103

Anhang A. Anhang

A1 Berechnung eines effektiven (molekularen) Absorptionsquerschnittes von Chl a in LHCII bei 645 nm

Im folgenden sei von dem Bild ausgegangen, daß das Verhalten des LHCII durch einen sehr schnellen und 100 % effektiven (inkohärenten) Transfer der Anregungsenergie von Chl b nach Chl a geprägt ist. Damit erzeugen im Chl b Bereich absorbierte Photonen letztlich angeregte Chl a (Singulett -) Zustände. Dieses Bild wird anschaulich durch die Tatsache, daß die Fluoreszenz des LHCII ausschließlich im Spektralbereich der Chl a - Fluoreszenz emittiert wird und das selbst bei sehr hohen Anregungs-Impuls-Intensitäten keine Chl b - Fluoreszenz zu beobachten ist. Chl b trägt so zur Erzeugung fluoreszierender Chl a-Singuletts und damit zur Entleerung von Chl a-Grundzuständen bei. Dabei kann man davon ausgegehen, daß bei Raumtemperatur alle Chl a-Moleküle zur Fluoreszenz beitragen.

Entsprechend diesen Voraussetzungen ist die Definition eines effektiven (molekularen) Absorptionsquerschnittes von Chl a in LHCII möglich:

(A1)

Hierbei ist der experimentell bestimmbare Absorptionskoeffizient (es gilt: ; d : Dicke, OD : optische Dichte der Probe). ist die (makroskopische) Konzentration von Chl a (in cm^-3 ). Diese ergibt sich aus der Chl - Gesamtkonzentration (C_Chl =0.2 mg/ml), dem Chl a/b Verhältnis (1.35; siehe Kap. 1.2.2 auf S. 17) sowie der molaren Masse, M_{Chl a} , von Chl a (M_{Chl a} =893.5 g/mol) und der Avogadroschen Zahl (N_A 6.02 _ 10²³ mol^-1 ):

= 7.7 _ 10¹⁶ cm^-3.

Bei 645 nm beträgt die optische Dichte des verwendeten solubilisierten LHCII 0.44 (bei d = 0.1 cm). Gl. (A1) ergibt somit: (645 nm) = 1.32 _ 10^-16 cm².

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A2 Berücksichtigung des zeitlichen Anregungsverlaufes bei der Berechnung von DOD

Bei den folgenden Berechnungen wird der durch die optische Weglänge hervorgerufene Zeitunterschied innerhalb der Probe vernachlässigt. Dies ist durch die Tatsache gerechtfertigt, daß die bei den Messungen verwendete Impulsdauer von ca. 2 ns wesentlich größer ist, als die Zeit für den Durchgang des Lichtes durch die Probe (ca. 3 ps bei 1 mm Meßküvette).

a) keine Verzögerung zwischen Pump- und Test-Impuls

In diesem Fall (bzw. bei Einstrahlexperimenten) ergibt zeitlich integrale Intensität am Meßdetektor:

(A2)

Dabei ist die zeitabhängige transmittierte Intensität, die ungeschwächte Intensität vor der Probe, die zeitabhängige Transmission und d die Dicke der Probe. Der zeitabhängige Absorptionskoeffizient kann als Summe geschrieben werden. Damit ergibt sich für die Transmission:

.

wobei den auf 1 normierten zeitliche Verlauf des Anregungsimpulses darstellt ( mit = 1.1 ns; siehe Gl. (E2) (S. 20) ).

Daraus erhält man die integrale Änderung der optischen Dichte:

(A3)

wobei die direkt aus der Messung gewonnene intensitätsabhängige relative Transmission ist.

b) Verzögerung zwischen Pump- und Test-Impuls

In diesem Fall ist der Test-Impuls um die Zeit bezüglich des Pump-Impulses verzögert und es gilt: . Analog zum obigen Fall (siehe Gl. (A2) ) erhält man: ,

wobei die zeitabhängige Transmission gegeben ist durch: .

