Pfab, Thiemo: Zum Endothelinsystem im Morris-Hepatom-7777 - Behandlung mit Endothelinrezeptorantagonisten in vitro und in vivo

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Kapitel 5. Zusammenfassung

Das 1988 von Yanagisawa et al. entdeckte Peptid Endothelin-1 (ET-1) hat neben seiner vasokonstriktorischen Wirkung auch wachstumsinduzierende Eigenschaften. In vitro wurde vielfach nachgewiesen, daß ET verschiedene neoplastische Zellen in ihrer Proliferation verstärkt und daß dieser Effekt durch ET-Rezeptorantagonisten aufgehoben werden kann. In vivo zeigte sich, daß einige maligne Tumoren ET-1 synthetisieren und peripher erhöhte Plasmakonzentrationen von ET-1 und seinem Vorläufer Big-ET-1 meßbar sind. Jedoch bleibt die tatsächliche Bedeutung des ET-Systems für das Wachstum maligner Zellen und die Angiogenese in Tumoren in vivo weiterhin ungeklärt.

In der vorliegenden Arbeit wurde das ET-System des experimentellen Lebertumors Morris-Hepatom (MH)-7777 in vitro und in vivo charakterisiert. Erstmals wurde versucht, Tumorwachstum auch in vivo durch Behandlung mit einem ET-Rezeptorantagonisten zu inhibieren, um Informationen über die Bedeutung des ET-Systems für das Wachstum maligner Tumoren im Wirtsorganismus zu gewinnen.

  1. Im Kulturüberstand von MH-7777-Zellen wurde die Menge des synthetisierten im-munreaktiven (ir) ET-1 gemessen. Über Proliferationsassays erfolgte die Untersuchung des Zellwachstums bei Inkubation mit verschiedenen ET-1-Konzentrationen sowie den ET-Rezeptorantagonisten BQ 123, LU 135252 und LU 302872.
  2. Zur Charakterisierung des ET-Systems im MH-7777 in vivo wurden die ir(Big-)ET-1-Plasmakonzentrationen hepatomtragender und gesunder Buffalo-Ratten bestimmt. Außerdem wurden die ir(Big-)ET-1-Gewebekonzentrationen im MH-7777 mit denen von Lebergewebe verglichen. Die Messung der ET-Rezeptordichte und deren Affinität im MH-7777 erfolgte über Scatchard-Rezeptor-Bindungsstudien.
  3. Einer Gruppe von 44 Buffalo-Ratten wurde jeweils beidseitig das MH-7777 in die Oberschenkelmuskulatur transplantiert. Die Hälfte der Tiere erhielt ab Transplantation den kombinierten ETA/B-Rezeptorantagonisten LU 302872 (40-80 mg/kg×d) mit dem Trinkwasser. Über 28 Tage wurde insbesondere das Tumorwachstum durch regelmäßige transkutane Messung mit einer Präzisionsschublehre verfolgt. Auch sonographische Volumenbestimmungen wurden durchgeführt. Anschließend wurden Hepatome und Organe entnommen, gewogen und vermessen. Serum wurde zu Analysezwecken entnommen.


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Die Ergebnisse zeigen eine endogene irET-1-Produktion der MH-7777-Zellen, die im Kulturmedium mitogen wirksame Konzentrationen erreicht. Exogene ET-1-Stimulation der Zellen bewirkt eine (auch optisch zu verifizierende) Proliferationssteigerung (p<0,05). Die Proliferationshemmung durch die beiden ETA-Rezeptorantagonisten ist schwächer ausgeprägt als die in beiden Proliferationsassays bestätigte ca. 50%ige Hemmung (p<0,05) durch den kombinierten ETA/B-Rezeptorantagonisten LU 302872 (10-4 mol/l). Deshalb wurde dieser auch im Tierversuch eingesetzt. Toxische Effekte der Substanzen in vitro konnten weitgehend ausgeschlossen werden.

Trotz im Vergleich zu Lebergewebe deutlich erhöhter Gewebe-(Big-)ET-1-Konzentrationen im Hepatom (p<0,05), ruft der Tumor keine Erhöhung der Plasmakonzentrationen hervor. Im Einklang mit den Ergebnissen aus der Zellkultur legt dies eine para- oder autokrine ET-1-Wirkung nahe. Die ETA-Rezeptordichte ist im MH-7777 im Vergleich zu Kontrolleber bei männlichen Tieren um 67% erhöht, während die ETB-Rezeptordichte (ähnlich dem Prostatakarzinom) geschlechtsunabhängig um 59% verringert ist (p<0,05).

Die absoluten Größen von Durchmesser und Volumen der Hepatome sind bei den mit LU 302872 behandelten Tieren je nach Meßmethode und Beobachtungszeitpunkt um 9-21% geringer als bei den Kontrollen (p<0,05). Der hochsignifikant stärkere Gewichtsverlust der behandelten Tiere könnte aus der verminderten Nahrungs- und Flüssigkeitsaufnahme resultieren. Lediglich die Kombination der Faktoren Tumortransplantation und LU 302872-Gabe führt unerwarteterweise nach kürzester Zeit zu einer drastischen Abnahme der Trinkmenge. Möglicherweise trägt der neuentwickelte ET-Rezeptorantagonist LU 302872 auch über andere Mechanismen zur schlechteren Stoffwechsellage der behandelten Tiere bei.

