Pfab, Thiemo: Zum Endothelinsystem im Morris-Hepatom-7777 - Behandlung mit Endothelinrezeptorantagonisten in vitro und in vivo

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Kapitel 2. Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Geräte

Zellkultur

Accu-Jet Pipettierhilfe, Brand, Wertheim, Deutschland

Brutschrank Heto Cell House 200, Heto-Holten, Allerød, Dänemark

Elektronische Präzisionswaage BP 6100 u. BP 210S, Sartorius, Göttingen, Deutschland

ELISA-Reader MRX Microplate Reader, Dynatech Laboratories, Guernsey, England

Kühlzentrifuge Megafuge 2.0 R, Heraeus, Hanau, Deutschland

Lamin Air HB 2448, Heto-Holten, Allerød, Dänemark

Mikroskop Leica DMIL, Leica Mikroskopie & Systeme, Wetzlar, Deutschland

Mobiler Bunsenbrenner Fireboy eco, Integra Biosciences, Fernwald, Deutschland

Neubauer Zählkammer N-Improved, Fein-Optik, Bad Blankenburg, Deutschland

Vortex Genie 2 Modell G 560, Scientific Industries, Bohemia, USA

Untersuchungen an hepatomtragenden Buffalo-Ratten

Automatischer Gammazähler MR 480, Kontron Analytik, München, Deutschland

Brutschrank Heraeus Kelvitron t, Heraeus, Hanau, Deutschland

Dounce-Gefäße 5 ml und 30 ml, B. Braun Melsungen, Melsungen, Deutschland

Embryonenquetsche, hergestellt im Institut für Molekularbiologie und Biochemie der Freien Universität Berlin

Kühlzentrifuge J2-21, Beckman, Irvine, USA

Membran-Vakuumpumpe Vacubrand, Wertheim, Deutschland

Mikro-Dismembrator U, B. Braun Melsungen, Melsungen, Deutschland

Neigungswaage Nr. 52899, Sauter, Ebingen, Deutschland

pH-Meter, Knick, Berlin, Deutschland

Photometer Eppendorf 1101 M, Eppendorf Gerätebau, Hamburg, Deutschland

Potter-Homogenisator Modell 853202, B. Braun Melsungen, Melsungen, Deutschland

Präzisionsschublehre, Helios Meßtechnik, Niedernhall, Deutschland

S-Monovette Z 7,5 ml, Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland

S-Monovette KE 2,7 ml mit EDTA, Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland


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Sonographiegerät Sigma 1 AC, Kontron, München, Deutschland mit 7,5 MHz-Schallkopf Typ S CE, Kontron, München, Deutschland

Spectrophotometer Modell 34, Beckman, Irvine, USA

Tischzentrifuge Biofuge 13, Heraeus, Hanau, Deutschland

Ultrazentrifuge Centrikon T-2000, Kontron, Zürich, Schweiz mit Fixed-angle Rotor Sorvall TFT 50.38, Du Pont, Delaware, USA

Vortex Genie 2, Bender & Hobein, Zürich, Schweiz

Verbrauchsmaterialien

96-Well Microtest Zellkultur-Platten Falcon, Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA

Einmal-Filterhalter S&S Rotrand 0,2 µm, Schleicher & Schuell, Dassel, Deutschland

Eppendorf Combitips, Eppendorf-Netheler-Hinz, Hamburg, Deutschland

Eppendorf Safe-Lock Reaktionsgefäße, Eppendorf-Netheler-Hinz, Hamburg, Deutschland

Eppendorf Standardtips, Eppendorf-Netheler-Hinz, Hamburg, Deutschland

Glaswaren von Schott, Mainz, Deutschland

Plastibrand Pasteurpipetten, Brand, Wertheim, Deutschland

Plastibrand Pipettenspitzen PD-Tips, Brand, Wertheim, Deutschland

Plastibrand Reaktionsgefäße, Brand, Wertheim, Deutschland

Serologische Pipetten Falcon, Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA

Sterican Kanülen 20 G Luer Lock Gr. 1, B. Braun Melsungen, Melsungen, Deutschland

Ultraschall Transmission Gel Aquasonic 100, Parker, Orange, USA

Zellkultur-Flaschen 25 ml, Sarstedt, Newton, USA

Zellkultur-Flaschen 250 ml Primaria Falcon, Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA

Weitere Verbrauchsmaterialien der Firmen Brand (Wertheim), Eppendorf-Netheler-Hinz (Hamburg) und Nunc (Naperville, USA).

2.1.2 Chemikalien

Zellkultur

BQ 123, California Peptide Research, USA

Dexamethasone, Sigma, Deisenhofen, Deutschland

Dimethylsulfoxid, Boehringer Ingelheim Bioprod. Partnership, Heidelberg, Deutschland

Dulbecco‘s Modified Eagles Medium, Bio Whittaker, Boehringer Ingelheim Bioproducts Partnership, Verviers, Belgien

Dulbecco‘s Phosphate Buffered Saline, PAA Laboratories, Linz, Österreich


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ET-1 (human, porcine), Sigma, Deisenhofen, Deutschland

FCS Seromed, Kat. Nr. S 0113, Biochrom, Berlin, Deutschland

Humaninsulin, Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland

  1. Kolorimetrischer BrdU-Zellproliferations-ELISA, Kat. Nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland

L-Glutamin Seromed, Biochrom, Berlin, Deutschland

LU 135252, Knoll, Ludwigshafen, Deutschland

LU 302872, Knoll, Ludwigshafen, Deutschland

MTT Thiazolyl Blue, Merck, Darmstadt, Deutschland

Penicillin/Streptomycin Seromed, Biochrom, Berlin, Deutschland

SDS Dodecylsulfat Natriumsalz, Merck, Darmstadt, Deutschland

Trypanblau-Lösung (0,4%), Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland

Trypsin, Seromed, Biochrom, Berlin, Deutschland

Untersuchungen an hepatomtragenden Buffalo-Ratten

Bacitracin 63000 U/g, Sigma, Deisenhofen, Deutschland

Big-ET-1-Enzymimmunoassay, Kat. Nr. BI-20072, Biomedica, Wien, Österreich

Bovines (S-Carboxymethyl) Albumin, Sigma, Deisenhofen, Deutschland

ET-1 (human, porcine), Sigma, Deisenhofen, Deutschland

ET-1-Enzymimmunoassay, Kat. Nr. BI-20022, Biomedica, Wien, Österreich

[125J]ET-1 (human, porcine) Kat. Nr. QEx 259, Du Pont de Nemours, Mechelen, Belgien

