Pfab, Thiemo: Zum Endothelinsystem im Morris-Hepatom-7777 - Behandlung mit Endothelinrezeptorantagonisten in vitro und in vivo

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Kapitel 3. Ergebnisse

3.1 Plasma- und Gewebekonzentrationen von irET-1 und irBig-ET-1 bei hepatomtragenden Buffalo-Ratten

3.1.1 Plasmakonzentrationen von irET-1 und irBig-ET-1

Die Plasmawerte für irET-1 und irBig-ET-1 zeigen keine signifikanten Unterschiede zwischen hepatomtragenden und gesunden Buffalo-Ratten. Dies gilt sowohl für einen Vergleich der Gesamtgruppe wie auch für eine nach Geschlechtern getrennte Auswertung (siehe Tabelle 9 ). Auch die Werte beider Geschlechter innerhalb einer Gruppe unterscheiden sich nicht statistisch signifikant.

Der Quotient irET-1/irBig-ET-1 unterscheidet sich ebenfalls weder hinsichtlich der Gruppen insgesamt, noch hinsichtlich der Geschlechter zwischen oder innerhalb der Gruppen signifikant (keine Darstellung der Daten).

Tabelle 9: irET-1- und irBig-ET-1-Konzentrationen im Plasma von MH-7777-tragenden Buffalo-Ratten sowie von gesunden Kontrollen. Angaben in pmol irET-1 bzw. irBig-ET-1 pro l Plasma. Die Daten sind Mittelwerte (± SE). Je Gruppe n=11 (MH-7777 5G und 6E, Kontrolle 4G und 7E). Unterschiede zwischen Gruppen und Geschlechtern sind nicht signifikant.

 

irET-1 (pmol/l)

irBig-ET-1 (pmol/l)

 

Gesamt

G

E

Gesamt

G

E

MH-7777

24,3 ± 6,1

14,5 ± 2,0

32,1 ± 9,8

16,6 ± 2,2

12,9 ± 5,0

19,7 ± 3,9

Kontrolle

24,0 ± 3,9

25,1 ± 3,2

23,5 ± 5,6

15,7 ± 2,3

14,3 ± 4,8

16,5 ± 2,5


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3.1.2 Proteinkonzentrationen in Hepatom- und Lebergewebe

Die Proteinkonzentrationen in Gewebeextrakt aus annähernd gleichen Mengen aufgearbeitetem Gewebe sind im Hepatom signifikant geringer als in Lebergewebe. Außerdem ist der Proteingehalt in der Leber von hepatomtragenden Tieren (Hepatomleber) im Vergleich zu Leber aus gesunden Kontrolltieren (Kontrolleber) leicht, aber statistisch signifikant vermindert (siehe Tabelle 10 ).

Tabelle 10: Proteinkonzentrationen der zur Bestimmung von Gewebe-ET-1 und -Big-ET-1 aufgearbeiteten Gewebeextrakte. Angaben in g/l Gewebeextrakt. Für Hepatom gilt p<0,00000001 in bezug auf die beiden anderen Werte, für Hepatomleber vs. Kontrollleber gilt p<0,01. Errechnung der p-Werte im unverbundenen (Kontrolleber vs. Hepatom und Hepatomleber) bzw. verbundenen (Hepatom vs. Hepatomleber) t-Test. Die Daten sind angegeben als Mittelwerte (± SE). Je Gruppe n=11.

Proteinkonzentration (g/l Gewebeextrakt)

Hepatom

Hepatomleber

Kontrolleber

16,2 ± 0,52

29,2 ± 0,38

30,8 ± 0,31

3.1.3 Gewebekonzentrationen von irET-1 und irBig-ET-1

Sowohl die irET-1- wie auch die irBig-ET-1-Gewebekonzentration ist nach 21 Tagen im MH-7777 signifikant gegenüber Lebergewebe von hepatomtragenden (Hepatomleber) und gesunden Tieren (Kontrolleber) erhöht (um durchschnittlich 93,7% [irET-1] bzw. 37,0% [irBig-ET-1] bezogen auf Kontrolleber). Zwischen Lebergewebe von hepatomtragenden und gesunden Buffalo-Ratten besteht statistisch kein signifikanter Unterschied hinsichtlich der irET-1- und irBig-ET-1-Konzentrationen (siehe Abb. 6 ).


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Abb. 6: Gewebekonzentrationen von irET-1 und irBig-ET-1 in Hepatom, Hepatomleber (Leber von hepatomtragenden Buffalo-Ratten) und Kontrolleber. Angaben in pmol irET-1 bzw. irBig-ET-1 bezogen auf g Protein im Gewebeextrakt. Die Daten sind Mittelwerte (± SE) aus n=11 je Kategorie. *p<0,05 **p<0,001 vs. Hepatom im unverbundenen (Kontrolleber vs. Hepatom) bzw. verbundenen (Hepatomleber vs. Hepatom) t-Test.

Auch der Quotient von irET-1 zu irBig-ET-1 ist im Hepatomgewebe bezogen auf die Proteinmenge signifikant höher als in Hepatomleber und Kontrolleber. Bezogen auf die Hepatomleber ist der Quotient im Hepatom um durchschnittlich 64,2% erhöht, bezogen auf die Kontrolleber um durchschnittlich 55,0% (siehe Abb. 7 ).


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Abb. 7: Quotient von irET-1 durch irBig-ET-1 in Hepatom, Hepatomleber (Leber von hepatomtragenden Buffalo-Ratten) und Kontrolleber. Die Daten sind Mittelwerte (± SE) aus n=11 je Kategorie. *p<0,0001 vs. Hepatom im unverbundenen (Kontrolleber vs. Hepatom) bzw. verbundenen (Hepatomleber vs. Hepatom) t-Test.

