Kapitel 4. Wirkung von Antithrombin III auf die Prostanoid- und Endothelinfreisetzung nach LPS-Applikation

4.1 Protokoll

4.1.1 Kontrolle

Nach Einstellung einer Flußrate von 11 ml/min erreichten die Lungen in einer 20minütigen Kontrollperiode stabile hämodynamische und ventilatorische Ausgangswerte.

In die Studie wurden nur solche Lungen aufgenommen, die folgende Kriterien erfüllten:

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1. eine homogene weiße Färbung der Lungenoberfläche ohne Zeichen eines Ödems, einer Einblutung oder von Atelektasen,
2. konstante pulmonalarterielle Drücke (4-6 mmHg bei einem pulmonal-venösen Druck von 0 mmHg) und ventilatorische Drücke (inspiratorischer Spitzendruck 7-10 mmHg, positiver endexpiratorischer Druck [PEEP] 1 mmHg),
3. kontinuierliche Gewichtsabnahme der Lunge während der Kontrolle,
4. konstantes Gewicht (maximale Zunahme 200 mg) bzw. Gewichtsabnahme während des gesamten weiteren Versuches.

4.1.2 Rezirkulation

Nach Ablauf der Kontrolle wurde jede Lunge für 120 min rezirkulierend perfundiert (rezirkulierendes Volumen 80 ml). Das gesamte Perfusat wurde dann in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -70°C zur Bestimmung von ET-1, Big-ET-1, TxB² und 6-Keto-PGF¹ aufbewahrt.

Der Versuch erfolgte in drei Gruppen:

1. In der LPS-Gruppe (n=11) erfolgte am Beginn der Rezirkulationsphase eine pulmonalarterielle Bolusinjektion von Salmonella-minnesota-Endotoxin (gelöst in 1 ml Phosphat-Pufferlösung mit 50 mg/l Hydroxylamin), die zu einer Konzentration von 50 µg LPS/ml 82 im Rezirkulat führte. In zusätzlichen Versuchen (n=3) wurde gezeigt, daß die Bolusinjektion des Lösungsmittels allein keinen Effekt auf die pulmonale Hämodynamik sowie die Freisetzung von TxB², 6-Keto-PGF¹, Big-ET-1 und ET-1 hat.

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2. In der AT-III-Gruppe enthielt das rezirkulierende Perfusat entweder 2 U/ml AT III (n=10), was der therapeutischen Dosis in klinischen Studien nach Fourier et al. 83 entspricht, oder 5 U/ml AT III (n=13), was die Maximal-konzentration hinsichtlich der Stimulation der PGI²-Synthese in Zellkultur darstellt 24 . AT III wurde für jeden Versuch frisch gelöst dem Perfusat zugesetzt.
3. In der Gruppe AT III + LPS wurden die Lungen in Anwesenheit von 2 U/ml AT III und 50 µg/ml LPS (n=5) perfundiert, was den in-vivo-Bedingungen im Tierexperiment 84 und im klinischen Versuch 83 entspricht.

Als Kontrolle dienten mit einem lediglich Hydroxylamin enthaltenden Puffer perfundierte Lungen (n=13).

Bovines Albumin, Endotoxin von Salmonella minnesota und Hydroxylamin stammten von Sigma Chemical (München, Deutschland). AT III (Aktivität 6,6 IU/mg) wurde von Centeon Pharma (Marburg, Deutschland) zur Verfügung gestellt.

4.2 Ergebnisse

4.2.1 Pulmonale Hämodynamik

Der mittlere pulmonalarterielle Druck zeigte keine Zeitabhängigkeit und keine Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen. Er lag im Mittel aller Versuchsgruppen bei 5,2±0,6 mmHg. Es wurden weiterhin in keiner der Gruppen Änderungen des Gewichtes, die für eine veränderte Permeabilität sprechen würden, beobachtet.