Folin-Ciocalteus Phenolreagenz, Merck, Darmstadt, Deutschland

Ketamin 10% (Ketaminhydrochlorid), Mallinckrodt Veterinary, Burgwedel, Deutschland

LU 302872, Knoll, Ludwigshafen, Deutschland

Rompun 2% (Xylazinhydrochlorid), Bayer, Leverkusen, Deutschland

Tris(hydroxymethyl)-aminomethanhydrochlorid, Merck, Darmstadt, Deutschland

Triton X-100, Merck, Darmstadt, Deutschland

Alle sonstigen Chemikalien wurden in analytischer Qualität von den Firmen Merck (Darmstadt), Boehringer Mannheim (Mannheim), Roth (Karlsruhe), Serva (Heidelberg) und Sigma (Deisenhofen) bezogen.


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2.1.3 Zellen und Hepatome

Die Zellen des MH-7777 für Zellkulturversuche wurden freundlicherweise von Prof. Dr. Tauber, Charité Berlin, Standort Virchow-Klinikum, zur Verfügung gestellt.

Buffalo-Ratten mit dem MH-7777 sind im Tierstall des Instituts für Molekularbiologie und Biochemie der Freien Universität Berlin etabliert. Dort wurden die Hepatome transplantiert und die Tierversuche durchgeführt.

Abb. 2: Buffalo-Ratte mit ausgeprägtem Morris-Hepatom-7777 am rechten Oberschenkel. Zustand 28 Tage nach Transplantation.

Zur Transplantation wurden Ratten mit deutlich sichtbarem Morris-Hepatom-7777 (siehe Abb. 2 ) zunächst durch i.p.-Injektion einer Mischung aus 12 mg Rompun (Xylazin) und 80 mg Ketamin pro kg Ratte narkotisiert. Die beidseitig sitzenden Hepatome sind klar begrenzt und können präzise extirpiert werden (siehe Abb. 3 ).

Abb. 3: Präpariertes Morris-Hepatom-7777.


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Nekrosefreies Tumorgewebe wurde mit einer Embryonenquetsche zerdrückt und damit weitgehend von Bindegewebe befreit. Zur Verflüssigung wurden 2 ml Gewebebrei mit 1 ml 0,154 mol/l NaCl-Lösung (0,9% isotone Kochsalzlösung) verdünnt. Jeweils 0,5 ml der resultierenden Flüssigkeit wurden über eine 20 G-Injektionskanüle beidseitig intramuskulär in die Oberschenkelmuskulatur gesunder, mit Äther betäubter Tiere injiziert. Nach drei bis vier Wochen Wachstum können die Hepatome entnommen werden.

2.1.4 Versuchstiere und ihre Haltung

Die Untersuchungen hinsichtlich der Plasma- und Gewebekonzentrationen von ET-1 und Big-ET-1, sowie die Charakterisierung der ET-Rezeptoren am MH-7777 und in Lebergewebe wurden an 250-560 g schweren, 12-15 Monate alten, männlichen und weiblichen Buffalo-Ratten aus der Zucht des Instituts für Molekularbiologie und Biochemie der Freien Universität Berlin durchgeführt. Ebenfalls aus dieser Zucht stammten ca. 9,5 Monate alte männliche Tiere mit Gewichten zwischen 360 und 490 g für die Trinkstudie vor dem Behandlungsversuch und als Kontrollen für die Serumwerte aus dem Behandlungsversuch. Für den Behandlungsversuch wurden männliche Buffalo-Ratten von Møllegard (Ll. Skensved, Dänemark) bezogen und mit einem Gewicht von 290 bis 545 g bei einem Alter von ca. 9,5 Monaten eingesetzt.

Alle Tiere erhielten Standardfutter (Altromin 1324, Altromin, Lage, Deutschland) und Leitungswasser bzw. Leitungswasser-Substanzgemisch ad libitum. Die Flüssigkeitszufuhr wurde im Behandlungsversuch kontrolliert.

Die Ratten wurden in Gruppen von zwei bis vier Tieren pro Käfig gehalten (Polyacrylatkäfige Typ III mit Edelstahldeckel, Ehret, Emmendingen, Deutschland; Tiereinstreu-Faser, Altromin, Lage-Lippe, Deutschland). Die Umweltbedingungen wurden mit einer Temperatur von 20°C (± 2°C), einer Luftfeuchtigkeit von 60% und einem Tag-Nachtzyklus von je 12 Stunden konstant gehalten.

Der Versuch wurde beantragt und am 13.1.1997 von der Senatsverwaltung für Gesundheit und Soziales Berlin mit der Genehmigungsnummer G 0106/96 zugelassen.


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2.2 Zellkultur

2.2.1 Kulturbedingungen und Passage

Die Zellen des MH-7777 wurden im Brutschrank unter Kulturbedingungen von 37°C und 5% CO2 in folgendem Medium kultiviert:

Nach dem Erhalt der Zellen des Morris-Hepatoms-7777 wurden diese zunächst fünfmal passagiert. Die Zellen wurden jeweils bei annäherndem Erreichen der Konfluenz der Zellkolonien in eine neue Flasche umgesetzt. Konfluenz war nach Aussaat von ca. 250.000 Zellen in eine 250-ml-Zellkulturflasche mit 20 ml Kulturmedium nach etwa einer Woche erreicht.

Das Passagieren verlief wie folgt:

Nach Absaugen des Mediums aus der Flasche wurde mit 5 ml PBS gespült und 5 ml Trypsin (0,25%) zugegeben. Während der Inkubation im Brutschrank bei 37°C wurde die Abrundung und Ablösung der Zellen regelmäßig optisch kontrolliert. Dieser Prozeß war nach ca. 10 min abgeschlossen. Daraufhin wurde die Trypsinaktivität mit 6 ml Kulturmedium gestoppt und die Zellen in einem sterilen Zentrifugenröhrchen abzentrifugiert (1200 min-1, 5 min, 4°C). Nach dem Absaugen des Überstands konnten die Zellen resuspendiert und neu ausgesät bzw. für Versuche verwendet werden.


