Pfab, Thiemo: Zum Endothelinsystem im Morris-Hepatom-7777 - Behandlung mit Endothelinrezeptorantagonisten in vitro und in vivo

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Kapitel 4. Diskussion

4.1 Das Endothelinsystem im Morris-Hepatom-7777 in vivo

Das 1988 von Yanagisawa et al. entdeckte Peptid Endothelin-1 (ET-1) ist nicht nur ein kreislaufwirksames Hormon, sondern besitzt auch wachstumsinduzierende Eigenschaften. In vitro wurde vielfach nachgewiesen, daß ET die Proliferation verschiedener neoplastischer Zellen verstärkt und daß dieser Effekt durch ET-Rezeptorantagonisten aufgehoben werden kann. In vivo zeigte sich, daß einige maligne Tumoren ET-1 synthetisieren und peripher erhöhte Plasmakonzentrationen von ET-1 und seinem Vorläufer Big-ET-1 meßbar sind. Jedoch bleibt die tatsächliche Bedeutung des ET-Systems für das Wachstum maligner Zellen und die Angiogenese in Tumoren in vivo weiterhin ungeklärt.

In der vorliegenden Arbeit wurde das ET-System des experimentellen Lebertumors Morris-Hepatom (MH)-7777 in vitro und in vivo charakterisiert. Erstmals wurde versucht, Tumorwachstum auch in vivo durch Behandlung mit einem ET-Rezeptorantagonisten zu inhibieren, um Informationen über die Bedeutung des ET-Systems für das Wachstum maligner Tumoren im Wirtsorganismus zu gewinnen.

Zur Charakterisierung des Endothelinsystems im MH-7777 in vivo, wurden die (Big-) ET-1-Plasmakonzentrationen von hepatomtragenden Buffalo-Ratten mit denen gesunder Tiere verglichen. Außerdem interessierten die (Big-)ET-1-Gewebekonzentrationen im Morris-Hepatom sowie in Lebergewebe von hepatomtragenden und gesunden Ratten. Um eventuellen ET-abhängigen Wachstumsmechanismen näherzukommen, wurde die Dichte der im MH-7777 vorhandenen ET-Rezeptoren und deren Bindungsaffinität bestimmt.

4.1.1 Plasmakonzentrationen von irET-1 und irBig-ET-1 bei hepatomtragenden Buffalo-Ratten

Das Morris-Hepatom-7777 ruft bei den beobachteten Buffalo-Ratten keine Erhöhung der (Big-)ET-1-Plasmakonzentrationen hervor.

Erhöhte Plasma-irET-1-Konzentrationen sind bei einer Vielzahl von Erkrankungen gemessen worden. Insbesondere bei solchen, die mit ischämischem Organversagen bzw. mit sehr schlechten hämodynamischen Zuständen einhergehen (siehe 1.1.5 und Nelson et al., 1995). Auch bei einigen neoplastischen Erkrankungen konnte diese


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Beobachtung gemacht werden. Beispielsweise bei Patienten mit hepatozellulärem Karzinom (HCC). Die Angaben der irET-1-Plasmakonzentrationen bei gesunden Kontrollpatienten liegen im Bereich von 1 bis 5 pmol/l, während bei HCC-Patienten signifikant erhöhte Werte in Bereichen von 1,7 bis 90 pmol/l angegeben werden ( Ishibashi et al., 1993; Nakamuta et al., 1993; Matsumoto et al., 1994). Auch bei Patienten mit Prostatakarzinom wurden erhöhte irET-1-Plasmakonzentrationen von durchschnittlich 10 pmol/l im Vergleich zu 2 pmol/l bei Kontrollen gemessen ( Nelson et al., 1995). Dagegen liegen die in der vorliegenden Arbeit bestimmten Werte von hepatomtragenden Buffalo-Ratten mit 24,3 (± 6,1) pmol/l nicht signifikant über den 24,0 (± 3,9) pmol/l der gesunden Kontrolltiere.

Zu diesen Befunden ist folgendes anzumerken:

  1. Bei allen HCC-Patienten der oben erwähnten Studien bestand zusätzlich eine Leberzirrhose, auf deren Grundlage sich das Karzinom entwickelt hatte. Eine Leberzirrhose ist schon für sich mit erhöhten irET-1-Plasmakonzentrationen assoziiert. Nur in einer der drei Studien konnte ein signifikanter Unterschied zwischen Patienten mit Zirrhose und solchen mit zusätzlichem HCC gezeigt werden ( Nakamuta et al., 1993).
  2. Die fünffach erhöhten irET-Plasmakonzentrationen bei Prostatakarzinom-Patienten gelten nur für weit fortgeschrittene, metastasierte Karzinome, während bei auf das Organ begrenzten Stadien keine signifikanten Unterschiede zu Kontrollen feststellbar sind ( Nelson et al., 1995).
  3. Karzinomzellen produzieren in vitro 20-700fach weniger ET-1 als Schweineaorta- oder Kälberpulmonalarterien-Endothelzellen ( Kusuhara et al., 1990). Dies wirft die Frage auf, ob in vivo tatsächlich durch Tumorzellen ausreichende Mengen ET-1 produziert werden können, um einen Anstieg der Plasmakonzentration zu bewirken.

Von Ishibashi et al. (1993) wurde recht überzeugend durch selektive Messung der arteriovenösen Differenz über das Tumorgefäßbett gezeigt, daß irET-1 aus HCC-Knoten freigesetzt wird. Trotzdem kann vermutet werden, daß bei Karzinompatienten erhöhte periphere ET-1-Konzentrationen Ausdruck eines allgemeinen Krankheitszustands im Sinne einer unspezifischen Wirtsreaktion sind. Diese könnte durch Faktoren ausgelöst werden, die sowohl bei schweren nicht-neoplastischen als auch bei schweren Tumorerkrankungen vorkommen. Beispielsweise könnten bekannte intragenetische Bindungssequenzen für AP-1 und andere Faktoren streßinduzierte ET-1-mRNA-Expression vermitteln ( Simonson et al., 1990). Insofern wäre die Entwicklung eines


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HCC aus einer Leberzirrhose bzw. die Metastasierung eines Prostatakarzinom als graduelle Verschlechterung eines allgemeinen Krankheitsbildes zu verstehen, das zunehmend erhöhte periphere ET-1-Konzentrationen zur Folge hat. Inwieweit die Tumoren durch eigene ET-1-Produktion, die im Vergleich zu Endothelzellen um Größenordnungen geringer ist, zur Erhöhung der Plasmakonzentration beitragen, ist weiter ungeklärt. Als Quelle von erhöhtem peripheren ET-1 bei einigen schweren Erkrankungen wie z.B. Atherosklerose und disseminierter intravasaler Gerinnung werden Endothelschäden vermutet, die zu ET-1-Austritt führen ( Battistini et al., 1993a).

All diese Überlegungen haben wenig Relevanz bezüglich der Hypothese der ET-Abhängigkeit von Tumorwachstum und/oder Tumorangiogenese im allgemeinen und bezogen auf das MH-7777 im besonderen, da ET-1 als auto- und parakrin wirkende Substanz gesehen werden kann. Beispielsweise sekretieren Endothelzellen ET-1 abluminal, wo es seine Wirkung auf die darunter liegende glatte Gefäßmuskulatur entfaltet ( Wagner et al., 1992; Yoshimoto et al., 1991). Aufgrund der starken Rezeptorbindung des ET-1, spiegeln erhöhte zirkulierende ET-1-Konzentrationen wahrscheinlich bei weitem nicht die viel höheren lokalen ET-1-Konzentrationen wider. Daher ist es kaum möglich, die Plasmakonzentrationen als Ausdruck des lokalen Aktivierungszustands zu interpretieren. Für das in hepatomtragenden Tieren im Plasma ebenfalls nicht relevant erhöhte Big-ET-1 gilt analog das gleiche.