In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, daß das ET-System für das MH-7777 sowohl in vitro als auch in vivo eine Bedeutung hat.

Welche Rolle die im Hepatom beobachtete (geschlechtsabhängige) ET-Rezeptorverschiebung im einzelnen spielt, muß in weiteren Studien gezielt untersucht werden. Unklar bleibt auch, ob die Verringerung der absoluten Tumormaße in vivo durch einen unspezifischen Effekt hervorgerufen wird oder ob spezifische Angriffe am ET-System involviert sind. Geplante histologische Untersuchungen der Tumoren geben darüber möglicherweise weiteren Aufschluß. Ergänzende Studien mit alternativen Applikationsformen und anderen ET-Rezeptorantagonisten erscheinen aussichtsreich.


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5.1 Summary

The peptide endothelin-1 (ET-1), discovered by Yanagisawa et al. in 1988, has growth-promoting properties besides its vasopressor characteristic. In vitro ET has been shown to increase proliferation of a variety of neoplastic cells. This effect can be abolished by ET receptor antagonists. In vivo a number of malign tumors produce ET. Also elevated plasma levels of ET-1 and its precursor big-ET-1 have been reported. However, the actual importance of the ET system for growth and angiogenesis in tumors in vivo remains unclear.

In the present study the ET system of the experimental liver tumor Morris hepatoma (MH) 7777 was characterized in vitro and in vivo. For the first time it was tried to inhibit tumor growth in vivo by treatment with an ET receptor antagonist in order to gain information about the ET systems importance for malign tumor growth within the host organism.

  1. The endogenously produced immunoreactive (ir) ET-1 was quantified in the supernatant of MH-7777 cells. Cell growth at incubation with different concentrations of ET-1 and the ET receptor antagonists BQ 123, LU 135252 and LU 302872 was evaluated performing cell proliferation assays.
  2. In order to characterize the ET system in MH-7777 in vivo ir(big-)ET-1 levels of hepatoma-bearing and healthy Buffalo rats were determined. In addition ir(big-)ET-1 tissue levels were compared to the levels of normal liver tissue. ET receptor density and affinity in hepatoma was determined performing Scatchard receptor binding assays.
  3. MH-7777 was transplanted into both hindlimbs of 44 Buffalo rats. Beginning right after transplantation half of them were applied the combined ETA/B receptor antagonist LU 302872 (40-80 mg/kg×d) added to the drinking water. For 28 days especially the tumor growth was followed up by regular transcutaneous measurement using a precision caliper. Volume determinations using ultrasound were additionally performed. At time of killing hepatomas and organs were excised, weighed and measured. Serum was taken for analysis.

The results show an endogenous ET-1 production of MH-7777 cells reaching mitogenic concentrations in culture media. Exogenous ET-1 stimulation causes a


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(microscopically confirmed) increase in cell proliferation (p<0,05). Growth inhibitory action of ETA-receptor antagonists is not as strong as the 50% inhibition (p<0,05) seen after incubation with the combined ETA/B receptor antagonist LU 302872 (10-4 mol/l). The latter was confirmed in both proliferation assays. This fact influenced the decision to use LU 302872 in the animal experiment. Toxic effects of the tested antagonists in vitro were excluded.

Despite the clearly elevated tissue (big-)ET-1 levels in hepatoma compared to liver tissue (p<0,05) no elevation of plasma levels was observed. Together with the mentioned findings of the cell culture experiments these results suggest a paracrine or autocrine way of ET action. ETA receptor density in hepatoma of male rats was shown to be increased by 67% compared to normal liver tissue, whereas ETB receptor density is reduced (as in prostate cancer) by 59% regardless of sex (p<0,05).

Looking at diameter and volume, the absolute hepatoma sizes are 9-21% smaller in animals receiving LU 302872 treatment (p<0,05). The highly significant weight loss of treated animals might be a result of reduced food and water intake. Only the combination of tumor transplantation and ingestion of LU 302872 unexpectedly leads to an immediate drastic reduction of water intake. There might be other effects of the newly developed ET receptor antagonist LU 302872 contributing to the impaired metabolic state of the treated animals.

The present study indicates that the ET system is relevant to growth of MH-7777 both in vitro and in vivo.

The detailed role of the observed (sex-dependent) ET receptor shift in hepatoma tissue has to be elucidated by further specific investigation. It also remains unclear whether the reduction of absolute tumor size in vivo is caused by an unspecific effect or whether specific influence focused on the ET system is involved. Planned histologic evaluation of the tumors might give more information on this question. Complimentary studies checking alternative forms of application and different ET receptor antagonists seem to be promising.


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Fri Mar 16 16:37:30 2001