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2.2.2 Inkubation mit ET-1 und ET-Rezeptorantagonisten

Zur Durchführung der Stimulations- und Hemmversuche an MH-7777-Zellen wurden folgende Lösungen hergestellt:

Alle Lösungen wurden anschließend sterilfiltriert, mit FCS-freiem Kulturmedium weiterverdünnt, portioniert und bei -20°C gelagert.

Zur Untersuchung der Wirkung von ET-1 bzw. seinen Antagonisten auf das Wachstum der MH-7777-Zellen sollten Interferenzen mit unbekannten Faktoren aus dem fetalen Kälberserum möglichst ausgeschlossen werden. Deshalb wurde ein Vorversuch durchgeführt, um die Proliferation von MH-7777-Zellen innerhalb eines Tages in FCS-reduziertem bzw. FCS-freiem Medium im Vergleich zu Standardmedium zu untersuchen. Dieser wurde analog der im folgenden geschilderten Versuche realisiert. Statt durch Lösungen mit ET-Rezeptorantagonisten wurde das FCS-haltige Medium nach einem Tag durch Medium mit 5%, 1% bzw. 0% FCS ersetzt. Die Zellmengen nach


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einem weiteren Tag wurden mit MTT-Assays (siehe 2.2.3.1 ) bestimmt. Die Ergebnisse (siehe 3.3 ) ermöglichten die Entscheidung, die weiteren Versuche in FCS-freiem Medium durchzuführen.

Die Behandlung der Zellen mit ET-1 sowie den ET-Antagonisten LU 135252, LU 302872 und BQ 123 wurde auf 96-Well-Zellkultur-Platten durchgeführt. Nach Bestimmung der Zellzahl in einer Neubauer-Zählkammer, wurde die Zellsuspension verdünnt. Pro Well kamen 100 µl mit je 6000 Zellen zur Aussaat.

Versuchsbeginn war nach einem Tag:

Das Kulturmedium wurde abgesaugt und durch 100 µl FCS-freies Medium mit ansteigenden Konzentrationen der zu testenden Substanzen ersetzt. Als Kontrolle dienten Zellen, deren Medium durch FCS-freies Medium ohne Zusätze ersetzt wurde. Die Konzentrationen waren logarithmisch ansteigend wie folgt:

Nach 24stündiger Inkubation bei gleichen Kulturbedingungen wurden Proliferationsassays bzw. die Trypanblau-Färbung (siehe 2.2.5 ) durchgeführt.

2.2.3 Proliferationsassays

2.2.3.1 MTT-Assay

Der kolorimetrische MTT-Assay ist ein seit 1983 ( Mosmann , 1983) weit verbreitetes Verfahren zur Messung der Zahl lebender Zellen in Zellkultursystemen. Er beruht auf der Reduktion des Tetrazoliumsalzes MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromid, C18H16N5SBr) durch verschiedene intrazelluläre Enzyme. Dies geschieht unter Bildung eines wasserunlöslichen Formazan-Farbstoffs, der in einem weiteren Schritt solubilisiert wird. Photometrisch kann die Farbstoffbildung quantifiziert werden. Sie korreliert nach Abzug des Leerwerts direkt mit der Zahl metabolisch aktiver Zellen in der Kultur.

Zur Durchführung wurden in jeden Well 20 µl MTT-Lösung pipettiert. Innerhalb der nächsten vier Stunden bildeten sich intrazellulär mikroskopisch gut erkennbare Farbstoffkristalle. Anschließend wurde zur Lyse der Zellen und zur Solubilisierung der Formazansalze 100 µl SDS-Lösung pro Well zugegeben. 24 Stunden später erfolgte die Messung der Absorption mittels eines Multiwell-Spektrophotometers (ELISA-Reader) bei einer Wellenlänge von 570 nm.

2.2.3.2 BrdU-Assay

Der BrdU-Assay mißt im Gegensatz zum MTT-Assay nicht die Stoffwechselaktivität der vorhandenen Zellen, sondern deren DNA-Synthese als direkteren Ausdruck der proliferativen Aktivität. Die Methode wurde als Alternative zum „Goldstandard“ der Proliferationsassays, dem [3H]Thymidin-Assay entwickelt ( Porstmann et al., 1985). Wie dieser beruht auch der BrdU-Assay auf dem Einbau eines markierten Nukleotids, das über nachgeschaltete Reaktionen quantifizierbar gemacht wird. Entstehende Farbstoffe und damit die Absorption, sind nach Abzug des Leerwerts proportional zur Zahl der proliferierenden Zellen in der jeweiligen Mikrokultur.

Es wurde nach der Anleitung des entsprechenden Kits von Boehringer Mannheim (Cell Proliferation ELISA, BrdU (colorimetric), Kat. Nr. 1 647 229) vorgegangen:

Nach der festgesetzten Inkubationszeit von in diesem Fall 24 Stunden, wurden pro Well 10 µl einer Lösung mit brommarkiertem Desoxyuridin (5-Bromo-2‘-desoxyuridin) zugegeben, was zu einer BrdU-Endkonzentration von 10 µmol/l führte. In der folgenden Reinkubationszeit von 120 min vollzog sich der Einbau des Pyrimidinanalogons BrdU in die DNA proliferierender Zellen anstelle von Thymidin. Anschließend wurde das Kulturmedium entfernt. Nach der Denaturierung der Zellen durch ein mitgeliefertes Schnellfixans erfolgte die Zugabe von hochspezifischen BrdU-Antikörpern in 100 µl Lösung. Nach weiteren 90 min wurden drei Waschgänge durchgeführt und durch Zugabe einer mitgelieferten Substratlösung eine Reaktion zur Detektion der Immunkomplexe ausgelöst. Diese Reaktion wurde nach 30 min mit 25 µl H2SO4 (1 mol/l) gestoppt und unmittelbar anschließend die Absorption in einem Multiwell-Spektrophotometer bei 450 nm gegen eine Referenzwellenlänge von 690 nm gemessen.


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2.2.4 LDH-Bestimmung

Um durch die zugegebenen Substanzen möglicherweise ausgelöste toxische Effekte auszuschliessen, wurde eine Bestimmung der LDH-Aktivität im Überstand der Zellkulturen durchgeführt.