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(A4)

A3 Berücksichtigung der Abnahme der Pump-Intensität innerhalb der Probe bei Messungen von DOD als Funktion von IP

Die Änderung der optischen Dichte des untersuchten solubilisierten LHCII hängt von der Pump-Impuls-Intensität ab. Letztere wird jedoch beim Durchgang durch die Probe geschwächt und erreicht letztlich den durch die Proben-Transmission T gegebenen Bruchteil des ungeschwächten Wertes (hier: T 0.36 bei = 645 nm).

Die den Meßdaten entsprechende mittlere Änderung der optischen Dichte ist durch folgenden Ausdruck gegeben:

(A5)

wobei die abnehmende Pump-Intensität entlang des optischen Weges innerhalb der Probe darstellt. Der Ausdruck für die im Integral von Gl. (A5) stehende ungemittelte Änderung der optischen Dichte als Funktion der Pump-Intensität läßt sich über die Ableitung von Gl. (A5) gewinnen:

Daraus erhält man:

(A6)

Gl. (A6) ermöglicht die schrittweise Berechnung von aus den experimentellen Daten . In einem ersten Schritt wurde eine kontinuierliche Funktion von aus den Datenpunkten erzeugt. Für die nachfolgende Berechnung von aus wurde ein Startwert angesetzt. Dieser läßt sich im Bereich geringer Pump-Intensitäten leicht aus und abschätzen.

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A4 Abschätzung der relativen Karotinoid-Triplett-Besetzung in solubilisiertem LHCII aus DOD bei 507 nm

Bei der Verzögerungszeit von 50 ns sind alle durch den Pump-Impuls erzeugten angeregten Chlorophyll-Singuletts abgebaut. Deshalb kann jede Änderung des Absorptionskoeffizienten bei 507 nm auf die Besetzung von Triplett-Zuständen zurückgeführt werden. Die Tatsache, daß die Kinetik des Abklingens von DOD bei 507 nm nicht von der Pump-Intensität abhängt, führt zu der Schlußfolgerung, daß dabei lediglich Karotinoid-Tripletts eine Rolle spielen.

Auf dieser Annahme basierend ergibt sich der Absorptionskoeffizient bei 507 nm: , wobei und die Absorptionsquerschnitte des Grund- und Triplett-Zustandes der Karotinoide sind. ist die Konzentration von Karotinoid-Tripletts, und sind die Gesamtkonzentrationen von Karotinoiden und Chlorophyllen und ist der Absorptionsquerschnitt des Chloropyhll-Grundzustands, der im Produkt einen konstanten Beitrag zu bei 507 nm liefert.

Der lineare Absorptionskoeffizient ist gegeben durch: . Deshalb ergibt sich mit : .

Nach Siefermann - Harms (1985) ist das Verhältnis ungefähr bei 507 nm. Damit ergibt sich::

(A7)

wobei die relative Besetzung von Karotinoid-Tripletts darstellt. Aus Abb. 26 (S. 68) folgt, daß es unmöglich ist, die Besetzung von Karotinoid-Tripletts zu sättigen. Das heißt, selbst bei extrem hohen Pump-Intensitäten gilt: .

Deshalb liefert Gl. (A7) folgende Ungleichung: .

Bei = 10¹⁸ ergibt sich aus den experimentellen Daten: 0.4. Daraus folgt: . Nimmt man eine relative Karotinoid Population von 0.5 an (bei = 10¹⁸ ) so ergibt sich für das Verhältnis der Absorptionsquerschnitte: 3. Eine Verringerung von auf den Wert 2.33 ( ) hat nur eine geringfügige Auswirkung auf (0.5 0.4 bei

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(A8)

für die relative Besetzung von Karotinoid-Tripletts als Funktion der Pump-Impuls-Intensität.