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4.2.2 Pulmonalvaskuläre Freisetzung von Thromboxan A² und Prostazyklin

Die Effekte von LPS und/oder AT III auf die Freisetzung von TxB² und 6-Keto-PGF¹ werden in Abb.2 gezeigt. Im Effluat der Kontrollungen wurden Konzentrationen von 59±23 pg/ml TxB² und 1480±364 pg/ml 6-Keto-PGF¹ gemessen. In der LPS-Gruppe stieg die Freisetzung von TxB² auf das 2,9fache und die von 6-Keto-PGF¹ auf das 1,6fache (jeweils p<0,05). Die Gabe von AT III hatte weder in einer Konzentration von 2 U/ml noch von 5 U/ml einen Effekt auf die TxB²- und 6-Keto-PGF¹-Spiegel. Die Applikation von LPS und 2 U/ml AT III hatte keine stärkeren Effekte als die Gabe von LPS allein.

Abb.2: Freisetzung von Thromboxan B² (A) und 6-Keto-PGF¹ (B) über 120 min in isoliert per-fundierten Rattenlungen. Die Lungen wurden entweder als Kontrolle (n=13) ohne LPS und AT III perfundiert oder in Anwesenheit von 50 µg/ml LPS (n=11), 2 U/ml AT III (n=10), 5 U/ml AT III (n=13) bzw. 2 U/ml AT III und 50 µg/ml LPS (n=5). Das Gesamtvolumen des rezirkulierenden Perfusats betrug 80 ml. Die Bestimmung erfolgte mittels Radioimmunoassay (Angaben in pg/ml). Die Nachweis-grenze betrug 2,5 pg/Ansatz für TxB² und 3,2 pg/Ansatz für 6-Keto-PGF¹. *, p<0,05 versus Kontrolle.

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4.2.3 Pulmonalvaskuläre Freisetzung von Big Endothelin-1 und Endothelin-1

Abb.3 zeigt die Konzentrationen von Big ET-1 und ET-1 im zirkulierenden Puffer: Die Kontrollungen sezernierten über 120 min 15,2±4,5 pg/ml Big ET-1 und 0,46±0,13 pg/ml ET-1. Nach Applikation von LPS stieg der ET-1-Spiegel auf das 1,6fache des Kontrollwertes (p<0,05), während die Werte für Big ET-1 unverändert blieben. Nach Gabe von 2 U/ml AT III stiegen die Konzentrationen von Big ET-1 und ET-1 auf das 1,7- bzw. 1,2fache (jeweils p<0,05). Auch 5 U/ml AT III führten zu signifikanten Anstiegen sowohl für Big ET-1 (1,6fach) als auch für ET-1 (1,3fach). Nach Applikation von 2 U/ml AT III und LPS erhöhte sich die Konzentration von Big ET-1 auf das 2,6fache, ein signifikant stärkerer Effekt als unter LPS oder AT III allein (jeweils p<0,05), während sich der Effekt auf die ET-1-Konzentration nicht von dem unter LPS oder AT III allein unterschied.

Abb.3: Freisetzung von Big ET-1 (A) und ET-1 (B) über 120 min in isoliert perfundierten Rattenlungen. Die Lungen wurden entweder als Kontrolle (n=13) ohne LPS und AT III perfundiert oder in Anwesenheit von 50 µg/ml LPS (n=11), 2 U/ml AT III (n=10), 5 U/ml AT III (n=13) bzw. 2 U/ml AT III und 50 µg/ml LPS (n=5). Das Gesamtvolumen des rezirkulierenden Perfusats betrug 80 ml. Die Bestimmung erfolgte mittels Radioimmunoassay (Angaben in pg/ml). Die Nachweisgrenze betrug 2 pg/Ansatz für Big ET-1 und 0,15 pg/Ansatz für ET-1. *, p<0,05 versus Kontrolle; #, p<0,05 versus LPS; §, p<0,05 versus AT III.

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Zunächst sollte der Einfluß von exogenem PGI² auf die beschriebene Stimulation der pulmonalvaskulären Big ET-1- und ET-1-Sekretion durch AT III untersucht werden. Die Bedeutung dieses Versuchsaufbaus leitet sich aus der bereits erwähnten Tatsache ab, daß in vivo nach Gabe von AT III eine Erhöhung der zirkulierenden PGI²-Spiegel vorliegt 21 , welche nach den hier beschriebenen Ergebnissen offensichtlich nichtpulmonalen Ursprungs ist, jedoch die pulmonale Big ET-1- und ET-1-Synthese beeinflussen könnte. Außerdem dienten die weiteren Versuche der Untersuchung der Mechanismen, die der Stimulation der pulmonalen Big ET-1- und ET-1-Freisetzung durch AT III zugrundeliegen.

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