Als Negativkontrolle dienten die unbehandelten Kulturen, während zur Erzeugung einer Positivkontrolle MH-7777-Zellen unter gleichen Bedingungen mit dem zelltoxischen Dimethylsulfoxid (20%, DMSO) behandelt wurden. Um über einen anderen Mechanismus Zellschädigung herbeizuführen, wurde in einigen Kulturen das Medium durch nährstoffreie PBS ersetzt. Eine noch deutlichere Form der Positivkontrolle wurde hergestellt, indem die Zellen mechanisch vom Boden gelöst und durch eine dünne Kanüle gezogen wurden. Ein Leerwert ohne Zellen lief mit.

Um eine größere Menge Überstand zu gewinnen, wurden die Ansätze in 25-ml-Zellkulturflaschen durchgeführt. Da sich in Vorversuchen gezeigt hatte, daß die LDH-Konzentrationen im Überstand der 96-Well-Zellkultur-Platten unter der Nachweisgrenze der verwendeten Methode lagen, wurde die Zellzahl pro ml Kulturmedium erhöht. Zunächst wurden 500.000 Zellen pro Flasche in 4 ml FCS-haltigem Medium ausgesät. Nach 24 Stunden wurde das Medium abgesaugt und durch 2 ml FCS-freies Medium mit den untersuchten Substanzen ersetzt. Es wurden jeweils die höchsten im Proliferationsexperiment (siehe 2.2.2 ) eingesetzten Konzentrationen gewählt, um die Ausprägung möglicher toxischer Effekte zu maximieren. Diese lagen für LU 135252 und LU 302872 bei 10-4 mol/l, sowie für BQ 123 bei 10-3 mol/l. Das Medium der Negativkontrollen wurde gegen 2 ml FCS-freies Medium ohne Zusätze ausgetauscht. Dem FCS-freien Medium der Positivkontrollen war einerseits 20% DMSO zugesetzt, während andererseits das Medium nach 24 Stunden durch 2 ml PBS ersetzt wurde. Nach weiteren 24 Stunden Inkubation - analog den Proliferationsexperimenten unter 2.2.2 - wurden die Überstände entnommen. Im Labor des Instituts für Laboratoriumsmedizin und Pathobiochemie der Charité Berlin, Standort Mitte, bestimmte Dr. med. Lun mittels eines üblichen Analyseautomaten die LDH-Aktivitäten (Gesamt-LDH). Ein Teil der Überstände wurde zusätzlich zur irET-1-Bestimmung im ET-1-Assay eingesetzt (siehe 2.2.6 ).


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2.2.5 Trypanblau-Färbung

Eine weitere Methode zur Überprüfung des Zustands von Zellen ist die Anfärbung mit Trypanblau. Lebende Zellen haben die Fähigkeit diesen Farbstoff abzuwehren und nicht in ihr Zytoplasma eindringen zu lassen. Wenn Zellen nach der Farbstoffzugabe mikroskopisch bläulich angefärbt erscheinen, spricht dies für eine Schädigung bzw. Zelluntergang durch toxische oder auch apoptotische Prozesse.

Nach Durchführung der Ansätze, wie oben beschrieben (siehe 2.2.2 ), wurde das Kulturmedium abgesaugt und jedem Well 20 µl Trypanblau-Lösung (0,4%) zugegeben. Diese wurde nach 3 min wieder abgesaugt. Als Positivkontrollen dienten Zellen, die 24 Stunden mit 20% DMSO im Medium inkubiert waren, sowie Zellen deren Medium durch PBS ersetzt worden war. Diese Positivkontrollen wurden auf gleiche Weise angefärbt. Es folgte die mikroskopische Auswertung der Anfärbbarkeit der MH-7777-Zellen nach 24stündiger Inkubation mit ET-1, den verschiedenen ET-Rezeptorantagonisten in ansteigenden Konzentrationen sowie DMSO und PBS im Vergleich zu unbeeinflußten Kontrollen.

Dazu wurde eine semiquantitative optische Quantifizierungsskala von 0 bis 5 benutzt. Niedrige Werte entsprechen einer geringen Anzahl erkennbar bläulich angefärbter Zellen, während bei einem Wert von 5 alle Zellen angefärbt und damit geschädigt erscheinen.

In jedem Ansatz wurde der Anteil bläulich angefärbter Zellen bezogen auf die Gesamtzellzahl mikroskopisch eingeschätzt. Dementsprechend wurden Werte von 0 bis 5 auf der optischen Quantifizierungsskala zugeordnet.

2.2.6 ET-1-Bestimmung

Zur Abklärung möglicher endogener ET-1-Produktion der MH-7777-Zellen wurde ein Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von irET-1 im Kulturüberstand der Hepatomzellen durchgeführt. Es kam der auch zur LDH-Bestimmung (siehe 2.2.4 ) gewonnene Überstand zur Verwendung. Allerdings wurde irET-1 lediglich im Medium der unbehandelten Kontrollen, sowie im Medium der LU 135252-behandelten Zellen bestimmt. Als Negativkontrolle diente zellfreies Medium. Der ET-1-Assay ist unter 2.3.2.4 beschrieben.


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2.3 Untersuchungen an hepatomtragenden Buffalo-Ratten

2.3.1 Präparation von Hepatomen und Leber

Für die Untersuchungen am MH-7777 (Bestimmung von Plasma- und Gewebe-ET-1 und -Big-ET-1 sowie Scatchard-Rezeptor-Bindungsstudie) wurden MH-7777 21 Tage nach erfolgter Transplantation (siehe auch 2.1.3 ) aus der Oberschenkelmuskulatur 12-15 Monate alter, 250-560 g schwerer, narkotisierter (12 mg Xylazin und 80 mg Ketamin pro kg Ratte i.p.) Buffalo-Ratten freipräpariert. Nach Entfernung von zentralen nekrotischen Anteilen wurde das Gewebe umgehend in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80°C bis zur weiteren Aufarbeitung gelagert. Anschließend wurde bei den gleichen Tieren sowie bei weiteren gesunden Kontrolltieren (siehe Tabelle 6 ) die Leber entnommen und auf identische Weise eingefroren.

Tabelle 6: Alter, Gewicht und Geschlechtsverhältnisse der untersuchten Buffalo-Ratten. Die Daten sind Mittelwerte (± SE). Je Gruppe n=11.

