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3  Material und Methoden

3.1 Versuchstiere

Die experimentellen Untersuchungen wurden an 30 weiblichen, ca. 2 Jahre alten, ausgewachsenen Hausschafen der Rasse Merino mit einem mittleren Körpergewicht von 51.4 ± 8.7 kg vorgenommen. Bezogen wurden sie über einen Schafszüchter. Eingangs wurden alle Schafe tierärztlich untersucht und waren physisch gesund. Die Haltung und Pflege, die Narkosen, die Operationen und die postoperative Nachsorge der Tiere erfolgten in der tierexperimentellen Abteilung des Virchow-Klinikums/Charité der Humboldt-Universität zu Berlin. Während des gesamten Zeitraumes waren die Tiere unter Aufsicht eines Veterinärmediziners bzw. Tierpflegers.

Die Entscheidung für das Schaf als Versuchstier wurde mit der langjährigen Erfahrung und Bewährung in der unfallchirurgischen Forschung begründet. Vergleichbare Studien zum Kreuzbandersatz und zur Kreuzbandaugmentation liegen vor [6,18-22,31,165]. Die realistische Belastungssituation im Kniegelenk ist hier besonders hervorzuheben.

3.2 Versuchsplanung und allgemeine Vorbereitungen

Ein Teilaspekt des komplexen Tierversuchs mit der Frage nach den Einheilungsvorgängen einer VKB-Ersatzplastik war die Korrelation der MRT-Befunde mit biomechanischen Parametern. Weitere Ergebnisse des Projekts, wie z. B. histologische Befunde, werden lediglich exemplarisch aufgeführt. Im Folgenden werden deshalb nur die für die hiesigen Fragestellungen notwendigen Materialien und Methoden dargestellt.

3.2.1 Zur Transplantatwahl und –entnahmetechnik

Zunächst wurden anatomische Untersuchungen zur Art des Transplantates und zur chirurgischen Entnahmetechnik am Schafskadaver durchgeführt. Hierbei zeigte sich, dass es beim Schaf keine, der der humanen Semitendinosussehne vergleichbare Bandstruktur an der medialen Beugeseite des Oberschenkels gibt [3]. Die Achillessehne ist jedoch doppelläufig und vom Durchmesser ausreichend, um einen [Seite 14↓]adaequaten Ersatz für die Semitendinosussehne darzustellen. Durch Entnahme des lateralen Drittels der Gastrocnemiussehne bleibt die Plantarflexion erhalten und wird zusätzlich durch den M. flexor digitalis superficialis unterstützt.

Die operativen Zugangswege und Fixationstechniken wurden so weit optimiert, um letztenendes ein standardisiertes Vorgehen zu gewährleisten. Daran anschließend wurde in einer aus drei Tieren bestehenden Vorversuchsgruppe Fragen zur Terminierung der Standzeiten, zur Beeinträchtigung der Belastungssituation nach der OP und zur Durchführbarkeit der biomechanischen Testung geklärt.

3.2.2 Festlegung der Standzeiten

In die Studie gingen 30 Schafe in fünf Gruppen zu je sechs Tieren ein. Die Standzeiten betrugen 6 und 12 Wochen für die Untersuchung des frühen Einheilverhaltens und 24, 52 und 104 Wochen für die Spätregeneration des Transplantates. Die Tiere wurden nach Ablauf der jeweiligen Zeitpunkte im MRT untersucht und anschließend getötet. Für die biomechanische Testung wurden beide Hinterläufe verwendet.

3.3 OP-Methode mit Rekonstruktion des VKB

3.3.1 Pharmaka für die Anästhesie und postoperative Analgesie

Prämedikation:

Xylazin 2 %ig (Rompun®, Delta-Pharm GmbH, Pfullingen)

Atropin (Atropinsulfat®, B. Braun AG, Melsungen)

Narkose:

Thiopental (Trapanal®, Byk Gulden, Konstanz)

Stickoxydul (Lachgas)

Isofluran (Forene®, Abbott GmbH, Wiesbaden)

Analgesie:

Fentanyl (Fentanyl®, Janssen-Cilag GmbH, Neuss)

Tramadol (Tramal®, Grünenthal, Stolberg)

Metamizol (Novaminsulfon-ratiopharm®, ratiopharm GmbH, Ulm)

Antibiotika:

Amoxicillin-Clavulansäure (Augmentan®, Smith Kline Beecham

Pharma, München


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3.3.2  Prämedikation, Intubationsnarkose und Analgesie

Im Rahmen der Prämedikation wurde den Tieren zur Sedation 1 ml 2 %iges Xylazin und zur Vagolyse 0.5 mg Atropin intramuskulär in den M. gluteus maximus injiziert.