Nach Geschlechtern aufgeschlüsselt stellen sich die gleichen Ergebnisse wie folgt dar (siehe Tabelle 11 ): Für die einzelnen Werte bestehen im Hepatom keine signifikanten Unterschiede zwischen den Geschlechtern. Hinsichtlich der irET-1-Konzentration in Hepatomleber und hinsichtlich aller Parameter in Kontrolleber sind signifikant höhere Werte bei weiblichen Tieren zu verzeichnen.

Tabelle 11: Geschlechtsspezifische Darstellung der Gewebekonzentrationen von irET-1 und irBig-ET-1 und des Quotienten irET-1/Big-ET-1 in Hepatom, Hepatomleber (Leber von hepatomtragenden Buffalo-Ratten) und Kontrolleber. Angaben in pmol irET-1 bzw. irBig-ET-1 bezogen auf g Protein im Gewebeextrakt. Der Quotient hat keine Einheit. Die Daten sind Mittelwerte (± SE) aus mindestens n=4 je Wert (Hepatom und Hepatomleber 5G und 6E, Kontrolleber 4G und 7E). *p<0,05 vs. gleicher Parameter der männlichen Tiere im unverbundenen t-Test.

 

Hepatom

Hepatomleber

Kontrolleber

 

G

E

G

E

G

E

irET-1

0,83 ± 0,14

0,77 ± 0,11

0,28 ± 0,01

0,45 ± 0,06*

0,27 ± 0,03

0,51 ± 0,06*

irBig-ET-1

0,25 ± 0,03

0,32 ± 0,04

0,17 ± 0,01

0,23 ± 0,03

0,16 ± 0,02

0,25 ± 0,02*

Quotient

3,26 ± 0,24

2,80 ± 0,16

1,62 ± 0,09

2,01 ± 0,15

1,68 ± 0,12

2,12 ± 0,11*


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3.2 ET-Rezeptoren in Hepatom- und Lebergewebe

3.2.1 ETA- und ETB-Rezeptordichte in Hepatom- und Lebergewebe

Aus den Scatchard-Rezeptor-Bindungsstudien resultieren Sättigungskurven. In diesen wird das nicht spezifisch gebundenen ET-1 (Abszisse) dem spezifisch gebundenen ET-1 (entspricht den gebildeten Hormon-Rezeptor-Komplexen), bezogen auf das Gesamtprotein (Ordinate), gegenübergestellt (siehe Abb. 8 ).

Abb. 8: Spezifische Bindung von [125J]ET-1 und unmarkiertem ET-1 bei Anwesenheit von 10 mol/l BQ 123 (ETA-Rezeptorantagonist) im Bindungsansatz zur Analyse der ETB-Rezeptordichte. Gezeigt ist eine typische Sättigungskurve an MH-7777-Gewebe, Hepatomleber (Leber von einer hepatomtragenden Buffalo-Ratte) und Kontrolleber. Free: Konzentration des gesamten nicht spezifisch gebundenen ET-1 in nmol/l; Bound: Konzentration des gesamten spezifisch gebundenen ET-1 (entspricht der Konzentration der gebildeten Hormon-Rezeptor-Komplexe) in pmol pro g Protein im Ansatz. Das Insert zeigt die lineare Umformung nach Scatchard. Alle Daten sind Mittelwerte aus drei parallelen Bestimmungen.


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Um die maximale Bindungskapazität (Bmax-Wert, entspricht der Rezeptordichte) und die Affinität der Bindungsstellen (KD-Wert) zu berechnen, wird die lineare Umformung nach Scatchard durchgeführt (siehe Insert Abb. 8 ).

Falls es sich um eine homogene Rezeptorpopulation ohne positive oder negative Kooperativität handelt, führt diese Darstellung zu einer Geraden. Die Scatchardtransformation der Bindungsdaten für den ETA- und ETB-Rezeptor in Hepatom, Hepatomleber (Leber von hepatomtragenden Buffalo-Ratten) und Kontrolleber ergaben stets einen linearen Zusammenhang zwischen Bound/Free und Bound. Dies bedeutet, daß jeweils nur ein Typ von ETA- bzw. ETB-Rezeptoren in den Geweben vorhanden ist.

Der Bmax-Wert entspricht dem Schnittpunkt mit der Abszisse, der KD-Wert ist der negative Kehrwert der Steigung.

Abb. 9: ETA- und ETB-Rezeptordichte in Hepatom, Hepatomleber und Kontrolleber. Angegeben als Bmax in pmol Rezeptoren pro g Protein im Ansatz, abgelesen aus den Sättigungskurven nach Scatchardtransformation. Die Daten sind Mittelwerte (± SE) aus jeweils n=11. *p<0,05, **p<0,0001, #p=0,08 jeweils vs. Hepatom der gleichen Rezeptorart im unverbundenen (Kontrolleber) bzw. verbundenen t-Test (Hepatomleber).

Die Auswertung der Bmax-Werte zeigt im Hepatomgewebe eine signifikant höhere ETA-Rezeptordichte als in der Hepatomleber (Leber von hepatomtragenden Buffalo-Ratten). Im Vergleich zu Hepatomleber ergeben die Werte eine Zunahme der ETA-Rezeptordichte um 33,8%, im Vergleich zu Kontrolleber um 25,8%. Das Signifikanzniveau


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von Hepatom zu Kontrolleber liegt mit p=0,08 geringfügig über der Signifikanzschwelle. Es gibt jedoch keinen signifikanten Unterschied zwischen Kontroll- und Hepatomleber (siehe Abb. 9 ).

Im Gegensatz zur ETA-Rezeptordichte ist die ETB-Rezeptordichte im Hepatom im Vergleich zu den beiden anderen Geweben hochsignifikant erniedrigt. Bezogen auf Hepatomleber ist die ETB-Rezeptordichte im Hepatom um 66,7%, bezogen auf Kontrollleber um 59,0% herabgesetzt.

Damit ist die ETB/ETA-Rezeptor-Relation im MH-7777-Gewebe mit 0,41 am niedrigsten, verglichen mit 1,27 in Kontrolleber und 1,66 in Leber von hepatomtragenden Buffalo-Ratten.