Gruppe

Alter (Monate)

Gewicht (g)

Geschlecht G:E

MH-7777

13,8 ± 0,45

349,9 ± 40,2

5:6

Kontrolle

13,1 ± 0,30

343,6 ± 31,1

4:7

2.3.2 Bestimmung von Plasma- und Gewebe-ET-1 und -Big-ET-1

2.3.2.1 Plasmagewinnung

Vor der Tumorentnahme wurde von den in 2.3.1 genannten narkotisierten Tieren durch Einstechen einer Glaskapillare in den retroorbitalen Venenplexus Blut in ein EDTA-Röhrchen abgenommen. Dieses wurde 15 min zentrifugiert (3000 min-1, 4°C, Kühlzentrifuge J2-21) und das im Überstand resultierende Plasma bis zur weiteren Verwendung im (Big-)ET-1-Assay bei -20°C gelagert.

2.3.2.2 Extraktion von Gewebe-ET-1 und -Big-ET-1

Hepatom- bzw. Lebergewebe wurde aufgetaut und Stücke von annähernd 350 mg abgewogen. Diese wurden in Eppendorfreaktionsgefäßen in flüssigem Stickstoff vorgefroren, um sie dann im ebenfalls vorgefrorenen mittelgroßen Schüttelgefäß eines Mikro-Dismembrators zu pulverisieren (60 s bei 2000 min-1). Das Gewebepulver wurde in 2 ml Phosphatpuffer aufgenommen und mittels eines Vortex-Geräts homogenisiert. Es folgte eine Ultrazentrifugation (60 min bei 100.000×g, 4°C, Centrikon T-2000).

Durch das Detergens Triton-X wurden die Plasmamembranen der noch intakten Zellen aufgelöst. Der Überstand als Gewebeextrakt entspricht weitgehend dem Zytosol, in dem (Big-)ET-1 vorwiegend zu erwarten ist.

Der Überstand wurde bis zur weiteren Verwendung zur Proteinbestimmung und im (Big-)ET-1-Assay bei -20°C tiefgefroren.

2.3.2.3 Proteinbestimmung

Eine Proteinbestimmung in den Gewebeextrakten bzw. in den rohen Plasmamembranfraktionen (siehe 2.3.3.1 ) ist notwendig, da in der Auswertung die (Big-)ET-1-Konzentrationen bzw. die ET-Rezeptordichten auf die jeweiligen Proteinkonzentrationen bezogen werden.

Die Bestimmung erfolgte nach der Methode von Lowry et al. (1951). Diese beruht auf zwei Reaktionen:

Zunächst wurde die Extinktion von Proteinlösungen bekannter Konzentrationen nach Reaktion mit Kupfer(II)-Ionen und Folin-Phenol-Reagenz gemessen, um eine Standardkurve zu erstellen. Die gleichen Reaktionen wurden mit den zu bestimmenden Lösungen durchgeführt. Anhand der gemessenen Extinktionen konnte durch Interpolation der Standardkurve die gesuchte Proteinkonzentration ermittelt werden.

Aufbewahrung der Lösungen bei 4°C, Folin-Phenol-Reagenz bei Raumtemperatur. Durchführung des Versuchs ebenfalls bei Raumtemperatur, wenn nicht anders angegeben.

Gemäß folgendem Pipettierschema wurden verschiedene bekannte Proteinkonzentrationen erzielt sowie die zu messenden Gewebeextrakte angesetzt (siehe Tabelle 7 ):

Tabelle 7: Pipettierschema für die Proteinbestimmung nach Lowry.

Probe

µl Proteinlösung

µl destilliertes Wasser

Leerwert

-

1000

Standardlösung 1

50

950

Standardlösung 2

100

900

Standardlösung 3

200

800

Standardlösung 4

300

700

Standardlösung 5

500

500

Zu bestimmende Lösungen

20

980

Durch Mischung von 100 ml Lösung A und 2 ml Lösung B erhält man Lösung C, die wegen begrenzter Haltbarkeit erst kurz vor Versuchsbeginn hergestellt werden darf.

Zu jeder Probe wurde 4 ml Lösung C pipettiert und gut geschüttelt. Nach 5 min folgten 0,5 ml Folin-Phenol-Reagenz und erneute gute Durchmischung. Während der anschließenden 30minütigen Inkubation im Brutschrank (50°C) bildeten sich die farbigen Verbindungen. Die Extinktion konnte nun bei einer Wellenlänge von 578 nm gemessen werden.


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Alle Proben wurden doppelt angesetzt, gemessen und der Mittelwert gebildet. Der Mittelwert des Leerwerts wurde von allen Extinktionswerten subtrahiert.

Aus den Werten der Standardlösungen wurde eine Standardkurve von Extinktion gegen Proteinkonzentration erstellt. Im Konzentrationsbereich bis 500 mg/l ist die Funktion annähernd linear, so daß eine Regressionsgerade durch die Meßwerte gelegt werden kann. Auf dieser konnten für die Extinktionswerte der zu bestimmenden Lösungen die entsprechenden Proteinkonzentrationen abgelesen werden.

2.3.2.4 ET-1- und Big-ET-1-Assay

Es wurde ein Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von irET-1 verwendet (Biomedica, Wien, Kat. Nr. BI-20022): Mikrotiterplatten sind mit einem immunaffinitätschromatographisch gereinigten polyklonalen ET-1-Antikörper beschichtet. Das irET-1 im zugegebenen Plasma bindet sich daran und ein monoklonaler Zweitantikörper bildet ein Sandwich. Über einen peroxidasemarkierten Detektionsantikörper wird die Menge an gebundenem Zweitantikörper photometrisch bestimmt. Die Farbentwicklung ist direkt proportional der ET-1-Konzentration.