Im Fall des untersuchten MH-7777 besteht also die Möglichkeit, daß entweder die lokal gebildeten ET-1-Mengen definitiv nicht ausreichend für eine Beeinflussung der Plasmaskonzentration sind oder daß erst in einem noch späteren Krankheitsstadium eine Plasma-ET-1-Erhöhung eintritt. Dieses wäre entweder durch Produktion seitens des Tumors oder als unspezifische Reaktion des kranken Organismus im Sinne eines Epiphänomens zu erwarten. Es sei als weiterer Gesichtspunkt angemerkt, daß in der Literatur von einem experimentellen Tumor berichtet wird, der - wie wahrscheinlich das MH-7777 - in vitro ET-1 produziert, bei dem aber diese ET-1-Produktion in vivo immunhistochemisch nicht nachweisbar ist ( Loesch et al., 1997).


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4.1.2 Gewebekonzentrationen von irET-1 und irBig-ET-1 bei hepatomtragenden Buffalo-Ratten

Für eine Bedeutung des ET-Systems für das Tumorwachstum des MH-7777 sprechen die deutlich und statistisch signifikant (p<0,05) erhöhten Werte von ET-1 und Big-ET-1 im Hepatomgewebe (bezogen auf den Proteingehalt) sowohl gegenüber Lebergewebe von hepatomtragenden Tieren (ET-1 um 115,2% bzw. Big-ET-1 um 40,3% erhöht) als auch von gesunden Kontrollen (ET-1 um 93,7% bzw. Big-ET-1 um 37,0% erhöht). Da die verwendete Nachweismethode keine weitere Lokalisierung der ET-Produktion zuläßt, kann über die ET-produzierenden Strukturen im MH-7777 aus den Ergebnissen dieser Arbeit heraus keine Aussage gemacht werden. In Betracht kämen in erster Linie Tumorzellen, Endothelzellen und Fibroblasten. In Lebermetastasen anderer mittel- bis geringgradig differenzierter experimenteller Tumormodelle (Fibrosarkom und Kolonkarzinom) wurde diese Differenzierung mittels elektronenmikroskopischer Immunhistochemie durchgeführt ( Loesch et al., 1997). In normaler Leber der untersuchten Rattenspezies war nur wenig ET-1 in einigen Endothelzellen (in 2% der sinusoidalen und portalvenösen Endothelzellen) und Fibroblasten zu identifizieren. Dagegen waren in den tumorperipher gelegenen Gefäßen der Lebermetastasen je nach Tumortyp 10-20% der Endothelzellen ET-1-positiv. Auch Fibroblasten und einige Tumorzellen des Fibrosarkoms zeigten ET-1-Positivität ( Loesch et al., 1997). Ob diese Verhältnisse im MH-7777 ähnlich sind müßte durch folgende histologische Verfahren geklärt werden.

Interessant ist neben den erhöhten ET-1- und Big-ET-1-Konzentrationen im Hepatomgewebe der Anstieg des Quotienten aus ET-1/Big-ET-1 um 50%. Dies legt zwei Vermutungen nahe, die einzeln oder auch gemeinsam zutreffen könnten. Entweder besteht eine verstärkte ECE-Aktivität, die zu vermehrter Umwandlung des Big-ET-1 zu ET-1 führt; eventuell bei gleichzeitig bestehender Überexpression des PräproET-1-Gens, was die erhöhte Big-ET-1-Konzentrationen erklären könnte. Oder es findet ein verminderter ET-1-Abbau statt, was dann zu einem Anstieg der Konzentrationen von ET-1 und seinen Vorstufen führt.

Über die Regulation des ECE ist bisher relativ wenig bekannt. Es gibt Berichte über eine Inhibition der ECE-Expression durch ET-1 in vitro ( Naomi et al., 1998) und in vivo ( Nakayama et al., 1999). Möglicherweise kommt es im Tumor aufgrund von Hypoxie oder durch lokale Faktoren zu einer Aufhebung dieses Rückkopplungsmechanismus.


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Die Folge wären erhöhte ECE-Konzentrationen mit dadurch erhöhtem ET-1/Big-ET-1-Quotienten im Tumorgewebe.

Gesunde weibliche Buffalo-Ratten haben signifikant höhere ET-1- und Big-ET-1-Lebergewebekonzentrationen als gleichaltrige männliche Kontrollen. Im Fall des Big-ET-1 erreicht die durchschnittliche Gewebekonzentration in weiblichen Kontrollebern (Lebern gesunder Tiere) sogar diejenige in Hepatomen aus männlichen Tieren. Auch der ET-1/Big-ET-1 Quotient ist bei den Weibchen signifikant gegenüber den Männchen erhöht. Diese Befunde sprechen für eine hormonelle Beeinflußbarkeit des ET-Systems.

4.1.3 ET-Rezeptoren in Hepatom- und Lebergewebe

Als wesentliches Ergebnis zeigt sich eine Erhöhung der ETA-Rezeptordichte um 67% im Morris-Hepatom-7777 männlicher Tiere im Vergleich zu Kontrolleber (p<0,05), während die ETB-Rezeptordichte geschlechtsunabhängig um 59% verringert ist (p<0,0001).

Auf Leberplasmamembranen gesunder Buffalo-Ratten wurde in der vorliegenden Arbeit eine ET-Rezeptordichte von 152,6 pmol/g Protein für ETA-Rezeptoren und 193,3 pmol/g Protein für ETB-Rezeptoren gemessen. Diese Werte liegen ungefähr im Bereich der im gleichen Labor mit der gleichen Methode gemessenen Leberplasmamembranen männlicher Wistar-Kyoto-Ratten ( Hocher et al., 1995b).

An Rattenleberplasmamembranen sind geschlechtsabhängige Unterschiede bezüglich des ET-Rezeptorbesatzes bekannt. Bei männlichen Tieren ist eine ausgewogene Verteilung der beiden ET-Rezeptorsubtypen publiziert ( Serradeil-le Gal et al., 1991), während weibliche Tiere ein Verhältnis von 80 zu 20 zugunsten des ETB-Rezeptors aufweisen ( Jouneaux et al., 1994). Diese Tendenz ist auch bei den hier untersuchten BuffaloRatten nachzuvollziehen. An den Leberplasmamembranen der weiblichen gesunden Tiere ist das ETB:ETA-Verhältnis 57:43 (p<0,05 für eine größere ETB-Rezeptordichte im gepaarten t-Test), bei den hepatomtragenden Tieren sogar 69:31 (p<0,01). Demgegenüber beträgt das Verhältnis bei männlichen Tieren in beiden Fällen ca. 53:47 (kein signifikanter Unterschied). In den genannten Studien gehen diese geschlechtsspezifischen Unterschiede mit funktionellen Verschiebungen der Regulation der Glykogenolyse vom ETA-Rezeptor bei männlichen zum ETB-Rezeptor bei weiblichen Tieren einher. Solche Geschlechtsunterschiede in der Glykogenolyseregulation sind auch für andere Rezeptoren beschrieben ( Studer et al., 1982). Die Vermutung einer sexualhormonabhängigen Expression der ET-Rezeptoren wird durch die vorliegenden Daten unterstützt.


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Die Technik der Extraktion einer rohen Membranfraktion läßt keine Differenzierung des globalen ET-Rezeptorbesatzes auf einzelne Strukturen zu. Durch Isolierung der wichtigsten in der Leber vorkommenden Zellarten konnte in vitro der ET-Rezeptorbesatz im einzelnen analysiert werden. Das Rezeptormaximum wurde auf den Ito-Zellen der Leber festgestellt ( Housset et al., 1993). Über den im Verhältnis 80 zu 20 vorherrschenden ETB-Rezeptor hemmt ET-1 das Wachstum dieser Zellen ( Mallat et al., 1995). ETB-Rezeptoren wurden auch auf Sinusoidalendothel und in Kupffer-Zellen festgestellt ( Housset et al., 1993). Housset et al. (1993) konnten in Hepatozyten keine Rezeptor-mRNA nachweisen, während Gandhi et al. (1992) multiple hochaffine ET-Rezeptoren auf Rattenhepatozyten beschreiben.