Abb. 10: ETA- und ETB-Rezeptordichte in Hepatom, Hepatomleber und Kontrolleber aufgegliedert nach Geschlechtern (m=G, w=E). Angegeben als Bmax in pmol Rezeptoren pro g Protein im Ansatz, abgelesen aus den Sättigungskurven nach Scatchardtransformation. Die Daten sind Mittelwerte (± SE) aus mindestens n=4 je Wert (Hepatom und Hepatomleber 5G und 6E, Kontrolleber 4G und 7E). *p<0,05, **p<0,001, jeweils vs. Hepatom der gleichen Rezeptorart und des gleichen Geschlechts im unverbundenen (Kontrolleber) bzw. verbundenen t-Test (Hepatomleber). #p<0,05 vs. gleicher Wert des anderen Geschlechts.

Aufgeschlüsselt nach Geschlechtern, zeigt sich ausschließlich hinsichtlich der ETA-Rezeptoren im Hepatomgewebe eine signifikante Differenz zwischen männlichen und weiblichen Tieren (siehe Abb. 10 ). Die ETA-Rezeptordichte ist bei weiblichen Tieren im


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Hepatom nicht signifikant gegenüber den beiden anderen Geweben erhöht, wie dies bei den männlichen Tieren und in der Gesamtbetrachtung der Fall ist. Bezüglich der ETB-Rezeptoren gibt es im Vergleich zur nicht nach Geschlechtern getrennten Betrachtungsweise keine Unterschiede.

3.2.2 Bindungsaffinität der ETA- und ETB-Rezeptoren

Die Bindungsaffinität der ETA-Rezeptoren ist in allen Geweben signifikant höher als die der ETB-Rezeptoren. Betrachtet man jeden der zwei Rezeptortypen für sich, so gibt es zwischen den drei untersuchten Gewebetypen wenig Unterschiede. Lediglich die Affinität des ETA-Rezeptors in MH-7777-Gewebe ist gegenüber Kontrolleber statistisch signifikant erniedrigt. Die Affinität der ETB-Rezeptoren ist in den drei Gewebetypen nicht signifikant unterschiedlich (siehe Tabelle 12 ). Die nach Geschlechtern getrennte Auswertung ergibt knapp signifikante Unterschiede für etwas höhere KD-Werte der ETA-Rezeptoren in Kontrolleber und der ETB-Rezeptoren in Hepatomgewebe von männlichen Tieren.

Tabelle 12: Bindungsaffinitäten der ETA- und ETB-Rezeptoren in MH-7777-Gewebe, Hepatomleber (Leber von hepatomtragenden Buffalo-Ratten) und Kontrolleber. Angabe der Bindungskonstanten KD (entspricht der Rezeptorbindungsaffinität) in pmol/l, abgelesen aus den Sättigungskurven nach Scatchardtransformation. Die Daten sind Mittelwerte (± SE) aus jeweils n=11. *p<0,01 vs. ETA-Rezeptoraffinität im gleichen Gewebe im verbundenen t-Test, #p<0,05 vs. ETA-Rezeptoraffinität in Kontrolleber im unverbundenen t-Test. +p<0,05 männliche vs. weibliche Tiere im unverbundenen t-Test (höhere Werte bei männlichen Tieren).

KD (pmol/l)

Hepatom

Hepatomleber

Kontrolleber

ETA-Rezeptoraffinität

757 ± 62 #

992 ± 121

1093 ± 128 +

ETB-Rezeptoraffinität

470 ± 25 * +

444 ± 41 *

533 ± 49 *


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3.3 Wachstumsverhalten der MH-7777-Zellen bei Inkubation mit ET-1 und ET-Rezeptorantagonisten

Im Vorversuch zur Klärung der FCS-abhängigkeit von MH-7777-Zellen ergab sich eine verminderte MTT-Reduktion durch Absenkung der FCS-Konzentration. Bei 5% und 1% FCS im Standardkulturmedium bewegen sich die durchschnittlichen Extinktionen (die sich proportional zur Zellmenge verhalten) mit 104,6% bzw. 97,5% noch dicht bei dem Kontrollwert der durchschnittlichen Extinktion bei 10% FCS im Medium (Kontrolle, gesetzt: 100%). In FCS-freiem Medium ist die durchschnittliche Extinktion nach einem Tag mit 74,9% der Kontrolle signifikant geringer (siehe Abb. 11 ).

Abb. 11: Wachstumsverhalten von MH-7777-Zellen in Kulturmedien mit verschiedenen FCS-Konzentrationen. Zellmengen von MH-7777-Zellen nach einem Tag Wachstum in Kulturmedien mit 0%, 1% und 5% FCS. Messung der Zellmengen über MTT-Assays. Angaben in Prozent der Extinktion bezogen auf die Extinktion bei einer Konzentration von 10% FCS im Kulturmedium. Errechnung der relativen Extinktion nur innerhalb des gleichen Versuchsdurchgangs. Die Daten sind angegeben als Mittelwerte (± SD) aus zwei Versuchsdurchgängen (n=2) mit jeweils zwölf parallelen Bestimmungen. *p<0,05 vs. Kontrolle (100%) im verbundenen t-Test.

Die Ergebnisse aus den Proliferationsassays nach ET-1-Stimulation waren nur unter Vorbehalt auszuwerten, da es extreme Schwankungen der Werte zwischen den einzel


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nen Versuchsdurchgängen gab. Versuche, diese Schwankungen durch Wiederholungen zu eliminieren, schlugen fehl. Innerhalb der einzelnen Versuchsdurchgänge liegen die Ergebnisse für die verschiedenen ET-1-Verdünnungsstufen allerdings meist dicht beieinander. Trotzdem wurden in Abb. 12 Mittelwerte der Ergebnisse aus den MTT-Assays gebildet, die relativ gut mit den Werten des einzigen durchgeführten BrdU-Assays übereinstimmen. Das Maximum liegt für den MTT-Assay bei einer Konzentration von 10-9 mol/l ET-1, mit durchschnittlich 134,7 % der Extinktion unbehandelter Kontrollen. Dieser Unterschied gegenüber den Kontrollwerten ist auch statistisch signifikant, ebenso wie die Unterschiede an den beiden nächsthöheren Konzentrationsstufen. Das Maximum im BrdU-Assay liegt mit 126,1% bei einer Konzentration von 10-10 mol/l.

