Papadopoulos, Sarantos: Untersuchungen genomischer Veränderungen von Mammakarzinomzellen mittels Random Amplified Polymorphic DNA

Robert-Rössle-Klinik


DISSERTATION
Untersuchungen genomischer Veränderungen von Mammakarzinomzellen mittels Random Amplified Polymorphic DNA

Zur Erlangung des akademischen Grades Doctor medicinae (Dr. med.)

Medizinischen Fakultät Charité, Campus Buch, der Humboldt-Universität zu Berlin

Sarantos Papadopoulos

Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. R. Felix

Gutachter:
Prof. Dr.med. W.-D. Ludwig
Prof. Dr.rer.nat. H. Lehrach
Prof. Dr.med. H. Stein

eingereicht: 14. März 2000

Datum der Promotion: 19. März 2001

Zusammenfassung

Im ersten Teil der Arbeit wurde die random amplified polymorphic DNA (RAPD) Methode für die Anwendung humaner DNA optimiert, indem die Konzentrationen der einzelnen Agentien und das thermische Profil der PCR-Reaktion verändert wurden. Des weiteren wurde der Einfluss von Polymerasen und PCR-Maschinen auf die RAPD, insbesondere auf die Erweiterung des Spektrums der Amplimere und die Reproduzierbarkeit der Reaktionen untersucht. Unsere Untersuchungen haben gezeigt, dass die RAPD eine sehr robuste und reproduzierbare Methode ist. Im zweiten Teil wurden qualitative und quantitative Unterschiede zwischen DNA von Brustkrebszellen und DNA von Leukozyten detektiert. Die dazu benutzten Primer basieren auf Sequenzen die in den Mechanismen der Tumorgenese involviert sind. Unsere Studie hat gezeigt, dass random priming in der Abschätzung von genomischen Schäden im Brustkrebs sehr nutzbar sein kann.

Schlagwörter:
Random Priming, Random Amplified Polymorhic DNA, RAPD, Optimierung, Mammakarzinom

Abstract

In the first part of this work, we have optimized random amplified polymorphic DNA (RAPD) for the use of human DNA in altering the concentration of the reaction components and the steps of the thermal profile in the polymerase chain reaction, by testing a large number of polymerases and multiple combinations with respect to their ability to increase the spectrum of amplimers and by examining the performance of various thermocyclers. We conclude that RAPD is a robust and reproducible method that could prove very useful for scientists and physicians. In the second part we used primers that were designed by choosing sequences involved in the development of DNA mutations, to successfully detect qualitative and quantitative differences between breast cancer DNA/normal DNA pairs. Our study showed that random priming proves very useful for assessing genomic damage in breast cancer.

Keywords:
Random Priming, Random Amplified Polymorhic DNA, RAPD, Optimization, Breast Cancer


Seiten: [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64-81]