Während sich die Rezeptorverhältnisse in der Leber gesunder und hepatomtragender Buffalo-Ratten nicht signifikant unterscheiden (auch bei nach Geschlechtern getrennter Betrachtung), sind die Werte für das aus Lebergewebe entstandene Morris-Hepatom 7777 deutlich verändert. In der Gesamtbetrachtung zeigt sich eine im Vergleich zu Kontrolleber auf 126% erhöhte ETA-Rezeptordichte (p=0,08). Demgegenüber ist die ETB-Rezeptordichte im Vergleich zu Lebergewebe gesunder Tiere auf 41% abgesunken (p<0,0001). Es ist hinzuzufügen, daß bei geschlechtspezifischer Analyse die ETA-Rezeptordichtezunahme im MH-7777 ausschließlich bei den männlichen Tieren auftritt (auf 167% [p<0,05] gegenüber 98% bei weiblichen Tieren bezogen auf Leber gesunder Tiere).

Zum Verständnis dieser Verschiebung der ET-Rezeptorverhältnisse im MH-7777 bedarf es weiterer Untersuchungen. Ein nächster Schritt wäre beispielsweise die Lokalisation der ET-Rezeptorsubtypen in den verschiedenen Tumorstrukturen durch immunhistochemische Techniken.

Interessant erscheint die Parallele zu Befunden an Prostatakarzinomgewebe, in dem ebenfalls eine deutlich erniedrigte ETB-Rezeptordichte gemessen wurde ( Nelson et al., 1996). Sowohl Scatchard-Rezeptor-Bindungsstudien und RT-PCR an Prostatakarzinom-Zellinien als auch Autoradiographien von humanem Prostatakarzinomgewebe zeigten deutlich verminderte bis nicht vorhandene Signale für ETB-Rezeptoren bzw. deren mRNA ( Nelson et al., 1996).

Sowohl beim Prostatakarzinom als auch beim MH-7777 könnte die verminderte ETB-Rezeptorexpression Faktoren wie Sekretion, Funktion und Elimination des ET-1 beeinflussen. So verläuft beispielsweise die Elimination zumindest des zirkulierenden Endothelins bei Ratten über ETB-Rezeptoren. Die Bindung von [125J]ET-1 in vivo wird


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durch einen ETB-Rezeptorantagonisten inhibiert und die Infusion eines ETB-Rezeptorantagonisten führt zu signifikant erhöhten ET-1-Plasmakonzentrationen ( Fukuroda et al., 1994). Ein ähnliches hormonales „Puffersystem“ ist für silente ANP-Rezeptoren vorgeschlagen worden ( Maack et al., 1987). Auch ein bestehendes ETB-Rezeptor-vermitteltes autokrines Feedback-System könnte beeinflußt werden ( Warner et al., 1993). Von humanen Keratinozyten ist bekannt, daß sie ausschließlich ETB-Rezeptoren besitzen und durch exogenes ET-1 in ihrer ET-1-Sekretion gehemmt werden ( Yohn et al., 1994). Diese Befunde wären durch die beschriebene ETB-Rezeptor-vermittelte Hemmung des ECE und dadurch verminderte ET-1-Synthese zu erklären ( Naomi et al., 1998). Im MH-7777 könnte in diesem Sinne durch die verminderte ETB-Rezeptordichte eine verstärkte ECE-Aktivität bestehen, die den erhöhten ET-1/Big-ET-1-Quotienten erklären würde. Alle genannten Hypothesen werden durch den Befund der im Hepatomgewebe erhöhten ET-1- und Big-ET-1-Konzentrationen unterstützt.

Die verminderten ETB-Rezeptoren könnten sowohl über die veränderte ET-Regulation als auch über andere Mechanismen die Tumorprogression des Hepatoms unterstützen. Der vasodilatatorische Effekt der ET-Isopeptide ist mit ETB-Rezeptor-vermittelter NO-Produktion in Verbindung gebracht worden, welche ihrerseits ETA-Rezeptor-induzierter Vasokonstriktion entgegenwirkt ( Warner et al., 1989; Hirata et al., 1993). NO reguliert allerdings nicht nur den ET-1-abhängigen Gefäßtonus, sondern greift auf verschiedenen Ebenen an, um als ET-1-Gegenspieler zu wirken. ET-Rezeptorbindung, daraus folgender Kalziumanstieg und endotheliale ET-1-Sekretion werden durch NO antagonisiert ( Goligorski et al., 1994; Boulanger et al., 1990). Obwohl die genaue Rolle des NO für das Tumorwachstum weiterhin unbekannt ist, gibt es einige Hinweise auf wachstumshemmende Wirkungen. NO induziert Zytotoxizität ( Corasaniti et al., 1994) und Apoptose ( Kitasjima et al., 1994; Fuko et al., 1996) in vitro, während in vivo sowohl Hemmung von Metastasenwachstum als auch Tumorwachstumsförderung beschrieben wird ( Xie et al., 1995; Jenkins et al., 1995). Ähnliche Phänomene wären im Morris-Hepatom aufgrund mangelnder ETB-Rezeptor-vermittelter NO-Synthese denkbar. Um weitere Klarheit über die Funktion des ETB-Rezeptors bei Lebertumoren zu bekommen, wäre eine Rezeptorstudie an humanem HCC-Gewebe oder anderen Leberneoplasien interessant.


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Zusammenfassend läßt sich sagen, daß im Fall des MH-7777 bis zum 21. Tag nach Tumortransplantation kein erhöhtes Plasma-ET-1 feststellbar ist. Es ist nicht abschließend geklärt, ob die bei anderen Tumoren gemessenen erhöhten ET-1-Konzentrationen ursächlich durch die Eigenproduktion des jeweiligen Tumors hervorgerufen werden. Eine Interpretation als unspezifisches Epiphänomen erscheint möglich. Für die Frage der lokalen proliferativen Bedeutung des Endothelins ist dies wenig relevant, da es sich bei ET-1 um ein vorwiegend auto- und parakrin wirkendes Hormon handelt. Für eine Bedeutung des ET-Systems im MH-7777 sprechen erhöhte (Big-)ET-1-Gewebekonzentrationen und ein erhöhter ET-1/Big-ET-1-Quotient in Hepatomgewebe. Letzterer wäre entweder durch eine verstärkte ECE-Aktivität oder einen verminderten ET-1-Abbau (möglicherweise aufgrund der verminderten ETB-Rezeptordichte) zu erklären. Die ETA-Rezeptordichte im Morris-Hepatom ist im Vergleich zu Kontrolleber nur bei den männlichen Tieren (auf 167%) erhöht (bei den weiblichen Tieren gibt es keine Differenz), während die ETB-Rezeptordichte geschlechtsunabhängig (wie beim Prostatakarzinom) stark verringert ist. Für die Klärung der Bedeutung dieses Phänomens bedarf es weiterer Untersuchungen. Vorstellbare Wirkungen sind eine geringere ETB-vermittelte ET-1-Elimination, eine verstärkte ECE-Aktivität durch Verminderung der ETB-vermittelten Hemmung sowie eine Reduktion der ebenfalls ETB-vermittelten Produktion von NO, welches wachstumshemmende Eigenschaften besitzen kann.


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4.2 Bedeutung des ET-Systems für das Wachstum von MH-7777-Zellen in vitro

In der vorliegenden Arbeit wurde die Menge des endogen synthetisierten irET-1 im Überstand kultivierter Morris-Hepatom (MH)-7777-Zellen bestimmt. Außerdem wurden MH-7777-Zellen in vitro mit ET-1 stimuliert sowie unabhängig davon mit verschiedenen ET-Rezeptorantagonisten behandelt, um die Bedeutung des ET-Systems für das Wachstum dieser Tumorzellinie zu untersuchen.

Die Ergebnisse zeigen, daß Medien von in vitro kultivierten MH-7777-Zellen nach 24stündiger Inkubation im ET-1-ELISA klar nachweisbare Mengen an immunreaktivem (ir) ET-1 enthalten, während dies in Kontrollmedium ohne Zellen nicht der Fall ist. Die Behandlung mit ET-Rezeptorantagonisten ergibt eine konzentrationsabhängige Proliferationshemmung, die bei der höchsten verwendeten Konzentration des ETB-Rezeptorantagonisten LU 302872 in beiden durchgeführten Proliferationsassays ca. 50% beträgt (p<0,05).

Die von den MH-7777-Zellen gebildeten irET-1-Mengen liegen bei durchschnittlich 10,3 fm/106 Zellen in 24 Stunden. Dieses entspricht einer nach 24 Stunden erreichten irET-1-Konzentration von ca. 10-11 mol/l Medium.

