Pfannenschmidt, Gerd: „Der Effekt von Antithrombin III auf die pulmonalvaskuläre Freisetzung von Big Endothelin-1, Endothelin-1 und Prostanoiden unter septischen und nichtseptischen Bedingungen sowie seine Mechanismen“

Aus der Medizinischen Klinik und Poliklinik I mit Schwerpunkt Kardiologie, Angiologie und Pulmologie der Medizinischen Fakultät Charité der Humboldt-Universität zu Berlin


DISSERTATION

„Der Effekt von Antithrombin III auf die pulmonalvaskuläre Freisetzung von Big Endothelin-1, Endothelin-1 und Prostanoiden unter septischen und nichtseptischen Bedingungen sowie seine Mechanismen“

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von Herrn Pfannenschmidt, Gerd ,
aus Frankfurt(Oder),

Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. R. Felix

Gutachter:
Prof. Dr. med. Karl Stangl
Prof. Dr. med. Karl Schrör
Prof. Dr. med. Ernst-Günter Krause

Datum der Promotion: 27.07.2000

Zusammenfassung

Die Arbeit sollte klären, ob die pulmonalprotektiven Effekte von AT III bei LPS-induziertem ARDS auch auf einer Stimulation der pulmonalvaskulären PGI2-Freisetzung beruhen. Die Freisetzung von Big ET-1 und ET-1 unter septischen Bedingungen sollte quantifiziert sowie mögliche Effekte von AT III auf diese Freisetzung untersucht werden. Dabei wurde das Modell der isolierten Rattenlunge verwendet. Die Perfusion der Lunge mit LPS führte zu einer Steigerung der Kon-zentration von 6-Keto-PGF1(, dem stabilen Metaboliten von PGI2, auf das 1,6fache und der Konzentration von TxB2, dem stabilen Metaboliten von TxA2, auf das 2,9fache gegenüber der Kontrollgruppe. Die Konzentration von ET-1 erhöhte sich unter LPS auf das 1,6fache, während der Big ET-1 Spiegel konstant blieb. Die Gabe von AT III hatte keinen Effekt auf die Freisetzung von PGI2 und TxA2. Die kombinierte Gabe von LPS und AT III wirkte ebenso wie die Gabe von LPS allein. Die Konzentrationen von Big ET-1 und ET-1 erhöhten sich unter 2 U/ml AT III auf das 1,7- bzw. 1,2fache und unter 5 U/ml AT III auf das 1,6- bzw. 1,3fache gegen-über den Kontrollen. Die kombinierte Gabe von LPS und AT III führte zu einem signifikant höheren Big ET-1-Spiegel vom 2,6fachen des Basalwertes, während sich die Konzentration von ET-1 nicht von der unter LPS bzw. AT III allein unterschied. Die Gabe von Cicaprost, einem stabilen synthetischen PGI2-Analogon, beeinflußte weder die basale noch die durch 2 U/ml AT III und 50 µg/ml LPS stimulierte Big-ET-1- und ET-1-Freisetzung. Nicardipin, ein Blocker der L-Typ-Kalzium-Kanäle, Heparin und N-Acetyl-Heparin, ein nicht an AT III bindendes Heparin, antagonisierten jeweils den stimulierenden Effekt von AT III auf die Big-ET-1- und ET-1-Freisetzung komplett. Staurosporin, ein Proteinkinase C-Inhibitor und Genistein, ein Tyrosinkinase-Inhibitor hatten keinen Effekt auf die durch AT III stimulierte Big-ET-1- und ET-1-Freisetzung.

SCHLUßFOLGERUNGEN: Das für den protektiven Effekt des AT III bei ARDS verantwortlich gemachte PGI2 scheint nichtpulmonalen Ursprungs zu sein. Eine PGI2-mediierte Hemmung der pulmonalen ET-1-Sekretion war nicht zu beobachten und scheint somit nicht am protektiven Effekt des AT III beim septischen ARDS beteiligt zu sein. Der beobachtete stimulierende Effekt des AT III auf die Freisetzung der pulmonalen Endotheline ist von möglicher pathophysiologischer Relevanz, da er die erwähnte protektive Wirkung des AT III mit hoher Wahrscheinlichkeit abschwächt. Dieser stimulierende Effekt des AT III scheint dabei an der intakten Rattenlunge weder von der Proteinkinase C noch von Tyrosinkinasen vermittelt zu sein. Weiterhin ist festzustellen, daß die stimulierende Wirkung des AT III auf die pulmonalvaskuläre Freisetzung von Big ET-1 und ET-1 von einem Kalziumeinstrom durch L-Typ-Kalzium-Kanäle und damit von der intrazellulären Kalziumkonzentration abhängig ist. Wie die gleiche Wirksamkeit von Heparin und N-Azetyl-Heparin zeigt, erfordert die Blockade des AT-III-Effektes durch die Heparine keine direkte Bindung an AT III, was auf die zusätzliche Rolle der intrazellulären Kalziumfreisetzung über IP3 hinweist.

