Pfannenschmidt, Gerd: „Der Effekt von Antithrombin III auf die pulmonalvaskuläre Freisetzung von Big Endothelin-1, Endothelin-1 und Prostanoiden unter septischen und nichtseptischen Bedingungen sowie seine Mechanismen“

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Kapitel 7. Diskussion

7.1 Effekte von LPS auf die pulmonalvaskuläre Freisetzung von Thromboxan, Prostazyklin, Big Endothelin-1 und Endothelin-1 sowie die pulmonale Hämodynamik

Die pulmonalen hämodynamischen Verhältnisse und die vaskuläre Permeabilität wurden durch die Gabe von LPS nicht verändert. Dieses Ergebnis entspricht dem anderer Arbeiten, die keine relevanten Änderungen des pulmonalvaskulären Widerstandes und der Permeabilität nach LPS-Gabe in vivo 16 und in vitro 82 an Ratten zeigten. Im Gegensatz dazu reagieren Kaninchen 3 , Schafe 89 , Schweine 17 und Menschen 7 auf LPS mit einer Steigerung des pulmonalvaskulären Tonus. Daran scheint, wie von Snapper et al. demonstriert, die auch bei diesen Spezies erhöhte pulmonale ET-1-Synthese beteiligt zu sein 89 . Es ist bekannt, daß ET-1 ETB-vermittelt die Freisetzung von NO und PGI2 stimuliert 68 , 90 . Die Balance zwischen der relaxierenden Wirkung dieser Substanzen und der konstringierenden Wirkung des ET-1 könnte bei der Ratte einen stabilisierenden Einfluß auf den pulmonalvaskulären Tonus haben, wie es in nichtpulmonalen Stromgebieten gezeigt werden konnte 91 . Die Konstanz der pulmonalen Hämodynamik nach LPS-Gabe stellt also eine Besonderheit der Spezies Ratte dar. Sie erweist sich jedoch für den Zweck der vorliegenden Arbeit, die Untersuchung der pulmonalvaskulären Mediator-veränderungen durch LPS und AT III, als vorteilhaft, da der pulmonalvaskuläre Druck als Einflußgröße konstant bleibt. Die funktionellen Auswirkungen der hier untersuchten Veränderungen können in jedem Fall nur am intakten Tier abgeschätzt werden.

Frühere Arbeiten zeigten eine verstärkte Freisetzung von TxA2 und PGI2 aus blutfrei perfundierten isolierten Lungen nach Gabe von Endotoxin oder bakteriellem Exotoxin 3 . Die vorliegende Arbeit bestätigt diese Ergebnisse und erweitert sie erstmals um die Quantifizierung der pulmonalvaskulären Freisetzung von ET-1 und seiner Vorstufe Big ET-1 unter basalen und septischen Bedingungen. Es zeigte sich ein signifikanter Anstieg der ET-1-Freisetzung aus den mit LPS perfundierten


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Lungen, der mit großer Wahrscheinlichkeit auf eine gesteigerte Synthese des Peptids zurückzuführen ist, wie in-vivo-Studien anhand einer gesteigerten Prä-pro-ET-1-mRNA-Expression in septischen Rattenlungen zeigten 16 . Unklar ist, warum die Big-ET-1-Konzentration nicht signifikant steigt. Eine mögliche Erklärung ist eine erhöhte Expression und Aktivität des endothelin-converting enzyme-1 (ECE-1), durch dessen proteolytische Wirkung Big-ET-1 in aktives ET-1 umgewandelt wird 37 . Dieser Effekt wurde bisher aber nur für nichtpulmonales Gewebe beschrieben 92 . Kürzlich konnte jedoch eine Steigerung der Expression der ECE-1-mRNA in Bronchial-epithelzellen durch TNFalpha gezeigt werden 93 . In einer weiteren Arbeit wurde demonstriert, daß es in LPS-perfundierten Kaninchenlungen unmittelbar nach Gabe des Endotoxins zu einer Steigerung der pulmonalen TNFalpha-Freisetzung kommt 94 . Somit ist es denkbar, daß es während der vorliegenden Experimente auch zu einer Stimulation der ECE-1-Expression kam.