Die Menge des endogen gebildeten ET-1 befindet sich damit im Bereich der Literaturangaben für andere Tumorzellinien. Diese liegen beispielsweise für HeLa- und Hep-2-Zellen unter (wie in der vorliegenden Arbeit) FCS-freien Bedingungen bei 3,5 bzw. 22,3 fmol/106 Zellen in 24 Stunden ( Shichiri et al., 1991b). Moraitis et al. (1997) geben für zwei Linien von Ovarialkarzinomzellen gebildete ET-1-Mengen von 1,7 bzw. 20,2 fmol/106 Zellen in 72 Stunden an, während Kusuhara et al. (1990) über irET-1-Konzentrationen von 0,42-15×10-11 mol/l in verbrauchten Medien von 13 humanen Krebszellinien berichten.

Diese durch endogene Produktion erzielten ET-1-Konzentrationen sind ausreichend, um mitogene Effekte zu erzielen. Von mehreren Autoren wird eine erfolgreiche exogene Stimulation von Tumorzellen in vitro im Konzentrationsbereich von 10-11 bis 10-7 mol/l beschrieben ( Shichiri et al., 1991a,b; Pagotto et al., 1995; Nelson et al., 1995; Moraitis et al., 1997). Es gibt sogar Berichte über proliferative Wirkungen bei noch geringeren ET-1-Konzentrationen. Die Konzentrations-Wirkungs-Beziehungen stellen sich in den erwähnten Publikationen sehr unterschiedlich dar. In einigen steigt die mitogene Wirkung linear an, in anderen gibt es Maxima an bestimmten


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Konzentrationsstufen, nach denen die Wirkung mit steigender Konzentration wieder abnimmt (z.B. Moraitis et al., 1997).

Die exogene ET-1-Stimulation der Morris-Hepatom-7777-Zellen wurde mit Konzentrationen von 10-11 bis 10-5 mol/l durchgeführt. Sie bewirkte im Konzentrationsbereich von 10-9 bis 10-7 mol/l eine im MTT-Proliferationsassay gemessene statistisch signifikante Proliferationssteigerung (p<0,05). Es gibt eine grobe Übereinstimmung zwischen dem Kurvenverlauf der Durchschnittswerte aus dem MTT-Assay und den Werten des wahrscheinlich zuverlässigeren BrdU-Assays (siehe Abb. 12 , zu den möglichen Ursachen unterschiedlicher Resultate beider verwendeter Proliferationsassays siehe unten). Eine direkte Zählung der Zellen, z.B. mittels eines Durchflußzytometers, erwies sich aufgrund der nicht vollständigen Vereinzelbarkeit der Zellen als undurchführbar.

Ein weiterer Anhaltspunkt für eine tatsächlich bestehende proliferative Wirkung des ET-1 auf die MH-7777-Zellen sind die mikroskopischen Beobachtungen im Rahmen der Trypanblau-Färbung. Die ET-1-stimulierten Zellen erschienen in allen Konzentrationsstufen optisch eindeutig weniger bläulich angefärbt und vitaler. Es waren fast keine angefärbten Zellen im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen zu sehen. Der durchschnittliche Wert auf der semiquantitativen optischen Quantifizierungsskala für bläulich angefärbte Zellen von 0 bis 5 lag bei 0,54 im Vergleich zu den durchschnittlichen Werten der Kontrollen und den mit ET-Rezeptorantagonisten stimulierten Zellen aller Konzentrationen im Bereich zwischen 1,42 und 1,75. Unter Mangelbedingungen kultivierte Zellen mit Austausch des Mediums durch nährstoffreien PBS erreichten Werte von 3,33, d.h. die Mehrzahl der Zellen war in diesem Fall bläulich angefärbt und damit geschädigt.

Nach diesem semiquantitativen Verfahren zu urteilen, ist der Zustand der ET-1-stimulierten MH-7777-Zellen deutlich besser als der der Kontrollen, was sich im Vergleich zu den Kontrollen in optisch eindeutig geringerer Anfärbbarkeit der Zellen durch den Farbstoff Trypanblau äußert. Dieser wird lediglich von irreversibel geschädigten Zellen aufgenommen. Die Feststellung gilt für alle Konzentrationsstufen ohne erkennbaren Unterschied.

Zusammenfassend läßt sich also sagen, daß MH-7777-Zellen unter FCS-freien Bedingungen eine Substanz produzieren, die sich als irET-1 nachweisen läßt. Die Menge dieses produzierten irET-1 liegt in der Größenordnung der ET-1-Produktion anderer Tumorzellen. Die Konzentration des irET-1 liegt in dem Bereich, für den in vitro


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mitogene Effekte gezeigt werden konnten. Exogene Stimulation der MH-7777-Zellen mit diesen und höheren Konzentrationen führte zu Ergebnissen, die innerhalb eines großen Schwankungsbereichs eine proliferationssteigernde Wirkung des ET-1 erkennen lassen (für 10-9 bis 10-7 mol/l ET-1 im MTT-Proliferationsassay p<0,05). Diese wird durch mikroskopische Beobachtungen nach Trypanblau-Färbung bestätigt, in denen ET-1-stimulierte MH-7777-Zellen deutlich weniger anfärbbar sind und einen vitaleren Eindruck machen als die entsprechenden Kontrollen. Unter Annahme dieser Ergebnisse kann ein autokriner Mechanismus der ET-1-vermittelten Proliferation für die untersuchten MH-7777-Zellen vermutet werden. Ein solcher Mechanismus wurde schon für andere Zellen, wie z.B. humane Tumorzellen ( Shichiri et al., 1991b) und Endothelzellen ( Eguchi et al., 1995) nachgewiesen (siehe auch 1.1.5 ).

Nach der Quantifizierung sowie exogenen Verstärkung des endogenen ET-Systems folgte die Hemmung der Wirkung des von den Tumorzellen endogen produzierten ET. Dabei ist zu beachten, daß exogen zugegebene ET-Rezeptorantagonisten zur Entfaltung ihrer Wirkung zunächst das relativ fest an den Rezeptoren gebundene endogene ET aus seiner Bindung verdrängen müssen.

Die Art der an der ET-1-vermittelten Proliferation beteiligten Rezeptoren wurde durch den Einsatz von ET-Rezeptorantagonisten näher untersucht. Sowohl die selektiven ETA-Rezeptorantagonisten BQ 123 und LU 135252 als auch der kombinierte ETA/B-Rezeptorantagonist LU 302872 führten nach 24stündiger Inkubation mit nicht exogen stimulierten Hepatomzellen zu einer verminderten MTT-Reduktion. Das Ausmaß der MTT-Reduktion wird im MTT-Proliferationsassay als Ausdruck der Zellzahl angesehen. Dies gilt in gleicher Weise für den Einbau von BrdU im BrdU-Proliferationsassay. Die im BrdU-Assay gemessene Extinktion als Maß für den BrdU-Einbau bestätigt die Ergebnisse des MTT-Assays nur bedingt. Ein weitgehend übereinstimmender Kurvenverlauf über die verschiedenen Konzentrationsstufen findet sich lediglich für den kombinierten ETA/B-Rezeptorantagonisten LU 302872. Bei den ETA-selektiven Rezeptoren steht den Ergebnissen einer über 50%igen Hemmung der MTT-Reduktion bei der jeweils höchsten Antagonistenkonzentration eine lediglich bei der höchsten Konzentration erkennbare leichte, aber statistisch signifikante Verminderung des BrdU-Einbaus gegenüber.

Die beste Methode zur Erfassung von Zellproliferation ist die direkte Zellzählung in einer Zählkammer oder mittels eines Durchflußzytometers. Entsprechende Versuche schlugen aufgrund der mangelnden Vereinzelbarkeit der Zellen fehl. Daher wurden zwei


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auf verschiedenen Prinzipien basierende Proliferationsassays parallel durchgeführt. Der kolorimetrische MTT-Assay ist ein verbreitetes Verfahren zur Messung der Zahl lebender Zellen in Zellkultursystemen. Er beruht auf der Reduktion des Tetrazoliumsalzes MTT durch verschiedene intrazelluläre Enzyme. Dies geschieht unter Bildung eines Formazan-Farbstoffs. Der BrdU-Assay mißt im Gegensatz zum MTT-Assay nicht die Stoffwechselaktivität der vorhandenen Zellen, sondern deren DNA-Synthese als direkteren Ausdruck der proliferativen Aktivität. Die Methode wurde als Alternative zum „Goldstandard“ der Proliferationsassays, dem [3H]Thymidin-Assay entwickelt. Wie dieser beruht auch der BrdU-Assay auf dem Einbau eines markierten Nukleotids, das über nachgeschaltete Reaktionen quantifizierbar gemacht wird. Diese unterschiedlichen Funktionsmechanismen machen divergierende Resultate vorstellbar.