Nach dem Wirkungseintritt (ca. 10 Min.) wurde den Tieren ein intravenöser Zugang in die V. jugularis externa gelegt, der mit 2 Hautnähten fixiert wurde. Als Dauerinfusion bekamen die Tiere eine Vollelektrolytlösung (Sterofundin, B. Braun Melsungen AG) langsam infundiert.

Die Narkose konnte nun mit 3-5 mg/kg KG (ca. 200 mg) Thiopental intravenös eingeleitet werden. Nach ca. 30 Sek. wurde zügig in Seitenlage oral intubiert, die Lage des Intubationstubus mittels Stethoskop sorgfältig überprüft, der Tubus geblockt und nachfolgend mehrfach fixiert. Hierbei kam ein Laryngoskop mit langem geraden Spatel (Typ Miller) und ein Oxford-Tubus, Größe 8.0, zur Anwendung. Nach der Intubation wurde den Tieren zusätzlich ein Magenschlauch zur Aspirationsprophylaxe gelegt. Während der gesamten Anästhesie wurde ein EKG über drei Elektroden abgeleitet und die endexpiratorische C02-Konzentration (Kapnometrie) über ein Monitor-System (Sirecust, Siemens) gemessen.

Zur Beatmung wurde ein halbgeschlossenes Narkosesystem der Fa. Dräger verwendet. Die Narkosegase wurden in einem Verhältnis 2 (Stickoxydul) zu 1 (Sauerstoff) und einem Volumenanteil des Inhalationsnarkotikums Isofluran von 1 Vol.% zugeführt. Das Atemminutenvolumen betrug durchschnittlich 7 Liter bei einer Atemfrequenz von 20/Min. Das Atemzugvolumen wurde in Abhängigkeit von der CO2-Konzentration (Soll: 40 mmHg) variiert. Eine intraoperative Analgesie erfolgte initial mit 0.1 mg Fentanyl und nach jeweils 30 Min. mit einer Wiederholungsdosis von 0.05 mg. Zur perioperativen Antibiotika-Prophylaxe bekamen alle Tiere einmalig 2.2 g Amoxicillin-clavulanat intravenös verabreicht.

Nach der letzten Hautnaht wurde die Narkose ausgeleitet und die Tiere für 10 Min. mit reinem Sauerstoff nachbeatmet. Bei ausreichender Spontanatmung konnte extubiert und der Magenschlauch gezogen werden.

Da die Versuchstiere postoperativ das Kniegelenk voll belasten sollten, wurde eine Analgesie benötigt. Hierzu bekamen die Tier über drei Tage jeweils 1250 mg Metamizol und 50 mg Tramadol intramuskulär injiziert.


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3.3.3  Chirurgische Technik und postoperative Nachbehandlung

