Pfannenschmidt, Gerd: „Der Effekt von Antithrombin III auf die pulmonalvaskuläre Freisetzung von Big Endothelin-1, Endothelin-1 und Prostanoiden unter septischen und nichtseptischen Bedingungen sowie seine Mechanismen“

Kapitel 3. Material und Methoden

3.1 Präparation

Für diese Studie wurden männliche Wistar-Ratten mit einem Körpergewicht von 300-400 g verwendet. Das Narkotisieren der Tiere erfolgte mit Thiopental-


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Natrium (40-80 mg/kg Körpergewicht [KG] intraperitoneal). Nach Eintritt des Atemstillstandes wurde ein Tracheostoma angelegt. Die Überdruckbeatmung mit einem Gasgemisch aus 21 % O2, 5 % CO2 und 74 % N2 erfolgte über eine Trachealkanüle (Atemzugvolumen 8-10 ml/kg KG, Frequenz 60 Atemzüge/min, positiver endexpiratorischer Druck [PEEP] 1 mm Hg) durch einen Respirator (Servo 910, Siemens-Elema, Solna, Schweden). Nach einer mediosternalen Thorakotomie wurde die Pulmonalarterie kanüliert und die Lunge in situ mit eiskalter (le 4°C) modifizierter Krebs-Henseleit-Pufferlösung (Zusammensetzung in mmol/l: NaCl 127; KCl 3,7; CaCl 2,5; KH2PO4 1,2; MgSO4 1,1; NaHCO3 24,9; Glukose 10; Pyruvat 1,8; N-2-Hydroxyethylpiparazin-n-2-ethansulfonsäure [HEPES] 5,9; pH=7,35-7,40) perfundiert. Das Herz wurde von der Lunge abpräpariert, so daß das Effluat frei aus den Pulmonalvenen abfloß. Dann wurde die Lunge aus dem Thorax gelöst und in einer feuchten, beheizbaren Lungenkammer an einen Gewichtsaufnehmer angeschlossen.

Das Atemzugvolumen wurde für 3-4 Atemzüge auf 15-17 ml/kg KG erhöht (deep breeze). Die zunächst albuminfreie Krebs-Henseleit-Lösung wurde dann durch eine 20 g/l Albumin enthaltende, sonst gleich zusammengesetzte Pufferlösung ersetzt. Der pulsatile pulmonale Anfangsfluß von 1,5-2 ml/min wurde in einem Zeitraum von 25 min allmählich auf 11 ml/min erhöht. Parallel dazu wurde die Temperatur des Perfusates sowie die der Lungenkammer (initial le 4°C) auf 37,5°C erhöht. Von diesem Vorgehen konnte ein möglichst vollständiges Ausspülen der Blutbestandteile und die geringstmögliche biochemische und biophysikalische Reaktion auf die Veränderung der Perfusionsbedingungen erwartet werden.

Der pulmonalarterielle Druck (PAP), die Atemwegsdrücke, sowie das Gewicht konnten kontinuierlich gemessen werden. Diese Parameter wurden mit einer Abtastfrequenz von 1,0 Hz unter Nutzung einer kommerziellen Software (Labwin, National Instruments) aufgezeichnet.

3.2 Modell „Isolierte Lunge“

Die Apparatur für die isolierte Lunge (Abb.1) stammt von der Firma Hugo


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Sachs Elektronik (March-Hugstetten, Deutschland). Eine Modifizierung der Anlage erlaubt ein Umschalten von einfacher (Durchfluß) in rezirkulierende Perfusion. Das rezirkulierende Perfusat wird vor jeder Lungenpassage zwischenoxygeniert und temperiert. Somit bleiben die Perfusionsbedingungen (Fluß, Temperatur, O2-Gehalt der Perfusionslösung) konstant.

3.3 Apparativer Aufbau zur volumenkonstanten Perfusion der isolierten Lunge

Die benutzte Apparatur zur volumenkonstanten Perfusion einer isolierten Lunge besteht aus einem temperaturkonstant gehaltenen Vorratsgefäß für die Perfusionslösung, einem Wärmetauscher, in dem das Perfusat, mit einem Gemisch aus 21 % O2, 5 % CO2 und 74 % N2 begast wird, einer Rollerpumpe, der beheizbaren Lungenkammer sowie einem Respirator (siehe Abb.1).

Der Wärmetauscher ist ein doppelwandiges Glasgefäß. Der Innenteil ist kugelig ausgebuchtet, um eine große Oberfläche zu erhalten. Das Gasgemisch wird im unteren Teil des Gefäßes eingeleitet und verläßt es durch ein Röhrchen auf der Oberseite über ein Gottliebsches Ventil (Überdruck-Tauchrohr). Die Begasung des Perfusates wird in diesem System nicht wie üblich mittels einer Gasdurchperlung erreicht, sondern ähnlich wie im bekannten Scheibenoxygenator einer Herz-Lungen-Maschine durch einen dünnen Flüssigkeitsfilm auf einer großen Austauschfläche. Der Flüssigkeitspegel und damit die Perfusatmenge, die sich im Wärmetauscher befindet und 5 ml beträgt, wird über eine Niveauelektrode, einen elektronischen Regler und eine Pumpe konstant gehalten.