Bei einem einschätzenden Vergleich beider Methoden zur Bestimmung der relativen Zellzahl stößt man für den MTT-Assay auf zahlreiche beschriebene Einschränkungen der Zuverlässigkeit. Es werden falsch positive Resultate ( Rollino et al., 1995) sowie zu hohe Ergebnisse bezüglich der Zellzahlen bei hohen FCS-Konzentrationen beschrieben ( Zhang et al., 1996). Es erscheint möglich, daß durch verschiedene Faktoren, wie z.B. FCS, Enzyme so moduliert werden, daß dies zu einer verstärkten MTT-Reduktion führt. Auch das umgekehrte Phänomen einer verminderten MTT-Reduktion beispielsweise durch den PKC-Inhibitor Calphostin C ist bekannt ( Berridge et al., 1992). Die MTT-Reduktion beteiligt verschiedene Enzyme in unterschiedlichen Zellkompartimenten unter Verwendung reduzierter Pyridinnukleotide als Kofaktoren. Die lange vorherrschende Vorstellung einer vorwiegend succinatabhängigen mitochondrialen MTT-Reduktion durch die Succinatdehydrogenase wurde zugunsten der einer vorwiegend NAD(P)H-abhängigen mikrosomalen Reduktion korrigiert ( Berridge et al., 1993; Berridge et al., 1997). Die zelluläre Produktion reduzierter Pyridinnukleotide, insbesondere von NADH, scheint der limitierende Faktor der MTT-Reduktion zu sein. Damit wäre die MTT-Reduktion in erster Linie ein Maß der glykolytischen NADH-Produktion ( Berridge et al., 1997).

So, wie der PKC-Antagonist Calphostin C (PKC- und NAD(P)H-unabhängig) den unbedeutenderen Teil der mitochondrialen MTT-Reduktion hemmt ( Berridge et al., 1992), wäre es vorstellbar, daß ETA-Rezeptorantagonisten ebenfalls Enzyme inhibieren, die zur MTT-Reduktion notwendig sind. In den vorliegenden Experimenten liegt eine Verringerung der MTT-Reduktion von über 50% vor. Daher ist eine Hemmung der NAD(P)H-Produktion oder des mikrosomalen Reduktionsvorgangs (als wesentlichste


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Faktoren der MTT-Reduktion) durch die ETA-Rezeptorantagonisten als am wahrscheinlichsten anzunehmen, wenn man davon ausgeht, daß es sich beim BrdU-Proliferationsassay um die verläßlichere Methode handelt. In jedem Fall ist bei der höchsten Konzentrationsstufe der ETA-Rezeptorantagonisten eine Proliferationshemmung zu verzeichnen. Auch wenn sie im BrdU-Assay für 10-4 mol/l LU 135252 nur bei 88,8% (p<0,05) und für 5×10-3 mol/l BQ 123 bei 82,6% (p<0,05) der unbehandelten Kontrollen liegt (statt bei 33,5% bzw. 43,6% der Kontrollen im MTT-Assay).

Es kann also (bei Annahme der diskutierten Voraussetzungen) durch den kombinierten ETA/B-Rezeptorantagonisten LU 302872 eine deutlich stärkere Proliferationshemmung erreicht werden (auf ca. 50% der Kontrollen) als durch die beiden selektiven ETA-Rezeptorantagonisten (88,8% bzw. 82,6% der Kontrollen). Dies läßt vermuten, daß die proliferative Wirkung des ET-1 an MH-7777-Zellen vorwiegend über ETB-Rezeptoren vermittelt wird. Allerdings ist auch durch die selektive Blockung der ETA-Rezeptoren eine Proliferationshemmung von mindestens 11% zu erzielen. Daher könnte es sich bei der Wachstumshemmung durch kombinierte Antagonisierung beider ET-Rezeptoren um einen synergistischen Effekt handeln. Dies würde bedeuten, daß die Behandlung mit einem spezifischen ETB-Rezeptorblocker unter Umständen ebenfalls nur zu einer leichten Proliferationshemmung führt und lediglich die Kombination aus ETA- und ETB-Rezeptorblock die beobachteten drastischen Effekten bewirkt.

Nach dem bisherigen Stand der Forschung können keine verläßlichen allgemeinen Aussagen darüber gemacht werden, welche ET-Rezeptoren vorwiegend an der Auslösung ET-1-abhängiger mitogener Effekte beteiligt sind ( _edo et al., 1996). Es existieren eine Reihe von in der Einleitung erwähnten Untersuchungen (siehe 1.1.8 ), die eine Hemmung von ET-1-induzierten mitogenen Effekten durch den ETA-Rezeptorantagonisten BQ 123 beschreiben. Allerdings wurden auch ETB-Rezeptor-vermittelte Proliferationseffekte an Endothelzellen ( Ziche et al., 1995) und humanen primären und metastatischen Melanomzellen ( Kikuchi et al., 1996) nachgewiesen. Daneben gibt es einen Bericht über ETB-Rezeptor-vermittelte Wachstumshemmung von humanen myofibroblastischen Ito-Zellen durch ET-1 ( Mallat et al., 1995). Diese Ergebnisse sprechen für eine Wachstumsstimulierung sowohl über den ETA- als auch über den ETB-Rezeptor, je nach untersuchter Zellart. Es ist allerdings anzumerken, daß es nicht genügend systematische Untersuchungen zu den unterschiedlichen Wirkungen der verschiedenen ET-Rezeptoren mit eventuell zu beobachtenden synergistischen Effekten auf proliferative Vorgänge gibt. Die Wachstumshemmung durch ET-1 stellt wahrscheinlich einen


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isolierten Sonderfall dar. Bei der Hemmung ET-1-induzierter mitogener Effekte durch den ETA-Rezeptorantagonisten BQ 123 handelt es sich fast ausschließlich um Reduzierung von Proliferation, die durch exogenes ET-1 induziert wurde. Lediglich Moraitis et al. (1997) führten eine erfolgreiche Hemmung nicht exogen stimulierter Tumorzellen mit BQ 123 durch. Auffallend sind die mindestens 1000fach geringeren BQ 123-Konzentrationen, die zur Wachstumshemmung benötigt werden. Pagotto et al. (1995) hemmen ET-1-stimulierte Meningeomzellen mit BQ 123 in einer Konzentration von 10-6 mol/l. Moraitis et al. (1997) benötigen lediglich 10-7 mol/l BQ 123, um sowohl ET-1-stimulierte als auch nicht stimulierte Ovarialkarzinomzellen in ihrem Wachstum zu hemmen. Dagegen traten in der vorliegenden Arbeit statistisch signifikante Effekte erst ab BQ 123-Konzentrationen von 10-3 mol/l auf.

Dies legt die Vermutung nahe, es könne sich bei den beobachteten wachstumshemmenden Effekten um toxische Wirkungen der hochdosierten ET-Rezeptorantagonisten handeln. Die Auswertung der LDH-Konzentrationen im Überstand der behandelten Zellen spricht gegen diese Vermutung. Alle durchschnittlichen LDH-Werte in den Kulturüberständen der mit der höchsten verwendeten ET-Rezeptorantagonisten-Konzentration inkubierten MH-7777-Zellen liegen dicht bei den durchschnittlichen Werten unbeeinflußter Kontrollen (92-122% der Kontrollwerte). Tatsächlich schädigende Bedingungen wie Austausch des Mediums durch PBS oder Inkubation mit 20% DMSO führten zu einer drastischen Steigerung der durchschnittlichen LDH-Konzentrationen auf fast das doppelte bzw. mehr als das dreifache der Kontrollkonzentrationen. Auch die Anfärbung der Zellen mit Trypanblau erbrachte keinen Hinweis auf toxische Effekte. Diese würden sich in verstärkter Anfärbbarkeit der toxisch geschädigten Zellen mit dem verwendeten Farbstoff äußern. In der semiquantitativen optischen Quantifizierungsskala für bläulich angefärbte Zellen von 0 bis 5 erreichte keine der mit ET-Rezeptorantagonisten behandelten Kulturen Werte über den 1,75 der Kontrollen.