Inhaltsverzeichnis

TitelseiteUntersuchungen genomischer Veränderungen von Mammakarzinomzellen mittels Random Amplified Polymorphic DNA
1 Einführung
1.1Molekularbiologische Methoden
1.2RAPD
1.3RAPD und Krebs
1.4Ziele der Arbeit
2 Material und Methoden
2.1Material und Geräte
2.1.1Feste Chemikalien
2.1.2Flüssige Chemikalien
2.1.3Standardpuffer und Lösungen
2.1.4Biochemikalien, Enzyme und Standards
2.1.5Gebrauchsfertige Kits
2.1.6Verbrauchsmaterial
2.1.7Humanes Gewebe
2.1.8Geräte
2.2METHODEN
2.2.1Aufarbeitung von DNA aus EDTA behandeltem Vollblut
2.2.2Proteinase K/Phenol/Chloroform-Methode
2.2.3Phenolextraktion
2.2.4Präzipitieren von DNA
2.2.5Rapid-Methode zur DNA Isolation
2.2.6Bestimmung der DNA-Konzentration
2.2.7Chelex ®(Biorad)
2.2.8Pulsed Field Gel Electrophoresis(PFGE)
2.2.9Isolation von Lymphozyten
2.2.10Aufarbeitung von DNA aus Vollblut und Gewebe
2.2.11Die Polymerasekettenreaktion (PCR)
2.2.12Durchführung der Polymerasekettenreaktion
2.2.13Agarosegelelektrophorese
2.2.14Analyse des Gels
2.2.15Klonierung und Sequenzierung der Fragmente
2.2.16DNA Analyse
2.2.17CAA(Chloracetaldehyd)
3 Resultate
3.1Zyklenanzahl
3.2DNA Konzentration
3.3DNA Isolierungsmethode
3.4Mischung von humaner mit humaner DNA und humaner mit bakterieller DNA.
3.5Mg+2 -, Primer - und KCl Konzentrationen
3.6PCR Additiva
3.7Heisser Start (Hot Start)
3.8PAD
3.9Denaturierungstemperatur und Übergang zur Anlagerungstemperatur
3.10Anlagerungstemperatur
3.11Rampe
3.12Extensionszeiten
3.13Programmveränderungen
3.14Enzyme
3.15PCR Maschinen
3.16Visualierungsmöglichkeiten der DNA
3.17Dynamin
4 Diskussion
4.1Zyklen
4.2DNA Konzentration
4.3DNA Isolierungsmethoden
4.4Mg+2 -, Primer - und KCl Konzentrationen
4.5Denaturierung
4.6Anlagerungstemperatur/zeiten
4.7Rampe
4.8Extensionszeiten
4.9Enzyme
4.10PCR Maschine
4.11PAD, Heisser Start, PCR Additiva, Visualisierungsmöglichkeiten der DNA, PCR Programmveränderungen
4.12Primer
4.13Dynamin
5 Zusammenfassung
6 Ausblick
Selbständigkeitserklärung
Bibliographie LITERATUR

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1
Tabelle 2:

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: DNA Mutationen wie Insertionen, Deletionen, Inversionen, Einzelbasensubstitutionen können das RAPD Produktprofil beeinflussen.
Abb. 2: N und T stehen für die entsprechende RAPD Produkte von DNA aus gesundem und Tumorgewebe. Quantitative Unterschiede machen sich als Intensitätsveränderungen bemerkbar, während qualitative als Positionsveränderungen der Fragmente auf den Gelen zu verstehen sind.
Abb. 3: Photo A zeigt die Variierung der Taq DNA Polymerase Konzentration. Reihen 1-8: 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 5, 7,5 und 10U. Bei 5, 7,5 und 10U entwickelte sich massiver Schmier.
Abb. 4: Die Reihen 1-9 zeigen die Variation der DNA Konzentration (Lösung A). Sie entsprechen 0,01 ng, 01 ng, 1 ng, 50 ng, 100 ng, 500 ng, 1 µg, 3 µg und 5 µg. Der Pfeil markiert eine Bande ca. 450 bp die bei 1 µg, 3 µg und 5µg sichtbar wurde. Muster die mit 50 ng, 100 ng und 500 ng produziert wurden, waren identisch. Die Reihen 10-19 zeigen Muster die mit DNA der Lösungen A und B abwechselnd produziert wurden. Die Reihen 10 und 11 entsprechen 1ng, 12 und 13 entsprechen 100 ng, 14 und 15 entsprechen 1 µg, 16 und 17 entsprechen 3µg, 18 und 19 entsprechen 5 µg. Das Photo zeigt, dass bei höheren Konzentrationen (3 µg und 5 µg) die von der Lösung B produzierten Muster schneller an Intensität abnahmen.
Abb. 5: Mischung der DNA zweier Personen, A und B(in dieser Reihenfolge in ng angegeben): (1)80 von A, (2)75 und 5, (3)70 und 10, (4)40 und 20, (5)40 und 40, (6)20 und 60, (7)10 und 70, (8)5 und 75, (9)80 von B. Die beiden Pfeile weisen auf die Banden deren Intensität ab- und zunimmt.
Abb. 6: Mischung menschlicher und bakterieller(Neisseria meningitidis) DNA (in dieser Reihenfolge in ng angegeben): (1)80, (2)80 und 0,02, (3)80 und 0,2, (4)80 und 2, (5)80 und 10, (6)80 und 20, (7)80 und 60, (8)80 und 100, (9)80 und 200, (10)200, Marker, (12)20 und 60, (13)40 und 40, (14)60 und 20. In der (5) werden zum ersten mal 3 Banden intensiver, die charakteristisch für die bakterielle DNA sind: eine ca. 3000bp, eine ca. 2400bp und eine ca. 1600bp.
Abb. 7: Auf dem Photo A wird auf den Reihen 1-4 die Variation der Deoxyribonukleotidkonzentrationen: 0,1 mM, 0,2 mM, 0,3 mM und 0,4 mM demonstriert. Die Reihen 5-8 zeigen eine Variation der Konzentration beider Primer: 0,25 µM, 0,5 µM, 0,75 µM und 1 µM respective.
Abb. 8: Photo A zeigt die Variierung der Denaturierungstemperaturen. Die Reihen 1-10 entsprechen 98, 96, 94, 92, 90, 88, 86, 84, 82 und 80 °C. Der Pfeill zeigt die auf eine ca. 1,2 kb Bande, dessen Presenz erst einheitlich war als die Denaturierung bei höheren Temperaturen (96 °C) stattfand oder als sie verlängert wurde. (60 Sek. und 90 Sek. anstatt 45 Sek., wie im Photo B gezeigt wird).
Abb. 9: Die ersten 6 Reihen zeigen Muster die bei einer Anlagerungstemperatur von 35°C produziert wurden und die nächsten 6 bei einer Anlagerungstemperatur von 43°C. Es wurden immer Programme benutzt mit dem schnellsten Übergang zwischen Anlagerungs- und Extensionstemperatur. Die Reihen 1 und 7 zeigen Fragmente, die mit einer Anlagerungszeit von 1 Minute produziert wurden, die 2 und 8 mit 3 Minuten, die 3 und 9 mit 5 Minuten, die 4 und 10 mit 7 Minuten, 5 und 11 mit 9 Minuten, 6 und 12 mit 11 Minuten.
Abb. 10: Photo A zeigt die Variation der Rampendauer. Die Reihen 1-7 entsprechen 0, 1, 3, 5, 7, 9 und 11 Minuten Rampen. Eine Rampenzeit von 7 Minuten war ausreichend.