Schlagwörter:
ARDS, LPS, Endothelin, Antithrombin III

Abstract

The aim of the present study was to clarify if the pulmonary protective effects of AT III in LPS-induced ARDS can be attributed to a stimulation of the pulmonary vascular release of PGI2. The pulmonary vascular release of big ET-1 and ET-1 under septic conditions and the possible influence of AT III was to be investigated. To this end, we used the model of the isolated perfused rat lung.

Exposure of the lung to LPS increased the release of 6-Keto-PGF1(, the stable metabolite of PGI2, 1.6fold and the production of TxB2, the stable metabolite of TxA2, 2.9fold compared with control lungs. The release of ET-1 increased 1.6fold under LPS, whereas the concentration of big ET-1 was unchanged. The application of AT III had no effect on the release of PGI2 and TxA2. The effects following combined application of LPS and AT III were similar to the effects of LPS alone. Compared with controls, AT III, at 2 U/ml, increased the perfusate levels of big ET-1 and ET-1 1.7fold and 1.2fold, respectively; the administration of 5 U/ml AT III raised big ET-1 and ET-1 1.6fold and 1.3fold, respectively. Combined application of LPS and AT III resulted in a 2.6fold rise of big ET-1 levels compared with controls, whereas concentrations of ET-1 did not differ from those in the presence of LPS or AT III alone. Cicaprost, a stable PGI2 analogue, affected neither the basal nor the AT III plus LPS-stimulated release of big ET-1 and ET-1. Nicardipin, an L-type calcium channel blocker, heparin and N-acetyl heparin, a heparin derivative devoid of AT III affinity, each antagonized completely the AT III-stimulated increase in big ET-1 and ET-1 levels. Staurosporin, an inhibitor of protein kinase C, and genistein, an inhibitor of tyrosine kinases, did not influence the AT III effects on endothelins.

CONCLUSIONS: In ARDS, the well-known rise in plasma PGI2 in response to AT III obviously originates from non-pulmonary sources. PGI2 does not suppress the pulmonary ET-1 secretion; therefore, this mechanism seems not involved in the AT III-induced lung protection during septic ARDS. The AT III-mediated stimulation of the release of pulmonary endothelins is of potential pathophysiological relevance, because it may blunt the protective effects of AT III in ARDS. In the intact rat lung, this stimulatory effect of AT III is mediated neither by protein kinase C nor by tyrosine kinases. Moreover, the observed effect of AT III on pulmonary endothelins is based on calcium influx through L-type calcium channels and depends on the intracellular calcium activity. The equipotency of heparin and N-acetyl heparin in inhibiting the AT III action demonstrates that direct binding of AT III is not essential for the blocking effect of heparins. This fact points to additional involvement of an IP3-dependent intracellular calcium release.

Keywords:
ARDS, LPS, antithrombin III, endothelin


Seiten: [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33]

Inhaltsverzeichnis

Titelseite„Der Effekt von Antithrombin III auf die pulmonalvaskuläre Freisetzung von Big Endothelin-1, Endothelin-1 und Prostanoiden unter septischen und nichtseptischen Bedingungen sowie seine Mechanismen“
1 Einleitung
2 Grundlagen
2.1Antithrombin III
2.2Endothelin
3 Material und Methoden
3.1Präparation
3.2Modell „Isolierte Lunge“
3.3Apparativer Aufbau zur volumenkonstanten Perfusion der isolierten Lunge
3.4Bestimmung von Thromboxan A2 und Prostazyklin
3.5Bestimmung von Endothelin-1 und Big Endothelin-1
3.6Datenanalyse
4 Wirkung von Antithrombin III auf die Prostanoid- und Endothelinfreisetzung nach LPS-Applikation
4.1Protokoll
4.1.1Kontrolle
4.1.2Rezirkulation
4.2Ergebnisse
4.2.1Pulmonale Hämodynamik
4.2.2Pulmonalvaskuläre Freisetzung von Thromboxan A2 und Prostazyklin
4.2.3Pulmonalvaskuläre Freisetzung von Big Endothelin-1 und Endothelin-1
5 Einfluß von Prostazyklin auf die durch Antithrombin III und LPS stimulierte Big Endothelin-1- und Endothelin-1-Freisetzung
5.1Protokoll
5.2Ergebnisse
5.2.1Pulmonale Hämodynamik
5.2.2Pulmonalvaskuläre Freisetzung von Big Endothelin-1 und Endothelin-1
6 Mechanismen der Stimulation der Big-Endothelin-1- und Endothelin-1-Freisetzung durch Antithrombin III
6.1Protokoll
6.2Ergebnisse
6.2.1Pulmonale Hämodynamik
6.2.2Effekte der Pharmaka auf die pulmonalvaskuläre Freisetzung von Big Endothelin-1 und Endothelin-1 in Abwesenheit von Antithrombin III
6.2.3Effekte der Pharmaka auf den Antithrombin-III-induzierten Anstieg der Big Endothelin-1- und Endothelin-1-Konzentration
7 Diskussion
7.1Effekte von LPS auf die pulmonalvaskuläre Freisetzung von Thromboxan, Prostazyklin, Big Endothelin-1 und Endothelin-1 sowie die pulmonale Hämodynamik
7.2Effekte von AT III auf die pulmonalvaskuläre Freisetzung von Thromboxan, Prostazyklin, Big Endothelin-1 und Endothelin-1 unter septischen und nichtseptischen Bedingungen
7.3Mechanismen der Antithrombin III-induzierten Stimulation der pulmonalvaskulären Big Endothelin-1-und Endothelin-1-Freisetzung
8 Zusammenfassung
Bibliographie Literatur
Danksagung
Lebenslauf
Selbständigkeitserklärung

