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4  Experimenteller Teil

4.1 Materialien und Geräte

4.1.1 Chemikalien

4-Acetamidobenzoesäure:

Lancaster Synthesis GmbH, Mülheim

Acetonitril:

HPLC ultra gradient grate; Mallinckrodt Baker,

Griesheim

 

Acetyl-Coenzym A:

Universitätsklinikum medizinische Fakultät der Humboldt-Universität zu Berlin

Acetyl-CoA-regenerierendes System:

Siehe Acetyl-Coenzym A

4-Aminophenol:

z.A.; Merck KGaA, Darmstadt

4-Aminosalicylsäure:

Lancaster Synthesis GmbH, Mülheim

Diphenylamin:

Riedel-de Haën Laboratory Chemicals, Seelze

EDTA:

Riedel-de Haën Laboratory Chemicals, Seelze

Eisen(II)sulfat:

z.A.; Riedel-de Haën Laboratory Chemicals, Seelze

Eisen(III)sulfat:

z.A.; Riedel-de Haën Laboratory Chemicals, Seelze

Glycin:

p.A.; Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim

Hämolysat:

Siehe Acetyl-Coenzym A

Kaliumchlorid:

z.A., Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim

Kaliumdichromat:

reinst, Laborchemie Apolda

Kaliumoxalat:

Lancaster Synthesis GmbH, Mülheim

Methanol:

HPLC ultra gradient grade; Mallinckrodt Baker, Griesheim

Lichrosolv; Merck KGaA, Darmstadt

1,10-Phenanthrolin:

z.A.; Ferak Laborat GmbH, Buchs

Natriumacetat:

rein; Ferak Laborat GmbH, Buchs

Natriumdihydrogenphosphat:

z.A.; Merck KgaA, Darmstadt

Natriummonohydrogenphosphat:

z.A.; Laborchemie GmbH, Apolda

Perchlorsäure:

z.A.; Riedel-de Haën Laboratory Chemicals, Seelze

Salicylsäure:

Caelo und Lorentz GmbH, Hilden

Salzsäure:

30% z.A.; Merck KGaA, Darmstadt

Schwefelsäure:

95-98% reinst; Merck KGaA, Darmstadt

Silberchlorid:

rein; Feinchemie GmbH, Sebitz

Wasser:

Reinstwasseranlage


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4.1.2  Untersuchte UV-Filter

Tabelle 39 : Untersuchte UV-Filter inkl. INCI (International Nomenclature of Cosmetic Ingredients) - Bezeichnung, Handelsname und Hersteller

Chemischer Lichtschutzfilter

INCI - Bezeichnung

Handelsname und Hersteller

4-Aminobenzoesäure

PABA

PABA
(Merck)

4-Bis(polyethoxy)amino­benzoe­säure-poly­ethoxy­ethyl­ester

PEG­ 25-­PABA­ethyl­ester

Uvinul P25
(BASF)

1-(4-tert.-Butylphenyl)-3-(4-methoxy­phenyl)propan-1,3-dion

Butyl-methoxy-dibenzoyl-methan

Eusolex 9020
(Merck)

2-Cyan-3,3-diphenyl-acrylsäure-2-ethyl-hexylester(Octocrilen)

Octocrylene

Uvinul N539
(BASF)

2-Hydroxy-4-methoxy-benzophenon (Oxybenzonum)

Benzophenone-3

Eusolex 4360
(Merck)

2-Hydroxy-4-methoxybenzophenon-5-sulfonsäure (Sulisobenzonum)

Benzophenone-4

Uvinul MS-40
(BASF)

3-(4‘-Methyl)benzyliden-bornan-2-on

Methyl-benzylidene-Camphor

Eusolex 6300
(Merck)

4-Methoxy-zimtsäure-2-ethyl-hexylester

Octyl-methoxy-cinnamate

Eusolex 2292
(Merck)

2-Phenylbenzimidazol-5-sulfonsäure

Phenyl-benzimidazole Sulphonic Acid

Eusolex 232
(Merck)

3,3,5-Trimethyl-cyclohexyl-salicylat (Homosalatum)

Homosalate

Homomenthyl-salicylat (Merck)


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4.1.3  Geräte und Arbeitsbedingungen

4.1.3.1 Photochemische Durchfluß-Reaktoren

A) Beam Boost, Firma ICT, Frankfurt

Reaktionsschleifen:

IC89501-1 Standardreaktionsschleife; Länge l = 5 m ; Innendurchmesser ID = 0,3 mm

IC89501-2 Standardreaktionsschleife; Länge l = 5 m ; Innendurchmesser ID = 0,3 mm

IC89501-3 Standardreaktionsschleife; Länge l = 5 m ; Innendurchmesser ID = 0,3 mm

IC89601 Hochdruck-Reaktionsschleife; Länge l = 5 m ; Innendurchmesser ID = 0,3 mm

Strahler:

IC89511 254 nm UV-Lampe

IC89512 366 nm UV-Lampe

B) Eigene Konstruktion

Aluminiumröhre: Durchmesser d = 12 cm mit zwei Durchlaß-Öffnungen

Kunsstoffaufsätze: Baumarkt

Ventilator: Papst-Motoren Typ 4650 N Durchmesser d = 12 cm

Thermofühler: Digital-Präzisions-Taschenthermometer, GTH175/MO, Conrad Electronics

Reaktionsschleifen:

Die Reaktionsschleifen wurden mittels einer Häkelnadel aus PTFE und ETFE (Ethyltetrafluorethylen)-Schläuchen in „Festen Maschen“ gehäkelt:

PTFE (Upchurch Scientific; ID = 0,010“ (0,254 mm); Länge l variabel)

ETFE (Upchurch Scientific; ID = 0,010“ (0,254 mm); Länge l variabel).8

Die Reaktionsschleifen aus Quarz wurden mittels eines Trägersystems positioniert:

Strahler:

Eingesetzt wurden sowohl Quecksilber-Niederdruckstrahler (UV-C, UV-B, UV-A) als auch Hochdruckstrahler.