Direkt nach der Narkoseeinleitung und Lagerung auf dem Rücken wurden die Tiere im Bereich beider Hinterläufe großflächig rasiert und mit Seifenlösung mehrfach abgewaschen. Die definitive Hautdesinfektion erfolgte dann mit Polyvidonjodlösung. Unter streng aseptischen Bedingungen wurde jeweils das linke Knie in offener Technik operiert [154]. Zunächst wurde nach posterolateraler Hautinzision über der ipsilateralen Tendo calcanei communis die doppelsträngige Sehne unter Schonung der umgebenden Weichteile dargestellt. Als zukünftiges Transplantat wurde das distale, laterale, 7.5 cm lange Drittel der Gastrocnemiussehne entnommen. Das Transplantat wurde anschließend an beiden Enden mit kräftigen Haltefäden fixiert und in einer mit physiologischer Kochsalzlösung getränkten Kompresse aufbewahrt. Die Sehnenscheide und die Faszien wurden mit resorbierbarem Nahtmaterial (Polyglactin) verschlossen. Der Hautverschluss wurde folgend mit nicht resorbierbarem Nahtmaterial (Polyamid) in Einzelknopfnahttechnik durchgeführt. Das linke Kniegelenk wurde nach anteromedialer, parapatellärer Hautinzision und Mobilisation der Patella nach lateral, eröffnet. Hierdurch konnte das mediale Kompartment und die Regio intercondylaris in ca. 90° Kniebeugung gezeigt werden. Nach Resektion der großen Plica synovialis und Spaltung des Hoffa'schen Fettkörpers wurde das VKB in seinem intraartikulären Verlauf dargestellt und anschließend an seinen Insertionsstellen unter Schonung der Binnenstrukturen scharf abgelöst. Die Reste der Kreuzbandstümpfe wurden sorgfältig entfernt und nach 90°-Kniebeugung eine 6 mm Bohrung am ehemaligen tibialen Kreuzband-ansatz (inside-out Orientierung) durchgeführt. Der Transplantattunnel wurde dann mit einem 7 mm Dilatator (Instrument Makar Inc., Okemos, MI) vorsichtig geweitet, wobei der Tunneleingang auf etwa 8 mm geweitet wurde. Zur Erleichterung der Schraubenpassage wurde eine Notch mit einem Tunnel-Notcher (Linvatec Corp., Largo, FL) angelegt. Anschließend wurde der femorale Tunnel in maximaler Kniebeugung in 1 Uhr Position in gleicher Weise angelegt. Die Haltefäden wurden durch die Knochentunnel nach extraartikulär ausgeleitet und das Transplantat zunächst femoral dann tibial inseriert. Zur Verblockung kamen biodegradierbare Interferenzschrauben (Sysorb; Sulzer Orthopädie, Münsingen, Schweiz) aus Poly-(D,L)-Laktid (Resomer R 208; Boehringer Ingelheim KG) zum Einsatz [150,158]. Die Schraube ist 8 mm lang mit einem Kerndurchmesser von 6.2 mm und einem Gewindedurchmesser von 8 mm. Zunächst [Seite 17↓]wurde femoral verblockt. Sodann wurde über ein Tensiometer (Sulzer Orthopädie, Münsingen, Schweiz) am tibialen Haltefaden das Transplantat unter 90 Newton Vorspannung im tibialen Knochentunnel bei 90° Beugung (inside-out Orientierung) verankert (Abb. 1). Die Gelenkkapsel und die Faszien wurden mit Polyglactinfäden verschlossen. Die Hautinzision wurde anschließend mit Polyamidfäden durchgeführt. In den kontralateralen Tibiakopf wurde zur Biokompatibilitätsprüfung in der unbelasteten Situation medial über eine Hautinzision eine weitere biodegradierbare Poly-(D,L)-Laktid Interferenzschraube nach vorheriger 7 mm Bohrung eingedreht. Zuletzt wurde die Narkose ausgeleitet und die Tiere direkt nach der OP geröntgt und zur Beobachtung in ihren Tierkäfig zurückgeführt. Nach drei Tagen postoperativer Analgesie und insgesamt 14 Tagen Aufenthalt in der tierexperimentellen Abteilung ohne Protektion der Kniegelenke wurden die Tiere auf einen externen Tierhof überführt, wo eine freie, uneingeschränkte Beweglichkeit in der Herde bis zur vollständigen Mobilisation garantiert werden konnte. Während der gesamten Zeit wurde jedes Tier regelmäßig nach einem standardisierten Protokoll in Hinblick auf Wundveränderungen, Beweglichkeit (Gehen, Laufen, Stehen) und Bewegungsumfänge untersucht.