Abb. 12: Wachstumsverhalten von MH-7777-Zellen bei verschiedenen ET-1-Konzentrationen. Zellmengen von MH-7777-Zellen nach einem Tag Wachstum in Kulturmedien mit den angegebenen ET-1-Konzentrationen. Messung der Zellmengen über MTT- und BrdU-Proliferationsassays. Angaben in Prozent der Extinktion bezogen auf die Extinktion ohne ET-1-Zugabe. Errechnung der relativen Extinktion nur innerhalb des gleichen Versuchsdurchgangs. Die Daten sind angegeben als Mittelwerte (± SE) aus n=12 für den MTT-Assay. Jeder Versuchsdurchgang besteht seinerseits aus fünf parallelen Bestimmungen jedes Wertes. Es wurden nur ein BrdU-Assay durchgeführt. *p<0,05 vs. Kontrolle (100%) im verbundenen t-Test.

Inkubation der MH-7777-Zellen mit den ETA-Rezeptorantagonisten LU 135252 oder BQ 123 bewirkt bei Messung mit dem MTT-Assay in höheren Konzentrationen eine


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deutliche, statistisch signifikante Verminderung der MTT-Reduktion (bzw. eine Proliferationshemmung). Dieses Ergebnis kann durch den BrdU-Assay nicht bestätigt werden. Dieser zeigt lediglich in der höchsten Konzentrationsstufe eine leichte, aber ebenfalls statistisch signifikante Tendenz in Richtung Wachstumshemmung an (siehe Abb. 13 ).

Abb. 13: Wachstumsverhalten von MH-7777-Zellen bei verschiedenen Konzentrationen von ETA-Rezeptorantagonisten. A: LU 135252. B: BQ 123. Zellmengen von MH-7777-Zellen nach einem Tag Wachstum in Kulturmedien mit den angegebenen Substanz-Konzentrationen. Messung der Zellmengen über MTT- und BrdU-Proliferationsassays. Angaben in Prozent der Extinktion bezogen auf die Extinktion ohne Antagonisten-Zugabe. Errechnung der relativen Extinktion nur innerhalb des gleichen Versuchsdurchgangs. Die Daten sind angegeben als Mittelwerte (± SE) aus n=8 für den MTT-Assay, bzw. an den vier höchsten Konzentrationen n=5 für den BrdU-Assay. Jeder Versuchsdurchgang besteht seinerseits aus fünf parallelen Bestimmungen jedes Wertes. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 vs. Kontrolle (100%) im verbundenen t-Test.


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Eine Hemmung der MTT-Reduktion auf 50% wird durch Konzentrationen von ca. 2,5×10-5 mol/l LU 135252 bzw. ca. 4×10-3 mol/l BQ 123 erreicht.

Beim kombinierten ETA/B-Rezeptorantagonisten LU 302872 liegt die durchschnittlich benötigte Konzentration zur Hemmung der MTT-Reduktion auf 50% bei ca. 6×10-5 mol/l. Auch diese Substanz ruft bei Messung mit dem MTT-Assay eine klare, statistisch signifikante Hemmung der Extinktion im oberen getesteten Konzentrationsbereich hervor. Der Effekt läßt sich im Gegensatz zu den Ergebnissen aus den Inkubationen mit ETA-Rezeptorantagonisten durch Messung des DNA-Einbaus mit dem BrdU-Assay bestätigen (siehe Abb. 15 ).

Abb. 14: Wachstumsverhalten von MH-7777-Zellen bei verschiedenen Konzentrationen des kombinierten ETA/B-Rezeptorantagonisten LU 302872. Zellmengen von MH-7777-Zellen nach einem Tag Wachstum in Kulturmedien mit den angegebenen Antagonisten-Konzentrationen. Messung der Zellmengen über MTT- und BrdU-Proliferationsassays. Angaben in Prozent der Extinktion bezogen auf die Extinktion ohne Antagonisten-Zugabe. Errechnung der relativen Extinktion nur innerhalb des gleichen Versuchsdurchgangs. Die Daten sind angegeben als Mittelwerte (± SE) aus n=6 für den MTT-Assay, bzw. an den vier höchsten Konzentrationen n=5 für den BrdU-Assay. Jeder Versuchsdurchgang besteht seinerseits aus fünf parallelen Bestimmungen jedes Wertes. *p<0,05, ***p<0,001 vs. Kontrolle (100%) im verbundenen t-Test.


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3.3.1 LDH-Bestimmung

Bei der LDH-Bestimmung im Überstand der mit verschiedenen Substanzen inkubierten MH-7777-Zellen (zum Ausschluß von toxischen Effekten) zeigt sich für die ET-Rezeptorantagonisten in der höchsten eingesetzten Konzentration ein dicht bei den Kontrollen liegendes LDH-Niveau. Die Werte der Positivkontrollen (Austausch des Mediums durch PBS, Zugabe von DMSO sowie mechanische Lyse) sind deutlich erhöht (siehe Abb. 16 ).

Abb. 15: LDH-Konzentrationen im Überstand von MH-7777-Zellen nach einem Tag Inkubation mit den angegebenen Substanzen bzw. nach mechanischer Lyse. Die Kontrollen wurden als 100% gesetzt. Alle Werte sind dargestellt in Prozent der Kontrollen und auf einer logarithmischen Ordinate aufgetragen. Die Daten sind angegeben als Mittelwerte (± SE) aus mindestens drei unabhängigen Versuchsdurchgängen (n=3). Statistische Tests wurden aufgrund der zu geringen Anzahl von Versuchsdurchgängen nicht durchgeführt.