7.2 Effekte von AT III auf die pulmonalvaskuläre Freisetzung von Thromboxan, Prostazyklin, Big Endothelin-1 und Endothelin-1 unter septischen und nichtseptischen Bedingungen

Die Gabe von AT III allein hatte keinen Einfluß auf die pulmonalvaskuläre Freisetzung von TxA2 und PGI2. Auch in Kombination mit LPS hatte AT III keinen additiven Effekt auf die Prostanoidfreisetzung. Somit scheint es unwahrscheinlich, daß die Pulmonalstrombahn eine Rolle bei der in vivo beobachteten 22 Erhöhung der zirkulierenden PGI2-Spiegel spielt. Dieses Ergebnis widerspricht keineswegs den Arbeiten anderer Autoren, da eine durch AT III stimulierte Freisetzung von PGI2 bisher lediglich an nichtpulmonalen Endothelzellen demonstriert wurde 23 , 24 .

Bisher existierten keine Untersuchungen darüber, inwieweit AT III die pulmonalvaskuläre Freisetzung von Big ET-1 bzw. ET-1 beeinflußt. Die Gabe von 2 U/ml bzw. 5 U/ml AT III erhöhte die Konzentrationen von ET-1 und insbesondere auch von Big ET-1 im Effluat unter nichtseptischen Bedingungen. Weiterhin hatte die Applikation von 2 U/ml AT III in Kombination mit LPS einen additiven Effekt auf die Freisetzung von Big ET-1 95 . Diese Befunde einer AT-III-induzierten Stimulation von


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Big ET-1 und ET-1 sind möglicherweise von erheblicher pathophysiologischer Relevanz.

Zunächst ist Big ET-1 potentiell ebenso wirksam wie ET-1 selbst, da es in der systemischen Zirkulation 96 und im Lungengewebe 97 durch ECE in das reife Peptid umgewandelt werden kann. ET-1 seinerseits weist zahlreiche inflammations-fördernde Eigenschaften auf. Es führt, wie an Ratten gezeigt wurde, zu einer Aggregation von Neutrophilen und Thrombozyten in der pulmonalen Mikro-zirkulation 98 . Es konnte demonstriert werden, daß ET-1 bei Anwesenheit von Leukozyten im Perfusat 98 , 99 selbst permeabilitätssteigernd wirkt 100 und außerdem die durch Leukozyten induzierte Lungenschädigung verstärkt 101 . Weiterhin regt ET-1 mononukleäre Zellen zu einer verstärkten Freisetzung der proinflammatorischen Zytokine TNFalpha, IL-1, IL-6 und IL-8 an 102 . Für die pathophysiologische Relevanz der erhobenen Befunde ist weiterhin die Gefäßaktivität des ET-1 von Bedeutung. Bei Spezies, die im Verlauf eines ARDS eine Erhöhung des pulmonalvaskulären Widerstandes zeigen (z.B. Kaninchen 3 , Schafe 89 , Schweine 17 , Menschen 7 ), kann dieser Effekt durch erhöhte Big-ET-1- oder ET-1-Konzentrationen weiter verstärkt werden, da diese Peptide vor allem in der Spätphase des ARDS wesentlich zur pulmonalen Vasokonstriktion beitragen 89 . Schließlich konnte - hinsichtlich weiterer Effekte der pulmonale Endotheline - gezeigt werden, daß pulmonales Big ET-1 sowohl unter basalen Bedingungen als auch im Zustand der akuten Lungen-schädigung 103 , 104 eine vasokonstriktorische Wirkung auf die Koronarstrombahn hat. Obgleich diese Effekte durch die vaskuläre Hyporeagibilität bei Sepsis abgeschwächt sein können, liegt hierin ein weiterer potentieller Schädigungsmechanismus begründet. Dieser könnte zusätzliche Bedeutung erlangen, wenn AT III beim nichtseptischen ARDS appliziert wird.

Es ist angesichts der zitierten Befunde kaum vorstellbar, daß die Stimulation der pulmonalvaskulären Big-ET-1- und ET-1-Freisetzung durch AT III zu den bekannten protektiven Effekten der Antiprotease am intakten Tier beiträgt 22 , 84 . Es ist vielmehr wahrscheinlich, daß die protektive Wirkung des AT III durch die verstärkt sezernierten pulmonalen Endotheline abgeschwächt wird. Ausgehend von den vorliegenden Ergebnissen erscheint der Versuch der kombinierten Gabe von AT III und ET-Antagonisten im tierexperimentellen ARDS sinnvoll, um weitere wertvolle Informationen zu gewinnen. Als ET-Blocker kommen selektive ETA-,ETB- bzw.