Abb. 1: VKB-Rekonstruktion mit Sehnentransplantat und Poly-(D,L)-Laktid Interferenzschrauben


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3.4  Kernspintomografische Untersuchung

3.4.1 Der Kernspintomograf

Die Untersuchungen wurden am MRT im Virchow-Klinikum (Humboldt-Universität zu Berlin) durchgeführt. Folgende Gerätespezifikation lag der Untersuchung zu Grunde:

Kernspintomograf:

Magnetom-63 SP, Fa. Siemens AG, Erlangen

Betriebsfeldstärke:

1.5 Tesla (1.4917....1.5012 Tesla)

Homogenität:

≤ 5 ppm über ein 50 cm Kugelvolumen

Oberflächenspule:

Augenspule der Fa. Siemens

Schichtdicke und -lücke:

2 mm ohne Schichtlücke

Genauigkeit der Schicht-

positionierung:

± 0.5 mm für Schichtbewegungen von ≤ 5 mm

Bildmatrix:

256 x 256 Bildpunkte

Repetitionszeiten (TR):

1000 – 2300 ms

Echozeiten (TE):

20 – 80 ms

Bildrekonstruktion:

Zweidimensionale Fourier-Transformation

Wichtung:

T1- und T2-Wichtung im Spin-Echo-Verfahren

3.4.2 Pharmaka für die Kernspintomografie

Neben den unter 3.3.1 bereits aufgeführten Pharmazeutika Xylazin, Atropin und Thiopental kamen weitere Medikamente zum Einsatz:

Relaxation:

Pancuroniumbromid (Pancuronium-ratiopharm®, ratiopharm GmbH, Ulm)

Kontrastmittel:

Gadoteridol (ProHance®, Fa. Byk Gulden, Konstanz)

3.4.3 Grundlagen zur Magnetresonanztomografie des Kniegelenkes

Im folgenden Abschnitt werden die grundsätzlichen physikalischen Phänomene und Begriffe der Magnetresonanztomografie (MRT) erläutert, die der Untersuchung zu Grunde liegen. Die ausführlichen physikalischen Grundlagen sind an anderer Stelle geschildert [37,70,78].


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Die MRT ist ein computergestütztes bildgebendes Verfahren, das auf dem Prinzip der Kernspinresonanz beruht. Dieses Prinzip wurde von F. Bloch und E. M. Purcell 1946 unabhängig voneinander entdeckt. Bei der Kernspinresonanz zeigen nur Atomkerne mit ungerader Ordnungszahl einen Eigendrehimpuls p (Kernspin) und ein von 0 abweichendes magnetisches Moment µ. Des Weiteren sind die Drehachsen der einzelnen "Kernmagnetfelder" im Raum beliebig orientiert, können jedoch mit einem stabilen äußeren Magnetfeld H0 in Wechselwirkung treten und ausgerichtet werden. Die Atomkerne richten sich dabei parallel oder antiparallel zur Richtung des Feldes aus und führen zusätzlich eine Kreiselbewegung (Präzessionsbewegung) um die Feldlinien des äußeren Magnetfeldes aus, dessen Frequenz auch Lamor-Frequenz genannt wird. Durch Hochfrequenzimpulse, die in Höhe der Lamor-Frequenz (Resonanzbedingung) des Atomkerns senkrecht zum Feldlinienverlauf des äußeren Magnetfeldes in das System einstrahlen, werden nur die parallel präzedierenden Atomkerne "umgeklappt" (Anregung).

Nach Beendigung des HF-Impulses kehren die Atomkerne in ihre Ausgangsposition zurück und erzeugen ein Induktionsfeld, dessen Spannungsverlauf über eine Hochfrequenzspule (kombinierte Sende- und Empfangsspule) gemessen und verstärkt wird. Der als Relaxation bezeichnete Übergang vom angeregten Zustand in den Grundzustand vollzieht sich mit bestimmten Zeitkonstanten, den beiden Relaxationszeiten T1 und T2 (Gewebsparameter).

Während der Relaxationszeit T1 ändert sich die Magnetisierung der Atomkerne in Feldrichtung (longitudinale Relaxation), und die bei der Anregung aufgenommene Energie tritt in Wechselwirkung mit ihrer physikalischen Umgebung, dem sog. Gitter (Spin-Gitter-Relaxation).

Die Relaxationszeit T2 hingegen ist ein Maß für die zeitliche Änderung der tranversalen Magnetisierung infolge einer Wechselwirkung der Kernspins untereinander (Spin-Spin-Relaxation).