3.3.2 Trypanblau-Färbung

In der Auswertung der Trypanblau-Färbung ergeben sich nach abschätzender Quantifizierung der bläulich angefärbten Zellen pro Well nach 24stündiger Inkubation der MH-7777-Zellen mit verschiedenen Substanzen folgende Ergebnisse:

In allen Konzentrationsstufen der ET-1-stimulierten Ansätze erscheinen die Zellen im Vergleich zu den Kontrollen zahlreicher und vitaler. Es sind verstärkt Mitosen zu


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erkennen, angefärbte Zellen fehlen fast völlig. Die Positivkontrolle mit PBS anstelle von Medium weist eine deutlich erhöhte Zahl bläulich gefärbter Zellen auf, während im DMSO-behandelten Ansatz nahezu ausschließlich bläuliche und damit geschädigte Zellen zu erkennen sind. In keinem Fall bestehen Unterschiede bezüglich der Anfärbbarkeit durch Trypanblau-Lösung zwischen Zellen, die mit unterschiedlichen Konzentrationen einer gleichen Substanz inkubiert werden. Insbesondere ist keinerlei Tendenz zu verstärkter Anfärbbarkeit bei höherer ET-Rezeptorantagonisten-Konzentration zu beobachten (keine Darstellung von Daten im einzelnen). Wegen der fehlenden konzentrationsabhängigen Unterschiede wurde ein Mittelwert der in drei unabhängig voneinander durchgeführten Durchgängen festgestellten Werte aller untersuchten Konzentrationen einer Substanz gebildet (siehe Tabelle 13 ).

Tabelle 13: Anteil der durch Trypanblau angefärbten Zellen nach Inkubation mit den angegebenen Substanzen. Angaben in Einheiten der semiquantitativen optischen Quantifizierungsskala von 0 bis 5 (keine bis alle Zellen bläulich angefärbt). Die Daten sind Mittelwerte der in drei unabhängig voneinander durchgeführten Durchgängen entsprechend der semiquantitativen optischen Quantifizierungsskala zugeordneten Werte aller untersuchten Konzentrationen einer Substanz. Wegen des semiquantitativen Charakters dieser Skala wurden keine statistischen Berechnungen durchgeführt.

ET-1

Kontrolle

LU 135252

LU 302872

BQ 123

PBS

DMSO

0,54

1,75

1,67

1,42

1,75

3,3

5,0

3.3.3 ET-1-Bestimmung

Die Auswertung der Ergebnisse des ET-1-Assays ergab irET-1 Konzentrationen von 9,81 (± 3,9) pmol/l für die Kontrollen und 6,5 (± 1,8) pmol/l irET-1 im Kulturüberstand LU 135252-behandelter Zellen. Dies entspricht irET-1-Konzentrationen von ca. 10-11 mol/l. Die großen Standardfehler ergeben sich aus unterschiedlichen im Ansatz verwendeten Zellzahlen. Auf absolute Zellzahlen bezogen ergibt sich in 24 Stunden eine irET-1 Produktion von 10,3 (±1,7) fmol/106 Zellen für unbehandelte Zellen und 7,1 (± 0,19) fmol/106 Zellen für LU 135252 - inkubierte Zellen (10-4 mol/l LU 135252). Die Daten sind Mittelwerte (± SE) aus n=3.


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3.4 Behandlungsversuch des MH-7777 mit LU 302872

3.4.1 Vorversuch zur Trinkmengenbestimmung

Der Vorversuch zur Bestimmung der Trinkmenge von gesunden Buffalo-Ratten sowie die Untersuchung des Einflusses von LU 302872 im Trinkwasser führte zu folgenden Ergebnissen:

Die durchschnittliche Trinkmenge der gesunden Tiere (Kontrollen) liegt bei 29,0 ± 1,1 (SE) ml pro Ratte pro Tag. Die Ratten, die statt Leitungswasser LU 302872-Lösung bekommen, nehmen zu Beginn des Versuchs noch annähernd dieselbe durchschnittliche Trinkmenge wie die Kontrollen zu sich. Im Laufe des Versuchs sinkt diese dann jedoch etwas ab und beträgt über die gesamte Versuchsdauer von 28 Tagen hinweg durchschnittlich 22,9 ± 0,9 (SE) ml pro Ratte pro Tag (siehe Abb. 17 ).

Hinsichtlich des Gewichts gab es in beiden Gruppen keinerlei signifikante Änderungen im Verlauf des Versuchs (keine Darstellung der Daten).

Abb. 16: Durchschnittliche Trinkmengen von gesunden Buffalo-Ratten, die entweder Leitungswasser (Kontrollen), oder eine LU 302872-Lösung bekommen. Die Daten sind als über alle Tiere gemittelte Werte erhoben worden, daher ist keine Angabe von SE möglich. n=4 für die Kontrollgruppe, n=7 für die LU 302872-Gruppe.


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3.4.2 Wachstumsverhalten des MH-7777 bei Behandlung

Die regelmäßige Überwachung des Wachstumsverlaufs der Morris-Hepatome durch Messung des transversalen Tumordurchmessers mit einer Schublehre, zeigt ein vermindertes Wachstum der Hepatome in der Gruppe der mit LU 302872 behandelten Buffalo-Ratten. Dieses verminderte Wachstum im Vergleich zur unbehandelten Gruppe (siehe auch Abb. 18 ) ist über den gesamten Verlauf betrachtet (Tag 10 bis Tag 28) in der „Analysis of variance“-Berechnung (ANOVA) statistisch signifikant (p<0,05).

