei niedrigen Konzentrationen auffälliger wie der Übergang von 1,5 zu 2 mM zeigte. Interessant ist auch, dass während der Standard PCR eine Mg+2 Konzentration von 1-2 mM eher angebracht ist um keine unspezifischen Produkte zu generieren, in RAPD´s die benötigte Mg+2 Menge die doppelte ist. Es gibt Wissenschaftler Park &Kohel, 1994 die eine Mg+2 Optimierung für jeden benutzten Primer oder Primer-Kombinationen empfehlen, wenn man mit der RAPD polymorphische Marker generieren möchte. Wenn der Effekt des Mg+2 nicht verifiziert wurde kann es durchaus sein, dass falsche DNA Polymorphismen auftauchen, die auch ein Problem für die Produzierbarkeit darstellen könnten.

Variationen der Konzentrationen von Primer, Desoxyribonukleotiden und KCl haben gezeigt, dass niedrige Änderungen das Fragmentmuster unbeeindruckt liessen. Man kann daraus schliessen, dass die Fingerprints eigentlich sehr stabil sind und dass eventuelle Pipettierfehler keinen Einfluss haben.

Interessant war die bevorzugte Produktion einer Bande während der Primerkonzentrationariierung. Die Produktion dieser 1,2 kb langen Bande die nur detektierbar war, wenn die SPAP5 Konzentration höher als die von SP3 war, wird wahrscheinlich vom ersten Primer dirigiert.

4.5 Denaturierung

Die Denaturierung der DNA Stränge findet meistens bei einer Temperatur von 94°C statt. Sie stellt eine moderate Temperatur dar bei der die DNA Schäden wie die Depurinierung und die Destabilisierung des Enzyms sich in Grenzen hält Douglas &Atchison, 1993,goesto="bib293">Gustafson, Alm, &Trust, 1993 . Die Lebenshalbzeit des Enzyms sinkt entsprechend von 130 zu 40 und zu 5 Minuten bei 92,5 , 95 und 97,5°C.

Die Experimente haben gezeigt, dass Denaturierungstemperaturen von 96°C - 92°C ein identisches Muster produzierten und dass eine Zeit von 60 Sekunden ausreichte, um eventuell schwierigen Amplikationen von vereinzelten Banden zu unterstützen. Im Gegensatz dazu zeigte sich, dass 15 Sekunden nicht genügend waren für die Wärmeleitung vom Heizungsblock entlang der Wände der PCR-Hütchen und die Überführung des PCR-Volumens auf 94°C. Diese Zeit hängt sicherlich auch noch von der Thermocycler-Konstruktion und seiner thermischen Kontrolle ab und könnte deshalb zwischen Fabrikaten unterschiedlich sein.

Die Variierung des Überganges zwischen Denaturierungs- und Anlagerungstemperatur hat keine Unterschiede hervorgebracht, im Gegensatz zu anderen Berichten wie der von Schweder et. al. Schweder, Shatters, West, &Smith, 1995 . In diesem Artikel wurde eine PCR-Maschine mit einem Hochdruckwasserzirkulator verbunden, so dass die Transitionsintervalle durch Veränderungen der Wassertemperatur und/oder des Wasserdrucks variiert werden konnten. Die Unterschiede die auftauchten, Banden die an Intensität zunahmen je länger die Transition war, wurden auf die stabilisierende Wirkung des verlängerten Überganges der Primer/Template Komplexe auf die Misspaarungen zurückgeführt. Der Unterschied zu den hier beschriebenen Experimenten besteht in der ausbleibenden Anwendung des langsamen Überganges zwischen 35°C und 72°C. Es sieht also so aus, dass mit der Benutzung der Rampe von 35°C zu 72°C alle diese inkonstanten Duplexes stabilisiert werden, so dass der Einfluss von unterschiedlich langen Transitionen von 94°C zu 35°C wettgemacht wird. Über die Rolle dieser Rampe wird später noch länger eingegangen werden.

4.6 Anlagerungstemperatur/zeiten

Die Anlagerungstemperatur ist bei der mit spezifischen Primer durchgeführte PCR, einer der entscheidenden Parameter für den Erfolg der Reaktion. Im random priming sieht die Situation etwas anders aus. Bei den Experimenten mit Rampe konnten zwischen 15, 35 und 43 °C keine grossen Unterschiede festgestellt werden. Man konnte lediglich vereinzelt Banden beobachten, dessen Produktion bei unterschiedlichen Anlagerungstemperaturen favorisiert wurden, offensichtlich aufgrund der unterschiedlichen Stringenz. Ohne Rampe wurden die Muster zwischen


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35 und 43°C schon erheblich unterschiedlicher. Auch lange Anlagerungstemperaturen konnten keine absolut identische Muster produzieren. Längere Anlagerungszeiten führten interessanterweise bei 43°C zur Intensitätszunahme von Banden und zur Stabilisierung des Musters, während bei 35°C die Banden grösser als 1,5kb stabilisiert wurden. Die durchgeführten Experimente haben gezeigt, dass die Rampe eine Gleichmässigkeit verleiht, die auch eine verlängerte Anlagerungstemperatur nicht bieten kann. Wenn man die Muster bei 35 und 43°C mit den unterschiedlich langen Anlagerungszeiten und den mit Rampe vergleicht, stellt man fest, dass in den ersten alle Banden die auch in den anderen vorkommen vorhanden sind, aber mit unterschiedlicher Betonung und manche nur andeutungsweise. Die Tatsache kann auch eine Ursache für die nicht Reproduzierbarkeit der Ergebnisse sein, die von anderen Wissenschaftler berichtet wird.

4.7 Rampe

Die Wirkung der Rampe ist sicherlich umstritten und die meisten PCR Anwender benutzen sie kaum, da sie auch die Dauer der Versuche verlängert. Von den hier beschriebenen Experimenten kann der Schluss gezogen werden, dass die Rampe der Faktor ist, der am meisten das Fragmentmuster beeinflusst, indem sie die Anzahl der Fragmente erhöht.

Eine erhöhte Mg+2 Konzentration hat den gleichen Effekt, aber die Auswirkung war grösser als die schnellstmögliche Transition zwischen Anlagerung und Extension angewandt wurde. Die Anzahl der Zyklen spielt eine untergeordnete Rolle da 50 Zyklen die Menge mancher oder aller schon vorhandener Banden erhöhte. Die Beobachtungen aus den Versuchen führen zur folgenden Feststellung:

- Die Reproduzierbarkeit ist auch ohne Rampe gegeben, wenn die Taq DNA Polymerase Konzentration mehr als 1 U pro 50 µl PCR Reaktionsvolumen beträgt.

- Die Funktion des langsamen Überganges zwischen Anlagerungs- und Polymerisationstemperatur erhöht die Anzahl der produzierten Banden.