Beim Einsatz der Kernspinresonanz in der Medizin nutzt man die Tatsache, dass der menschliche Körper zu mehr als 60% aus Wasser besteht. Wasserstoff hat zudem eine sehr hohe Nachweisempfindlichkeit zur Messung der kernmagnetischen Resonanz. Ein Prozessrechner steuert selektiv bestimmte Körperschichten (axiale, sagittale, koronare) an und setzt gezielt die magnetischen Feldgradienten und die Hochfrequenzimpulse ein (Abb.2). Man erhält digitalisierte Kernsignale und nach [Seite 20↓]Bildrekonstruktion in einer digitalen Matrix ein in Grau- bzw. Farbstufen darstellbares dreidimensionales Abbild des betreffenden Bereichs (hoher Weichteilkontrast) [37].

Durch Variation der Geräteparameter - Pulswiederholzeit TR, Echozeit TE - kann der Untersucher unterschiedliche Wichtungen einstellen: Protonendichte-, T1-und T2-gewichtete Bilder. Kontrastmittel verstärken das Signalverhalten durch Verkürzung der Relaxationszeiten, womit pathologisch veränderte Strukturen besser abgegrenzt darstellbar werden, und erhöhen zusätzlich die diagnostische Sensitivität und Spezifität. In dieser Studie kommt Gadolinium-DTPA (Diäthylentriaminpentazetat) als Kontrastmittel zur Anwendung. Es handelt sich dabei um eine Substanz, die zentral ein dreiwertiges Gadolinium-Ion mit sieben ungepaarten Elektronen im halbaufgefüllten 4f-Orbital enthält. Diese ungepaarten Elektronen besitzen, wie bei ungepaarten Nukleonen ein magnetisches Moment und somit paramagnetische Eigenschaften, welche nur T1-gewichtete Aufnahmen verstärken. Auf Grund seines hohen Molekulargewichtes, der Ladung und seiner hydrophilen Eigenschaften verbleibt es im extrazellulären Raum. Die Ausscheidung erfolgt durch glomeruläre Filtration und die Halbwertszeit beträgt ca. 90 Minuten.

Die einwandfreie Beurteilung in der MRT erfordert ein standardisiertes Vorgehen, bei der die komplexe Anatomie des Kniegelenkes unbedingt berücksichtigt werden muss. Unter Beachtung der Verlaufsrichtung des VKB heißt dies im Einzelnen: Lagerung des Kniegelenkes in ca. 90° Beugung; Aufnahmetechnik in schräg-sagittalen und -koronaren Schnittebenen; Einhaltung einer Schichtdicke von 2 mm möglichst ohne Schichtabstand; geeignete Variation der physikalischen Geräteparameter.


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Abb. 2: Prinzipieller Aufbau und Informationsfluss einer MRT [37]

3.4.4 Durchführung der MRT-Untersuchung

Das Prozedere der Prämedikation wurde wie unter 3.3.2 beschrieben durchgeführt. Anschließend wurden die Tiere gewogen. Die Intubationsnarkose wurde sodann mit 3-5 mg/kg KG Thiopental intravenös eingeleitet und mit sukzessiven Einzeldosen aufrechterhalten. Die Beatmung mittels Beatmungsbeutel erfolgte unter Langzeitrelaxation mit 4 mg Pancuroniumbromid intravenös. Hierdurch konnten Bewegungsartefakte, die den Erfolg der MRT-Untersuchung beeinträchtigen können, verringert werden. Eine Überwachung der Herz-Kreislauf-Funktion während der Narkose wurde durch Palpation der A. carotis communis oder A. radialis erreicht. Die Kniegelenke der Tiere wurden standardisiert in 90° Beugung gelagert und in dieser Position mit Sandsäcken fixiert.

Die Untersuchungen fanden an einem 1.5-Tesla-Kernspintomografen unter Verwendung einer kombinierten Sende- und Empfangsspule (Augenspule) statt. Die Datenerfassung erfolgte mit einer Matrix von 256 x 256 Bildpunkten, das Messfeld [Seite 22↓](Field of view, FOV) betrug 120 x 120 mm. Zur besseren Darstellbarkeit des vorderen Kreuzbandes unter Berücksichtigung der schrägen Verlaufsrichtung, wurde für die sagitale Projektion eine Untersuchungsebene gewählt, die um 20 Grad zur Waagerechten geneigt war. Die Schichtdicke der Untersuchungen betrugen 2 mm. Es wurde ohne Schichtlücke untersucht. Die Repetitionszeit (TR) und die Echoverzögerungszeit (TE) wurden entsprechend der Wichtung optimiert. Nach einer Lokalisationsmessung (Scout) erfolgte zunächst die Messung im nativen Zustand mit einer T1-gewichteten Spin-Echo-(S E ) Sequenz (TR 1000 ms, TE 20 ms). Anschließend wurden nach Applikation von Gadolinium-DTPA als Kontrastmittel (0,1 mmol/kg KG) T1-gewichtete SE-Sequenzen (TR 1000 ms, TE 20 ms) angefertigt [94,154].