Abb. 17: Größenzunahme des MH-7777 in Buffalo-Ratten. Mit LU 302872 behandelte Tiere vs. unbehandelte Kontrollen. Angabe des mit einer Schublehre gemessenen transversalen Tumordurchmessers in mm. Die Daten sind Mittelwerte (± SE) aus jeweils n=38 (je 19 Tiere mit je einem Hepatom rechts und links). Die Prozentangaben drücken die durchschnittliche Tumorgröße der behandelten Gruppe in Prozent der durchschnittlichen Tumorgröße der Kontrollgruppe zu diesem Zeitpunkt aus. *p<0,05 vs. Kontrollgruppe zum gleichen Zeitpunkt im unverbundenen t-Test (Vergleich, der für jedes Tier zwischen rechts und links gemittelten Werte). Der Vergleich beider Kurven in ihrer Gesamtheit ergibt in der “Analysis of variance“-Berechnung (ANOVA) einen statistisch signifikanten Unterschied mit einem p<0,05. Für die in positiver Richtung velaufende Tendenz der Meßwerte innerhalb einer Gruppe ergibt sich in der ANOVA ein p<0,0001.

Die zur Messung erforderliche Tumorgröße ist nach 10 Tagen erstmals erreicht. Zu diesem Zeitpunkt gibt es noch keine signifikanten Größendifferenzen. Die Wachstumsgeschwindigkeiten (Anstieg der Kurve) unterscheiden sich lediglich zwischen dem


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10. und 15. Tag klar voneinander. Die durchschnittliche Wachstumsgeschwindigkeit ist in diesem Zeitraum in der Kontrollgruppe um durchschnittlich 30,2% höher als in der behandelten Gruppe. An den vier folgenden Meßpunkten liegen die durchschnittlichen Größen der Hepatome in der behandelten Gruppe regelmäßig deutlich unter denen der Kontrollgruppe (79-91% der durchschnittlichen Größen in der Kontrollgruppe). An drei dieser Meßpunkte unterscheiden sich die durchschnittlichen Größen auch statistisch signifikant (siehe Abb. 18 ).

Am 10. Tag starb nach der Messung mit der Schublehre ein Tier aus jeder Gruppe durch die Äthernarkose. Weitere zwei Tiere pro Gruppe starben am 20. Tag in der Xylazin/Ketamin-Narkose nach der sonographischen Tumorvolumenbestimmung. In allen Fällen handelte es sich um Ratten mit überdurchschnittlich großen Tumoren. Alle diese Tiere wurden aus der Berechnung der durchschnittlichen Tumorgrößen in Abb. 18 und des durchschnittlichen Gewichts in Abb. 21 herausgenommen. Auch in den in diesen Zusammenhängen durchgeführten statistischen Berechnungen wurden diese Tiere nicht berücksichtigt. In die einmalig stattfindenden Querschnittsuntersuchungen zur Bestimmung des Tumorvolumens am 20. und 28. Tag gingen alle zu diesen Zeitpunkten lebenden Tiere ein.

Abb. 18: Errechnete Volumina extirpierter MH-7777 von LU 302872-behandelten Tieren und unbehandelten Kontrollen. Die Hepatome wurden am 28. Tag nach Transplantation entnommen, mit einer Schublehre in drei Dimensionen vermessen und das angenäherte Volumen wurde errechnet. Die Daten sind Mittelwerte (± SE) aus jeweils n=38 (je 19 Tiere mit je einem Hepatom rechts und links). *p<0,05 vs. Kontrollgruppe im unverbundenen t-Test beim Vergleich der für jedes Tier zwischen rechts und links gemittelten Werte. Ein Vergleich der Einzelwerte ergibt ein Signifikanzniveau von p=0,068.


62

Die Hepatome wurden nach der Entnahme am 28. Tag mit der Schublehre in drei Dimensionen vermessen und das angenäherte Tumorvolumen errechnet. Danach ist das durchschnittliche Tumorvolumen in der Kontrollgruppe um 21,7% größer als das der behandelten Gruppe. Dieser Unterschied ist statistisch signifikant (siehe Abb. 18 ).

Zusätzlich zur Errechnung des Tumorvolumens wurde das Gewicht der am 28. Tag nach Transplantation extirpierten Hepatome bestimmt. Das durchschnittliche Tumorgewicht in der Kontrollgruppe ist um 11,0% größer, als das der behandelten Gruppe. Allerdings ist aufgrund der niedrigeren Tiergewichte in der behandelten Gruppe (siehe 3.4.3 ) das relative Tumorgewicht in der Kontrollgruppe umgekehrt um 14,2% niedriger (siehe Tabelle 14 ).

Sonographisch konnten die Hepatome erstmals am 20. Tag nach Transplantation deutlich nachgewiesen werden (siehe Abbildung 19 ).

Abb. 19: Sonographische Aufnahmen von MH-7777 in vivo am 20. Tag nach Transplantation. Gezeigt sind zwei typische Ansichten von Transversalschnitten am Oberschenkel von Buffalo-Ratten. Die runden, hypodensen Areale zwischen den Markierungen (+) entsprechen den Hepatomen. Abmessungen der markierten Strukturen: links 125 × 190 mm, rechts 90 × 145 mm.

Das aus den sonographischen Werten unter der Annahme eines Rotationsellipsoids errechnete durchschnittliche Tumorvolumen der Kontrollgruppe, liegt 36,4% über dem der behandelten Gruppe (siehe Tabelle 14 ).

Trotz dieser klaren Tendenzen, sind weder die Unterschiede der durchschnittlichen Werte des Tumorgewichts, noch die des sonographisch ermittelten Tumorvolumens zwischen beiden Gruppen statistisch signifikant.