Das langsame Erhitzen von 35°C auf 72°C und die Tatsache, dass die Taq Polymerase schon bei niedrigen Temperaturen mit der Polymerisation anfängt, führt wahrscheinlich schon früh zur Stabilisierung des Primer/Template/Polymerase Komplexes und gibt der Polymerase genügend Zeit schon bei niedriger Temperatur eine Extention der Fragmente zu starten, die DNA später mit steigender Temperatur an Effektivität zunimmt. Wenn man die Produkte bei dem schnellsten Übergang mit den bei der Rampe vergleicht, kann man davon ausgehen , dass der langsame Temperaturanstieg von 35°C zu 72°C ein gewisses unspezifisches Andocken erlaubt. Für das Priming eines Primers sind die ersten 6 Basen an seinem 3´Ende wichtig. Es wurde auch beschrieben, dass für ein schwaches Priming schon eine 2 Basenpaarhomologie Sommer &Tautz, 1989 ausreicht. Viele PCR-Fragmente also, die mit Wirkung der Rampe produziert werden, sind wahrscheinlich unspezifische Amplimere, dessen Produktion aber erwünscht ist, da so eventuelle Polymorphismen zwischen Personen oder anderen Unterschiede zwischen Genome aufgedeckt werden können. Man sieht auch, dass manche PCR-Produkte hauptsächlich die grösseren erst an Intensität zunehmen, wenn die Rampe verlängert wird, was dafür spricht dass sie etwas unspezifischer sind als die anderen. Das Problem aber das entsteht ist, dass solche unspezifischen Produkte manchmal auch bei kurzen Übergängen produziert werden was dem Verlust der Produzierbarkeit zur Folge hat. Deshalb wurde am Anfang für die Experimente auch eine relativ lange Rampe gewählt (11°C/sec.), die jetzt bestätigt worden ist. Eine Rampe von 11°C/sec. ist also ausreichend um unter diesen Visualisierungskonditionen (Agarose Gel und Ethidiumbromidfärbung) ein stabiles Bild zu geben. Ein längerer Übergang zwischen 35°C und 72°C hat keinen Einfluss mehr auf das Fragmentmuster.

4.8 Extensionszeiten

Die Beobachtung, dass die Variierung der Polymerisationstmperatur keine Unterschiede ergab, ist ein Hinweis dafür, dass die Extension schon bei niedrigen Temperaturen anfängt, obwohl die Taq Polymerase ihre volle Aktivität noch nicht entfalten kann. Wegen der langsamen Rampe ist die Polymerisation in dem Moment wo das PCR Reaktionsvolumen die 72 °C erreicht schon abgeschlossen. Deshalb ist eine Extensionstemperaur von z.B. 80°C nicht nötig, obwohl die maximale Aktivität des Enzyms bei 80 °C liegt. Beeindruckenderweise ist bei Benutzung einer Rampe die Extension fast überflüssig. Hier könnten evtl. 60 Sek. oder 120 Sek. Polymerisationszeit das Muster weiter stabilisieren. Die Ergebnisse bei den Anlagetemperaturen 35 °C und 43 °C


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waren vergleichbar. Interessanterweise führt eine Extensionszeit länger als 4 Minuten zu eine Vermehrung der hochmolekularen Banden die nicht aufgetrennt werden konnten und die dem sogenannten Schmier zugezählt werden. Diese Vermehrung ist auf Kosten der niedermolekularen Banden passiert, so dass die Intensität des ganzen Musters abnahm.

4.9 Enzyme

Aus den Versuchen konnte entnommen werden, dass die unterschiedlichen Polymerasen nicht absolut identische Muster produzieren, eine Tatsache die auch andere Wissenschaftler beobachtet haben Schierwater &Ender, 1993 . Die Ursachen dafür sind die Unterschiede in der Definition der Einheiten die die Enzymaktivität beschreiben: Die Einheit der Pharmacia Taq DNA Polymerase wurde bei 70 °C, die der GIBCO bei 74 °C, die der Qiagen bei 72 °C, die von Stratagene bei 80 °C festgelegt. Darüberhinaus wurden die Enzyme von unterschiedlichen Stämmen einer Art isoliert, z.B. die Polymerase von MBI Fermentas aus Thermus aquaticus YT1, während die von Boehringer Mannheim aus Thermus aquaticus BM Stämmen. Schliesslich ist zu erwähnen, dass die Amplifikationen in Puffern stattfinden die auch unterschiedliche Konzentrationen aufweisen, weil offensichtlich die Optima der Enzyme variieren: z.B. das 10x Amplifizierungspuffer (AP) von Perkin Elmer (100mM Tris HCl, PH 8,3 bei 25 °C, 500 mM KCl), das 10 x AP von MBI Fermentas (100 mM Tris HCL, PH 8,8 bei 25 °C, 500 mM KCl, 0,8 % Nonidet P40), das 10 x AP von Takara Taq (100 mM, Tris HCl, PH 8,3, 500 mM KCl, 0,01 % (w/v) Gelatine), das 10 x AP von GIBCO (200mM Tris HCl, PH 8,4, 500 mM HCl, das 10 x AP von Goldstar/Eurogentec (750 mM Tris HCl, PH 9,0 bei 25 °C, 200 mM (NH4) 2 SO4 , 0,1 % (w/v) Tween 20) weisen sich nicht nur durch ihre unterschiedlichen PH und Salze aus, sondern auch durch die An- und Abwesenheit von Stabilisatoren.

Das Stoffel Fragment ist eine rekombinante DNA Polymerase die im Vergleich zur Taq DNA Polymerase um 289 Aminosäuren am N-Ende kleiner ist und nach Angaben des Anbieters durch ein breiteres Mg+2 Optimum (2,5-5 mM) eine erhöhte thermische Stabilität und eine zehnfach geringere Prozessivität charakterisiert wird. Die Versuche konnten zwar das Mg+2 Optimum bestätigen aber nicht die erhöhte thermische Stabilität, da Denaturierungs-temperaturen von 98 °C zur Produktion von nur 2 Banden führten. Die geringe Prozessivität kann dafür verantwortlich gemacht werden, dass Banden über 2 kb ungenügend amplifiziert werden und dass lange Rampe eingesetzt werden müssen um ihre Produktion zu steigern.

Eine weitere Möglichkeit ist die Benutzung von Enzymkombinationen. Das Problem was sich ergibt, sind die unterschiedlichen Optima wie z.B. was die KCl Konzentration angeht. Die Gibco Taq hat wie auch die Amplitaq von Perkin Elmer ihr KCl Optimum bei 50 mM, während das des Stoffel Fragments bei 10 mM liegt. Deshalb konnten Kompromisse wie 30 mM KCl zu keinen befriedigendem Resultat führen.

Die Suche eines Enzyms oder eine Kombination von Enzymen die die Produktion der Fragmente unter 1 kb fördern, um ein möglich st grosses Spektrum zu bekommen oder übersetzt einen grösseren Einblick in das Genom, konnte erfolgreich abgeschlossen werden. Die 2,5 : 1 Kombination von Deltapol mit Combipol, die im Endeffekt eine Kombination von 3 Enzymen ist nämlich Taq DNA Polymerase, Klentaq und eines Enzyms mit proofreading Aktivität, z.B. Pfu oder Vent und 8 Units Klentaq zusammen mit 3 Units Combipol hat ein Muster produziert das für ein Screening der Genome verschiedener Individuen oder Arten auf Unterschiede benutzt werden kann. Danach, je nach dem molekularen Gewicht der Unterschiede, können in zweiter Linie Enzyme benutzt werden, die unterschiedliche Regionen betonen, z.B. Klentaq oder Stoffel Fragment für niedermolekulare Combipol und LA von Takara für die hochmolekulare Bereiche um die 3 kb und höher. Es ist selbstverständlich, dass Enzymkombinationen oder auch die aufeinanderfolgende Benutzung von mehreren Enzymen für das Screening der gleichen DNA sehr kostenaufwendig werden können, speziell wenn eine grosse Anzahl von Proben bearbeitet werden soll.