3.4.5 Auswertung des MRT-Signalverhaltens

3.4.5.1 Qualitative Auswertung

Zunächst wurde das intraartikulär verlaufende VKB in drei Bereiche gleicher Distanz unterteilt, so dass die femoralen und tibialen Insertionsstellen (nicht Schraubenlager) und der mittlere Anteil einzeln ausgewertet werden konnte (Abb. 4). Sodann wurden alle Sequenzen hinsichtlich Artefakte, Darstellbarkeit, Durchgängigkeit, Homogenität, Densität und Lage bzw. Form der Inhomogenität untersucht.

Einteilung des Signalverhaltens (Densität):

-Niedrige Signalintensität:

Sie wird weiter unterteilt in ein fehlendes Signal (schwarz) und in Signale geringerer Intensität als der von Muskulatur (dunkel). Sie wird als hypointens bezeichnet.

-Mittlere Signalintensität:

Sie entspricht im Wesentlichen dem Signalverhalten der Muskulatur und wird als isointens bezeichnet.

-Hohe Signalintensität:

Sie entspricht entweder dem Signalverhalten des Fettgewebes (hell) bzw. höherer Intensität als der von Muskelgewebe. Sie wird als hyperintens bezeichnet.


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3.4.5.2  Quantitative Auswertung

Zusätzlich zu der qualitativen Beurteilung des Signalverhaltens erfolgte eine systematische, EDV-gestützte Bestimmung der absoluten Signalintensitäten in ROI (region of interest)-Technik des VKB-Ersatzes aller Sequenzen einschließlich der kontralateralen nicht operativ versorgten Kniegelenke im intraartikulärem Verlauf. Hierfür wurde der Bandersatz ebenfalls in drei Bereiche gleicher Distanz unterteilt. Daneben wurde die Signalintensität des hinteren Kreuzbandes und des Hintergrundes gemessen. Das hintere Kreuzband wurde wegen seines stabilen Messsignals im postoperativen Verlauf als interner Standard gewählt, da der VKB-Ersatz ebenfalls Sehnengewebe darstellt und die Veränderungen der Signalintensität im Vergleich zum normalen bzw. vitalen Sehnengewebe studiert werden sollte (Abb. 3 und 4).

Der Radius des kreisrunden Messfeldes wurde nach einer qualitativen Vorauswertung sämtlicher MRT-Bilder standardisiert auf 5 mm festgelegt, wodurch das Band im gesamten postoperativen Verlauf sicher erfasst werden konnte (Abb. 4). Für jeden Messbereich wurde ein Mittelwert aus 3 Einzelmessungen gebildet.

Als Maß für die relative Signalintensität wurde jeweils der Signal/Noise-Quotient (S/N) in Anlehnung an Stöckle et al. [135] berechnet :

Abb. 3: MR-Scan in T1-Wichtung eines kontralateralen Kniegelenkes mit Bezeichnung wichtiger Strukturen.


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Abb. 3: MR-Scan in T1-Wichtung eines kontralateralen Kniegelenkes mit Bezeichnung wichtiger Strukturen.

PT = Patellarsehne; VKB = Vorderes Kreuzband; HKB = Hinteres Kreuzband.

Abb. 4: Sagitaler MR-Scan in T1-Wichtung mit Gd-DTPA

Eingezeichnet im Verlauf des VKB sind die Messbereiche (weisse Kreise), deren Signalintensität vermessen wird. Proximal und distal des VKB sind die Schraubenlager der Poly-(D,L)-Laktid Interferenzschrauben deutlich zu erkennen.