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Tabelle 40: Technische Daten der verwendeten Strahler

Lampentyp

Herstellerbezeichnung

Haupt-emission

Leistung

Länge

Durch-messer

UV-C-Strahler

Philips TUV 8W (G8 T 5)

253,7 nm

8 W

29 cm

16 mm

UV-B-Strahler

Philips TL 4W/12

280-350 nm

4 W

14 cm

16 mm

UV-A-Strahler

Philips TL 8W/05

320-480 nm

8 W

29 cm

16 mm

Hg-Hochdruck-strahler

Philips HPK 125 W BA 15 D Typ 57203 B100

UV-vis

125 W

3 cm

1.5 cm

4.1.3.2 UV-Spektroskopie

Shimadzu Spectrophotometer UV-2101-PC, inkl. Thermostat

4.1.3.3 Hochdruckflüssigkeitschromatographie

1. Merck Hitachi - HPLC Anlage A

D-7000 HPLC System Manager

L-6200 A Intelligent Pump

D-6000 Interface

L-4500 Diode-Array Detector

Merck Licrospher 100 RP-18 Säule

Perkin Elmer LS 50 B Luminescence Spectrometer

Supelco Rheodyne 7125 mit 20 µL Injektionsschleife

2. HPLC-Anlage B

Bischoff HPLC-Pumpe

Supelco Rheodyne 8125, Injektionsvolumen 5 und 20 µL

Merck Licrospher 100 RP-18 Säule

Detektoren:

(In der Regel erfolgte nach der UV-Detektion die amperometrische Detektion, Ausnahmen sind bei den folgenden Versuchsbeschreibungen angegeben.)


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Datenaufnahme durch KDAC 500/I Data Aquisition and Control Software; Keithley Instruments, Inc.

Auswertung der Daten:

4.2 Bestimmung der Bestrahlungszeiten

Geräteparameter: HPLC-Anlage B

Probe: Aktinometer-Lösung (4 10-3 mol/L)

Die praktische Ermittlung der Bestrahlungszeiten erfolgte durch Injektion einer Aktinometer-Lösung in das FIA-System mit und ohne Integration der Reaktionsschleifen. Ausgewertet wurden die durch elektronische Datenaufnahme unter Variation verschie­dener Parameter ermittelten Peakprofile der UVD (Detektionswellenlänge λ = 300 nm).Die Arbeiten wurden unter Rotlicht durchgeführt. Die anschließende Auswertung erfolgte durch Anwendung der Keithley Software (s.o.) mittels eines Basic-Programms, wobei die Peakhöhe h, die Peakfläche A, sowie die Zeit, die dem Peakmaximum entspricht, T max bestimmt wurden.

Für weitere Berechnungen nach Methode 2 (vgl. Kapitel 3.2.2.1.) und die graphische Darstellung der Peakprofile erfolgte Datentransfer zu microsoft excel. Die lineare Regressionsanalyse erfolgte mittels ORIGIN windows microcalTM software.

Bei der Bestimmung der Bestrahlungszeiten richten sich die Angaben des Innen­durch­messers nach denen der Herstellerangaben, die Längen der Schläuche wurde selbst festgesetzt. Die Reaktionskapillaren wurden um 4 cm der angegebenen Länge verlängert. Diese Enden (jeweils 2 cm am Anfang und Ende der Kapillare) dienten der einfacheren Integration in das HPLC-System mittels Kupplungsstücken und wurden bei den Versu­chen zur Bestrahlung durch Abkleben intransparent gemacht. Weiterhin wurde die Bestimmung von T 0 nach Integration einer 4 cm langen Kapillare durchgeführt, um beide relevanten Kupplungsstücke zu integrieren (siehe auch Kapitel 3.2.2.1.).

4.2.1 Bestimmung der Verweilzeiten im System ohne Kapillaren

Durch Injektion (n = 6) der Aktinometer-Lösung in das FIA-System ohne Integration der Reaktionsschleifen wurden die Verweilzeiten T 0 an drei Tagen bei verschiedenen [Seite 150↓]Flußraten (F = 0,2; 0,4; 0,7; 1,0; 1,5 mL/min) ermittelt. Die Bestimmung erfolgte nach der Integration eines 4 cm langen Stücks Kapillare (siehe Kapitel 3.2.2.1.).

4.2.2 Bestimmung der Dispersionskoeffizienten durch das Einführen von Windungen

Die Bestimmung erfolgte nach Integration der selbst gefertigten Reaktionsschleifen (ID = 0,254 mm, l = 1, 5 und 15 m) und der handelsüblichen Reaktionsschleife (ID = 0,254 mm, l = 5 m) nach und vor dem Häkeln; (n = 6). Die nicht gehäkelten Kapillaren wurden nach der Hälfte der Länge die Kapillaren gewunden, so daß diese als lockere Schleife in das System integriert wurden.

4.2.3 Bestimmung der Verweilzeiten im Gesamtsystem

Die Verweilzeiten in selbst gefertigten Kapillaren aus PTFE und ETFE (ID = 0,254 mm) mit unterschiedlichen Längen (l = 1,04; 1,54; 2,04; 2,54; 3,04 m) wurden bei verschiedenen Fließgeschwindigkeiten (F = 0,2; 0,5 und 1,0 mL/min) bestimmt; (n = 4). Die Auswertung erfolgte mittels linearer Regression.

