zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Physik

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I

von Diplom Physiker René Schödel ,
geboren am 6. November 1966 in Ludwigsfelde

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Dr. h.c. H. Meyer

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. J. Rabe

Gutachter:
Prof. Dr. J. Voigt (Humboldt-Universität zu Berlin)
Prof. Dr. G. Renger (Technische Universität Berlin)
Prof. Dr. P. Hoffmann (Humboldt-Universität zu Berlin)

Tag der mündlichen Prüfung: 7. Juli 1999

Zusammenfassung

Das Anliegen dieser Arbeit besteht darin, die Kinetik von elektronischen Singulett- und Triplett-Anregungen innerhalb des solubilisierten Lichtsammelkomplexes des Photosystem II (LHCII) zu untersuchen. Die Untersuchungen gliedern sich in drei Teilkomplexe:

1. Klärung der Frage, in welchem Maße die gegenseitige Wechselwirkung zwischen angeregten Singulett-Zuständen (Singuletts) zu deren Vernichtung führt. Um dies zu analysieren, wurden Messungen zur nichtlinearen Fluoreszenz von LHCII in einem großen Bereich der Anregungsimpuls-Intensität durchgeführt. Dazu war es notwendig, eine Methode zu entwickeln, die es erlaubt, die von der Probe ausgesandte Fluoreszenz räumlich zu selektieren. Die so gemessene Fluoreszenzausbeute von solubilisiertem LHCII verringert sich um bis zu 4 Größenordnungen bei maximaler Intensität und entspricht einem sättigenden Verhalten der Fluoreszenz. Aus diesen Untersuchungen ergibt sich, daß der Transfer der Anregungsenergie innerhalb eines gesamten solubilisierten LHCII-Trimers extrem schnell vonstatten geht.
2. Untersuchung zur Kinetik der Karotinoid-Triplett-Bildung im LHCII. Dazu wurde ein Meßaufbau für Pump-Test-Messungen der nichtlinearen Transmission mit optischer Zeitverzögerung zwischen Pump- und Test-Impuls realisiert. Besonderes Augenmerk wurde auf die Vermeidung von Meß-Artefakten gelegt. Die zeitliche Änderung der Absorption bei 507 nm spiegelt die Kinetik der Karotinoid-Triplett-Bildung in solubilisiertem LHCII wider. Bei der Modellierung der gemessenen Daten wurde die Rate für den Triplett-Transfer von ³Chl nach Car variiert. Die beste Anpassung ergibt den Grenzfall . Als untere Grenze kann im Rahmen der Meßgenauigkeit ein Wert von (0.5 ns)^-1 angegeben werden. Dieser Wert ist mehr als eine Größenordnung größer, als der noch vor kurzer Zeit akzeptierte Wert von Kramer und Mathis (1980). Dieses Ergebnis zeigt, daß die Wechselwirkung zwischen Chlorophyllen und Karotinoiden in LHCII wesentlich stärker ist, als bisher angenommen wurde.
3. Untersuchung der Wechselwirkung von Singuletts mit langlebigen Tripletts anhand der Fluoreszenz, die durch einen elektronisch verzögerten Test-Laser-Impuls hervorgerufen wird. Diese ”Test-Fluoreszenz“ nimmt mit Erhöhung der Pump-Intensität drastisch ab und erreicht bei hohen Pump-Intensitäten wenige Prozent des Ausgangswertes. Das Zurückkehren zum Ausgangswert wurde als Funktion der Verzögerungszeit bei verschiedenen Pump-Intensitäten gemessen. Mit Hilfe der Stern-Volmer Gleichung lassen sich daraus die quenchenden Populationen berechnen. Dies ergibt, daß das Quenching bei vergleichsweise geringen Pump-Intensitäten eindeutig den Karotinoid-Tripletts zugeordnet werden kann. Bei hohen Pump-Impuls-Intensitäten wurde eine zusätzliche, extrem stark quenchende Spezies identifiziert, bei der es sich möglicherweise um Chlorophyll-Tripletts oder -Ionen handelt.