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3.5  Biomechanische Testung

3.5.1 Begriffe und Definitionen

Die Versagenslast (engl.: failure load) gibt die Kraft an, die zum Zerreißen der jeweiligen Struktur notwendig ist (Abb. 5). Ihre Einheit ist Newton (N). Die Versagenslast des VKB ist altersabhängig und mit zunehmendem Alter rückläufig [160].

Die Steifigkeit (engl.: stiffness) gibt den Widerstand gegen Deformierung in Längsrichtung an. Ihre Einheit ist Newton pro Millimeter (N/mm). Sie entspricht der Steigung zwischen zwei Punkten im linearen Anteil des Kraft-Weg-Diagrammes (Abb. 5).

Unter Reißfestigkeit (engl.: tensile stress) versteht man die Kraft, die pro Flächeneinheit des Querschnittes an einem bestimmten Punkt des Materials in Richtung der Längsachse wirkt. Im internationalen Maßsystem wird die Reißfestigkeit wie Druck in Pascal (Pa) angegeben (1Pa = 1 N/m2).

Abb. 5: Beispielhafte Darstellung eines Kraft-Weg-Diagrammes mit Kennzeichnung der für die Auswertung wichtigen Abschnitte.

Aus der Steigung des linearen Abschnittes wird die Steifigkeit berechnet. Die max. Kraft ist der max. Versagenslast gleichzusetzen. Aus [26].


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3.5.2  Explantation der Kniegelenke

Nach der MRT-Untersuchung in Narkose bekamen die Tiere eine Überdosis von jeweils 40 mmol/l Kaliumchlorid als Bolus intravenös injiziert. Der Herzstillstand erfolgte in wenigen Sekunden nach Injektion.

Die Hinterläufe wurden sodann mit femoralem und tibialem Anteil (Minimum 20 cm Abstand zum Gelenksspalt) explantiert. Nach Eröffnung der Kapsel wurde der Kniebinnenraum in Hinblick auf evtl. pathologische Veränderungen makroskopisch beurteilt, fotografisch dokumentiert und Synovia zur mikrobiologisch/histologischen Kontrolle entnommen. Bis zur biomechanischen Testung wurden die Präparate sofort mit feuchten Kompressen (physiologische Kochsalzlsg.) vollständig bedeckt und luftdicht in einer Gefriertüte bei -20°C im Kühlschrank tiefgefroren. So konnte ein Austrocknen des Präparates sicher verhindert werden. Zwölf Stunden vor der mechanischen Prüfung wurden die Kniegelenke bei 4°C wieder aufgetaut.

3.5.3 Vorbereitungen zur mechanischen Testung

Die Testung wurde sowohl an den linken Kniegelenken der 5 beteiligten Versuchsgruppen, als auch an 12 Kniegelenken der rechten Seite (Kontrolle) durchgeführt. Für den Zeitpunkt „0“ wurden 10 rekonstruierte Kniegelenke und 12 Achillesehnentransplantate (zum Zeitpunkt der Tötung entnommen) der rechten Seite mechanisch getestet.

Zur Präparation der Kniegelenke wurden die tibialen und femoralen Knochenanteile vollständig vom umgebenden Weichteilgewebe befreit und mit Technovit® 7200 (Polymethylmetacrylate, Heraeus-Kulzer GmbH, Wertheim) in speziellen Aluminiumzylindern fixiert. Nach dem Aushärten des Kunststoffes folgte eine dynamische Stabilitätsmessung, dessen Ergebnisse nicht Bestandteil dieser Arbeit waren. Die Kniegelenke wurden während der gesamten Testung mit physiologischer Kochsalzlösung benetzt, um ein Austrocknen zu verhindern. Für die Bestimmung der Querschnittsfläche und die Zerreißtestung wurden die periartikulären Weichteile einschließlich der extraartikulären ligamentären Strukturen und die Gelenkkapsel vorsichtig entfernt.