Die Anwendung der verschiedenen Auswertemethoden (siehe Kapitel 3.2.2.1.) erfolgte anhand der ermittelten Peakprofile nach Integration einer selbst gefertigten ETFE-Kapillare (Länge l = 1,04 m, Innen­durchmesser ID = 0,254 mm) unter Variation der Flußrate (F = 0,2; 0,4; 0,7; 1,0 und 1,5 mL/min); (n = 6).

4.2.4 Einfluß des Unterbrechens der Pumpentätigkeit auf die Peakform

Die Peakformen der Signale nach Passieren einer selbst gefertigten ETFE-Kapillare
(l = 5 m, ID = 0,254 mm) unter Unterbrechung der Pumpentätigkeit nach 15 s für 10 s,
1 min, 10 min, 50 min, 60 min, 120 min 180 min bei einer Fließgeschwindigkeit von
F = 0,5 [Seite 151↓]mL/min wurden durch Übereinanderlegen der erhaltenen Signale und Bestimmung der Flächen und Peakhöhen ausgewertet.

4.2.5 Einfluß der Temperatur

Die Peakformen der Signale nach Passieren einer selbst gefertigten ETFE-Kapillare
(l = 2 m, ID = 0,254 mm) und Erwärmen der Reaktionsschleife in einem Wasserbad
(Temperatur: 20, 30, 40, 50, 60 und 70 °C ) bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,5 mL/min wurden durch Übereinanderlegen der erhaltenen Signale und Bestimmung der Flächen und Peakhöhen ausgewertet.

4.2.6 Vergleich der eingesetzten Reaktionsschleifen

Die Bestrahlungszeiten 16 verschiedener selbst gefertigter oder käuflich erworbener Reaktionskapillaren wurden bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,2 mL/min thoretisch berechnet und praktisch bestimmt; (n = 4).


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4.3  Aktinometrische Bestimmung von Strahlungsintensitäten

Die aktinometrischen Bestimmungen erfolgten nach Hatchard und Parker [26], modifiziert nach Murov [29].

4.3.1 Lösungen

  1. o-Phenanthrolin-Lösung: 0,2 g 1,10-Phenanthrolin wurden in 100 mL Wasser gelöst
  2. Pufferlösung: 82 g NaOAc·3 H20 und 10 mL konz. H2SO4 wurden zu 1,0 L mit Wasser aufgefüllt
  3. Fe2(SO4)3-Lösung: 100 g Fe2(SO4)3 . nH2O und 55 mL konz. H2SO4 wurden zu 1,0 L mit Wasser aufgefüllt
  4. EDTA-Lösung: 0,1 mol/L EDTA (Ampulle)
  5. K2C2O4-Lösung: 1,2 mol/L K2C2O4
  6. FeSO4-Lösung: 0,08 mol/L FeSO4-Lösung in 0,05 mol/L H2SO4
  7. K2Cr2O7-Lösung: 0,016 mol/L K2Cr2O7
  8. Diphenylamin-Lösung: 1 % Diphenylamin in konz. H2SO4

4.3.2 Bestimmung des Absorptionskoeffizienten des o-Phenanthrolinkomplexes

Die FeSO4-Lösung wurde mit der K2Cr2O7-Lösung nach Zugabe von Diphenylaminlösung eingestellt und zu 4 10-4 mol/L verdünnt. Jeweils 0; 1,0; 3,0; 5,0; 7,0; 9,0 mL der Lösung wurden in 25 mL Kolben gegeben und mit 0,05 mol/L H2SO4 auf ungefähr 12,5 mL aufgefüllt. Nach Zugabe von 2 mL 0,2 % 1,10-Phenanthrolinlösung und Auffüllen der Kolben mit Pufferlösung wurde die Absorption bei 510 nm gemessen. Nach Durchführung einer linearen Regression wurde aus der Steigung der Geraden der Absorptionskoeffizient ermittelt.


[Seite 153↓]

4.3.3  Vorbereitung der Aktinometerlösung

Die Fe2(SO4)3-Lösung wurde mit der EDTA-Lösung in Glycin-gepufferter Lösung
(0,3 g/ 100 mL Lösung, pH = 3-4) mit Salicylsäure (0,2g/ 100 mL Lösung) als Indikator eingestellt.

Bei Bedarf wurden 5,0 (bzw. 50,0 ) mL der Fe2(SO4)3-Lösung und 5,0 (bzw. 50,0 ) mL der K2C2O4-Lösung zu 100,0 mL aufgefüllt.

4.3.4 Intensitätsmessungen

4.3.4.1 Stationäre Bestrahlung

Die Bestrahlung von 2,0 mL Aktinometer-Lösung (0,02 mol/L) erfolgte in Quarzküvetten
(1 cm Schichtdicke) für 5, 8, 10, 20, 25 s (UV-C-Strahler) und 10, 20, 25, 30, 40 s (UV-B und UV-A-Strahler). 1 mL der bestrahlten Lösung wurde mit 2 mL o-Phenanthrolin-Lösung und 2 ml Puffer-Lösung versetzt, mit Wasser zu 10,0 mL aufgefüllt und die Absorption bei 510 nm bestimmt. Als Vergleich diente eine entsprechende nicht bestrahlte Lösung.

4.3.4.2 Bestrahlung im Durchfluß

Geräteparameter: HPLC-Anlage B (Kapitel 2.1.3.3.)