Es wurde nach der Anleitung des erwähnten Kits vorgegangen:

Je 200 µl mitgelieferter ET-1-Standard (0,4; 1; 2,5; 6,25; 15,6 pmol/l), mitgelieferte ET-1-Positivkontrolle, bzw. zu bestimmendes Plasma (aus 2.3.2.1 ) oder Gewebeextrakt (aus 2.3.2.2 ) wurden in verschiedene Wells pipettiert. Je 50 µl Zweitantikörper wurden in alle Wells, außer dem Leerwert hinzupipettiert. Die Mikrotiterplatten wurden mit Folie abgedeckt und 3 Stunden bei 37°C im Schüttler inkubiert. Anschließend erfolgte die Entleerung der Wells und drei Waschdurchgänge mit jeweils 350 µl mitgeliefertem Waschpuffer. Der Zugabe von peroxidasegekoppeltem anti-Maus IgG Antikörper folgte eine erneute Inkubation für 60 min bei 37°C im Schüttler. Nach weiteren drei Waschgängen wurde 200 µl Tetramethylbenzidin-Lösung als Substrat in alle Wells pipettiert Es folgte eine Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur in Dunkelheit. Nach der Zugabe von 50 µl mitgelieferter Stoplösung in alle Wells wurde die Platte gut geschüttelt und sofort die Extinktion bei 450 gegen 690 nm als Referenz gemessen.

Der Absorptionswert des Leerwerts wurde von allen anderen Meßwerten abgezogen. Sodann wurde aus den Meßwerten der Standards eine Standardkurve erstellt, auf der die ET-1-Konzentrationen der Proben abgelesen werden konnten.

Der Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von irBig-ET-1 (Biomedica, Wien, Kat. Nr. BI BI-20072) unterschied sich nur in wenigen Punkten:


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Einsatz von nur 100 µl mitgeliefertem Big-ET-1-Standard, mitgelieferter Big-ET-1-Positivkontrolle, zu bestimmendem Plasma oder Gewebeextrakt, peroxidasegekoppeltem Antikörper sowie Tetramethylbenzidin-Lösung.

2.3.3 Scatchard-Rezeptor-Bindungsstudie

Die Scatchard-Rezeptor-Bindungsstudie ist ein Verfahren zur Bestimmung von Rezeptoraffinität und Rezeptordichte an Zellen oder in Gewebe. In der vorliegenden Arbeit sollten Affinität und Dichte von ET-Rezeptoren an MH-7777- sowie Lebergewebe gemessen werden.

Dazu ist zunächst die Aufarbeitung des Gewebes notwendig, um eine standardisierte Gewebefraktion zu erhalten, auf der der interessierende Hauptanteil der ET-Rezeptoren vermutet wird. Es wird eine Proteinbestimmung durchgeführt (siehe 2.3.2.3 ), um in der anschließenden Bindungsstudie Gewebeproben mit gleicher Proteinkonzentration einsetzen zu können. In der Auswertung wird die Rezeptordichte auf die Proteinmenge bezogen. In der folgenden Bindungsstudie wird das Verhältnis der Bindung von radioaktiv markiertem zu unmarkiertem ET-1 in Gegenwart eines ETA- bzw. ETB-Rezeptorliganden untersucht.

Die Präparation der rohen Plasmamembranfraktionen aus den MH-7777 und die Bindungsstudie wurden mit geringen Modifikationen nach der von Hocher et al. (1992, 1995a,b) beschriebenen Methode durchgeführt. Die Auswertung wird durch die lineare Umformung nach Scatchard (1949) ermöglicht.

2.3.3.1 Präparation der rohen Plasmamembranfraktion

Die Methode geht auf Nambi et al. (1990) zurück.

Es wurde 0,4 g Hepatom- bzw. Lebergewebe abgewogen und mit einer Schere grob zerkleinert. Der Brei wurde in 10 ml NaHCO3 (20 mmol/l) aufgenommen und über


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20 Durchgänge in einem elektrischen Potter-Homogenisator bei 1000 min-1 weiter zerkleinert. Es schlossen sich 20 Hübe mit lose sitzendem L-Pistill im Dounce-Gefäß an.

Die Homogenate wurden 15 min bei 3000 min-1 (1000×g, 4°C, Bremse offen, Kühlzentrifuge J2-21) zentrifugiert, um größere Zellfragmente zu eliminieren. Der verbleibende Überstand wurde erneut 30 min bei 18.250 min-1 (40.000×g, 4°C, Bremse offen, Centrikon T-2000) ultrazentrifugiert. Das Pellet wurde in 1,5 ml Scatchard-Bindungspuffer ohne BSA resuspendiert und bis zur weiteren Verarbeitung (Proteinbestimmung siehe 2.3.2.3 , Bindungsstudie) bei -20°C eingefroren.

Alle geschilderten Arbeitsschritte wurden auf Eis bei 4°C durchgeführt.

2.3.3.2 Bindungsstudie

Ziel der Bindungsstudie ist es, eine Sättigungskurve für ET-1, d.h. eine Funktion von gebundenem zu ungebundenem ET-1 bei steigenden ET-1-Konzentrationen zu erstellen. Dazu wird ET-1 gemäß der untenstehenden ET-1-Verdünnungsreihe zur Lösung der rohen Plasmamembranfraktion zugegeben. Um die Bindung nach der Inkubation messen zu können, wird zusätzlich radioaktiv markiertes ET-1 eingesetzt. Einerseits bindet ET-1 selektiv an sättigbaren spezifischen Bindungsstellen - den ET-Rezeptoren - andererseits auch unspezifisch an Strukturen wie Proteinen, Lipiden, Zellmembranen und am Kunststoffmaterial. Diese unspezifische Bindung ist nicht sättigbar, sondern steigt proportional zur Konzentration des Liganden an. Unspezifische Bindungsstellen sind in wesentlich höherer Anzahl vorhanden als spezifische. Demgegenüber ist die Affinität des Liganden zu den unspezifischen Bindungsstellen deutlich geringer als zu den spezifischen. Um den Anteil der unspezifischen Bindung zu quantifizieren, wird unmarkiertes ET-1 in 50.000fachem Überschuß zugegeben. Das markierte ET-1 wird aufgrund dieses Überschusses praktisch vollständig von der geringen Anzahl spezifischer Bindungsstellen verdrängt. Die noch zu messende Bindung des radioaktiven ET-1 entspricht der unspezifischen Bindung. Die spezifische Rezeptorbindung erhält man durch Subtraktion der unspezifischen von der Gesamtbindung.