A5 Abschätzung der relativen Chlorophyll-Triplett-Besetzung in solubilisiertem LHCII aus DOD bei 675 nm

Im Gegensatz zum blauen/grünen Spektralbereich zeigen Karotinoide keine Absorption im roten Bereich der Q_y-Bande und deshalb bei 675 nm (siehe Siefermann - Harms, 1985). In diesem Fall ist der Absorptionskoeffizient, , gegeben durch: , wobei und die Chlorophyll-Absorptionsquerschnitte des Grund- und Triplett-Zustandes darstellen. ist die makroskopische Konzentration verbleibender Chlorophyll-Grundzustände, wobei für die Population von Chlorophyll-Tripletts steht. Die relative Änderung der optischen Dichte bei 675 nm durch die Besetzung von Chlorophyll-Tripletts ergibt sich analog zu obiger Betrachtung für Karotinoid-Tripletts (siehe Anhang A4 ):

(A9)

Bei der Pump-Impuls-Intensität von = 6 _ 10¹⁷ ist die Amplitude der schnellen DOD-Komponente, die auf die Bildung von ³Chl zurückgeführt wurde, etwa 0.5 (siehe Abb. 38 auf S. 90). Demzufolge sind bei der genannten Pump-Impuls-Intensität Chlorophyll-Tripletts etwa für die Hälfte der mit 50 ns Verzögerung gemessenen relativen Änderung der optischen Dichte bei 675 nm verantwortlich (vergleiche Abb. 37 auf S. 89): -0.01.

Für das Verhältnis soll näherungsweise der Wert für Chl a in azetonischer Lösung im Q_y Absorptionsmaximum verwendet werden: Das ergibt (siehe Abb. 22A auf S. 64): . Setzt man diesen Wert und -0.01 in Gl. (A9) ein, so ergibt sich für die relative Besetzung von Chlorophyll-Tripletts in solubilisiertem LHCII:

.

108

A6 Die zeitliche Entwicklung von Singulett- und Triplett- Zuständen von Chl b in Lösung

Abb. 40 zeigt die zeitliche Besetzung von Singulett- und Triplett-Zuständen von Chl b in Lösung. Diese wurden mit Gl. (T12) und den Parametern von Abb. 30 berechnet (S.75). Die gestrichelte Linie zeigt die gespiegelte Anpassung an die Meßdaten von DOD bei 460 nm (siehe Abb. 30 auf S. 75). Diese ist qualitativ in guter Übereinstimmung mit der Kurve, die die Summe aus Singulett- und Triplett-Besetzungen darstellt. Grund dafür ist die Tatsache, daß die abgeschätzten Absorptionsquerschnitte und bei 460 nm (siehe S.75) wesentlich kleiner sind als . Deshalb gilt näherungsweise: (siehe Gl. (T11) ).

Abbildung 40
Die zeitliche Entwicklung der Besetzung von Singulett-Zuständen, , und Triplett-Zuständen, , von Chl b in Lösung (durchgezogene Linien). Die gestrichelte Linie stellt die Anpassung an die Meßkurve von DOD bei 460 nm dar. Die gepunktete Linie zeigt den zeitlichen Verlauf des Pump-Impulses (für weiteres siehe Text).

Der Hauptunterschied zwischen der berechneten Kurve und der gemessenen DOD bei 460 nm wird dadurch hervorgerufen, daß der Test-Impuls zu einer zeitlichen Mittelung führt und damit ein leichtes Abflachen der gemessenen Kurve verursacht (dieser Effekt wird bei der Anpassung in Abb. 30 auf S. 75 durch Verwendung von Gl. (T13) berücksichtigt.

Bemerkung:

Die Besetzung von Chl b Tripletts kann näherungsweise beschrieben werden durch:

(A10)

Dies folgt direkt aus Gl. (T12) (siehe S. 76), wenn man setzt. Letzteres ist möglich, da die Relaxation von Chl b Tripletts auf einer ms- Zeitskala abläuft.