Probe: Aktinometer-Lösung (2 10-2 mol/L)

Versuchsdurchführung:

Eine 0,02 molare Aktinometer-Lösung wurde entsprechend der späteren Proben in das Durchfluß-System injiziert und nach Passage des photochemischen Reaktors in einem
2,0 mL Kolben aufgefangen. Die Arbeiten wurden unter Rotlicht durchgeführt. Anschließend erfolgte nach Zugabe von 500 µL o-Phenanthrolin-Lösung und 500 µL Puffer-Lösung und Auffüllen des Kolbens die Bestimmung der Absorption bei 510 nm. Der Nullabgleich erfolgte gegen eine entsprechend den oben angegebenen Bedingungen durchgeführte Probe ohne Bestrahlung. Folgende Parameter wurden variiert:

  1. Das Einstrahlungsspektrum: Soweit keine anderen Angaben erfolgen wurden alle nachfolgenden Experimente mit den drei Hg-Nieder­druckstrahlern mit Emissionsbereichen im UV-B, UV-A und UV-C durchgeführt (Nutz-Brenndauer der Strahler < 500 h).[Seite 154↓]
  2. Die Fließgeschwindigkeit: Die Bestrahlung erfolgte unter Einsatz der Kühlung in gehäkelten Kapillaren aus PTFE und ETFE (l = 1,0 m, ID = 0,254 mm) bei 0,7; 0,8; 1,0; 1,5 und 2,0 mL/min (UV-C-Strahler) und 0,3; 0,4; 0,5; 0,7 und 1,0 mL/min (UV-A-Strahler und UV-B-Strahler); (n = 4). Für alle nachfolgenden Versuche betrug die Flußrate 2,0 mL/min für den UV-C-Strahler und 1,0 mL/min für den UV-A-Strahler und UV-B-Strahler, soweit nicht anders angegeben.
  3. Die Kapillarlänge: Die Bestrahlung erfolgte unter Einsatz der Kühlung in gehäkelten Kapillaren aus PTFE und ETFE (ID = 0,254 mm) mit 1; 1,5; 2; 2,5; 3 m Länge. Für alle folgenden Versuche wurden Kapillaren mit 1 m Länge verwendet; (n = 4).
  4. Der Einsatz von Reflektormaterialien: Eingesetzt wurden unter Einsatz des Ventilators der photochemische Reaktor, eine aus Aluminiumfolie gefertigte Röhre mit 5 cm Durchmesser und eine aus schwarzer Pappe gefertigte Röhre mit 10 cm Durchmesser; (n = 6).
  5. Das Material der Reaktionsschleifen: Der Vergleich zwischen Quarz, PTFE und ETFE erfolgte mit Kühlung durch Einsatz kurzer, nicht gewickelter Reaktionskapillaren (l = 12 cm), die durch ein Trägersystem in einem Abstand von 0,8 cm längs des eingesetzten Strahlers positioniert wurden bei einer Flußrate von 0,15 mL/min; (n = 6).
  6. Die Lebensdauer der Lampen: Vergleichende Untersuchungen zwischen drei UV-C-Niederdruckstrahlern, die unterschiedliche Arbeitsstunden
    (100 h, 300 h, > 1500 h) in Betrieb waren, in einer ETFE-Kapillare ohne Kühlung durchgeführt; (n = 6).
  7. Die Windungen der Kapillare: Kapillaren aus ETFE (l = 1 m; ID = 0,254 mm) wurden um das Trägersystem gewickelt (in eine Richtung) oder als gehäkelte Reaktionskapillare eingesetzt. Der Abstand zur Lampe betrug 0,8 cm. Die Flußrate betrug 0,5 mL/min.
  8. Der photochemische Reaktor: Eingesetzt wurden der konstruierte photochemische Reaktor und das handelsübliche Gerät "Beam Boost" der Firma ICT. Die Bestrahlung erfolgte in ETFE-Kapillaren mit dem UV-C und UV-A-Strahler; (n = 6).[Seite 155↓]
  9. Die Temperatur: Die nachfolgenden Versuche wurden sowohl mit (20 - 23°C) als auch ohne Kühlung (45 - 50°C) durchgeführt.
  10. Die Einbrenndauer der Lampe: Vor den durchgeführten Versuchen wurde die Aktinometer-Lösung direkt nach dem Einschalten der Strahlungsquelle und weitergehend alle 5 min (bis 60 min) injiziert. Nach 8 h Einbrenndauer erfolgten wiederum 6 Injektionen in 5 minütigen Abständen. Die Bestrahlung erfolgte mit dem UV-A, UV-B und UV-C-Strahler in gehäkelten Reaktionsschleifen (ETFE und PTFE, l = 1 m, ID = 0,254 mm) sowohl mit als auch ohne Kühlung.

4.3.4.3 Abschätzung der Einstrahlintensität

Probe: Aktinometer-Lösung (0,2 mol/L und 10-5 mol/L)