In 10 ml Scatchard-Bindungspuffer mit BSA wurde 1 g/l Bacitracin gelöst. Es wurden ca. 60 µl [125J]ET-1-Lösung mit einer Aktivität von ca. 1,85 MBq/l (spezifische Aktivität des [125J]ET-1: 81.400 TBq/mol) zugegeben, bis die Zählraten des Gammazählers in 50 µl bei 30.000-40.000 cpm lagen. Zur selektiven Analyse der ET-Rezeptorsubtypen wurden jeweils 4,5 ml dieser Lösung mit 82,5 µl entweder BQ 123-Lösung oder BQ 3020-Lösung ergänzt. Die resultierende Konzentration ist damit ausreichend zur völligen Absättigung des betreffenden Rezeptorsubtyps.

Pro Lösung roher Plasmamembranfraktion wurden in zwei Sätze à acht Eppendorfreaktionsgefäße jeweils 50 µl der acht verschiedenen Konzentrationen der ET-1-Verdünnungsreihe pipettiert. Dazu kamen in einen Satz je 50 µl der radioaktiven Antagonistenlösung mit BQ 123, in den anderen Satz je 50 µl der Lösung mit BQ 3020.

Zum Starten der Bindungsreaktion wurden 50 µl der Lösung roher Plasmamembranfraktion eines Organs bzw. Tumors in jedes der 2×8 Eppendorfreaktionsgefäße pipettiert. Die Inkubation erfolgte bei Raumtemperatur.

Als geeignete Inkubationszeit zur Einstellung eines Gleichgewichts zwischen Assoziations- und Dissoziationsvorgängen hatten sich 120 min erwiesen. Nach dieser Zeit wurde die Bindungsreaktion durch 1 ml kalten (4°C) Bindungspuffer mit BSA gestoppt.

Freies und rezeptorgebundenes (sowohl unmarkiertes als auch radioaktives) ET-1 wurde durch Zentrifugation bei 13.000 min-1 (20.000×g, 10 min, 4°C, Biofuge 13) getrennt. Die Pellets wurden zwei weitere Male mit eiskaltem Scatchard-Bindungspuffer mit BSA gewaschen. Dazu wurde der Überstand abgesaugt, 1 ml Scatchard-Bindungspuffer mit BSA zugegeben, standardisiert 10 s mit einem Vortex-Gerät auf höchster Schnelligkeitsstufe gemischt und erneut unter o.g. Bedingungen zentrifugiert.

Nach dem letzten Absaugvorgang erfolgte die Zählung der radioaktiven Impulse pro Minute im Pellet durch einen automatischen Gammazähler. Damit konnte die Menge des gebundenen [125J]ET-1 quantifiziert werden.


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Alle Ansätze wurden parallel dreifach durchgeführt und der Mittelwert gebildet.

Der Wert für die unspezifische Bindung im Ansatz mit 10 µmol/l ET-1 wurde von den Werten aller anderer Ansätze abgezogen, um die spezifische Bindung zu erhalten.

Aus der bekannten Aktivität des [125J]ET-1 und einer bekannten Zählausbeute des Gammazählers von 78%, konnte die Menge des [125J]ET-1 im Testansatz errechnet werden. Zusammen mit der bekannten Menge des unmarkierten ET-1 aus der ET-1-Verdünnungsreihe ergab sich die Gesamt-ET-1-Menge im Testansatz. Durch Übertragung des bekannten Verhältnisses von spezifisch gebundenem zu gesamtem [125J]ET-1 auf das gesamte ET-1 (unmarkiert und markiert), erhält man die Menge des spezifisch gebundenen und freien Gesamt-ET-1. Daraus konnte die gesuchte Sättigungskurve erstellt werden.

2.3.4 Behandlungsversuch mit LU 302872

In einem Vorversuch wurde die normale Trinkmenge einer gesunden Buffalo-Ratte ermittelt. Außerdem sollte die Verträglichkeit von LU 302872 im Trinkwasser geprüft werden.

Dazu wurden 11 männliche Buffalo-Ratten im Alter von ca. 9,5 Monaten und einem Gewicht von 360-490 g (Mittelwert ± SE: 436,4 ± 11,2 g) über 28 Tage kontrolliert. Vier Tiere bekamen wie bisher Leitungswasser ad libitum. Bei sieben Tieren wurde das Trinkwasser durch eine LU 302872-Lösung ersetzt (Zusammensetzung siehe unten). Die Trinkmenge und das Körpergewicht wurden regelmäßig im Abstand von wenigen Tagen gemessen.

Tabelle 8: Alter, Gewicht und Geschlecht der im Behandlungsversuch eingeschlossenen Buffalo-Ratten. Die Daten sind Mittelwerte (± SE). Je Gruppe n=22.

Gruppe

Alter (Monate)

Gewicht (g)

Geschlecht

Behandlung

9,41 ± 0,04

467,3 ± 13,5

G

Kontrolle

9,44 ± 0,03

486,1 ± 9,1

G

Der Behandlungsversuch wurde an 44 männlichen Buffalo-Ratten mit einem Alter von ca. 9,5 Monaten und einem Gewicht von 290-545 g durchgeführt (siehe Tabelle 8 ). Die Tiere bekamen beidseitig Morris-Hepatome in die Oberschenkelmuskulatur transplantiert, wie oben beschrieben (siehe 2.1.3 ). Die Tiere wurden zur Transplantation


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nacheinander aus den Käfigen genommen, danach alternierend zwei Gruppen zugeordnet und damit randomisiert verteilt.

Die Gruppen unterschieden sich weder im Vorversuch, noch im Behandlungsversuch hinsichtlich des Alters oder Gewichts statistisch signifikant voneinander.

Die Behandlungsgruppe erhielt als Trinkflüssigkeit statt Leitungswasser eine Lösung mit LU 302872:

Diese Lösung entspricht 3,15 mmol/l LU 302872. Sie wurde so berechnet, daß sich für eine 500 g schwere Ratte bei einer täglichen Trinkmenge von 30 ml eine angestrebte LU 302872-Dosis von 100 mg/kg×d ergibt. Im Verlauf des Versuchs zeigte sich eine deutliche Abnahme der Trinkmenge, so daß die Zusammensetzung der Lösung verändert wurde: Ab dem 20. Versuchstag wurde die doppelte Menge LU 302872 (3,33 g/l Lösung) eingesetzt und zusätzlich 10% Saccharose (100 g/l Lösung) zugegeben.

Die Kontrollgruppe erhielt wie bisher Leitungswasser ad libitum.