Interessanterweise wurden auch mit der DNA Polymerase des Thermus thermophilus(Tth) reproduzierbare Ergebnisse erzielt. Es ist bekannt, dass Fragmente die durch diese Polymerase synthetisiert werden eine erhöhte Mutationsfrequenz aufweisen wegen des Fehlens der proofreading. Exonukleaseaktivität am 3´Ende. Auf der anderen Seite, die Tatsache, dass mit der Pfu DNA Polymerase oder der Vent DNA Polymerase sehr wenige Fragmente generiert werden, kann mit der 12 mal erhöhten Fidelität der DNA Synthese dieses Enzyms gegenüber der Taq DNA Polymerase erklärt werden, die wiederum auf der 3´rarr 5´proofreading Exonukleaseaktivität basiert. Die Banden die keine hohe Homologie zum Ausgangsmaterial haben werden abgebaut. Das ist ein


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weiterer Hinweis, dass eine absolute Homologie nur für eine sehr kleine Anzahl von Banden zuttrifft und wie das Muster zeigt, es sich um hochmolekularen Banden handelt.

Tests mit der Taq DNA Polymerase von Qiagen unter Anwendung der Q-Solution der gleichen Firma weisen darauf hin, dass diese Lösung Betaine beinhaltet. Das Muster mit der Q-Solution ohne die Benutzung von zusätzlichem MgCl2 führte zu einem Muster das sehr ähnlich war mit demjenigen das mit Betaine (2,5M oder als finale Konzentartion) produziert wurde. Die Firma Chiagen behauptet, dass die Anwendung der Q-Solution die zeitraubende PCR Optimierung ersetzten kann. Diese Behauptung kann aufrecht erhalten werden, nur wenn man von der Standard PCR spricht und nicht vom random priming.

4.10 PCR Maschine

Wie Penner et al. Penneret.al, 1993 zeigten, hängt die Anzahl der produzierten Fragmente vom Fabrikat des PCR-Gerätes und die DNA-Konzentration ab und steht nicht in Relation mit der Länge des benutzten Primer (Startmoleküle). Andere Wissenschaftler haben auch den PCR-Maschinentyp als Hauptsache der Bandenmustervariation vorgeschlagen, die auf Unterschiede im Temperaturprofil zurückzuführen sind MacPherson, Eckstein, Scoles, &Gajadhar, 1993,goesto="bib100">Meunier &Grimont, 1993 . Da die RAPD-Methode abhängig von der Anlagerungstemperatur der willkürlich ausgewählten Primer unter präzisen Konditionen ist, spielt das Temperaturprofil jedes Cyclers eine ausschlagende Rolle für die Reproduzierbarkeit und Intensität der Fragmente.

Aus den vorliegenden Ergebnissen geht hervor, dass eine lange Rampe den möglichen technischen Unterschieden und eventuell Insuffizienzen (Unzulänglichkeiten) der PCR-Geräte entgegenwirkt und dass sie zur Uniformität der Amplifizierungskonditionen beiträgt, was das Temperaturprofil anbelangt.

Wenn man die Bandenmuster der Maschine der Firma Appligene beim Protokoll ohne Rampe beobachtet, könnte man vermuten, dass die reale Temperatur in den PCR Hütchen nie die nominelle (Solltemperatur) erreicht, da der Block des Gerätes schon wieder stark heizt bevor das Reaktionsvolumen die gewünschte Temperatur erreicht. Im Falle des Protokolls das die Rampe beinhaltet, ist der Temperaturanstieg so verlangsamt, dass die Ist-Temperatur in Hütchen die nominelle fast erreicht.

Abb. 18: Die gestrichelte Linie repräsentiert die de facto Temperatur des PCR Reaktionsvolumens im Appligene Thermocycler während die durchgehende, die nominalle. In diesem Diagramm wird eine PCR ohne Rampe analysiert.

Die Benutzung der Eppendorf-Hütchen in der PE-Maschine ohne Anwendung der Rampe führte zu grossen Unterschieden im Bandenmuster. Sie sind wahrscheinlich ein Hinweis für den sehr schnellen Temperaturübergang der zwischen den drei Stufen der PCR im PE-Gerät stattfindet.

Eine andere Ursache ist wahrscheinlich die erhöhte Wanddicke der Eppendorf-Hütchen im


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Vergleich zu den PE-Hütchen. Sie ist für die grössere Trägheit der Eppendorf-Hütchen im Bezug auf Temperaturveränderungen verantworlich, so dass die gewünschten Temperaturen später eintreten und DNA für eine kürzere Dauer anhalten.

4.11 PAD, Heisser Start, PCR Additiva, Visualisierungsmöglichkeiten der DNA, PCR Programmveränderungen

Weitere Versuche die Reproduzierbarkeit zu sichern und die Breite des Musters zu vergrössern haben sich in mehreren Richtungen erstreckt. Durch die Addierung von Stoffen wie DMSO, Formamid, Glycerol, Trehalose, Betaine in unterschiedlichen Konzentrationen um Anlagerungsprobleme und Hindernisse die sich durch die sekundäre Struktur der DNA ergeben zu überwinden, durch die Änderung des PCR Programms im Sinne einer Betonung und Unterstützung von Teilen der Reaktion z.B. mittels Zeitverlängerung wie der Denaturierung (PAD) oder der Extension in den letzen Zyklen um limitierende Faktoren wie die kalte Oligonukleotidfusion oder das “Plateau“ Phänomen entgegenzuwirken und auch Versuche die Bandenanalyse zu verbessern mittels Substanzen wie CAA, haben sich nicht als hilfreich herausgestellt.

4.12 Primer

Aus den durchgeführten Experimenten lässt sich ableiten, dass der GC%(Guanosin, Cytosin) Gehalt der Primer keine Auswirkung auf die Reproduzierbarkeit der Muster hat, so dass ein Primer mit 40% GC Gehalt gleichwertig in diesem Punkt ist mit einem Primer der 70% oder 80% GC Gehalt aufweist. Bestätigt wurde allerdings, dass Primer mit hohem GC Gehalt eine grössere Anzahl von Amplimeren produzieren Kubelik &Szabo, 1995 In dieser Hinsicht wurden 2 Primer, nähmlich ACR1(TTT TTT CAG G) und DCR1(ATA CTT ACC T) mit 40% GC Gehalt untersucht. Ob ein Primer aber trotzdem informativ ist, d.h. Unterschiede aufdecken kann, kann nur durch Experimente verifiziert werden.

Es muss hier sicherlich erwähnent werden, dass bei Primerkombinationen die Chance Unterschiede zu finden grösser ist, als bei einzelnen Primern; eine Beobachtung, die auch andere Arbeitsgruppen gemacht haben. Bei den Primer, die überhaupt keine Produkte generiert haben, muss davon ausgehen werden, dass die priming Orte (Anlagerungspositionen) weit auseinander liegen, d.h. dessen Abstand um die 5kb oder grösser ist.

Die Primer sollten, wenn möglich, die zwei Bedingungen von den Erstbeschreibern erfüllen, d.h. der GC Gehalt sollte 50-70% sein und die Sequenzen sollten keine Palindrome beinhalten. Manche konstruierte Primer konnten diese Voraussetzungen aufgrund der zugrundeliegenden Sequenzen, z.B. der TELO3, nicht erfüllen. Die Art auf der diese Sequenzen in den Mechanismen der Tumorgenese involviert sind, wird in den nächsten Paragraphen beschrieben. Die Tabelle 2 beinhaltet Primer und dessen Kombinationen die sich von tumorrelevanten Sequenzen ableiten lassen. Am Ende der Paragraphen wird auf die abgeleitete Primer hingewiesen.