  1. Bestimmung des Absorptionskoeffizienten der Aktinometer-Lösung:
    Die Bestimmung des Absorptionskoeffizienten bei 254 nm erfolgte mit Aktinometer-Lösungen der Konzentrationen c = 4×10-5; 5×10-5; 6×10-5 und 7×10-5 mol/L. Die Bestimmungen des Absorptionskoeffizienten bei 311 nm erfolgte mit Aktinometer-Lösungen der Konzentrationen c = 5×10-5; 1×10 -4; 1,5×10-4 und 3×10-4 mol/L. Die Bestimmungen des Absorptionskoeffizienten bei 366 nm mit den Konzentrationen c = 2×10-4; 4×10-4; 6×10-4 und 8×10-4 mol/L.Nach dem Durchführen einer linearen Regression wurde aus der Steigung der Geraden der Absorptionskoeffizient ermittelt.
  2. Hoher Konzentrationsbereich: "Totalabsorption"
    Geräteparameter: HPLC-Anlage B ohne UV-Detektor
    Eine Aktinometer-Lösung (0,2 mol/L) wurde ohne und mit Einsatz der Kühlung in einer Reaktionskapillare bestrahlt. Als Reaktionskapillaren wurden 4,5 cm lange Schläuche aus PTFE, ETFE und Quarz verwendet. Die Lösung wurde mit und ohne Einsatz der Kühlung bei einer Flußrate von 1,0 mL/min injiziert. Nach 3 s wurde die Pumpentätigkeit für 10, 20, 30, 40 und 50 s (UV-C-Strahler) bzw. 20, 40, 60, 80, 100 und 120 s (UV-B-Strahler) unterbrochen (n = 3). Nach dem Durchfließen und Auffangen des Eluats in einem Maßkolben (2 mL) erfolgte nach Zugabe von 500 µL o-Phenanthrolin-Lösung und 500 µL Puffer-Lösung das Auffüllen des Kolbens und die Bestimmung der Absorption bei 510 nm. Die Auswertung erfolgte nach Auftragen der Absorption gegen die Belichtungszeit mittels linearer Regression.[Seite 156↓]
  3. Niedriger Konzentrationsbereich
    Geräteparameter: HPLC-Anlage B mit UV-Detektor
    Eine Aktinometer-Lösung (10-5 mol/L) wurde unter Einsatz der Kühlung bestrahlt. Die Bestrahlung erfolgte in 1m langen gewickelten Schläuche aus PTFE und ETFE (n = 3). Die Flußraten betrugen 2,5; 2,0; 1,0; 0,5 und 0,25 mL/min für die UV-C-Bestrahlung und 1; 0,5; 0,25; 0,2 und 0,1 mL/min für die UV-A- und UV-B-Bestrahlung. Anschließend erfolgte die Detektion bei 300 nm.


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4.4  Untersuchungen zur Photostabilität von UV-Filtern

4.4.1 UV-Spektren

Die Aufnahme der UV-Spektren der UV-Filter erfolgte mittels des Shimadzu Spectro­photometer UV-2101-PC im für das Screening relevanten Fließmittel (siehe Kapitel 4.4.2.) bei pH = 5,5. Die Konzentration der Lösungen betrug 0,1 g/L; bzw. 1,0 g/L für 4-Bis­(poly­ethoxy)­amino­benzoe­säure-poly­ethoxy­ethyl­ester (PEG-PABA). Durch den Einsatz eines Thermostaten wurde die Temperatur allmählich bis auf 70 °C gesteigert.

Zudem erfolgte eine Aufnahme in HCl (0,1 mol/L) bzw. NaOH (0,1 mol/L) für wasser­lösliche UV-Filter, während für nicht wasserlösliche UV-Filter Methanol/ HCl (0,1 mol/L) bzw. NaOH (0,1 mol/L) (90:10 v/v) eingesetzt wurde.

UV-Spektren der 4-Aminobenzoesäure (PABA) wurden zusätzlich in folgenden Lösungsmitteln aufge­nommen (c = 0,1 mg/L):

Lösungen:

Perchlorsäure-Lösung p H = 2,5:

Perchlorsäure-Lösung R (EAB) wurde tropfenweise zu 1000 mL Wasser gegeben und damit der pH-Wert auf 2,5 eingestellt.


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Acetat-Pufferlösung p H = 5,5:

Pufferlösung pH 5,5 (EAB) wurde 1:1000 verdünnt und der pH-Wert mittels Glaselektrode überprüft.

Acetat-Pufferlösung p H = 3,7:

Pufferlösung pH 3,7 (EAB) wurde 1:1000 verdünnt und der pH-Wert mittels Glaselektrode überprüft.

Acetat-Lösung p H = 7,0:

30,0 mg Natriumacetat R wurden in 1000 mL gelöst und der pH-Wert mittels Glaselektrode überprüft.

Phosphat-Pufferlösung p H = 7,0:

Phosphat-Pufferlösung pH 7,0 R 1 wurde 1:100 verdünnt und der pH-Wert mittels Glaselektrode überprüft.

4.4.2 Fließinjektionsanalyse

Geräteparameter: HPLC-Anlage B (Kapitel 4.1.3.3.) ohne Integration der Trennsäule

Durch Integration des konstruierten Photoreaktors in ein FIA-System mit anschließender UVD und ECD wurde ein Screening für die zehn ausgewählten UV-Filter durchgeführt.

Eingesetzt wurden der UV-C-, UV-B- und UV-A-Strahler (nach 30 min Einbrenndauer). Die UV-Detektion erfolgte bei zwei Wellenlängen, wobei eine davon die Wellenlänge des jeweiligen Absorptionsmaximums darstellte. Die ECD wurde bei einem Potential von
+1200 mV durchgeführt. Die Bestrahlung erfolgte in einer PTFE-Kapillare (l = 5 m,
ID = 0,294 mm9) bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 mL/min, wobei die Bestrahlungs­zeit durch Stoppen der Pumpe variiert wurde (T stop = 40; 80 und 120 s). Das Screening wurde mit Kühlung durchgeführt und die Temperatur durch einen Thermofühler kontrolliert. Als Fließ- und Lösungsmittel wurde Acetat-Pufferlösung pH = 5.5 eingesetzt, der durch eine Vakuumpumpe entgast wurde. Bei nicht wasserlöslichen UV-Filtern wurde Methanol (90%) zugesetzt. Alle Proben wurden vor Licht geschützt. Die Konzentration betrug 2,5 mg/L (Auftragsmasse: 50 ng) bzw. 25 mg/L für PEG-PABA.