Abb. 11: Photo A zeigt die Variation der Extensionszeit. Die Muster der Reihen 1-6 wurden bei 35°C produziert, während die der Reihen 7-12 bei 43°C. Die Reihen 1-6 und 7-12 entsprechen 0, 1, 2, 3, 4, und 5 Minuten Extensionszeit. Interessanterweise vermehrte sich der Schmier je länger die Extensionszeit wurde. Die Produktmenge der Reihen 5, 6, 11 und 12 nahm auch zu.
Abb. 12: Bild 1: Enzyme: Amplifikationen in folgende Reihenfolge mit 2,5U Enzym: Invitaq, Invitaq mit Trehalose (finale Konzentration von 10%), Combipol, Combipol mit Trehalose (finale Konzentration von 10%), Appligene Oncor, Super Taq Plus, Takara Taq, Takara Ex Taq, Takara LA Taq, Qiagen Taq, Qiagen Taq mit Q-Lösung ohne Mg+2 , Qiagen Taq mit der Q-Lösung und Mg+2 , Gibco Taq mit Betaine (finale Konzentration von 3M).
Bild 2: Amplifikationen in folgende Reihenfolge mit 2,5U Enzym: Goldstar, Dap, Pwo, Vent, Vent mit DMSO(finale Konzentration von 5%), Vent exo-, Deep Vent, Deep Vent exo-.
Bild 3: Amplifikationen in folgende Reihenfolge mit 2,5U: Gibco Taq, Stratagene Taq, Stratagene Taq Plus, Stratagene Taq mit Extender, Stratagene Pfu, USB Taq, USB Tth und USB Hot Tub.
Bild 4:Amplifikationen in folgende Reihenfolge mit 2,5U Enzym: Gibco Taq, Promega Taq, Perkin Elmer Amplitaq, Stoffel Fragment, MBI Fermentas Taq, MBI Frementas Tth, Pharmacia Taq, Boehringer Mannheim Taq, Boehringer Mannheim Tth und Boehringer Mannheim Expand High Fidelity.
Abb. 13: Amplifikation mit dem Stoffel Fragment: (1) 2,5U bei 2mM Mg+2 und 11Sek./°C (2) 2,5U bei 4mM Mg+2 und 11Sek./°C, (3) bis (5): 2,5U bei 4mM Mg+2 und entsprechenden Rampen von 16 Sek./°C, 24 Sek./°C, 32 Sek./°C, (6) wie (1) aber mit Denaturierung bei 98°C, (7) wie (1) aber mit eine Extensionszeit von 5 Min., (8) 2,5U Gibco Taq bei 4mM Mg+2 und eine Rampe von 11 Sek./°C..
Abb. 14: Von (1) bis (12): Amplifikation mit (1) 12,5 U Klentaq bei 8mM Mg+2 , (2) 2,5 U Invitaq bei 4mM Mg+2 , (3),(4),(5),(6) Klentaq und Invitaq mit entsprechenden Einheitenanalogien 10:1, 5:1, 2,5:1, 2,5:1 und jeweils 10U, 10U, 10U und 6,25U Klentaq bei 8mM Mg+2 , (7),(8),(9),(10),(11),(12) Klentaq und Combipol mit entsprechenden Einheitenanalogien 20:1, 5:1, 2,5:1, 2,5:1, 2,5:1, 2,5:1 und jeweils 10U, 10U, 10U, 8U, 8U und 6,25U Klentaq bei 8mM Mg+2 . In der (11) wurde zusätzlich Trehalose (finale Konzentration 10%) benutzt.
Abb. 15: Die RAPD Profile der ersten 6 Reihen wurden ohne Rampe, während die folgenden 6 Reihen mit Rampe produziert wurden. Die Muster 1 und 8 wurden mit der Appligene, die 2 und 9 mit der Pharmacia, die 3 und 10 mit der Biometra, die 4 und 11 mit der MJR, die 5 und 12 mit der Landgraf und die 6,7,13 und 17mit der Perkin Elmer PCR-Maschine produziert. Die 6 und 13 wurden mit den 200 µl Perkin Elmer Hütchen produziert, während die 7 und 14 mit den 500 µl Eppendorf Hütchen.
Abb. 16: Amplifikation von sechs Tumorgewebe- und Leukozyten-DNA-Paaren mit den STARK und TELO3 Primer. Sichtbar sind drei Unterschide mit einem Molekulargewicht von 500, 700 und 1000bp.
Abb. 17: Die Hybridisierung ergab zwei Banden für jede Probe. Die Banden aus dem Tumorgewebe zeichnen sich durch eine höhere Intensität aus, was für eine Amplifikation der entsprechenden Sequenzen spricht. Die obere Bande entspricht dem 700bp langem Fragment, die untere dem 500bp langem Fragment.
Abb. 18: Die gestrichelte Linie repräsentiert die de facto Temperatur des PCR Reaktionsvolumens im Appligene Thermocycler während die durchgehende, die nominalle. In diesem Diagramm wird eine PCR ohne Rampe analysiert.

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HTML - Version erstellt am:
Wed Sep 5 16:50:29 2001