Alle fünf Tage wurde die LU 302872-Lösung neu angesetzt und zusammen mit dem Leitungswasser ausgetauscht. Gleichzeitig wurde die Trinkmenge der zurückliegenden fünf Tage durch Wiegen der Trinkflaschen bestimmt. Die durchschnittliche Trinkmenge pro Tier und Tag ergab sich aus der Division der pro Käfig getrunkenen Flüssigkeit durch die Anzahl der Ratten pro Käfig und die Zahl der vergangenen Tage. Ebenfalls alle fünf Tage wurden die Ratten anschließend an die Bestimmung der Trinkmenge gewogen.

Der Versuch erstreckte sich über 28 Tage. Überwacht wurden die Trinkmenge, das Körpergewicht, das Verhalten und Aussehen der Tiere sowie das Tumorwachstum. Am 28. Tag wurde Serum gewonnen (siehe 2.3.4.4 ) und die Tumoren wurden präpariert (siehe 2.3.4.3 ). Auch Leber, Herz und Nieren wurden entnommen und gewogen.

Zur Beurteilung des Tumorwachstums wurden verschiedene Methoden verwendet.


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2.3.4.1 Tumorwachstumsmessung mit Schublehre

Zur regelmäßigen Überwachung des Wachstumsverlaufs der Hepatome wurden die Durchmesser aller Tumoren in Abständen von fünf Tagen mit einer Schublehre in leichter Äthernarkose bestimmt. Diese Methode wurde für das MH in der Literatur u.a. von Erdstein et al. (1984; 1989) und Mishkin et al. (1981) beschrieben. Die Messungen wurden immer vom gleichen Untersucher durchgeführt, ohne daß dieser zum Zeitpunkt der Messung die Gruppenzugehörigkeit der Tiere kannte.

Der Tumor wurde durch das dünne umgebende Gewebe hindurch palpiert und der größte in bezug zum Oberschenkel transversale Durchmesser mit der Schublehre bestimmt (siehe Abb. 4 ).

Abb. 4: Messung des transversalen Durchmessers eines MH-7777 in vivo mittels Schublehre. 28. Tag nach Transplantation.

2.3.4.2 Sonographische Tumorvolumenbestimmung

Einmalig wurde am 20. Tag nach Transplantation das Tumorvolumen sonographisch bestimmt.

An den narkotisierten (12 mg Xylazin und 80 mg Ketamin pro kg Ratte i.p.) Buffalo-Ratten wurde sonographisch ein in bezug zum Oberschenkel transversaler Schnitt durch den Tumor gelegt. Längs- und Querdurchmesser wurden vermessen und ein Ausdruck angefertigt. Unter der Annahme eines Rotationsellipsoids wurde über die Formel 4/3pi·ab2 das angenäherte Tumorvolumen berechnet. Dabei entsprechen a und


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b den Radien, also der Hälfte der gemessenen Durchmesser. Der größere Längsdurchmesser ist 2·a, der kleinere Querdurchmessers entspricht 2·b.

Das Sonographiegerät (Sigma 1 AC, Kontron, München, Deutschland) wurde uns für diesen Zweck freundlicherweise von Dr. G. Baatz überlassen. Die beste Auflösung ergab ein 7,5 MHz-Schallkopf (Typ S CE, Kontron, München, Deutschland), der uns freundlicherweise von Herrn Hölscher (Kontron, Filiale Berlin, Deutschland) leihweise zur Verfügung gestellt wurde.

2.3.4.3 Messung von Tumorgewicht und -volumen nach Entnahme

Am 28. Tag nach Transplantation wurden die Tumoren in Narkose entnommen, wie unter 2.3.1 beschrieben.

Die Hepatome wurden trockengetupft und einzeln gewogen. Außerdem erfolgte eine Vermessung von Höhe, Breite und Tiefe der freipräparierten Tumoren mit der Schublehre (siehe Abb. 5 ). Als Annäherung an das Tumorvolumen wurde aus diesen Werten über die Formel 4/3pi·abc ( Linder-Horowitz et al. 1969) ein Volumen errechnet. Dabei sind a, b und c die jeweiligen Radien, entsprechen also jeweils der Hälfte von Höhe, Breite und Tiefe.

Abb. 5: Vermessung eines freipräparierten MH-7777 mit der Schublehre.

2.3.4.4 Serumanalysen

Vor der Tumorentnahme wurde den narkotisierten Tieren durch Einstechen einer Glaskapillare in den retroorbitalen Venenplexus Blut in ein Serum-Röhrchen entnommen. Dieses wurde 15 min zentrifugiert (3000 min-1, 4°C, Kühlzentrifuge J2-21) und das im Überstand resultierende Serum bis zur weiteren Verwendung bei -20°C gelagert.


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Von gesunden, altersgleichen (ca. 9,5 Monate) männlichen Buffalo-Ratten aus der Zucht des Instituts für Molekularbiologie und Biochemie der Freien Universität Berlin wurde auf die gleiche Weise Serum gewonnen. Dieses diente als Kontrollmaterial von gesunden Tieren ohne Hepatom.

Im Institut für Laboratoriumsmedizin und Pathobiochemie der Charité Berlin, Standort Mitte, wurden von Dipl. chem. Priem in den Serumproben Natrium, Gesamtprotein, Albumin, Kreatinin, Harnstoff (Urea), Cholesterin, Triglyceride, Aspartataminotransferase, Alaninaminotransferase, Glukose und LDH mit Routineverfahren bestimmt.

2.4 Statistische Verfahren

Die gemessenen und errechneten Werte und sind als Mittelwert ± Standardfehler (SE) oder wenn angegeben ± Standardabweichung (SD) dargestellt.

Die Unterschiede zwischen Gruppen wurden mit Hilfe von verbundenen und unverbundenen t-Tests festgestellt.

Zur Sicherung des Unterschieds der mit der Schublehre ermittelten Wachstumskurven und Tiergewichtsverläufe wurden mit Hilfe von Dr. Trautner (Institut für Arbeitsmedizin, Sozialmedizin und Epidemiologie der Humboldt Universität zu Berlin) „Analysis of variance“-Berechnungen (ANOVA) mit dem SAS-System durchgeführt.

Ein Ergebnis wurde als signifikant angesehen, wenn die Irrtumswahrscheinlichkeit p kleiner als 5% war.


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Fri Mar 16 16:37:30 2001