Die Bestimmung der Peakflächen erfolgte:

Für 1-(4-tert.-Butylphenyl)-3-(4-methoxyphenyl)propan-1,3-dion wurde zusätzlich ein weiter­gehendes Screening der UVD bei vier Detektionswellenlängen, jeweils mit und ohne Einsatz der Kühlung, nach einer Bestrahlungszeit von 10 min durchgeführt.

Die Bestrahlung von 4-Acetamidobenzoesäure (PAABA) erfolgte in einer ETFE-Kapillare
(l = 5 m, ID = 0,254 mm) durch die UV-A und UV-C-Strahlungsquelle mit und ohne Einsatz des Ventilators, wobei das Arbeits­potential variiert wurde: + 0,6, + 0,8, + 1,0 und + 1,2 V (n = 4). c = 0,5 mg/L.

Für 4-Aminobenzoesäure (PABA) wurde die Versuchsdurchführung wie folgt erweitert:

Absorptionsdiagramm:

Zusätzlich wurde das Screening nach Integration eines zweiten UV-Detektors anstelle des amperometrischen Detektors durchgeführt. Die Detektionswellenlängen des ersten Detektors wurden variiert (λ = 270, 260 und 240 nm), die Detektionswellenlänge des zweiten Detektors blieb konstant bei λ = 280 nm. Die Bestrahlungszeiten wurden durch Unterbrechen der Pumpentätigkeit für 1 bis 10 min (in einminütigen Abständen) variiert
(n = 3).

Konzentration:

Zusätzlich wurden PABA-Lösungen unterschiedlicher Konzentration bestrahlt (1 mg/L, 10 mg/L, 100 mg/L). Die Bestrahlungszeiten wurden durch Unterbrechen der Pumpentätigkeit für 1 bis 10 min (in einminütigen Abständen) variiert (n = 3).

Amperometrische Detektion:

Das Arbeitspotential wurde variiert: von +0,6, +0,8, +1,0 und +1,2 V (n = 4) mit und ohne UV-C-Bestrahlung in einer ETFE-Kapillare (l = 5 m, ID = 0,254 mm); c = 0,5 mg/L.


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4.4.3  Hochdruckflüssigkeitschromatographie

Geräteparameter: HPLC Anlage B

Durch Integration des Photoreaktors in ein HPLC-System mit anschließender UVD und ECD wurde ein Screening für die ausgewählten UV-Filter durchgeführt. Die Detektion erfolgte bei zwei Wellenlängen (UVD), wobei eine die Wellenlänge des jeweiligen Absorptionsmaximums darstellte (vgl. Kapitel 4.4.2.). Die ECD erfolgte bei einem Potential von +1,2 V bzw. +1,0 V.

Geräteparameter: HPLC-Anlage A

Für PABA und 4-Acetamidobenzoesäure (PAABA) wurde zusätzlich die Merck-Hitachi HPLC-Anlage (HPLC-Anlage A) eingesetzt. Nach der Detektion durch den Diodenarray-Detektor erfolgte die Fluoreszenzdetektion.

Eingesetzt wurden der UV-C-, UV-B- und UV-A-Strahler, sowie der Hg-Hochdruckstrahler. Die Bestrahlung erfolgte im konstruierten Photoreaktor in einer ETFE-Kapillare (l = 5 m,
ID = 0,257 mm), wobei die Bestrahlungszeiten durch Stoppen der Pumpe bis zu 4 h
(T stop = 10 min, 60 min, 2 h, 4 h) variiert wurde. Das Screening wurde sowohl mit als auch ohne Kühlung durchgeführt und die Temperatur durch einen Thermofühler kontrolliert.

Als Fließ- und Lösungsmittel wurde Acetatpuffer pH = 5,5 eingesetzt, der durch eine Vakuumpumpe entgast wurde. Bei nicht wasserlöslichen UV-Filtern wurde Acetonitril oder Methanol zugesetzt (Fließ- und Lösungsmittel, siehe Tabelle 41). Alle Proben wurden vor Licht geschützt. Die Konzentration der UV-Filter-Lösungen waren 2,5 mg/L, gelöst im Fließmittel und hergestellt aus einer Stammlösung von 10 mg in 100 mL. Um die entstandenen Photoprodukte mit den zugehörigen UV-Spektren (PABA und PAABA) zu erhalten, wurden höhere Konzentrationen (0,1 g/L) eingesetzt.

Die Linearität im Konzentrationsbereich wurde anhand der Konzentrationen 1,25 mg/L; 2,5 mg/L und 0,25 mg/L durch Auftragen der Signale und der Empfindlichkeiten überprüft.

Die Bestimmung der Peakflächen erfolgte:

Tabelle 41: Screening im HPLC-System: Fließ- und Lösungsmittel des jeweiligen UV-Filters

Chemischer Lichtschutzfilter

Fließ- und Lösungsmittel (v/v)

4-Aminobenzoesäure

siehe Tabelle 42

4-Bis(polyethoxy)aminobenzoesäure-polyethoxyethylester

nicht durchgeführt:
siehe Kapitel 3.3.11.