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Tabelle 14: Zusammenstellung von Ergebnissen der Methoden zur Beurteilung des MH-7777-Wachstums. An den angegebenen Tagen (nach Transplantation) wurden die Volumina der Hepatome von LU 302872-behandelten Buffalo-Ratten und unbehandelten Kontrollen über verschiedene Methoden errechnet bzw. die Tumoren gewogen. Die Daten sind Mittelwerte (± SE) aus n=42 für die sonographische Volumenbestimmung (je 21 Tiere mit je einem Hepatom rechts und links), n=38 für die Volumenbestimmung mit der Schublehre und das absolute Tumorgewicht (je 19 Tiere mit je einem Hepatom rechts und links) sowie n=19 für das relative Tumorgewicht (je 19 Tiere, Summe der individuellen Tumorgewichte rechts und links). *p<0,05 vs. Kontrollgruppe im unverbundenen t-Test (Vergleich der für jedes Tier zwischen rechts und links gemittelten Werte).

Methode

Tag

Behandelte Gruppe

Kontrollgruppe

Tumorvolumen sonographisch (mm3)

20

1421 ± 222

1938 ± 278

Tumorvolumen Schublehre (mm3)

28

6330 ± 450 *

7701 ± 426

Tumorgewicht absolut (g) relativ (g/100 g Ratte)

28 28

8,01 ± 0,59 4,51 ± 0,45

8,89 ± 0,43 3,87 ± 0,18

3.4.3 Gewicht und Trinkmengen der Tiere im Behandlungsversuch

Als weitere Parameter wurden das Verhalten und Aussehen, das Körpergewicht und die Trinkmengen der Versuchstiere überwacht.

Im Verlauf des Versuchs war eine allgemeine Verschlechterung des Zustands der Tiere zu verzeichnen. Es trat eine zunehmende Kachexie auf, die Tiere entwickelten struppiges Fell und in einigen Fällen waren leichte periorbitale Blutungen zu beobachten. Tendenziell traten diese Erscheinungen stärker in der behandelten Gruppe auf. Außerdem konnte stichprobenartig eine Verminderung der Futteraufnahme in dieser Gruppe festgestellt werden.

Entsprechend der erwähnten Kachexie nimmt das durchschnittliche Gewicht der Tiere in beiden Gruppen kontinuierlich ab. Allerdings beginnt dieser Gewichtsverlust in der behandelten Gruppe schon ab dem 10. Tag, während er in der Kontrollgruppe erst am 15. Tag einsetzt und deutlich langsamer verläuft. Ab dem 15. Tag unterscheiden sich die durchschnittlichen Gewichte beider Gruppen statistisch signifikant (siehe Abb. 21 und Tabelle 16 ).


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Abb. 20: Durchschnittliche Tiergewichte im Verlauf des Behandlungsversuchs mit LU 302872 an hepatomtragenden Buffalo-Ratten im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen. Die Daten sind Mittelwerte (± SD) aus jeweils n=19. *p<0,001, **p<0,00001 vs. Kontrollgruppe am gleichen Tag im unverbundenen t-Test. Der Vergleich beider Kurven in ihrer Gesamtheit ergibt in der ANOVA einen statistisch signifikanten Unterschied mit einem p<0,01. Für die in negativer Richtung velaufende Tendenz der Meßwerte innerhalb einer Gruppe ergibt sich in der ANOVA ein p<0,0001.

Tabelle 15: Verschiedene Gewichtsparameter der behandelten und unbehandelten Buffalo-Ratten zu Beginn und am Ende des Behandlungsversuchs. Die Daten sind Mittelwerte bzw. errechnet aus Mittelwerten aus jeweils n=19 (nur „Gewicht an Tag 1, inklusive später gestorbener Tiere“ n=22).

Gewichtsparameter

Behandelt

Unbehandelt

Gewicht an Tag 1, inklusive später gestorbener Tiere

467,3 g

486,1 g

Gewicht an Tag 1, exklusive je 3 später gestorbener Tiere

461,6 g

489,7 g

Gewicht an Tag 28

374,1 g

461,5 g

Absoluter Gewichtsverlust von Tag 1 bis Tag 28

87,5 g

28,2 g

Relativer Gewichtsverlust von Tag 1 bis Tag 28

19,0%

5,8%

Gewicht an Tag 1 relativ zur jeweils anderen Gruppe

94,3%

106,1%

Gewicht an Tag 28 relativ zur jeweils anderen Gruppe

81,1%

123,4%

Schon von Beginn an ist das durchschnittliche Gewicht der behandelten Gruppe (461,6 ± 15,1 g) niedriger als das der Kontrollgruppe (489,7 ± 9,1 g), weil die sechs im Verlauf des Versuchs gestorbenen Ratten in der Darstellung in Abb. 21 nicht eingerechnet sind. Da in der behandelten Gruppe schwerere Tiere starben als in der


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Kontrollgruppe, verstärkte sich die schon aus der Randomisierung entstandene Tendenz der durchschnittlich schwereren Kontrollgruppe. In der ANOVA zeigt sich beim Vergleich der Gewichtsverläufe beider Gruppen über die gesamte Zeit ein Unterschied mit einem Signifikanzniveau von p<0,01.

Abb. 21: Durchschnittliche Trinkmengen der hepatomtragenden Buffalo-Ratten im Behandlungsversuch. Vergleich von LU 302872-behandelten Tieren mit unbehandelten Kontrollen (durchgezogene Linien, runde Symbole). Die Daten sind Mittelwerte (± SE) aus der durchschnittlichen Flüssigkeitsaufnahme der Tiere aus jeweils sechs Käfigen (à zwei bis vier Tiere). Für alle Meßzeitpunkte gilt p<0,0001 vs. dem gleichzeitig erhobenen Wert der anderen Gruppe im unverbundenen t-Test. Zum Vergleich (gepunktete Linien, quadratische Symbole) die in Abb. 17 dargestellten durchschnittlichen Trinkmengen von gesunden Buffalo-Ratten, die entweder Leitungswasser, oder eine LU 302872-Lösung bekommen. Diese Daten sind als über alle Tiere gemittelte Werte erhoben worden, daher ist keine Angabe von SE möglich. n=4 für die Kontrollgruppe, n=7 für die LU 302872-Gruppe.