Schlagwörter:
LHCII, Chlorophyll-Fluoreszenz, Karotinoide, Tripletts

Abstract

In this study the kinetics of electronically excited singlet and triplet states within solubilized light harvesting complexes of photosystem II (LHCII) is investigated. It is subdivided into three parts:

1. The mutual interaction between excited singlet states and their annihilation was analyzed. For that purpose nonlinear fluorescence measurements were performed in a huge range of excitation pulse intensity. A method was developed that allows a spatial selection of the fluorescence. The fluorescence yield determined in this way shows a drastic decrease of up to 4 orders of magnitude at the highest intensity used and corresponds to a saturation like behavior of the fluorescence. As a result of the theoretical investigation of this result, the excitation energy transfer within the overall LHCII-trimer is extremely fast.
2. The kinetics of carotenoid triplet formation in LHCII was analyzed by pump-probe measurements of nonlinear transmission using an optically generated delay between pump- and probe-pulses. Special care was taken to prevent artifacts in this kind of measurement. The temporal change of the absorbance at 507 nm reflects the kinetic of carotenoid triplet formation in solubilized LHCII. The fit of the experimental data by a kinetic model provides that the rate for the triplet transfer from ³Chl to Car is (0.5 ns)^-1. This value is more than one order of magnitude higher than the results obtained so far (Kramer and Mathis, 1980). This shows that the interaction between chlorophylls and carotenoids is much higher than previously assumed.
3. The interaction between singlets and (long living) triplets was investigated by measurements of the fluorescence originating from a delayed probe pulse in the presence of a pump pulse. This ”probe-fluorescence“ decreases drastically with increasing pump pulse intensity up to a level of a few percent at the highest intensity. The recovery to the initial value (pump pulse off) was studied as a function of the electronically generated time delay and at different pump intensities. The population of quenching species was calculated by means of the Stern-Volmer Equation. As a result of this analysis the quenching at low pump intensities can clearly be attributed to carotenoid triplets. At high pump pulse intensities an extremely strong quenching species is formed which can be probably identified by chlorophyll-triplets or -ions.

Keywords:
LHCII, chlorophyll-fluorescence, carotenoids, triplets

Tabellenverzeichnis
Tabelle 1
Tabelle 2	Übersicht über Parameter, die für den im Pauli - Master Formalismus behandelten Komplex mit absorbierenden Grundzuständen von Bedeutung sind. Die rechte Spalte zeigt an, ob feste Werte angegeben werden können oder ob der Parameter als variabel anzusehen ist.

Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1	Vereinfachte Darstellung der Einbettung des LHCII in die Thylakoidmembran höherer Pflanzen (Quelle: Renger, 1992).
Abbildung 2	Raumtemperatur-Absorptionsspektren von Chl a und Chl b (in azetonischer Lösung; eigene Messung mit ca. 0.1 mg Chl a, b /ml ) sowie den in LHCII vorkommenden Karotinoiden (aus Siefermann-Harms, 1987) in einer gemeinsamen Darstellung mit solubilisiertem LHCII (eigene Messung mit ca. 0.2 mg Chl a + b/ml). Eigene Messungen mit Shimadzu UVPC
Abbildung 3	Singulett-Anregungszustände (S0 , S1 , Sn ) im LHCII. In dieser Darstellung wird die Bedeutung der Pigment-Pigment und Pigment-Protein Wechselwirkung für die Spezifik der Zustände nicht berücksichtigt (siehe Text). Durch Absorption von Photonen (h _ ) in bestimmten Spektralbereichen werden angeregte Singulett-Zustände von Chl a, Chl b und Car erzeugt (Sn mit n 1). Interne Konversionsprozesse (IC) und direkte Anregung führen zum Zustand . Von Chl b nach Chl a sowie von Car nach Chl a findet Anregungsenergietransfer (EET) statt.
Abbildung 4	Fluoreszenzemissionsspektren des LHCII bei verschiedenen Temperatur (Die Messung erfolgte bei geringen Anregungsintensitäten mit Doppelmonochromator GDM 1000 bei exc =645 nm)
Abbildung 5	Fokussierung eines Parallelstrahlenbündels. Die Strahldivergenz ist stark übertrieben eingezeichnet. Abbildungsfehler sind nicht berücksichtigt.
Abbildung 6	Schematische Darstellung des Einflusses der Richtungsänderung des Anregungsstrahles auf die Position in der Brennebene.
Abbildung 7	Schematische Darstellung der Geometrie zur Abtrennung des Pumpstrahles bei Pump-Test-Messungen der Transmission
Abbildung 8	Schematische Darstellung der sich aus unterschiedlichen Voraussetzungen ergebenden Modelle zur quantitativen Beschreibung der Singulett - Singulett Vernichtung.
Abbildung 9	Räumliche Verteilung der Fluoreszenz bei verschiedenen Anregungsintensitäten (Darstellung in der Probenebene bei identischer räumlicher Verteilung der Anregungsintensität)
Abbildung 10	Prinzip der räumlich selektiven Messung der Fluoreszenz
Abbildung 11	Schematische Darstellung des Meßaufbaus zur Messung der intensitätsabhängigen Fluoreszenz
Abbildung 12	Normierte Fluoreszenzausbeute von solubilisiertem LHCII als Funktion von IP bei unterschiedlicher räumlicher Selektivität
Abbildung 13	Normierte Fluoreszenzausbeute als Funktion der Anregungsintensität in solubilisiertem LHCII und Chl a in Lösung. Die Messungen erfolgten unter Nutzung des Prinzips der räumlichen Selektivität. Die durchgezogene Linie ist zeigt eine Anpassung der experimentellen Daten von für Chl a in Lösung. Dabei wurden das Ratengleichungssystem Gl. (F4) und Gl. (F5) sowie aus der Literatur bekannte Parameter zugrunde gelegt (siehe Kap. 2.2.4. ).
Abbildung 14	Zusammenfassende Darstellung aller betrachteten Prozesse, die einen Einfluß auf die Wahrscheinlichkeit, , dafür besitzen, daß sich in einem Komplex mit Gesamtzuständen (Chlorophyllen) i einfach und j doppelt angeregte Zustände befinden.
Abbildung 15	Das sättigende Verhalten der Fluoreszenz: Die Fehlerkreuze entsprechen den gemessenen Daten von solubilisiertem LHCII und sind den Werten der Fluoreszenzausbeute (siehe Abb. 13 auf S. 37) komplementär. Die dargestellten Kurven wurden mit dem Pauli-Master-Model berechnet. Dabei wurde das zeitliche Profil des Anregungsimpulses explizit berücksichtigt. Scharparameter ist die (die Kurvenform bestimmende) bimolekulare Singulett-Singulett-Annihilationsrate (siehe Legende). Die übrigen Parameter lauten: =2.3 _ 10-15cm², = (4.3 ns)-1, , =(0.5 ps)-1, = 0.1 _ , = .
Abbildung 16	Zeitabhängige Darstellung von bei IP =5 _ 1018 Photonen cm-2 Impuls-1 entsprechend den Parametern der durchgezogenen Linie von Abb. 15. Alle weiteren Lösungen ergeben Null.
Abbildung 17	Anpassung der gemessenen intensitätsabhängigen Fluoreszenz durch das ”Cluster - Modell“. Es wurden die folgenden Parameter benutzt: =2.3 _ 10-15cm², = (4.3 ns)-1, , =(0.5 ps)-1, = 0.1 _ .