Die Lunge wird volumenkonstant perfundiert. Die Flußrate wird mit einer Rollerpumpe, die Perfusat aus dem Wärmetauscher fördert, konstant gehalten. Das Perfusat wird der Lunge über eine in der Pulmonalarterie eingebundene Kanüle zugeführt.

Um eventuell im Perfusat vorhandene Bläschen abzufangen, ist vor der Pulmonalarterienkanüle eine Blasenfalle installiert. Das Lungeneffluat fließt passiv


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aus der Lunge ab, wird in der Einschlagphase verworfen und während der Rezirkulation mit einer Pumpe wieder in das Vorratsgefäß gefördert. Während der Rezirkulation beträgt die Gesamtmenge des in der Anlage befindlichen Perfusates 80 ml.

Die Lungenkammer besteht aus einem beheizbaren, doppelwandigen Glas-gefäß, in dem die Lunge an der kanülierten Trachea an einem Gewichtsaufnehmer befestigt ist.

Abb.1: Schematischer Aufbau des Modells Isolierte Lunge


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3.4 Bestimmung von Thromboxan A2 und Prostazyklin

TxB2 (stabiler Metabolit von TxA2) und 6-Keto-PGF1alpha (stabiler Metabolit von PGI2) wurden aus nichtextrahierten Proben bestimmt. Die Methodik wurde an anderer Stelle ausführlich beschrieben 80 . Es wurden Eichlösungen von 2-100 pg/Ansatz für TxB2 und 6-Keto-PGF1alpha benutzt. Die Trennung von freier und gebundener Aktivität wurde mittels Aktivkohleabsorption durchgeführt. Die Nachweisgrenze, als 10 %ige Verdrängung des radioaktiven Tracers definiert, lag bei 2,5 pg/Ansatz für TxB2 und bei 3,2 pg/Ansatz für 6-Keto-PGF1alpha. Die Antikörper wurden in Kaninchen gezüchtet und zeigten praktisch keine Kreuzreaktivität (< 0,1 % bei 50 %iger Verdrängung des Tracers) gegenüber herkömmlichen Prostaglandin- und Thromboxan-Standards.

3.5 Bestimmung von Endothelin-1 und Big Endothelin-1

Die Konzentration von ET-1 wurde im Radioimmunoassay mit Hilfe eines kommerziellen Kits (Peninsula, Belmont, CA) bestimmt. Die Nachweisgrenze betrug ~0,15 pg/Ansatz; die Kreuzreaktivität für andere ET-Isomere und Big-ET-1 war geringer als 5 % und 37 %, jeweils nach Angaben des Herstellers. Für die Big-ET-1-Messung wurde ein polyklonales Antiserum gegen Big-ET-1 (1-39; Ratte) in Kaninchen gezüchtet. Eine Eichkurve wurde für Big-ET-1 (1-39; Ratte) für einen Meßbereich von 2-512 pg/Ansatz erstellt. Für die Messung wurden die Proben in einem Phosphatpuffer für 48 Stunden bei 4°C mit dem Antiserum (Verdünnung 1:10.000) inkubiert. Anschließend wurde für weitere 20 Stunden 125I-Big-ET-1 (Anawa, Zürich, Schweiz) zugesetzt (Gesamtvolumen: 300 µl). Die gebundene Radioaktivität wurde mittels Polyethylenglykol separiert und mit einem gamma-Zähler gemessen. Die Nachweisgrenze lag bei ~2 pg/Ansatz (~ 10 % Verdrängung des radioaktiven Tracers), und die IC50 betrug 45 pg/Ansatz. Die unspezifische Bindung wurde mit 1 ng Big-ET-1 (1-39; Ratte) bestimmt und betrug somit ca. 4 % der Gesamtbindung. Die Kreuzreaktivität des Antiserums betrug mit Big-ET-1 (1-38; human) 9 %, mit Big-ET-1 (1-39; Schwein) 47 %, mit Big-ET-1-Fragment 22-39


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(Rind) 16 %, mit ET-1, atrialem natriuretischen Faktor (1-28; Ratte) und Angiotensin II jeweils ~0,1 % bei IC50.

3.6 Datenanalyse

Die Daten werden als Mittelwert (MW) ± Standardabweichung (STABW) angegeben. Die Untersuchung auf signifikante Gruppenunterschiede bezüglich der Mediatorkonzentrationen erfolgte mit Hilfe einer nichtparametrischen Varianzanalyse (ANOVA) für wiederholte Messungen 81 . Nach der globalen Testung wurde als multipler Vergleich der Students-Newman-Keuls-Test bzw. - zum Vergleich der einzelnen Gruppen mit der Kontrollgruppe - Dunnett´s Test durchgeführt. Für die Zeitverläufe der hämodynamischen Größen wurde eine nichtparametrische two-way ANOVA verwendet 81 . Eine Irrtumswahrscheinlichkeit von p<0,05 wurde als signifikant angesehen.


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Wed Nov 15 13:47:58 2000