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A7 Der Einfluß der Karotinoid-Grundzustandsabsorption im LHCII bei 507 nm

Betrachtet man den Grenzfall geringer Pump-Intensitäten, so ergeben sich die folgenden Ratengleichungen für die Besetzungszahldichten der Singuletts von Car ( ) und Chl ( ):

	(A11a)
	(A11b)

wobei für die Rate des (ultra-schnellen) Singulett-Singulett-Transfer steht, der die Energie der gebildeten (angeregten) Karotinoid-Singuletts mit nahezu 100% iger Effizienz zu den Chlorophyllen weiterleitet (Peterman et al., 1997b). ist die Rate für die Relaxation von Chlorophyll-Singuletts. Die Rate , de die Relaxation von Karotinoid-Singuletts beschreibt,. kann wegen des ultra-schnellen Singulett-Singulett-Transfers vernachlässigt werden. Letzterer führt darüber hinaus dazu, daß im gesamten Zeitbereich nahezu Null bleibt. Deshalb ergibt die zeitliche Ableitung von und damit Gl. (A11a) ebenfalls Null. Gl. (A11a) lautet dann:

.

A8 Einfluß der Pump-Impuls Intensität auf den Zeitverlauf der (angeregten) Chlorophyll-Singulett-Zustände

Die Sättigung der Fluoreszenz in solubilisierten LHCII Komplexen läßt sich quantitativ am einfachsten durch ein Ratengleichungsmodell beschreiben, das von einem Gesamtabsorptionsquerschnitt, , ausgeht (siehe Kapitel 2.2.5.2. auf S. 46). Im Zusammenhang mit dieser Beschreibungsweise wird die Absorption von mehr als einem Photon pro Komplex als Anregungszustandsabsorption (des Komplexes) angesehen. Folglich wird die Abnahme der Fluoreszenzausbeute durch eine Entleerung von (Komplex-) Grundzuständen hervorgerufen. Da die gebildeten höheren Anregungszustände des Komplexes sehr schnell relaxieren lautet die kinetische Gleichung für die Besetzung von (einfach angeregten) Singulett-Zuständen:

(A12)

bestimmt den Anteil von Komplexen, die bereits angeregt wurden. k ist die reziproke Lebensdauer von einfach angeregten Singulett-Zuständen ( ). ist in der Größenordnung von ca. 10^-15 cm² bei 507 nm

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Abb. 41 zeigt den Einfluß der Pump-Impuls-Intensität auf den nach Gl. (A12) berechneten zeitlichen Verlauf der Besetzung von .

Abbildung 41
Einfluß der Pump-Impuls-Intensität auf den zeitlichen Verlauf der Besetzung von Chlorophyll-Singuletts sowie des Integrales in solubilisiertem LHCII entsprechend Gl. (A12).
Die gestrichelte Linie stellt die Grenze bei niedrigen Pump-Intensitäten dar.
Die durchgezogene Linie entspricht der Intensität, bei der die Messungen von DOD bei 507 nm durchgeführt wurden (1015 Photonen cm-2 Impuls-1).
Die gepunktete Kurve zeigt den Einfluß hoher Pump-Intensitäten (1016 Photonen cm-2 Impuls-1).

Der Aufbau der Karotinoid-Triplett-Besetzung kann mit dem Integral über die angeregten Chlorophyll-Singuletts identifiziert werden (siehe Anhang A9 auf S. 110). Deshalb sind in Abb. 41 zu den berechneten Besetzungen auch die entsprechenden Integrale für die verschiedenen Intensitäten eingezeichnet.

Offensichtlich existiert bei 10¹⁵ lediglich eine geringe Abweichung vom Verhalten bei geringen Intensitäten. Erst bei 10¹⁶ sind die Abweichungen deutlich. Messungen von DOD, die bei einer Pump-Intensität von 10¹⁶ durchgeführt wurden, weisen tatsächlich den in Abb. 41 dargestellten berechneten Verlauf auf (Daten nicht gezeigt).