Die Tumorgenese ist häufig mit DNA-Rekombinationen assoziiert, die in Deletionen von Tumorsuppressorgenen und veränderte Expression oder Amplifikation von Protoonkogenen resultieren Sengstag, 1994 . Diese Mutationen haben als Ursache die mitotische nicht homologe Rekombination, d.h. den Austausch zwischen nicht homologen DNA Regionen Guptaet.al, 1997 .

Die Destabilisierung dieser Gene könnte durch preexistierende Rekombinationshotspots oder die Herstellung von de novo Hotspots durch die Chromosomenumlagerung selbst erklärt werden. Regionen werden als Hotspots, d.h. bevorzugte Stellen für die Einleitung der Rekombination, bezeichnet, wenn deren Rekombinationsfrequenz per Distanzeinheit mehr als 1 centi Morgan (cM) per Megabase (Mb) DNA beträgt Lichten &Goldman, 1995 .

Die genetische Rekombination wurde in den letzten Jahrzehnten am besten an Bakterien und Hefen untersucht. Bei den E. coli Bakterien wurde herausgefunden, dass die Rekombinationsfrequenz strangaufwärts (am 5´Ende) der Sequenz 5´-GCTGGTGG-3´ erhöht ist. Die Frequenz ist grösser nah an der Sequenz und nimmt exponentiell ab um einen Faktor von 2 für jede 2-3 Kb die man sich vom 5´Ende entfernt.

Diese Sequenz ist auch als Chi bekannt, was für "cross-over hotspot instigator" steht, also "Rekombinationsspot Förderer". Diese Chi Sequenzen sind in sogenannten Rekombinationsinseln eingebettet, die GT reich und ungefähr 800 bp lang sind. Neuere Untersuchungen Tracy, Chedin, &Kowalczykowski, 1997 schlagen vor, dass diese 8


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bp Sequenz länger ist, nämlich 5´-C(/T) GCTGGTGGC(/T)GG-3´ und dass sie eventuell auch in der Transkription eine Rolle spielt Bell, Chow, Ho, &Forsdyke, 1998 .

Untersuchungen bei Eukaryonten haben gezeigt, dass ähnliche Sequenzen auch hier die Rekombination stimulieren. Ein Beispiel dafür findet man bei den molekularen Ereignissen, bei der chronischen myeloischen Leukämie(CML). Bei der Pathogense der Erkrankung spielt eine spezifische Translokation in weissen Blutzellen, eine reziprobe Translokation von Stücken zwischen den Chromosomen 9 und 22, die zu einem verkürztem Chromosom 22 führt, dass als Philadelphia-Chromosom bekannt geworden ist, eine wichtige Rolle. Als Resultat der Translokation fanden Molekularbiologen eine Verschmelzung des ABL Gens von Chromosom 9 mit einem Gen auf Chromosom 22. Die Region der Fusion der beiden Genen hat den Verlegenheitsnamen BCR (Breakpoint cluster Region) bekommen. Die Sequenzanalyse der humanen ABL und BCR Genen und der Regionen, die in der Philadelphia chromosomalen Translokation involviert sind, haben gezeigt, dass Chi-ähnliche Oktamere Sowerby, Kennedy, Fitzgerald, &Morris, 1993,goesto="bib25">Chissoeet.al, 1995 in beiden Sequenzen vorkommen.

Zweites Beispiel ist ein chronischer B-Zelltumor Jaegeret.al, 1994 , der als follikuläres Lymphom bezeichnet wird. Das pathogenetische Merkmal ist die chromosomale Translokation t (14;18) (q32;q21). Die Gene die hier verbunden werden, sind das Gen für die schweren Ketten des Immunglobulins (IgH) auf dem Chromosom 14 und das Gen Bcl-2 auf dem Chromosom 18. Durch Studien wurde entdeckt, dass die Bcl-2 major (mbr) und minor (mcr) Bruchpunktregionen wie auch die entsprechenden Regionen des Gens der schweren Ketten des Immunglobulins Rekombinationssequenzen beinhalten, die grosse Ähnlichkeiten zur Chi Sequenz zeigen Wyatt, Rudders, Zelenetz, Delellis, &Krontiris, 1992 .

Diese Überlegungen führten zur Konstruktion von zwei Primern, nähmlich CHI und STARK.

Studien über die Mutationen des Mismatsch Repair Gens hMSH2 Marshall, Isidro, &Boavida, 1996 , haben bei einer Person folgenden Befund ans Licht gebracht: Ein 553 bp Fragment der hMSH2 cDNA wurde deletiert und durch eine 36 bp Alu-Sequenz ersetzt, die grosse Homologie zur 26 bp langen Alukernsequenz aufwies und das GCTGG Motif beinhaltet, das Teil der prokaryotischen Chi-Sequenz ist. Aus dieser Alukernsequenz wurde der Primer CORE ausgewählt und konzipiert.

Andere Sequenzen, die chromosomale Rekombinationen begünstigen, sind repetitive Sequenzen Korenberg &Rykowski, 1988 wie z.B. die Short Interspersed Nucleic Elements (SINEs) und die Long Interspersed Nucleic Elements (LINEs).

Von dem SINEs ist besonders ein Typ hervorzuheben, nämlich die Alu-Sequenzen. Das humane Genom beiinhaltet 106 Kopien der Alu Wiederholungen, die in ungefähren Abständen von 4 Kb vorkommen. Sie sind 300 bp lang, vor 65 Millionen Jahren entstanden, werden nur in Primatgenomen gefunden, machen 5-10% des ganzen Genoms aus und weichen von einer Consensus-Sequenz ungefähr 13% ab. Es gibt Hinweise, dass eine positive Korrelation zwischen Gendichte und Aludichte existiert. In situ Hybridisierungsstudien haben gezeigt, dass Alu-Sequenzen vorwiegend in genreichen GC-reichen (56% GC), R (R für reverse) Banden der Metaphasenchromosomen lokalisiert sind, Regionen, die vorzüglich an homologen und nichthomologen chromosomalen Austauschprozessen teilnehmen. An einer Anzahl von krankheitsassoziierten Rearrangements und Deletionen sind Alu-Sequenzen ebenfalls beteiligt: mehrere Philadelphia-Chromosom BCR-ABL Translokation Bruchpunkte; eine Inversion-Deletion im ss-Globin Gen; intragenomische Deletionen im Lysylhydroxylase Gen; LDL-Rezeptor Gen; Apolipoprotein ss Gen; Adenosin Deaminase Gen (ADA-SCID); Complement Component C1 Gen.

Die besten Beispiele dafür sind das Low Density Lipoprotein Rezeptor Gen Lehrman, Russell, Goldstein, &Brown, 1987 und das Complement Competent 1 Inhibitor Gen (C1I) Ariga, Carter, &Davis, 1990 . Diese Gene beinhalten eine grosse Anzahl von Alu-Elementwiederholungen und sind wahrscheinlich deshalb empfänglicher für Alu hergeleitete Genrekombinationen. Rüdiger et al. haben in einer Studie die Alu-Sequenzen, die bei Rekombinationen des LDL-Rezeptor Gens vorkommen, verglichen und vorgeschlagen, dass eine 26 basenpaarlange Kernsequenz(Coresequence) in den Alu-Elementen die Rekombination stimuliert, was die Ursache


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für das häufige Vorkommen dieser Elemente bei Genumordnungen sein könnte.