Abbildung 18	Experimentelle Daten (Fehlerkreuze) der relativen Änderung der optischen Dichte bei 645 nm in solubilisiertem LHCII als Funktion der Laserimpulsintensität (aus Hillmann 1995). Die durchgezogene Linie wurde auf Grundlage der Pauli - Master Gleichungen berechnet (siehe Text). Dabei wurden die Parameter der durchgezogenen Linie von Abb. 15 (S. 44) und folgendes gesetzt: 12 = 1.3 _ 01; 2n = 0.8 _ 01 .
Abbildung 19	Berechnung von Absorptionsänderungen bei 680 nm auf einer sub - ps Zeitskala mit Hilfe des Pauli - Master Gleichungs - Formalismus (Gl. 20). Dabei wurden die Parameter der durchgezogenen Linie von Abb. 15 (S. 44) benutzt und 12 = 0.7 _ 01; 2n = 0.5 _ 01 ; 10 =01 gesetzt . Zugrunde gelegt wurde ein Pump-Impuls von 0.13 ps Länge und verschiedene Pump-Intensitäten entsprechend den experimenellen Bedingungen in Bittner et al. (1994).
Abbildung 20	Schematische Darstellung des Meßaufbaus zur Charakterisierung von Tripletts
Abbildung 21	Pump-Impuls induzierte Änderung der optischen Dichte (DOD) gemessen nach 50 ns an Chl a (A) und Chl b (B) in 80 % azetonischer Lösung. Zum Vergleich sind die entsprechenden Absorptionsspektren (OD0) dargestellt. Pump-Intensität: ca. 1017 Photonen cm-2 Impuls-1 bei 645 nm
Abbildung 22	Darstellung der nach Gl. (T3) berechneten Absorptionsquerschnitte der Triplett-Zustände von Chl a (A) und Chl b (B) (durchgezogene Linien). Zum Vergleich sind die Grundzustands-Absorptionsquerschnitte eingezeichnet (gestrichelte Linien).
Abbildung 23	Pump-Impuls induzierte Änderung der optischen Dichte (DOD) gemessen nach 50 ns an solubilisiertem LHCII (durchgezogene Linie). Zum Vergleich ist das Absorptionsspektren (OD0) des verwendeten LHCII dargestellt. Pump-Intensität: ca. 1017 Photonen cm-2 Impuls-1 bei 645 nm
Abbildung 24	Pump-Impuls-induzierte Absorptionsänderungen bei 507 nm (links) und 530 nm (rechts) als Funktion der Verzögerungszeit zwischen Pump- und Test-Impuls in solubilisiertem LHCII unter Sauerstoff-freien (oben) und Luft-gesättigten Bedingungen (unten). Die durchgezogenen Linien zeigen mono-exponentielle Anpassungen mit entsprechender Lebensdauer.
Abbildung 25	Normierte Relaxationskinetik von DOD bei 507 nm bei verschiedenen Pump-Impuls-Intensitäten.
Abbildung 26	DOD/OD0 bei 507 nm und 50 ns Verzögerung zwischen Pump- und Testimpuls als Funktion der Pump-Intensität in solubilisiertem LHCII. Die Fehlerkreuze stellen die gemessenen Daten dar. Bei der durchgezogenen Linie wurde der Effekt abnehmender Pump-Intensität innerhalb der Probe eliminiert (siehe Text).
Abbildung 27	Doppelt logarithmische Darstellung der relativen Karotinoid-Triplett-Besetzung nach Gl. (T4) (durchgezogene Linie; entspricht durchgezogener Linie von Abb. 26) und der integralen Pump-Fluoreszenz (gestrichelte Linie, dargestellt ist eine kontinuierliche Funktion berechnet aus den Datenpunkten von Abb. 15 auf S. 44) als Funktion der Pump-Impuls-Intensität. Letztere wurden mit einem konstanten Faktor skaliert, um die Übereinstimmung bei geringen Pump-Intensitäten zu verdeutlichen.
Abbildung 28	Einfach logarithmische Darstellung von (durchgezogene Linie, identisch mit durchgezogener Linie von Abb. 27), die skalierte Pump-Fluoreszenz (gestrichelte Linie, identisch mit gestrichelter Linie von Abb. 27) und die Differenz aus beiden (gepunktete Linie, siehe Gl. (T9) ).
Abbildung 29	Meßaufbau für Pump- Test Messung der Transmission mit optischer Zeitverzögerung des Test-Impulses
Abbildung 30	Pump-Impuls-induzierte Absorptionsänderungen bei 460 nm von Chl b in Lösung als Funktion der optischen Verzögerungszeit zwischen Pump- und Test-Impuls. Die durchgezogene Linie stellt eine berechnete Modellkurve für DOD(t ) bei Verwendung des (gestrichelt) dargestellten zeitlichen Verlaufes des Pump-Impulses dar (siehe Text).