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unselektive ET-Rezeptor-Antagonisten, die teilweise schon in klinischen Studien untersucht werden 105 , sowie Hemmer des ECE in Frage 106 , 107 . Der pulmonale Gefäßwiderstand läßt sich bereits durch die Gabe von selektiven ETA-Rezeptor-Blockern wirksam senken, jedoch konnte die durch exogen zugeführtes ET-1 ausgelöste pulmonale Permeabilitätsstörung stärker durch einen nichtselektiven ET-Rezeptorantagonisten gehemmt werden 105 - 107 . Für den Versuch der kombinierten Gabe mit AT III kommt somit am ehesten ein nichtselektiver ET-Rezeptor-Blocker in Frage. Besondere Aufmerksamkeit gilt, wie bereits angeführt, der ET-1-Blockade bei nichtseptischem ARDS, da hierbei die vasokonstriktorischen Effekte von Big ET-1 und ET-1 nicht durch eine vaskuläre Hyporeagibilität vermindert sind.

7.3 Mechanismen der Antithrombin III-induzierten Stimulation der pulmonalvaskulären Big Endothelin-1-und Endothelin-1-Freisetzung

Da die Gabe von AT III keinen Einfluß auf die pulmonalvaskuläre PGI2-Freisetzung zeigte, ist anzunehmen, daß die in vivo beobachtete Erhöhung der PGI2-Plasmakonzentration 27 nichtpulmonalen Ursprungs ist. Um diese systemische, potentiell die ET-Freisetzung inhibierende 26 - 29 PGI2-Sekretion zu simulieren, wurde Cicaprost, ein stabiles synthetisches PGI2-Analogon, appliziert. Es konnte demonstriert werden, daß Cicaprost keinen Einfluß sowohl auf die basale als auch auf die durch 2 U/ml AT III und 50µg/ml LPS stimulierte Big ET-1- und ET-1-Freisetzung hat. Somit kann die von Razandi et al. 29 n bovinen aortalen Endothelzellen beobachtete Hemmung der ET-1-Sekretion durch PGI2 an unserem Modell nicht bestätigt werden, was seine Ursache in Speziesunterschieden und der Betrachtung unterschiedlicher Gefäßregionen haben kann.

Im weiteren wurden in der vorliegenden Arbeit die Mechanismen der oben beschriebenen AT-III-induzierten Steigerung der Big-ET-1- und ET-1-Freisetzung untersucht. Es zeigte sich, daß der Effekt des AT III durch die Blockade spannungsabhängiger L-Typ-Kalzium-Kanäle mit Nicardipin komplett inhibiert werden kann. Dieses Ergebnis entspricht dem bekannter Arbeiten, die einen stimulierenden Effekt des intrazellulären Kalziums auf die Synthese von ET-1 in


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kultivierten Endothelzellen beschreiben 85 Die Existenz spannungsabhängiger Kalzium-Kanäle in Endothelzellen ist umstritten. In einigen vorliegenden Studien an kultivierten Endothelzellen verschiedener Gefäßgebiete konnten keine spannungsabhängigen Kalzium-Kanäle nachgewiesen werden 108 , 109 . Die Freisetzung von ET-1 aus Endothelzellen sowohl der humanen Umbilikalarterie und -vene als auch der Aorta vom Schwein konnte jedoch durch Gabe von Nisoldipin bzw. Nimodipin, anderen Blockern der L-Typ-Kalzium-Kanäle, konzentrationsabhängig unterdrückt werden 110 , 111 , so daß von der Existenz dieser Ionenkanäle zumindest in bestimmten Gefäßgebieten ausgegangen werden muß. Die hier vorgelegten Daten machen deutlich, daß der stimulierende Effekt des AT III auf die pulmonalvaskuläre Big-ET-1- und ET-1-Freisetzung auch durch spannungsabhängige L-Typ-Kalzium-Kanäle vermittelt wird 112 .