A9 Illustration der zeitlichen Entwicklung von Triplett-Zuständen in solubilisiertem LHCII

Abb. 42 zeigt sowohl die zeitliche Entwicklung von Karotinoid-Tripletts (durchgezogene Linien) als auch von Chlorophyll-Tripletts (gestrichelte Linien) die sich aus Gl. (T18) bei verschiedenen Ratenkonstanten, , für den Triplett-Transfer ergeben. Offensichtlich besteht im Fall (Kurve “I“ bei = (0.01 ns)^-1 ) gute Übereinstimmung zwischen der berechneten Besetzung von Karotinoid-Tripletts und DOD bei 507 nm (gepunktete Kurve). Die verbleibende Abweichung zwischen beiden Kurven ist auf die Tatsache zurückzuführen, daß der Test-Impuls eine zeitliche Breite besitzt. Dieser Effekt wurde bei der Anpassung der Daten in

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Abbildung 42
Zeitliche Entwicklung von Karotinoid-Tripletts (durchgezogene Linien) und Chlorophyll-Tripletts (gestrichelte Linien) in solubilisiertem LHCII bei verschiedenen Raten :
I : (0.01 ns)-1, II : (1 ns)-1, III : (3 ns)-1, IV : (10 ns)-1).
Die gepunktete Linie entspricht den gemessenen Daten von bei 507 nm.
Die oberen Kurven stellen den Zeitverlauf der Anregungsimpulse sowie der entsprechenden Chlorophyll-Singulett-Besetzung dar.

Kurve “I“ ist mit dem Integral in Übereinstimmung. Das bedeutet, daß die Karotinoid-Triplett-Besetzung komplementär zum Abklingen der Chlorophyll-Singulett-Besetzung abläuft. Dies soll im folgenden illustriert werden:

Die Relaxationsterme über können in Gl. (T18) vernachlässigt werden (siehe S. 80), dann ergibt sich:

	(A13a)
	(A13b)

Im Falle bleibt die Chlorophyll-Triplett Besetzung , , aufgrund des schnellen Triplett-Transfers im gesamten Zeitbereich nahezu null (siehe Abb. 42). Deshalb verschwindet die zeitliche Ableitung von und Gl. (A13a) kann Null gesetzt werden.

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(A14)

Es sei bemerkt, daß dieser für Karotinoid-Tripletts erhaltene Ausdruck (Gl. (A14) ) identisch ist mit dem der Triplett-Besetzung von Chl b in Lösung (siehe Gl. (A10 auf S. 108). Abb. 43 illustriert den Fall unter Annahme eines 100 ps Pump-Impulses.

Abbildung 43
Zeitliche Entwicklung von Karotinoid-Tripletts (durchgezogene Linien) für ( = (0.01 ns) ^-1 ). Die gepunktete Linie entspricht den gemessenen Daten von bei 507 nm. Die oberen Kurven stellen den Zeitverlauf des angenommenen - Pump-Impulses sowie der entsprechenden Chlorophyll-Singulett-Besetzung dar.

Dem Verlauf der berechneten Karotinoid-Triplett-Besetzung (durchgezogene Linie) ist die gemessene Kurve für DOD bei 507 nm (gepunktete Kurve) gegenübergestellt. Wieder ist das Integral bestimmend für (siehe oben) und unterscheidet sich daher nur gering vom Fall in Abb. 42. Deshalb ist die zeitliche Auflösung bei Experimenten zum Triplett-Transfer in LHCII nur unwesentlich durch die Verwendeten ns-Impulse (ca. 2 ns) reduziert. Experimente mit kürzeren Impulsen müßten auf der Gleichen Zeitskala, wie die hier vorgestellten durchgeführt werden (bis 20 ns Verzögerung). Deshalb ist die Qualität der experimentellen Daten hauptsächlich durch die Güte der optischen Verzögerungsstrecke bestimmt.

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