Ein weiterer Gesichtspunkt zur Interpretation der vorliegenden Ergebnisse ist die Rolle apoptotischer Prozesse. Als Gegenpol zu proliferativen Vorgängen ist häufig Apoptose zu beobachten. In diesem Zusammenhang wurde ET-1 als protektiver, Apoptose inhibierender Faktor beschrieben ( Wu-Wong et al., 1997; Shichiri et al., 1997; Shichiri et al., 1998). Die Tatsache, daß bei der Trypanblau-Färbung der ET-1-behandelten Zellen fast keine bläulich angefärbten Zellen zu sehen sind (ein sehr geringer Wert von 0,54 auf der semiquantitativen optischen Quantifizierungsskala), könnte möglicherweise mit einer Hemmung der auch bei den Kontrollen in gewissem


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Umfang natürlich stattfindenden Apoptose erklärt werden. Möglicherweise greifen auch die ET-Rezeptorantagonisten in die Regulation der Apoptose ein. Da in der vorliegenden Arbeit keine Untersuchungen zum Nachweis apoptotischer Zellen durchgeführt wurden, sind diese Überlegungen lediglich als Ausblick auf mögliche weiterführende Forschungsvorhaben zu verstehen.

Zusammenfassend läßt sich sagen, daß bei der Beurteilung der Proliferation der mit ETA-Rezeptorantagonisten inkubierten MH-7777-Zellen Diskrepanzen zwischen den beiden parallel durchgeführten Proliferationsassays auftraten. Diese sind möglicherweise dadurch zu erklären, daß es durch die isolierte Blockierung des ETA-Rezeptors zu einer Beeinflussung der für die MTT-Reduktion wesentlichen Enzyme bzw. Kofaktoren kommt. Nach Auswertung des wahrscheinlich verläßlicheren BrdU-Assays zeigt sich eine knapp 50%ige Proliferationshemmung durch Inkubation der MH-7777-Zellen mit hohen Konzentrationen des kombinierten ETA/B-Rezeptorantagonisten LU 302872. Dagegen liegt die Hemmung durch die ETA-Rezeptorantagonisten LU 135252 und BQ 123 jeweils nur im Bereich von 10%-20%. Es kann also ein vorwiegend ETB-Rezeptor-vermittelter oder auch ein synergistisch über beide Rezeptoren wirkender ET-abhängiger proliferativer Mechanismus vermutet werden. Die Tatsache, daß höhere als für andere Zellen in der Literatur beschriebene Konzentrationen an ET-Rezeptorantagonisten zur Proliferationshemmung benötigt wurden legt die Vermutung toxischer Effekte nahe. Diese konnte jedoch durch Bestimmung der LDH-Konzentrationen im Kulturüberstand und Trypanblau-Färbung nicht bestätigt werden. Ob Apoptoseprozesse für die beobachteten Phänomene von Bedeutung sind muß in weiteren Untersuchungen geklärt werden.


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4.3 Wachstumshemmung des MH-7777 durch LU 302872 in vivo

4.3.1 Vorbemerkung

Wegen der in vitro am deutlichsten ausgeprägten proliferationshemmenden Wirkung wurde auch zum Versuch der Tumorbehandlung in vivo ein kombinierter ETA/B-Rezeptorantagonist eingesetzt. Aus einer isolierten Blockung des ETA-Rezeptors scheint nur eine geringere Wachstumshemmung zu folgen. Ob der Effekt des LU 302872 auf die Zellen also vorwiegend über den ETB-Rezeptor vermittelt wird, als gemeinsame Wirkung aus der Inhibierung beider Rezeptoren hervorgeht oder auf einem unbekannten Mechanismus dieser relativ neuen Substanz beruht, ist nicht bekannt. Der Versuch einer Reproduktion des hemmenden Effekts auf das MH-7777 in vivo liegt dem Experiment hypothetisch zugrunde.

Für den Behandlungsversuch des Hepatoms in vivo gibt es allerdings noch andere Gesichtspunkte, da hier nicht nur die direkte Beeinflussung der Hepatomzellen, sondern auch die Wirkung auf Fibroblasten, Endothel- und Gefäßmuskelzellen im Rahmen der Tumorangiogenese von Bedeutung ist. Für glatte Gefäßmuskelzellen sind ETA-Rezeptor-vermittelte mitogene Wirkungen von ET-1 bekannt ( Eguchi et al., 1992a; Ohlstein et al., 1992; Guo et al., 1996; siehe 1.1.8 ), so daß in diesem Zusammenhang auch ein Block des ETA-Rezeptors relevant sein könnte. Für Endothelzellen wurde eine Stimulierung von Zellwachstum und Proliferation über den ETB-Rezeptor beschrieben ( Ziche et al., 1995). Die ET-Produktion dafür erfolgt zum Teil autokrin ( Eguchi et al., 1995). In Lungentumoren sind ET-Bindungsstellen in Blutgefäßen nachgewiesen ( Zhao et al., 1995). Bei kolorektalen Karzinomen werden ET-Bindungsstellen hauptsächlich in Tumorgefäßen und im Stroma um neoplastische Zellnester beschrieben ( Inagaki et al., 1992). Um die in dieser Arbeit nur global im Hepatom gemessenen Rezeptordichten Tumor-, Bindegewebs- und Muskelzellen zuordnen zu können, müßten Rezeptorstudien an den Tumorzellkulturen bzw. immunhistochemische Untersuchungen an Hepatomgewebe durchgeführt werden. Die genannten Daten lassen jedoch eine Rolle des ET-1 für vaskuläre Regulationsprozesse im Tumorgefäßbett vermuten.

Ein weiterer Unterschied der Verhältnisse in vivo gegenüber der Zellkultur ist zu berücksichtigen. Die überadditiven gegenseitigen Verstärkungen von ET-1 und vielen anderen Wachstumsfaktoren ( Battistini et al., 1993b) legen die Vermutung nahe, daß ET-1 möglicherweise eine eher regulierende als rein mitogene Wirkung ausübt. Dieser


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Aspekt ist in vivo von noch größerer Bedeutung, da mehr zusätzliche Wachstumsfaktoren an der Tumorentwicklung beteiligt sind als in FCS-freiem Medium in der Zellkultur. So wurde beispielsweise gezeigt, daß die Wirkung von TGFbeta je nach zusätzlich vorhandenen Wachstumsfaktoren sowohl proliferationssteigernd als auch antiproliferativ sein kann ( Roberts et al., 1985).

Trotz fehlender detaillierter Kenntnis der ET-bezogenen molekularen Vorgänge im MH-7777 und ohne den Anspruch, diese durch den Versuch aufklären zu wollen, wurden 22 männliche Buffalo-Ratten über 28 Tage mit LU 302872 behandelt. Ziel war die Beantwortung der Frage, ob das ET-System für das Hepatomwachstum in vivo eine Rolle spielt und ob Versuche einer Beeinflussung von Tumorwachstum in vivo durch Eingriffe in das ET-System erfolgversprechend erscheinen.

4.3.2 Wachstumsverhalten des MH-7777 bei Behandlung mit LU 302872

Die beidseits in die Oberschenkelmuskulatur der Ratten transplantierten Hepatome wachsen langsamer in den Tieren, die LU 302872 mit dem Trinkwasser aufnehmen. Der zwischen rechtem und linkem Hepatom gemittelte transversale Durchmesser ist ab dem 15. Tag nach Transplantation im Verlauf an allen Meßpunkten um 9-21% geringer als bei Kontrollen (Unterschiede an Tag 15, 25 und 28 signifikant). Auch das sonographisch ermittelte Tumorvolumen, das Entnahmegewicht und das errechnete Entnahmevolumen der Hepatome sind in der behandelten Gruppe geringer (letzteres statistisch signifikant).