Deletionen, die durch Alu-Elemente vermittelt werden, kommen auch häufig bei Genen vor, die in der Krebsentwicklung eine Rolle spielen, wie z.B. das Mismatsch Repair Gen hMLH1, das NF-1 Gen und das Brustkrebsgen BRCA 1. Es konnte gezeigt werden, dass Alu vermittelte Rekombination für das Auftreten einer 165 bp Deletion in der cDNA des hMLH 1 Nystrom-Lahtiet.al, 1995 Gens verantwortlich war. Diese Mutation, die durch die Alu Sequenzen im Intron 15 und 16 vermittelt wurde, kann zum Hereditären-Nicht-Polypösen-Colon-Ca (HNPCC) führen.

Das NF-1 Tumorsuppressorgen Legius, Marchuk, Collins, &Glover, 1993 wurde bei einem Patienten durch eine Deletion mit Neurofibromatose Typ I inaktiviert. Die Deletion entfernte 200 kb vom Chromosom 17 und wurde durch den Verlust von mehreren polymorphen Marker des 17.Chromosoms begleitet. Die Sequenzierung der Deletionsbruchpunkte zeigte, dass die Ursache dafür eine Rekombination zwischen tetrameric short tandem repeats waren, die wiederum durch zwei Alu Wiederholungen flankiert wurden.

In einer grossen Familie mit Brustkrebs und Ovarialkrebsbelastung wurde eine 1 kb Deletion festgestellt, die das Exon 17 des BRCA 1 Gen beinhaltet und die auf ein genomisches Rearrangement zwischen Alu Sequenzen zurückgeht Pugetet.al, 1997 .

Die BRCA 1 Smithet.al, 1996 Gensequenz beinhaltet zu 46,3% repetitive Elemente. Ausserdem hat ein Vergleich gezeigt, dass es bis jetzt nur 3 bekannte Gene gibt, die eine höhere Alu Dichte aufweisen: das Apolipoprotein-Gen C-1 mit 60,8%, das Blym transforming Gen mit 53,7% und das Apolipoprotein C-IV Gen mit 41,3%. Im BRCA 1 Gen wurden auch 19 der vorher genannten Alukernsequenzen (Coresequence) gefunden.

Die Feststellung, dass die Alu-Elemente eine Rolle in der Förderung von nicht homologen Rekombinationen spielen, die zu Keimbahndeletionen und -duplikationen in einer Anzahl von Genen führt, erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass Gene mit höherer Frequenz an Alu Sequenzen auch auffälliger sind gegenüber somatischer Mutationen. Diese ist eine mögliche Erklärung für den sporadischen Brustkrebs Smith, Lee, 1996 und auch für andere Erkrankungen mit einer Neoplasiepredisposition z.B. die Fanconi Anämie Levran, 1998 .

Die Alu Sequenzen vermitteln also die chromosomalen Rearrangements indirekt, entweder durch die Förderung der Misspaarung und illegitimer Rekombination von nonhomologe Alu reichen Regionen oder durch die Formation von inter- oder intrachromosomalen Hairpinloop Strukturen, die DNA chromosomale Translokationen und Deletionen fördern. Der Primer R12A/267 für die Amplifikationen beinhaltet Teil der Consensus Alu Sequenz Munroe, 1996 .

Es bestehen weitere Hinweise, dass eine vergleichbare Funktion mit der Alu-Elemente auch die L1-Elemente der LINEs ausüben. Die L1 Elemente der Primaten Korenberg &Rykowski, 1988 befinden sich vorwiegend auf den G/Q (Giemsa oder Quinacrine) Banden der Metaphasenchromosomen, die GC-arm (GC-Gehalt 42 %) und genarm sind. Sie sind länger als 5Kb und ihre Anzahl beträgt mehr als 104 Kopien pro Primatengenom. Die Alu und die L1 Sequenzen sind also in umgekehrter Weise im menschlichen Genom verteilt. L1 vermittelte Genrekombinationen wurden in mehreren Erkrankungen festgestellt: z.B. a) eine 300 kb Deletion im Intron 10 des PAX Gens in der familiären Aniridie, b) eine Translokation im Intron 24 des COL 5A Gens im Ehlers-Danlos Syndrom, c) eine 7,1 Kb L1 Element Insertion im Intron 6 der ss-Untereinheit des Glycin-Rezeptors in der kongenitalen Myoklonie.

Die Verbindung des L1 Elements mit DNA Deletionen in Krebszellen wurde zum ersten Mal von Inoue Inoueet.al, 1997 beobachtet; L1-Elemente vermitteln häufige Deletionen im FRA3B/FHIT Locus mit folgender Inaktivierung des FHIT Gens. FRA3B ist eine fragile Stelle (fragile site) also eine chromosomale Region, die zytogenetisch detektierbare Lücken nach bestimmter Chemikalienexposition (z.B. Aphidicolin) der Zellen aufweist und auf dem 3p14.2 die im FHIT (Fragile Histidine Triad) Gen lokalisiert ist. Auf der Basis der Sequenz von L1 Elementen ist der Primer L1HS entstanden


54

Munroeet.al, 1994 .

Vergleichbare Analysen von diskreten genetischen Loci zwischen Primaten weisen auf die Fähigkeit des Genoms der höheren Primaten, genreiche genomische 5 bis 50 Kb lang Segmente zu duplizieren oder ihre Transposition in die perizentromerische Regionen unterschiedlicher Chromosomen zu fördern Eichler, 1999 . Der Begriff perizentromerisch bezieht sich auf eine grosse Zone beidseits des Zentromers, die direkt distal der alpha-Satelliten Wiederholungen beginnt und bis zur ersten zytogenetisch Giemsagefärbten Bande reicht.

Mit den Duplikationen ist oft eine Bewegung von Material zwischen nicht homologen Chromosomen verknüpft, die durch intrachromosomale Ereignisse gefolgt werden, welche Kopien auf eine nicht-tandem Art verteilen. Der Abstand zwischen den Duplikaten kann 1-3 Mb ertragen. Obwohl der Duplikatmechanismus nicht bekannt ist, gibt es Vorschläge, dass mehrere repetitive Sequenzen in diesen Regionen die Duplikationen fördern.

Als Beispiel werden hier die ss-Satelliten genannt, dessen Fähigkeit zur schnellen Expansion und Kontraktion bekannt ist, wahrscheinlich über Mechanismen, wie saltatorische Replikation oder unequal crossing over. Wenn Krüppel-assoziierte BOX Zinc Finger (KRAB-ZNF) Gene nahe an ss-Satelliten Wiederholungen integriert werden, DNA beginnen sie sich zu duplizieren, indem sie durch diese ss-Satelliten Matrix getragen werden, die ständig in Fluss ist Eichleret.al, 1998 . Die Präsenz von inverted ss-Satelliten Blöcken, die das ZNF Gen flankieren, fördert weiter die Duplikation. Es konnte gezeigt werden, dass solche grosse Palindrome die Genamplifikation fördern und dass sie auch mit anderen Cluster von duplizierten Genen assoziiert sind. Es ist auch wahrscheinlich, dass andere repetitive Sequenzen an solchen Mechanismen beteiligt sind.