Auch die Trinkmengen beider Gruppen unterscheiden sich von Beginn an signifikant. Schon zwischen dem 1. und 5. Tag beträgt die durchschnittliche Flüssigkeitsaufnahme in der LU 302872-behandelten Gruppe nur 68% der Menge der unbehandelten Kontrollgruppe. Trotz Saccharosezusatz ab dem 20. Tag gehen diese Werte zwischen dem 20. und 25. Tag auf ein Minimum von 30% zurück. Erst in den letzten drei Tagen steigt der Prozentsatz wieder auf 47% der Flüssigkeitsaufnahme der Kontrollgruppe. Damit liegt die unbehandelte Kontrollgruppe im Bereich der Trinkmengen des Vorversuchs mit gesunden Tieren. In den ersten 10 Tagen gleicht die Flüssigkeitsaufnahme der der gesunden Tiere mit Leitungswasserversorgung. Im weiteren Verlauf nähert sich


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die Kurve den Trinkmengen der gesunden Tiere mit LU 302872 im Trinkwasser an. Die Trinkmengen der behandelten hepatomtragenden Ratten liegen weit unter diesem Bereich (siehe Abb. 22 ).

Damit wird die pro Kilogramm Körpergewicht angestrebte LU 302872-Dosis von 100 mg/d nicht erreicht. Die tatsächlichen Dosen liegen im Verlauf des Versuchs bei 38,0-78,5 mg/kg×d (siehe Abb. 23 ).

Abb. 22: Durchschnittlich in der behandelten Gruppe erzielte Dosen von LU 302872. Angaben in mg LU 302872 pro kg Ratte pro Tag. Die Daten sind Mittelwerte, errechnet aus der durchschnittlichen Flüssigkeitsaufnahme der Tiere aus sechs Käfigen (à zwei bis vier Tiere).

3.4.4 Organgewichte nach dem Behandlungsversuch

Die durchschnittlichen Gewichte der nach Abschluß des Behandlungsversuchs entnommenen Organe sind in Tabelle 18 dargestellt. In absoluten Zahlen sind das durchschnittliche Leber-, Nieren- und Herzgewicht in der behandelten Gruppe signifikant geringer als in der Kontrollgruppe. Aufgrund des ebenfalls hochsignifikant niedrigeren durchschnittlichen Körpergewichts in der behandelten Gruppe, gilt dies für die relativen Organgewichte nicht. Hinsichtlich der relativen durchschnittlichen Gewichte von Leber und Herz gibt es keine relevanten Unterschiede zwischen den Gruppen. Das absolute Nierengewicht ist bei den behandelten Tieren signifikant erniedrigt, das relative Nierengewicht dagegen signifikant erhöht.


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Tabelle 16: Durchschnittliche absolute und relative Organgewichte (Leber, Niere, Herz) sowie Körpergewicht der behandelten und unbehandelten Buffalo-Ratten nach Abschluß des Behandlungsversuchs am 28. Tag nach Transplantation. Die absoluten Gewichtsangaben sind in g, die relativen Gewichtsangaben in g Organ pro 100 g Körpergewicht der einzelnen Tiere. Die Daten sind Mittelwerte (± SE) aus jeweils n=19 (bei Nierengewicht n=38). *p<0,001, **p<0,00001 vs. Kontrollgruppe im unverbundenen t-Test.

 

 

Behandelt

Kontrolle

Körpergewicht (g)

 

374 ± 14,4 **

462 ± 9,1

Lebergewicht

absolut (g)

12,2 ± 0,38 *

14,9 ± 0,55

 

relativ (g/100 g)

3,30 ± 0,09

3,07 ± 0,20

Nierengewicht

absolut (g)

1,18 ± 0,03 *

1,34 ± 0,03

 

relativ (g/100 g)

0,32 ± 0,007 *

0,29 ± 0,005

Herzgewicht

absolut (g)

1,09 ± 0,04 *

1,29 ± 0,04

 

relativ (g/100 g)

0,29 ± 0,007

0,28 ± 0,007


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3.5 Serumparameter gesunder und hepatomtragender Buffalo-Ratten

Abb. 23: Durchschnittliche Konzentrationen der angegebenen Substanzen bzw. Enzymaktivitäten im Serum von behandelten und unbehandelten hepatomtragenden Buffalo-Ratten (G) sowie altersgleichen gesunden Kontrollen ohne Tumor. Die Daten sind Mittelwerte (± SE) aus n=16 in den hepatomtragenden Gruppen sowie n=9 in der gesunden Kontrollgruppe. *p<0,05 vs. den jeweils beiden anderen Gruppen im unverbundenen t-Test. Abkürzungen: Na=Natrium, Alb.=Albumin, Krea=Kreatinin, Chol.=Cholesterin, Trigl.=Tri-glyceride, ASAT=Aspartataminotransferase, ALAT=Alaninaminotransferase, Glc.=Glukose, LDH=Laktatdehydrogenase.


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Der deutlichste Unterschied hinsichtlich der Serumwerte von hepatomtragenden und gesunden Tieren zeigt sich bei den Leberenzymen. Die durchschnittlichen Enzymaktivitäten von Aspartataminotransferase und Alaninaminotransferase im Serum sind bei den transplantierten Tieren statistisch signifikant um ein Vielfaches erhöht. Gleiches gilt für die durchschnittlichen Konzentrationen von Natrium, Kreatinin und Cholesterin, wobei hier die Erhöhungen viel schwächer ausgeprägt sind. Außerdem gibt es für Natrium und Cholesterin statistisch signifikante Unterschiede zwischen der behandelten und unbehandelten Gruppe. Im Fall des Natriums mit einem höheren durchschnittlichen Wert in der behandelten Gruppe, beim Cholesterin umgekehrt. Für Albumin, Triglyceride, Glukose und LDH konnten keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen festgestellt werden. Alle anderen Ergebnisse im Detail siehe Abb. 23 .


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Fri Mar 16 16:37:30 2001