Abbildung 31	bei 507 nm als Funktion der Verzögerungszeit zwischen Pump- (1015 Photonen cm-2 Impuls-1) und Test-Impuls in solubilisiertem LHCII (Datenkreuze). Die gestrichelte Linie zeigt die an der Zeitachse gespiegelte Chl b Kurve (siehe Abb. 30). Die Punkte stellen Werte dar, die bei einer Wellenlänge von 550 nm und gleicher Dichte absorbierter Photonen gemessen wurden.
Abbildung 32	Anpassung der gemessenen Daten von bei 507 nm (Fehlerkreuze) durch das beschriebene Modell bei verschiedenen Raten für den Triplett-Transfer in solubilisiertem LHCII. Der Fall = (0.01 ns)-1 stellt den Grenzfall dar.
Abbildung 33	Schematische Darstellung des Meßaufbaus bei Pump - Test - Messungen der Fluoreszenz
Abbildung 34	Doppelt logarithmische Darstellung des Verhältnisses .
Abbildung 35	Das Verhältnis als Funktion der Verzögerungszeit (t 50 ns) bei verschiedenen Pump-Intensitäten.
Abbildung 36	Normierte Darstellung des Zeitverlaufes der ”totalen Quencher-Konzentration“ in solubilisiertem LHCII bei verschiedenen Pump-Impuls-Intensitäten. Die Datenpunkte wurden mit Gl. (T21) aus den experimentellen Daten von Abb. 35 (siehe S. 86) berechnet. Das Bild oben rechts zeigt die Kinetik der Karotinoid-Tripletts, die an derselben Probe wie in Abb. 35 gemessen wurde. Die durchgezogenen Linien entsprechen einer Anpassung mit zwei exponentiell abfallenden Komponenten. Zu einer konstant bleibenden 7.1 µs- Komponente entwickelt sich mit steigender Pump-Intensität eine 1.1 µs- Komponente (gestrichelte Linie). Siehe Text für Einzelheiten.
Abbildung 37	DOD/OD0 bei 675 nm und 50 ns Verzögerung zwischen Pump- und Test-Impuls als Funktion der Pump-Intensität in solubilisiertem LHCII. Die Fehlerkreuze stellen die gemessenen Daten dar. Bei der durchgezogenen Linie wurde der Effekt abnehmender Pump-Intensität innerhalb der Probe eliminiert (siehe Text).
Abbildung 38	Normierte Kinetik der Pump-Impuls-induzierten Absorptionsänderungen, DOD, gemessen bei der Pump-Intensität von 6 _ 1017 Photonen cm-2 Impuls-1 und bei 507 nm bzw. 675 nm (Punkte). Die durchgezogenen Linien stellen folgende mono- bzw. bi-exponentielle Anpassungen an die experimentellen Daten dar: 507 nm: = 7.1 µs 675 nm: a1 = -0.48; = 0.9 µs; a2 = -0.52; = 7.1 µs.
Abbildung 39	Experimentelle Daten für die Pump-Impuls-induzierte Abnahme der Test-Fluoreszenz (Kreuze) und Anpassung der Daten für IP 1015 Photonen cm-2 Impuls-1 durch Gl. (T24) mit = 7.
Abbildung 40	Die zeitliche Entwicklung der Besetzung von Singulett-Zuständen, , und Triplett-Zuständen, , von Chl b in Lösung (durchgezogene Linien). Die gestrichelte Linie stellt die Anpassung an die Meßkurve von DOD bei 460 nm dar. Die gepunktete Linie zeigt den zeitlichen Verlauf des Pump-Impulses (für weiteres siehe Text).
Abbildung 41	Einfluß der Pump-Impuls-Intensität auf den zeitlichen Verlauf der Besetzung von Chlorophyll-Singuletts sowie des Integrales in solubilisiertem LHCII entsprechend Gl. (A12). Die gestrichelte Linie stellt die Grenze bei niedrigen Pump-Intensitäten dar. Die durchgezogene Linie entspricht der Intensität, bei der die Messungen von DOD bei 507 nm durchgeführt wurden (1015 Photonen cm-2 Impuls-1). Die gepunktete Kurve zeigt den Einfluß hoher Pump-Intensitäten (1016 Photonen cm-2 Impuls-1).
Abbildung 42	Zeitliche Entwicklung von Karotinoid-Tripletts (durchgezogene Linien) und Chlorophyll-Tripletts (gestrichelte Linien) in solubilisiertem LHCII bei verschiedenen Raten : I : (0.01 ns)-1, II : (1 ns)-1, III : (3 ns)-1, IV : (10 ns)-1). Die gepunktete Linie entspricht den gemessenen Daten von bei 507 nm. Die oberen Kurven stellen den Zeitverlauf der Anregungsimpulse sowie der entsprechenden Chlorophyll-Singulett-Besetzung dar.
Abbildung 43	Zeitliche Entwicklung von Karotinoid-Tripletts (durchgezogene Linien) für ( = (0.01 ns) -1 ). Die gepunktete Linie entspricht den gemessenen Daten von bei 507 nm. Die oberen Kurven stellen den Zeitverlauf des angenommenen - Pump-Impulses sowie der entsprechenden Chlorophyll-Singulett-Besetzung dar.

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