1-(4-tert.-Butylphenyl)-3-(4-methoxyphenyl)propan-1,3-dion

Acetonitril/Acetat-Pufferlösung pH = 5,5 (90/10)

2-Cyan-3,3-diphenyl-acrylsäure(2-ethyl-hexylester)

Acetonitril/Acetat-Pufferlösung pH = 5,5 (90/10)

2-Hydroxy-4-methoxy-benzophenon (Oxybenzonum)

Acetonitril/Acetat-Pufferlösung pH = 5,5 (70/30)

2-Hydroxy-4-methoxybenzophenon-5-sulfonsäure (Sulisobenzonum)

Acetonitril/Acetat-Pufferlösung pH = 5,5 (10/90)

3-(4‘-Methyl)benzyliden-bornan-2-on

Acetonitril/Acetat-Pufferlösung pH = 5,5 (90/10)

4-Methoxy-zimtsäure-2-ethyl-hexylester

Methanol/ Acetat-Pufferlösung pH = 5,5 (75/25)
Methanol/ Acetat-Pufferlösung pH = 5,5 (70/30)

2-Phenylbenzimidazol-5-sulfonsäure

Acetonitril/Acetat-Pufferlösung pH = 5,5 (10/90)

3,3,5-Trimethyl-cyclohexyl-salicylat

Acetonitril/Acetat-Pufferlösung pH = 5,5 (90/10)

4-Acetamidobenzoesäure

Acetonitril/Acetat-Puffer-Lösung pH = 5,5 (90/10)
Acetonitril/Acetat-Puffer-Lösung pH = 3,7 (90/10)


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Für 4-Aminobenzoesäure (PABA) wurde die Versuchsdurchführung wie folgt erweitert:

Variation des Fließmittels und der Detektionswellenlänge:

Es wurden Fließmittel und Detektionswellenlängevariiert (analog Tabelle 29, Kapitel 4.3.5.2.1.)

Kinetik des photochemischen Abbaus:

Geräteparameter: HPLC-Anlage B mit UV-C und UV-B-Strahler

ETFE-Kapillare (l = 5 m, ID = 0,257 mm)

Flußrate: F = 0,5 mL/min

PABA-Lösung: c = 1,0 mg/L im Fließmittel

Fließ- und Lösungsmittel:

Tabelle 42 : Verwendete Fließ- bzw. Lösungsmittel zur kinetischen Analyse unter Angabe der jeweiligen Zeiten des Unterbrechens der Pumpentätigkeit

Fließ- und Lösungsmittel

UV-C

Stoppen der Pumpe T stop [s]

(n = 3)

UV-B

Stoppen der Pumpe T stop [s]

(n = 3)

Acetonitril/ Phosphat-Pufferlösung pH = 7,0 (10:90 v/v)

30, 60, 90, 120

30, 90, 480, 960, 1920

Acetonitril/ Acetat-Lösung
pH = 7,0 (10:90 v/v)

30, 60, 90, 120

30, 90, 480, 960, 1920

Methanol/ Acetat-Pufferlösung
pH = 5,5 (10:90 v/v)

30, 60, 90, 120

30, 90, 480, 960, 1920

Acetonitril/ Acetat-Pufferlösung
pH = 5,5 (10:90 v/v)

30, 60, 90, 120

30, 90, 480, 960, 1920

Acetonitril/ Acetat-Pufferlösung
pH = 3,7 (10:90 v/v)

120, 240, 360, 480

480, 960, 1440, 1920, 2880

Acetonitril/ Perchlorsäure-Lösung
pH = 2,5 (30:70 v/v)

120, 240, 360, 480

480, 180, 3600, 7200


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Variation der Aufgabemassen:

Aufgabemasse: 10 ng, 20 ng und 50 ng

Tabelle 43: Verwendete Fließ- bzw. Lösungsmittel zur Variation der Aufgabemassen unter Angabe der jeweiligen Zeiten des Unterbrechens der Pumpentätigkeit

Fließ- und Lösungsmittel

UV-C
Stoppen der Pumpe T stop [s]
(n = 3)

Acetonitril/ Phosphat-Pufferlösung pH = 5.5 (10:90 v/v)

30, 60, 90, 120

Vergleichssubstanzen - Diodenarray-Detektor und Fluoreszenzdetektor (bei verschie­denen Konzentrationen der PABA):

Geräteparameter: HPLC-Anlage A; der fluorimetrische Detektor wurde hinter den UVD geschaltet. (Anregungswellenlänge 280 nm, Detektionswellenlänge 300 nm)

Jeweils drei Konzentrationen der PABA (c = 100 mg/L; 2,5 mg/L und 1,0 mg/L im Fließmittel) wurden injiziert und nach folgender Tabelle die Pumpentätigkeit unterbrochen (n = 3). Als Vergleichssubstanzen wurden 4-Aminophenol, 4-Aminosaliylsäure und 3-Hydroxy-4-amino­benzoe­säure im jeweiligen Fließmittel (c = 1,0 mg/L) eingesetzt.

Tabelle 44 : Verwendete Fließ- bzw. Lösungsmittel bei Einsatz des Diodenarray-Detektors und des Fluoreszenzdetektors unter Angabe der jeweiligen Zeiten des Unterbrechens der Pumpentätigkeit

Fließ- und Lösungsmittel

UV-C

Stoppen der Pumpe T stop [s]

(n = 3)

Acetonitril/ Acetat-Pufferlösung
pH = 5,5 (10:90 v/v)

30, 60, 90, 120

Acetonitril/ Acetat-Pufferlösung
pH = 3,7 (10:90 v/v)

120, 240, 360, 480, 6000, 12000

Methanol/ Acetat-Pufferlösung
pH = 5,5 (10:90 v/v)

30, 60, 90, 120

Methanol/ Acetat-Pufferlösung
pH = 3,7 (10:90 v/v)

120, 240, 360, 480, 6000, 12000


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4.5  Optimierung analytischer Verfahren

4.5.1 Fließinjektionsanalyse

Lösungen der PABA und der PAABA im Fließmittel wurden unter Variation der Bestrahlungszeit durch Unterbrechen der Pumpentätigkeit im FIA-System bestrahlt.