Interessant ist, dass grosse genomische Segmente von paralogen Sequenzen (Sequenzähnlichkeit aufgrund von Duplikation) auf beiden Seiten von Bruchpunkt Cluster bekannter Mikrodeletion / Mikroduplikation Syndrome, wie das Prader-Willi Syndrom (PWS) in 15q11-13 und das Smith-Magenis-Syndrom (SMS) in 17p11.2, entdeckt wurden, was auf ihre Rolle in der Vermittlung aberranter Rekombinationen mit assoziierter Instabilität dieser Regionen hinweisen könnte. Perizentromerische Regionen tendieren also zur genomischen Instabilität und zwei von diesen Intervallen, 15q1.2 und 22q11 gehören zu den unstabilsten Regionen des humanen Genoms Eichler, 1998 . Diese Regionen sind häufig mit sporadischen Duplikationen und Deletionen assoziiert und werden deshalb auch als Hotspots angesehen. Der Grund dafür sind die Präsenz von grossen Blocks von paralogen Sequenzen, die durch Satelliten DNA flankiert werden.

Die DNA des Zentromers beinhaltet hintereinanderliegende repetitive Sequenzen, sogenannte Satelliten DNA und im niedrigeren Masse interspersed repetitive DNAs, also SINEs und LINEs Kalitsis, 1997 . Es konnten mehrere Satelliten DNA Familien ausgemacht werden. Familie 1 besteht aus 42 bp Wiederholungen, die durch alternierende 17 bp und 25 bp Einheiten gebildet werden. Familie 2 wird aus ATTCC Wiederholungen zusammengestellt. Die Satelliten DNA Familie 3 wird auch aus dem Pentaner ATTCC/GGAAT zusammengestellt, dessen Reihenfolge manchmal durch eine spezifische 10 bp-Sequenz unterbrochen wird Lee, Wevrick, Fisher, Ferguson-Smith, &Lin, 1997 . In der Satelliten-3-DNA finden auch chromosomale Rearrangements statt, die zu Robertsonian Translokationen führen. Die Hypothese besagt, dass Guanin-reiche Satelliten 3 Wiederholungen die chromosomale Rekombination durch Formation von Tetraplex Strukturen fördern. Eine weitere Familie ist die der alpha Satelliten DNA. An der Grenze zwischen alpha und Familie 3 Satelliten DNA finden sich auf den Chromosomen 13, 14 und 21 direkte repetitive Sequenzen, die als Bindungsstelle für das Protein pJa fungieren sollen. Aus dieser repetitiven Sequenz wurde der Primer C4 konzipiert.

An dieser Stelle wäre zu erwähnen, dass die SINEs, hauptsächlich die Alu-Sequenzen, im Zentromer ungefähr 50-fach im Vergleich zum übrigen Genom unterrepresentiert sind. Diese Unterrepresentierung betrifft auch die LINEs Sequenzen, z.B. die Kpn Familie.

Andere als Rekombinationshotspots vorgeschlagene Sequenzen sind die Variable Number of Tandem Reats (VNTRs) also die Minisatelliten und die Mikrosatelliten. Die Minisatelliten DNA besteht aus Kopien von DNA-Abschnitten aus 16-64 Basenpaaren, die im Genom verstreut sind,


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aber gehäuft im subtelomeren Bereich vorkommen. Mikrosatelliten bestehen aus 10-50 Kopien von sehr einfachen Sequenzwiederholungen, wie die am häufigsten vorkommende (A)n oder die zweithäufigste (CA) n, wobei n 10 bis 60 Basen beträgt. Die Mikrosatelliten sind zufällig im Genom verteilt, hochgradig polymorph und liegen in sehr grosser Anzahl vor (z.B. wird geschätzt, dass die CA-Sequenz in 10000 bis 50000 Kopien vorhanden ist) Eshleman &Markowitz, 1995 .

Es gibt Hinweise, dass die hypervariable Minisatelliten-DNA und die (GT)n Mikrosatelliten als Rekombinationshotspots der Gene der menschlichen HLA-DQ Oberflächenantigene fungieren. Interessant ist, dass manche DNA-Sequenzen wie die Mikrosatelliten (CG)n und (TG)n, eine strukturelle Veränderung vor der üblichen rechtsgängigen B-DNA Helix zur linksgängigen Z-DNA Form durchmachen können. Die Hotspotaktivität des (GT) n Motifs im Z-DNA Bereichs, wurde zum ersten Mal als Erhöhung der intramolekularen Rekombination zwischen 2(TG)n Wiederholungen von replizierenden SV40 Viren in Affenzellen Wahls, 1998 festgestellt. Rekombinationen zwischen Nukleotidwieder-holungen der Z-DNA-Form sind 8-mal häufiger als die zwischen anderen Mikrosatelliten.

Dass GT-reiche Loci eine spezielle Rolle in der Rekombination spielen, es lässt sich sowohl auch durch das Verhalten von Mikrosatelliten DNA als auch durch das der interstitiellen telomerischen Sequenzen schliessen. Die konstanten Teile der schweren Ketten der Immunglobuline unterliegen Rearrangements mittels homologen Rekombinationen von Regionen (switch-Loci) die GT-reich sind. Zusätzlich ist zu erwähnen dass das Hefeprotein Rad 51, ein REC-A-Homolog eine ähnliche Preferenz für GT-reiche Sequenzen aufweist. Diese Tatsachen sind eventuell ein Hinweis dafür, dass GT-reiche Regionen universell benutzt werden, um Rekombinationen zu stimulieren.

Die genaue Rolle der VNTRs im Mechanismus der Rekombination ist unklar. Es wurde vorgeschlagen, dass sie als Hotspots agieren, in dem sie als Auflösungspunkte für die Holliday Junctions fungieren Wahls, 1998 .

Nuernberg et. al. Nuernberg, 1991 konnte bei Hirntumoren mittels Hybridisierung mit einer (GTG)5 Sonde amplifizierte Fragmente nachweisen, was auch nach Rehybridisierung mit der (GT)8 Sonde im Gegensatz zur vergleichenden Leukozyten DNA gelang. Da das EGFR-Gen bei diesen Tumoren ebenfalls amplifiziert ist, versuchte er mittels Southern-Technik den Zusammenhang zwischen beiden amplifizierten Regionen, des Gens und des GT-Bereiches zu zeigen. Nach vergleichender Hybridisierung und Berücksichtigung der Genrestriktionskarte lokalisierte er interessanterweise den Bereich im EGFR-Gen zwischen Exon 5 und Exon 7, also im 5. oder 6. Intron.

Solche Mikrosatelliten wie (GT)n sind auch in anderen Genen anzutreffen wie z.B. im BCR-Gen, wo es beginnend von Position 74.381 21 mal wiederholt wird Chissoe, Bodenteich, 1995 .

Unterschiedliche Mikrosatelliten, nämlich Wiederholungen von 22 einfachen Sequenzen (SSRs = Single Sequence Repeats, eine andere Bezeichnung für Mikrosatelliten) wie z.B. (CGT)7, (TA) 5, (CTTTT)2, (GT)23, die mindestens 10 Nukleotide lang sind, findet man auch im BRCA 1 Gen Smith, Lee, 1996 . Nach Mikrosatellitensequenzen wurden die Primer EP2, EP5, EP6 und EP7 konzipiert.