Im Gegensatz zu Studien von Imai et al. 113 und Marsen et al. 114 , in denen eine Beteiligung der Proteinkinase C bzw. von Tyrosinkinasen bei der Regulation der ET-1-Synthese demonstriert wurde, konnten in dieser Arbeit keine Wirkungen des Proteinkinase C-Inhibitors Staurosporin und des Tyrosinkinase-Inhibitors Genistein auf die basale oder AT III-stimulierte Freisetzung von Big ET-1 und ET-1 dokumentiert werden. Zwar wurde in dieser Studie jeweils nur eine Konzentration des jeweiligen Pharmakons eingesetzt; dies erscheint jedoch als ein notwendiger Kompromiß angesichts der zahlreichen Nebenwirkungen von Staurosporin und Genistein. So blockiert Staurosporin die Proteinkinasen A (Ki=7 nM) und G (Ki=8,5 nM) 87 und Genistein L-Typ-Kalzium-Kanäle (IC50=50 µM) 115 . Es ist jedoch unwahrscheinlich, daß die genutzten Konzentrationen (Staurosporin 50 nM, Genistein 100 µM) die Signaltransduktion über die Proteinkinase C bzw. Tyrosin-kinasen nicht wirksam inhibieren, weil die beobachteten Affinitäten für Staurosporin und Genistein im unteren nanomolaren (Ki=0,7 nM) 87 bzw. im mikromolaren (IC50=10-20 µM) 88 Bereich liegen. Speziesunterschiede sowie die Nutzung unter-schiedlicher Gefäßgebiete und Modelle (intaktes Organ versus kultivierte Zellen) erklären möglicherweise die divergierenden Beobachtungen bezüglich des Einflusses der PKC bzw. von Tyrosinkinasen.

Heparin und sein Derivat N-Azetyl-Heparin, das keine Affinität zu AT III und somit keine antikoagulatorische Aktivität besitzt, beeinflußten die basale pulmonalvaskuläre Sekretion von Big ET-1 und ET-1 nicht, blockierten jedoch den


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AT-III-induzierten Konzentrationanstieg beider Peptide vollständig. Es ist allgemein anerkannt, daß AT III über endotheliale heparinähnliche Glykosaminoglykan-rezeptoren wirkt, da es seine Wirkung bei Verwendung von modifiziertem AT III, das nicht an Glykosaminoglykanrezeptoren binden kann, nicht entfaltet 22 . Für die Effekte des AT III scheint somit die Bindung an Glykosaminoglykanrezeptoren essentiell zu sein. Durch die Verwendung von Heparin und N-Azetyl-Heparin sollte die Frage geklärt werden, ob Heparin seine inhibitorische Wirkung über die Konkurrenz mit den Glykosaminoglykanrezeptoren um AT III oder über eine Beeinflussung der intrazellulären Signaltransduktionswege des AT III ausübt. Daß im Ergebnis der AT-III-Effekt in gleicher Weise von AT-III-bindendem und nicht-AT-III-bindendem Heparin geblockt wurde, spricht für die zweite Variante 112 . Heparin scheint also eher mit der intrazellulären Signalübertragung als mit der Rezeptorbindung des AT III zu interagieren. Es ist von Heparin bekannt, daß es als Rezeptorblocker des Inositol-1,4,5-trisphosphat (IP3) wirkt 116 und die von IP3 induzierte bzw. mediierte Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration verhindert 117 , 118 . Die IP3-Rezeptoren und somit der Wirkort des Heparins sind jedoch intrazellulär lokalisiert. Bei den angeführten Studien 116 - 118 mußte die Zellmembran stets permeabilisiert bzw. das Heparin mit einer Mikroinjektion in die Zelle appliziert werden. In der vorliegenden Arbeit erscheint es aufgrund der Größe und der Ladung des Heparinmoleküls und der offenbar nicht gestörten pulmonalvaskulären Permeabilität unwahrscheinlich, daß das applizierte Heparin die Endothelzellmembran penetrieren konnte. Es gelang jedoch einer anderen Arbeitsgruppe kürzlich, einen endothelialen Heparinrezeptor nachzuweisen und zu sequenzieren 119 , 120 sowie zu zeigen, daß Heparin und somit vermutlich auch das nicht-AT III-bindende N-Azetyl-Heparin Endothelzellen zur Produktion von Heparansulfat stimuliert 121 . Dieses heparinähnliche Glykos-aminoglykan unterscheidet sich vom Heparin lediglich durch eine geringere Sulfatierung der Hyaluronsäurereste. Es konnte jedoch weiterhin eine verstärkte Sulfatierung eben dieser Hyaluronsäurereste des unter Heparinstimulation produzierten Heparansulfats festgestellt werden 121 . Es erscheint somit möglich, daß dieses Heparinderivat nunmehr intrazellulär die IP3-Rezeptoren blockiert und damit die Wirkung des IP3 auf die Kalziumfreisetzung antagonisiert. Damit würden sowohl Nicardipin als auch die Heparine ihre inhibitorische Wirkung auf die AT III-induzierte Stimulation der Big ET-1- und ET-1-Freisetzung über eine Modulation der intrazellulären Kalziumkonzentration entfalten.
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