Es stellt sich die Frage, auf welche Weise LU 302872 das geringere absolute Wachstum der Hepatome bewirkt. Einerseits könnte dies über die Hemmung der Tumorzellproliferation analog den Zellkulturexperimenten geschehen (siehe 4.2 ). Alternativ oder auch zusätzlich wäre eine Hemmung der Tumorangiogenese denkbar, welche ihrerseits zu Minderversorgung des Hepatomgewebes und einer daraus resultierenden Wachstumsverlangsamung führt. Auch die mögliche Rolle von Apoptoseprozessen bei der Tumorwachstumshemmung muß im Rahmen der beschriebenen Rezeptorveränderungen im MH-7777 bedacht werden (die ETA-Rezeptordichte ist gegenüber Lebergewebe erhöht, die ETB-Rezeptordichte vermindert, siehe 4.1.3 )

Schon erwähnt wurde die in Mastozytom- und Gefäßmuskelzellen bekannte ETB-Rezeptor-vermittelte NO-abhängige (über cGMP und Fas) Apoptose ( Kitasjima et al., 1994; Fuko et al., 1996), welche eine Apoptoseverminderung bei geringerer


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ETB-Rezeptordichte erklären könnte. Auch über die verstärkte ETA-Rezeptorexpression im MH-7777 kann Apoptose unterdrückt werden. An Gefäßmuskelzellen und Fibroblasten mit dereguliertem c-myc sind ET-1-abhängige apoptoseprotektive Wirkungen bekannt ( Wu-Wong et al., 1997; Shichiri et al., 1997; Shichiri et al., 1998). Diese werden möglicherweise durch Anwendung von ET-Rezeptorantagonisten wie im durchgeführten Versuch abgeschwächt und führen dadurch zu geringerem Wachstum. Allerdings konnte an Prostatakarzinomzellen kein apoptoseprotektiver Effekt durch ET-1 erzielt werden. Nelson et al. (1996) vermuten eher einen mitosesteigernden als einen apoptosesenkenden Effekt durch ET-1. Zur Klärung dieser Fragen in bezug auf das MH-7777 müßten weitere Untersuchungen durchgeführt werden.

Der Gewichtsverlauf in der unbehandelten Gruppe liegt im in der Literatur beschriebenen Bereich. Dieser reicht von gegenüber Kontrollen unverändertem Gewicht an Tag 14 nach Transplantation (wie in der vorliegenden Studie) ( Shewchuk et al., 1996) bis zu 23% Gewichtsverlust nach 42 Tagen (in der vorliegenden Arbeit 5,8% nach 28 Tagen) ( Le Bricon et al., 1996).

Dagegen fällt ein statistisch hochsignifikant stärker ausgeprägter Gewichtsverlust der behandelten Tiere auf (19% vs. 5,8% in der Kontrollgruppe). Dies geht einher mit einem tendenziell schlechteren Allgemeinzustand und stärkerer Kachexie der Tiere in dieser Gruppe, wobei die kritische Marke von 30% Gewichtsverlust ( Tisdale , 1991) zu diesem Zeitpunkt noch nicht erreicht ist.

Wie läßt sich der ausgeprägte Gewichtsverlust der Tiere in der behandelten Gruppe erklären?

Als mögliche Ursachen kommen einerseits verminderte Nahrungs- und Flüssigkeitsaufnahme durch LU 302872 in Frage. Andererseits wäre eine den katabolen Effekt des Tumors verstärkende Wirkung von LU 302872 über einen noch nicht bekannten Mechanismus vorstellbar.

Bei unbehandelten hepatomtragenden Buffalo-Ratten bleibt die Nahrungsaufnahme bis zum 10. Tag nach Transplantation konstant und sinkt ab diesem Zeitpunkt bis auf ca. 50% ( Strelkov et al., 1989). An gesunden Kontrollen, welche die gleichen Futtermengen bekamen, wie von den hepatomtragenden ad libitum aufgenommen wurden, konnte gezeigt werden, daß die verminderte Nahrungszufuhr für 40% des Verlusts an Muskelgewicht verantwortlich ist ( Strelkov et al., 1989). Die Nahrungsaufnahme wurde im durchgeführten Experiment nicht quantifiziert. Trotzdem kann davon


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ausgegangen werden, daß sie sich in der unbehandelten Gruppe ähnlich verhält wie von Strelkov et al. (1989) beschrieben. Stichprobenartig wurde in der behandelten Gruppe eine geringere Nahrungsaufnahme festgestellt.

Sowohl die signifikant verminderte Gesamtproteinkonzentration als auch der signifikant erhöhte Harnstoff sprechen für einen verstärkten Proteinkatabolismus der behandelten Tiere.

An einem anderen Tumormodell zeigte sich (ohne Behandlung) ebenfalls ein Abfall der Nahrungsaufnahme ab dem 10. Tag mit darauffolgendem kompensatorischem Anstieg der Flüssigkeitsaufnahme. Dieser kompensatorische Effekt konnte auch bei gesunden Tieren unter Nahrungsrestriktion beobachtet werden ( Morrison , 1968).

Ein Anstieg der Flüssigkeitsaufnahme wurde im durchgeführten Versuch nicht gemessen. Die Flüssigkeitsaufnahme sank dagegen in beiden Gruppen im Laufe des Versuchs ab. Sie befand sich in der behandelten Gruppe jedoch schon zu Versuchsbeginn auf einem deutlich niedrigeren Niveau.

Sowohl die Implantation des Tumors als auch die Zugabe von LU 302872 zum Trinkwasser führt in getrennten Experimenten über vier Wochen zu einer Abnahme der Trinkmengen in vergleichbarer Größenordnung. Eine Kombination beider Faktoren (MH-7777 und LU 302872) führt schon in der Meßperiode der ersten fünf Tage zu einer Verringerung der Flüssigkeitsaufnahme auf 68%. Dies ist ein unerwartetes Ergebnis, da in diesen ersten Tagen nur verhältnismäßig wenige Tumorzellen vorhanden sind. Offensichtlich reicht die Wirkung dieser wenigen Zellen aus, um zusammen mit LU 302872 eine drastische Verminderung der Trinkmenge zu bewirken. Über den zugrundeliegenden Mechanismus kann nur spekuliert werden. Möglicherweise produziert das Hepatom einen zirkulierenden Faktor, der zusammen mit LU 302872 die Diurese herabsetzt oder das Durstempfinden senkt. Möglicherweise wird durch den ETA/B-Rezeptorantagonisten LU 302872 in Kombination mit vom MH-7777 freigesetzten Faktoren in die komplexen, in ihren Einzelheiten unverstandenen Wirkungen der Endotheline auf die Salz-Wasser-Regulation eingegriffen. Sowohl Einflüsse auf renaler als auch auf zentral-hormonaler Ebene könnten für die beobachteten Phänomene von Bedeutung sein.

Die in der behandelten Gruppe gemessenen signifikant erhöhten Natriumwerte könnten Ausdruck der geringeren Trinkmenge bzw. des gestörten Wasser/Elektrolyt-Haushalts dieser Tiere sein.


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Es kann festgehalten werden, daß die Behandlung mit LU 302872 bei MH-7777-tragenden Buffalo-Ratten zu einer von Beginn an deutlichen Abnahme der Trinkmenge führt. Diese kann unter Einbeziehung der Vorbefunde nur aus einer gemeinsamen Wirkung des Hepatoms und des Pharmakons erklärt werden. Gleichzeitig scheint sich die Nahrungsaufnahme gegenüber hepatomtragenden Kontrollen zu verringern. Eine ursächliche Beziehung zwischen verminderter Nahrungs- und Flüssigkeitsaufnahme der behandelten Tiere sowie dem über das tumorbedingt zu erwartende Maß hinaus verstärkten Gewichtsverlust, erscheint naheliegend. Über welchen Mechanismus LU 302872 bei hepatomtragenden Tieren zu verminderter Nahrungs- und Flüssigkeitsaufnahme und einem möglicherweise zusätzlich direkt katabolen Effekt führt, ist unklar.