Die Enden der enkaryotischen Chromosome (Telomere) sind durch eine Anordnung von repetitiven Sequenzen charakterisiert. In Menschen und Mäusen ist TTAGGG die wichtigste repetitive Einheit mit eine Orientierung 5´rarr3´in Richtung auf das Ende des Chromosoms Blackburn, 1991 . Im Menschen erstrecken sich diese Wiederholungen über 10-15 kb, während sie in der Maus mit 30-150 kb erheblich länger sind. Telomer ähnliche Sequenzen (Telomere-like Repeats = TLRs genannt) sind auch in bestimmten interstitiellen chromosomalen Stellen anzutreffen. Das menschliche Chromosom 2 z.B., beinhaltet mindestens ein TLR auf der q13 Bande JW, Baldini, Ward, Reeders, &Wells, 1991 . Weitere Untersuchungen haben gezeigt, dass diese TLRs durch eine Kopf-zu-Kopf Anordnung der TTAGGG Sequenz zustande kommt, d.h. 5´-(TTAGGG)n-(CCCTAA)n-3´. Aufgrund dieser Daten wurde vorgeschlagen, dass dieser Locus eine Stelle einer älteren Telomer-Telomer Fusion darstellt. Aus dieser Kopf-zu-Kopf Anordnung ergab sich der Primer


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TELO3.

Hastie und Allshire Hastie &Allshire, 1989 haben vorgeschlagen, dass diese interstitielle TLRs an den chromosomalen fragilen Stellen (fragile sites) vorhanden sind. Die fragile Stelle FRAXA (Xq27.3) hat eine einfache repetitive Struktur; sie besteht aus der wiederholenden (CCG) n Einheit, die nicht telomer-ähnlich ist. Die fragile Stelle FRA2B, lokalisiert auf 2q13, beinhaltet auch keine TLR Sequenzen wie in situ Hybridisierungen gezeigt haben.

Trotz dieser Tatsachen konnte gezeigt werden, dass eine Einführung von ~500 bp TLR Sequenzen an eine interstitielle Stelle von Sängetierchromosomen zu einer erhöhten Frequenz von spontanen Brüchen an der Integrierungsstelle führen kann. Kopf-zu-Kopf Anordnungen von Telomersequenzen die interstitiell in Hefechromosomen anwesend sind, zeigen eine hohe Bruchfrequenz und im Paramecium(ein Ziliat) interstitielle Telomersequenzen sind Hotspots für illegitime Rekombinationen.

Während die fragilen Stellen in der Entwicklung der menschlichen Leukämie wahrscheinlich auch involviert sind, gibt es mehr Hinweise in diesem Zusammenhang in der Maus. Eine Anzahl von Radio-sensitiven Stellen (RSS = Radiatio-sensitive sites) wurden auf dem Chromosom 2 von Knochenmarkzellen der CBA/H Maus gefunden, ein Stamm der als Modell für die Radiatio-verursachte akute myeloische Leukämie (AML) fungiert Silver &Cox, 1993 . Die erhöhte Frequenz der induzierten Rearrangements in den RSS des Chromosoms 2 und terminalen Regionen anderer Chromosome suggeriert die Anwesenheit von interstitiellen TLR Sequenzen an den RSS. In situ Hybridisierungen konnten zeigen, dass die RSS auf dem Chromosom 2 durch eine Fülle von TLRs charakterisiert werden.

Es gibt starke Hinweise von in vitro Studien, dass Telomersequenzen die Formation von Komplexen DNA-Strukturen fördern können, die von einer Verbindung /Paarung von 4 Guanin-Basen ausgehen (bilden ein sogenanntes G-Quartet), die nicht die Watson-Crick Regel befolgen Bouffler, Silver, &Cox, 1993 .

Solche vorübergehenden Strukturen wurden als Stellen von chromosomalen Rekombinationen vorgeschlagen. Die Anwesenheit von interstitiellen Telomersequenzen wurden an den Bruchpunktverbindungspunkten (Junctions) von strukturell abnormalen Chromosomen festgestellt. Die Rekombinationsereignisse, die die CAD Genamplifizierung in chinesichen Hamsterzellen begleiten, involvieren häufig TTAGGG-Wiederholungen.

Vor kurzem wurde ein Fall von AML mit einer springenden Translokation (jumping translokation) registriert, die einen Bruchpunkt am 11q23 aufweist Cuthbert, McCullough, Finney, Breese, &Bown, 1999 . FISH demonstrierte Triplikation des MLL Gens und die Anwesenheit von interstitiellen Telomersequenzen, was die Rolle der repetitiven Sequenzen im Mechanismus der springenden Translokationen unterstützt.

Krawczak und Cooper Krawczak &Cooper, 1991 haben Ähnlichkeiten zwischen Deletionen untersucht und eine Konsensussequenz TGA/GA/GG/TA/C ausgemacht (diese Sequenz war die Basis für den DH Primer), die in Deletionshotspots von 5 humanen Genen (AT3, F8, HBA, HBB und HPRT) vorkam. Diese Sequenz trafen die Genetiker ausserdem in der Nähe von ungefähr die Hälfte der untersuchten 60 sporadischen Deletionen von verschiedenen Genen an. Sie wurde häufig an Orten von spontanen Deletionen im Hamster ARPT Gen gefunden, konnte mit mehreren grossen Deletionen/Translokationen von humanen Genen assoziiert werden, agiert während der DNA Replikation als Hemmungsorte für die humane Polymerase alpha und konnte durch in vitro Studien dieser Polymerase als anfällig für Frameshift Mutationen charakterisiert werden.

Es ist seit längerem bekannt, dass Deletionen in mitochondrialen Genomen bei allen Patienten mit Kearns-Sayre Syndrom (KSS) und in ungefähr der Hälfte der Patienten mit progressive externe Ophthalmoplegie (PEO) vorkommen. Die Deletionen unterscheiden sich sowohl in Grösse als auch in ihre Lokalisation, ausser einer 5 kb langen, die wiederum in mehr als ein Drittel aller Patienten vorkommt Schonet.al, 1989 . Diese häufige Deletion wird in normalen mitochondrialen Genomen von einer 13 Basenpaar lange perfekten direkten Repetition flankiert. Diese Beobachtung deutet an, dass die homologe Rekombination, die bei Pflanzen und niederen Eukaryonten hauptsächlich aktiv ist, auch in Säugergenome stattfindet und dass sie eine der Ursachen ist für Deletionen dieser beiden mitochondrialen Myopathien. Aus dieser 13bp langen


57

Sequenz wurde der MHS Primer konstruiert.

Es wurden weitere Primer gebildet, die sich an der Exon-Intron-Grenze Sequenz Mount, 1982 anlehnen, mit unterschiedlichen GC% Gehalt, sowie ein Primer, der sich an der TATA-Box orientiert.

Stone und Wharton Stone &Wharton, 1994 haben 1994 eine Modifizierung der “RNA Fingerprinting“ Methode benutzt, um differentiell exprimierte oder angereicherte cDNA Fragmente von spezifischen Genfamilien zu identifizieren. Die Technik wurde erfolgreich bei Säugertierzellen angewandt, um neue Mitglieder der SER/THR Protein Kinase Familie und der Zinc Finger Protein Familie zu entdecken. Aus den dort beschriebenen Primer wurde der Zn ausgesucht.

Die Sequenzen der benutzten Primer stehen in der Tabelle 2. Zusätzlich wird da festgehalten, ob ein Primer Banden produziert und ob er informativ ist, d.h. ob er Unterschiede zwischen Mammatumor- und Leukozyten DNA aufdecken kann.