Tabellenverzeichnis

Tab.1: Freisetzung von Big ET-1 und ET-1 über 120 min in isoliert perfundierten Rattenlungen. Die Perfusion erfolgte rezirkulierend mit 80 ml Puffer. Die Lungen wurden entweder als Kontrolle (n=13) oder in Anwesenheit von 50 µM Nicardipin, einem Blocker der L-Typ-Kalzium-Kanäle (n=4), 50 µg/ml Heparin (n=4), 50µg/ml N-Azetyl-Heparin, einem Heparinderivat ohne Affinität zu AT III (n=4), 50nM Staurosporin, einem Inhibitor der Proteinkinase C (n=4) bzw. 100µM Genistein, einem Tyrosinkinase-Inhibitor (n=4) perfundiert. Die Bestimmung erfolgte mittels Radioimmunoassay (Angaben in pg/ml). Die Nachweisgrenze betrug 2 pg/Ansatz für Big ET-1 und 0,15 pg/Ansatz für ET-1.

Abbildungsverzeichnis

Abb.1: Schematischer Aufbau des Modells Isolierte Lunge
Abb.2: Freisetzung von Thromboxan B2 (A) und 6-Keto-PGF1alpha (B) über 120 min in isoliert per-fundierten Rattenlungen. Die Lungen wurden entweder als Kontrolle (n=13) ohne LPS und AT III perfundiert oder in Anwesenheit von 50 µg/ml LPS (n=11), 2 U/ml AT III (n=10), 5 U/ml AT III (n=13) bzw. 2 U/ml AT III und 50 µg/ml LPS (n=5). Das Gesamtvolumen des rezirkulierenden Perfusats betrug 80 ml. Die Bestimmung erfolgte mittels Radioimmunoassay (Angaben in pg/ml). Die Nachweis-grenze betrug 2,5 pg/Ansatz für TxB2 und 3,2 pg/Ansatz für 6-Keto-PGF1alpha. *, p<0,05 versus Kontrolle.
Abb.3: Freisetzung von Big ET-1 (A) und ET-1 (B) über 120 min in isoliert perfundierten Rattenlungen. Die Lungen wurden entweder als Kontrolle (n=13) ohne LPS und AT III perfundiert oder in Anwesenheit von 50 µg/ml LPS (n=11), 2 U/ml AT III (n=10), 5 U/ml AT III (n=13) bzw. 2 U/ml AT III und 50 µg/ml LPS (n=5). Das Gesamtvolumen des rezirkulierenden Perfusats betrug 80 ml. Die Bestimmung erfolgte mittels Radioimmunoassay (Angaben in pg/ml). Die Nachweisgrenze betrug 2 pg/Ansatz für Big ET-1 und 0,15 pg/Ansatz für ET-1. *, p<0,05 versus Kontrolle; #, p<0,05 versus LPS; §, p<0,05 versus AT III.
Abb.5: Freisetzung von Big ET-1 (A) und ET-1 (B) über 120 min in isoliert perfundierten Rattenlungen. Die Lungen wurden entweder als Kontrolle (n=13) oder mit 5 U/ml AT III (n=13) perfundiert. Weiterhin wurden in Anwesenheit von 5 U/ml AT III folgende Pharmaka appliziert: 50 µM Nicardipin, ein Blocker der L-Typ-Kalzium-Kanäle (n=7); 50 µg/ml Heparin (n=6); 50 µg/ml N-Azetyl-Heparin, ein Heparinderivat ohne Affinität zum AT III (n=6); 50 nM Staurosporin, ein Inhibitor der Proteinkinase C (n=8) und 100 µM Genistein, ein Tyrosinkinase-Inhibitor (n=8). Das Gesamtvolumen des rezirkulierenden Perfusats betrug 80 ml. Die Bestimmung erfolgte mittels Radioimmunoassay (Angaben in pg/ml). Die Nachweisgrenze betrug 2 pg/Ansatz für Big ET-1 und 0,15 pg/Ansatz für ET-1. *, p<0,05 versus Kontrolle.

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Wed Nov 15 13:47:58 2000