Geräteparameter: HPLC-Anlage B (Injektionsvolumen 20 µL) ohne Trennsäule

Arbeitspotential: a) +600 mV, b) +800 mV

Fließgeschwindigkeit F = 0,5 mL/min. ETFE-Kapillare: l = 5 m, ID = 0,254 mm.

Fließmittel:

  1. Methanol/ Perchlorsäure-Lösung pH = 2,5 (10:90 v/v)
    T
    stop = 40; 80; 120; 160; 240; 600; 900; 1200 und 1800 s
  2. Methanol/ Acetat-Pufferlösung pH = 5,5 (10:90 v/v)
    T
    stop = 40; 80; 120; 160; 240; 360; 480; 600; 660; 900 und 1200 s
  3. Methanol/ Acetat-Lösung pH = 7,0 (10:90 v/v)
    T
    stop = 40; 80; 120; 160; 240; 360; 480; 600; 660; 900 und 1200 s
  4. Acetonitril/ Acetat-Lösung pH = 7,0 (10:90 v/v)
    T
    stop = 40; 80; 120; 160; 240; 360; 480; 600; 660; 900 und 1200 s

4.5.2 Hochdruckflüssigkeitschromatographie

4.5.2.1 Einfluß der Temperatur

Geräteparameter: HPLC-Anlage B (Injektionsvolumen 20 µL) mit Trennsäule

Arbeitspotential: +1200 mV

Lösungen der PABA und der PAABA (c = 18,48, 12,32, 9,24, 6,17 und 3,08 µmol/L, Stammlösung: 1 mmol/L) im Fließmittel wurden unter Variation der Bestrahlungszeit im HPLC-System mittels UV-C-Strahler bestrahlt. Zunächst erfolgte die Bestrahlung ohne Kühlung (n = 2), dann mit Kühlung (n = 4), anschließend erfolgte die Wiederholung der Werte ohne Kühlung (n = 2).

Fließgeschwindigkeit F = 0,5 mL/min. ETFE-Kapillare: l = 5 m, ID = 0,254 mm.

Fließmittel: Acetonitril/Acetat-Pufferlösung pH = 3,5 (85/15) (v/v)


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4.5.2.2  Einfluß der Konzentration und des Arbeitspotentials

Geräteparameter: HPLC-Anlage B (Injektionsvolumen 20 µL) mit Trennsäule

Arbeitspotential: a) +600 mV, b) +800 mV; c) +1000 mV

Lösungen der PABA und der PAABA aus einer Stammlösung ( c = 1 mmol/L)

(c = 1000; 750; 500; 250; 125; 62,5; 46,88; 35,16; 20,00; 14,06; 7,03; 1,78; 1,00; 0,49; 0,24; 0,12; 0,06 µM)

wurden, beginnend mit der niedrigsten Konzentration, in das HPLC-System injiziert. Zunächst erfolgte keine Integration des photochemischen Reaktors, dann Integration des Reaktors ohne Betätigen der Strahlungsquelle, dann Bestrahlung mittels UV-C-Strahler. (jeweils n = 3).

Fließgeschwindigkeit F = 0,5 mL/min. ETFE-Kapillare: l = 5 m, ID = 0,254 mm.

Fließmittel: Acetonitril/ Acetat-Pufferlösung pH = 3,5 (85/15) (v/v)

4.5.2.3 Einfluß einer Matrix

Geräteparameter: HPLC-Anlage B (Injektionsvolumen 20 µL) mit Trennsäule

Arbeitspotential: +600 mV

PABA und der PAABA wurden zusammen in der Matrix-Lösung gelöst (Stammlösung:
1 mmol/L) und anschließend (c = 20.0 µmol/L) im HPLC-System mittels UV-C-Strahler bestrahlt.

Fließgeschwindigkeit F = 0,5 mL/min. ETFE-Kapillare: l = 5 m, ID = 0,254 mm.

Fließmittel: Acetonitril/Acetat-Pufferlösung pH = 3,5 (85/15) (v/v)

Matrix-Lösung:

A) Acetonitril/ Acetat-Pufferlösung pH = 3,5 (85/15) (v/v)90%

B) Leermatrixprobe10%
bestehend aus: Hämolysat, Acetyl-CoA-regenerierendes System, Acetyl-Coenzym A, Perchlorsäure

4.5.2.4 Kalibrierung

Geräteparameter: HPLC-Anlage B (Injektionsvolumen 20 µL) mit Trennsäule

Arbeitspotential: +600 mV

PABA und der PAABA wurden zusammen im Fließmittel bzw. der Matrix-Lösung gelöst (Stammlösung: 1 mmol/L) und anschließend (c = 1,8; 7,2; 14,3; 21,4 und 35,6 µmol/L) im HPLC-System mittels UV-C-Strahler bestrahlt (n = 6).


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Die Kalibrierung wurde an drei Tagen wiederholt, am 4. Tag erfolgte die Kalibrierung in der Matrix-Lösung.

Fließgeschwindigkeit F = 0,5 mL/min. ETFE-Kapillare: l = 5 m, ID = 0,254 mm.

Fließmittel: Acetonitril/Acetat-Pufferlösung pH = 3,5 (85/15) (v/v).


Fußnoten und Endnoten

8 Die Angaben des Innendurchmessers entsprechen Herstellerangaben.

9 Bei den Untersuchungen zur Photostabilität beziehen sich alle Angaben des Innendurchmessers auf die berechneten Werte aus Tabelle 16, Kapitel 4.2.2.4.

10 die Bestrahlung für 4 h erfolgte nur mit dem UV-A-Strahler



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03.01.2005