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Tabelle 2:

Primer Name Sequenz (5´=> 3´) PCR-Produkte Unterschiede/
informativ

 

CHI

GTG GGG AGG ACG

-

-

 

STARK

TGC TGG TGG TGG

-

-

 

EP 2

GAT AGA TAG ATA

+

-

 

EP 5

GAA GAA GAA GAA

+

-

 

EP 6

ACG ACG ACG ACG

+

+

 

EP 7

TGT CTG TCT GTC

+

-

 

TELO 3

TTA GGG CCC TAA

-

-

 

ACR 3

TTT CTC CAG G

+

+

 

DCR 4

GAA CTT ACC T

+

+

 

C 4/ PJa

GGT GAA AAA G

+

-

 

CORE

CCA AAG TGC TGG

-

-

 

R 12 A/ 267

AGC GAG ACT CCG

+

-

 

TATA

GGG CTA TAA G

+

+

 

Zn

GTC GTC GAA TTC CAC ACA GGA GAA AAG CC

+

 

 

Zn + CORE

-

-

 

Zn + DCR4

+

+

 

Zn + R 12 A/ 267

-

-

 

Zn + ACR3

+

+

 

Zn + TELO3

+

-

 

Zn + DH

Schmier

-

 

TATA + R 12 A/ 267

+

+

 

ACR 3 + DCR 4

+

-

 

EP 7 + ACR 3

+

-

 

C 4/ PJA + ACR 3

+

-

 

C 4/ PJA + DCR 4

+

+

 

CHI + TELO 3

+

+

 

CORE + TELO 3

+

+

 

STARK + ACR 3

+

+

 

STARK + DCR 4

+

+

 

STARK + EP 2

-

-

 

STARK + EP 6

+

+

 

STARK + R 12 A /267

+

+

 

STARK + TELO 3

+

+

 

STARK + C 4

-

-

 

DH + ACR 3

+

+

 

DH + DCR 4

+

+

 

DH + EP 2

+

+

 

DH + EP 6

+

+

 

DH + R 12 A /267

+

+

 

DH + TELO 3

-

-

 

DH + C 4

+

+

 

DH + MHS

+

+

 

L1HS + MHS

+

-

 

L1HS + STARK

-

-


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Aus den durchgeführten Experimenten lässt sich ableiten, dass eine Primersynthese, die sich nach bekannten und tumorrelevanten Sequenzen richtet, keine Garantie für die Entdeckung von Unterschiede zwischen Genomen ist. Primer, die z.B. nach der Exon-Intron Grenze Sequenz oder die nach den Alu Elementen synthetisiert worden sind, haben beim Vergleich von Tumor- mit gesundem Gewebe beim Mammacarzinom zu keinem Erfolg geführt. Dagegen haben Primer mit telomeraseähnlichen Sequenzen oder Primer mit Sequenzen vergleichbar der des “Chi“ Elements oder mancher Mikrosatelliten eine grössere Fähigkeit gezeigt, Differenzen aufzudecken.

4.13 Dynamin

Dynamin ist wegen seiner Grösse(ein Homotetramer von 100kDa Untereinheiten), seiner niedrigen Affinität zu GTP(30µM) und seiner hohen intrinsischen und stimulierten Rate der GTP Hydrolyse ein eher untypisches Mitglied der GTPase Superfamilie Schmid, 1998 . Untypisch ist weiter, dass Moleküle mit unterschiedlichen Funktionen mit Dynamin am Carboxylende des Proteins interagieren, entweder über die PH (Pleckstrin Homologie) Domäne oder die RP (Prolinreiche) Domäne, und seine GTPase Aktivität regulieren können wie z.B. Mikrotubuli, Phospholipidvesikel, Phosphatidylinositol-4,5-biphosphathaltige Phospholipidvesikel, SH3 (Src Homologie 3 Domäne)-haltige Proteine, wie die Phospholipase C gamma, das wachstumsfaktorrezeptorgebundene Protein 2 (Grb2), die regulatorische Untereinheit der phosphatidylinositol-3-Kinase (p85) und die beta/gamma Untereinheiten der dreiteiligen G-Proteine.

Die Interaktion des Dynamins mit Proteinen dieser Art weist auf seine Involvierung in der Signaltransduktion mittels Tyrosinkinaserezeptoren hin Urrutia, Henley, Cook, &McNiven, 1997 . Diese Hypothese wurde durch die Immunpräzipitation mit einer Anzahl von Tyrosinkinasewachstumsfaktorenrezeptoren einschliesslich des EGF Rezeptors unterstützt. Zusätzlich konnte Scaife et al. Scaife &Margolis, 1990 zeigen, dass die Verbindung des Dynamins mit der Phospholipase C gamma weiter zunimmt, wenn eine Wachstumsfaktorstimulation stattfindet. Diese Resultate sind ein Hinweis dafür, dass Dynamin evtl. in unterschiedlichen Signalkaskaden ist als Antwort auf Stimulationen durch unterschiedliche Agonisten ist. Diese Hypothese wird zusätzlich von der Tatsache unterstützt, dass mindestens drei Dynamingene mit mehreren Splice Varianten existieren. Dies führt unweigerlich zur Frage, wieso es so viele Formen gibt und ob sie einzigartige oder redundante Zellfunktionen übernehmen.

Obwohl die Funktion der Dynaminproteine in den Signalwegen unklar ist, kann man von den bisher bekannten Daten mit Sicherheit sagen, dass diese GTPase eine wichtige Rolle in der clathrinvermittelte Endozytose und im Recycling der synaptischen Vesikel spielt Schmid, 1998 .

Die hier beschriebene Amplifikation der Dynaminsequenz in Mammakarzinomproben könnte ein Hinweis für seine Involvierung in der Karzinogenese sein. Unseres bisheriges Wissen über dieses Molekül und ganz speziell seine Interaktionen in der Signaltransduktionskaskaden ist aber völlig unzureichend, um seine Rolle zu konkretisieren.

Die Amplifizierung kann auch ein Zeichen dafür sein, dass in der Nähe des Dynamins auf dem Chromosom 9q34 sich ein oder mehrere Gene befinden, die unmittelbar an der Tumorgenese teilnehmen. Amplifikationen der Region 9q34 in Mammakarzinomen sind schon beschrieben worden, aber, da sie mit der CGH (Komparative Genomische Hybridisierung) nicht detektiert wurden, sondern durch die Chromosomendissektion, geht man davon aus, dass sie sich auf niedrigem Niveau bewegen Guan, Meltzer, Dalton, &Trent, 1994 . Tatsächlich ist es so, dass das Dynamin I Gen auf einem Abschnitt des Chromosoms 9 Newman-Smith, Shurland, &van der Bliek, 1997 lokalisiert ist, der sehr intensiv studiert wird. Eine grosse Anzahl von Genen wurde dieser Region zugeordnet: Gelsolin, Argininosukzinat, Adenylatkinase, ABL Onkogen, AB0 Blutgruppe und Tenaszin. Zusätzlich zu den Translokation des ABL in der chronischen myeloischen Leukämie sind hier zwei Neuropathien aufgezeichnet: die tuberöse Sklerose(TSC1) und die idiopathische Torsionsdystonie. Die neurologischen Komponenten dieser Erkrankungen sind vereinbar mit Mutationen des Dynamin I Gens, weil Dynamin so wichtig für die synaptische Transmission ist. Darüber hinaus gibt es Daten, die die Hypothese stützen, dass das TSC1 als Tumorsuppressorgen für das Urothelkarzinom fungieren kann Hornigoldet.al, 1999 . Abschliessend kann man wohl sagen, dass die


60

Nachbarschaft des Dynamin I Gens eine hochinteressante Region ist und zwar nicht nur für das Mammakarzinom. Es muss jedoch noch erhebliche Arbeit geleistet werden, um ihre Rolle in der Tumorgenese zu klären.


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Wed Sep 5 16:50:29 2001