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3.5.4  Querschnittsfläche des Bandes

Die Querschnittsfläche (engl. cross-sectional area) des Bandes wurde im mittleren Anteil mit Hilfe eines Flächenmikrometers (Fa. Mitutoyo Inc., Osaka, Japan (± 0.1 N)) mit 5 Zwischenstücken verschiedener Größe (4 x 4.5 mm bis 9 x 5.5 mm) bestimmt. Der mediale Femurkondylus wurde zuvor entfernt. Der Vorschub betrug 4.5 N. Letztendlich wurde der Mittelwert aus 3 Einzelmessungen unter Berücksichtigung der Versagenslast zur Berechnung der Reißfestigkeit herangezogen.

3.5.5 Versagenstest der Kniegelenke

Die anschließende Zerreißtestung an der Material-Testmaschine (Zwick 1455, Genauigkeitsklasse 1, Fa. Zwick GmbH, Ulm, Deutschland) erfolgte kontinuierlich bis zur vollständigen Ruptur des vorderen Kreuzbandes. Hierfür wurden Femur und Tibia in 60°-Beugung zueinander achsengerecht in Spezialhalterungen fixiert (Abb. 6). Mit einer Vorlast von 1 N und einer Dehnungsrate von 1 mm/s wurde das Konstrukt bis zum Versagen des Bandes belastet. Die gesamte Testung wurde bei Raumtemperatur vorgenommen. Die ermittelten Daten wurden EDV-gestützt in Form eines Kraft-Weg-Diagrammes aufgezeichnet und ausgewertet. Hierdurch konnte die Versagenslast und die Steifigkeit incl. dazugehörige Längenänderung bestimmt werden. Der Versagensmodus (Transplantatruptur an den Insertionsstellen, Sehnenruptur im Bandverlauf oder knöcherner Ausriss) wurde dokumentiert.

3.5.6 Versagenstest des Achillessehnentransplantates

Die Sehne wurde in einer kühlbaren Spezialhalterung zwischen zwei Metallblöcken so fixiert, dass eine freie Sehnenlänge von 3 cm resultierte. Anschließend wurde mit Trockeneis tiefgekühlt.

Die Testung wurde mit einer Vorlast von 5 N und einer Dehnungsrate von 1 mm/s durchgeführt.


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Abb. 6: Aufbau der Materialtestmaschine Zwick.

Femur und Tibia sind in Spezialhalterungen eingespannt und stehen achsengerecht in 60°-Flexion zueinander. Das VKB wird bis zum Versagen belastet.


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3.6  Statistische Prüfverfahren

Bei der Auswertung der Ergebnisse konnten 30 bzw. 29 Schafe zu je 6 bzw. 5 Tieren pro Gruppe (6,12,24,52 (n=5) und 104 Wochen Standzeit) berücksichtigt werden. Für den Zeitpunkt „0“ wurden 6 im MRT und 12 rechte Kniegelenke für die biomechanischen Parameter ausgewertet.

Sämtliche statistischen Berechnungen erfolgten unter Zuhilfenahme des Softwarepaketes SPSS 8.0 für Windows (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA).

Für die deskriptive Statistik wurden der Mittelwert und die Standardabweichung bestimmt.

Für den analytischen Statistikteil wurde das Datenmaterial der Signal/Noise-Quotienten und der biomechanischen Testung mit dem Kolmogoroff-Smirnoff-Anpassungstest auf das Vorliegen einer Normalverteilung geprüft. Hierbei fand sich keine Normalverteilung, weshalb die Verlaufsdaten mit dem Mann-Whitney-U Wilcoxon Rank Sum Test auf signifikante Unterschiede untersucht wurden. Des Weiteren wurden Unterschiede der Signalintensität vor und nach Kontrastmittelapplikation mit dem Wilcoxon-Test für paarige Stichproben errechnet.

In beiden Fällen wurde ein Signifikanzniveau von p ≤ 0.05 festgelegt.

Zur Korrelationsanalyse wurden die MR-Werte mit den dazugehörigen biomechanischen Daten (Versagenslast, Steifigkeit und Reißfestigkeit) herangezogen. Die Signal-Noise-Quotienten der drei Messbereiche wurden nach MR-Verfahren getrennt den biomechanischen Daten gegenübergestellt und mit Hilfe des Spearman´schen Rang-Korrelationskoeffizienten r s für nicht normalverteilte Variablen eine mögliche Korrelation ermittelt. Ein p-Wert < 0.05 wurde als statistisch signifikant angesehen. α=0.05.


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04.08.2004