Anschließend an diese Überlegungen stellt sich die Frage, welche Wirkung die verminderte Nährstoff- und Flüssigkeitsaufnahme auf das Hepatomwachstum haben könnte.

Allgemein ist davon auszugehen, daß ein maligner Tumor relativ unabhängig vom Ernährungszustand des Wirts wächst, also kaum durch Mangelernährung des Wirts in seinem Wachstum gebremst wird. Vorstellbar wäre im Gegenteil, daß eine katabole Stoffwechsellage durch Schwächung von Abwehrmechanismen das Wachstum eines Tumors verstärkt. Dazu kommt, daß niedrig differenzierte Morris-Hepatome, wie das verwendete MH-7777, im Vergleich zu höher differenzierten Hepatomen streßresistenter sind ( Blatteis et. al., 1980). Außerdem konnte von Blatteis et al. (1980) gezeigt werden, daß die errechnete Substratutilisation im Tumorgewebe (Tumorwachstum bezogen auf Nahrungsaufnahme) auch unter Streßbedingungen unverändert hoch ist, während sie im Wirtsorganismus sinkt. Entweder können die Hepatomzellen unter diesen Bedingungen im Gegensatz zum Wirt das verfügbare Substrat weiterhin unverändert gut nutzen oder sie entziehen dem Wirt Teile seines proportionalen Anteils, um sie für das eigene Wachstum zu verbrauchen und damit den allgemeinen Abfall der Substratutilisation zu kompensieren. Für seine Proteinsynthese benutzt das MH-7777 einen beträchtlichen Anteil der Aminosäureaufnahme des Wirts ( Le Bricon et al., 1995). In jedem Fall scheint der Wirt unter verminderter Nahrungsaufnahme und anderen Streßfaktoren mehr zu leiden, als der Tumor selbst. Es erscheint also fraglich, ob durch Mangelernährung des Wirts eine Hemmung von MH-Wachstum hervorgerufen werden kann.


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Das Wachstum der Tumoren in der unbehandelten Gruppe entspricht annähernd den schon 1969 beschriebenen Größenordnungen eines Gewichts von 12,7 (± 3,1) g pro Tumor nach 46 Tagen und einer Verdopplungszeit von 11,7 Tagen ( Linder-Horowitz et al., 1969).

Die Organgewichte von Leber, Dünndarm und Epitrochlearismuskel verringern sich nach MH-7777-Transplantation proportional zum abnehmenden Körpergewicht, während die relativen Organgewichte konstant bleiben ( Le Bricon et al., 1996). Die in der vorliegenden Arbeit bei den behandelten Tieren gemessenen geringeren Organgewichte von Leber, Niere und Herz (p<0,001) sind wahrscheinlich durch das proportional dazu abnehmende Körpergewicht bedingt. Die relativen Organgewichte unterscheiden sich außer bei den Nieren nicht.

Der herausragendste Befund bei der Betrachtung der Serumwerte ist die signifikante Erhöhung der Transaminasen (Aspartataminotransferase, Alaninaminotransferase) bei den hepatomtragenden Tieren. Dies ist als Ausdruck eines zentral nekrotisierenden heterotopen Lebertumors nicht verwunderlich. Ähnliche, aber statistisch nicht signifikante Verhältnisse werden auch bei den LDH-Konzentrationen als Zeichen einer malignen Erkrankung beobachtet.

Eine Erhöhung des Serumcholesterins wurde auch beim MH-7288CTC und beim Aszites-Hepatom (Yoshida AH-130) gemessen ( Xu et al., 1996; Tessitore et al., 1993). Eine Erhöhung ist auch deutlich signifikant bei den MH-7777-tragenden Buffalo-Ratten zu beobachten. Durch die Behandlung mit LU 302872 reduziert sich das Cholesterin wieder in Richtung des Referenzwertes gesunder Tiere, bleibt allerdings weiterhin signifikant erhöht.

Einen weiteren Gesichtspunkt liefert die bisher nicht publizierte Beobachtung, daß Langzeitbehandlung mit einem Racemat von LU 302872 zur Verminderung verschiedener Matrixproteine im Bindegewebe der Niere führt. Diese Substanz scheint also in die Kollagen- bzw. Bindegewebssynthese einzugreifen. Es wäre denkbar, daß der beobachtete schlechtere Allgemeinzustand der behandelten Tiere im Zusammenhang mit einer Kollagenmangelerscheinung steht oder daß die Stromabildung des Tumors beeinflußt wird.


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Letztlich ungeklärt bleiben nach der vorliegenden Studie folgende Fragen:

Auf welche Weise führt LU 302872 zu einer Verminderung der Flüssigkeitsaufnahme? Wie hoch ist der Rückgang der Nahrungsaufnahme und wodurch wird er ausgelöst? Ist der Gewichtsverlust durch verminderte Flüssigkeits- und Nahrungsaufnahme bedingt und/oder gibt es einen direkten Effekt von LU 302872? Ist das verminderte Wachstum des MH-7777 in behandelten Tieren ein unspezifischer Effekt oder wird er durch tumorspezifische Wirkung des ET-Rezeptorantagonisten LU 302872 hervorgerufen?

Die letzte Frage kann möglicherweise nach der geplanten histologischen Untersuchung der Hepatome aus behandelten und unbehandelten Tieren beantwortet werden. Über den Effekt der verminderten Nahrungs- und Flüssigkeitsaufnahme auf das Tumorwachstum könnte eine Studie Aufschluß geben, in der unbehandelte Tiere die gleichen Nahrungs- und Flüssigkeitsmengen bekommen, wie die behandelten Tiere ad libitum zu sich nehmen.

Zusammenfassend läßt sich sagen, daß im letzten Teil der vorliegenden Arbeit untersucht wurde, ob das ET-System für das Hepatomwachstum in vivo eine Rolle spielt. Dazu wurde versucht, das Wachstum von MH-7777 in Buffalo-Ratten mit dem neuentwickelten kombinierten ETA/B-Rezeptorantagonisten LU 302872 zu hemmen. Dieser hatte in vitro die deutlichste Proliferationshemmung hervorgerufen. In vivo könnte auch die Beeinflussung von Tumorangiogeneseprozessen sowohl über den ETA- als auch über den ETB-Rezeptor von Bedeutung sein. Außerdem spielen die in vivo zusätzlich vorhandenen Wachstumsfaktoren in ihrer Wechselwirkung mit ET-1 wahrscheinlich eine Rolle.

Die absolute Größe der Hepatome ist im Verlauf der Behandlung an den verschiedenen Meßpunkten um durchschnittlich 9-21% geringer als in der unbehandelten Gruppe (p<0,05). Der hochsignifikant stärkere Gewichtsverlust der behandelten Tiere könnte aus der verminderten Nahrungs- und Flüssigkeitsaufnahme resultieren. Die Kombination der Faktoren MH-7777-Transplantation und LU 302872-Gabe führt unerwarteterweise schon nach kürzester Zeit zu einer drastischen Abnahme der Trinkmenge, was vielleicht die Ursache für die erhöhten Natriumwerte ist. Möglicherweise trägt LU 302872 auch über einen anderen unbekannten Mechanismus zur katabolen Stoffwechsellage der behandelten Tiere bei, die sich in einem schlechteren Allgemeinzustand, verminderter Gesamtproteinkonzentration und erhöhter Harnstoffkonzentration


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im Serum ausdrückt. Unklar bleibt, ob die Verringerung der absoluten Tumormaße durch einen unspezifischen Effekt hervorgerufen wird oder ob es einen spezifischen Effekt durch Angriff am ET-System gibt. Eher für einen spezifischen Effekt spricht die beschriebene Streßresistenz von undifferenzierten Morris-Hepatomen sowie eine bei Mangelernährung konstante Substratutilisation seitens der Tumorzellen im Gegensatz zum Wirtsorganismus. Genauere Erkenntnisse über durch LU 302872 hervorgerufene spezifische Effekte am Hepatom, können möglicherweise die Ergebnisse der geplanten histologischen Analysen hinsichtlich möglicher Unterschiede der Gefäßdichte, Apoptoserate, Metastasenrate und anderer Meßgrößen in den Hepatomen und Lebern der behandelten und unbehandelten Buffalo-Ratten liefern.


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Fri Mar 16 16:37:30 2001