Schödel, René: Zur Kinetik von Singulett- und Triplett-Anregungen im Lichtsammelkomplex des Photosystems II höherer Pflanzen (LHCII).

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Kapitel 1. Grundlagen, verwendete Proben und Allgemeines zum experimentellen Aufbau

1.1. Grundlagen

1.1.1. Allgemeines zur Photosynthese

Die Photosynthese dient der Umwandlung solarer Energie in freie chemische Reaktionsenthalpie und deren Speicherung in stabilen chemischen Verbindungen. Eine sehr allgemeine Form der Definition der Photosynthese ist durch folgende Gleichung gegeben:

(E1)

Dabei ist ein oxidierbares Substrat (in dieser allgemeinen Form repräsentiert es eine große Anzahl organischer und anorganischer Verbindungen). stellt eine Kohlenwasserstoffverbindung dar. Die obige Reaktion kann als Reduktion von durch Wasserstoff aufgefaßt werden, der durch bereitgestellt wird. Die verbrauchte Lichtenergie wird dadurch in chemische Bindungsenergie von Kohlenwasserstoffmolekülen umgewandelt.

Die bei der Photosynthese ablaufenden Prozesse untergliedern sich in Licht- und Dunkelreaktionen. Lichtreaktionen umfassen die Absorption von Licht und eine Folge von Energietransfer- sowie Elektronentransferschritten. Sie ermöglichen die Oxidation von unter Bildung von reduzierten energietragenden chemischen Komponenten NADPH/NADH und ATP. Die Dunkelreaktion wird durch NADPH/NADH und ATP angetrieben. Dabei wird Kohlenstoff gebunden, was zur Bildung von organischen Molekülen und zum Abbau von führt.

Photosynthetische Organismen können in zwei Gruppen gegliedert werden: anoxygene und oxygene. Letztere produzieren Sauerstoff und nutzen deshalb als Elektronendonator. Dagegen finden bei der anoxygenen Photosynthese (anaerobe Bakterien) eine Vielzahl von anorganischen und organischen Substanzen als Verwendung (z. B. , aber auch organische Säuren).


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Oxygene Organismen sind durch das Vorhandensein von Chl a gekennzeichnet. Unterschiede gibt es hinsichtlich Zellorganisation sowie sekundärer Pigmentierung. Zu den oxygenen Organismen zählen:

Anoxygene Organismen (Photosynthesebakterien) können entsprechend ihrem Reaktionszentrum in folgende Klassen eingeteilt werden (zur Übersicht siehe Clayton und Sistrom., 1983; Renger, G., 1999):

1.1.2. Die Photosynthese höherer Pflanzen

Der Photosyntheseapparat höherer Pflanzen befindet sich in speziellen Zellorganellen, den Chloroplasten. Diese sind linsenförmig und haben einen Durchmesser von 4 - 8 µm. Im Inneren sind die Chloroplasten von einem Netz von Membranen durchzogen, den Thylakoiden. Die Thylakoidmembranen bestehen aus einer Lipiddoppelschicht. Man unterscheidet lamelare (Stroma-) und gestapelte (Grana-) Thylakoide. In diese Membranen sind die Bestandteile des Photosyntheseapparates eingebettet, die sich wiederum aus verschiedenen Pigment-Protein Komplexen zusammensetzen (für eine detaillierte Darstellung siehe Irrgang, 1999).

Bei allen oxygenen Photosyntheseorganismen ist der lichtgetriebene Elektronentransport vom H2O zu NADP+ durch das Zusammenspiel zweier Photosysteme (PS), PSI und PSII gekennzeichnet. Ausgangspunkt ist die Absorption von Photonen durch die Pigmentmoleküle des Antennensystems (Chl a, Chl b und Karotinoide). Bei höheren Pflanzen ist der Hauptteil der nicht kovalent gebundenen Antennenpigmente in die sogenannten Lichtsammelkomplexe (Light Harvesting Complexes, LHC) eingebaut. Man unterscheidet hierbei den Lichtsammelkomplex des Photosystems I (LHCI) sowie den des Photosystems II (LHCII). Durch den Transfer der durch Licht gebildeten Anregungszustände wird die Energie zu den photochemisch aktiven Pigmenten weitergeleitet (siehe Renger, G., 1992, 1999a, b). Diese sind in den sogenannten Reaktionszentren lokalisiert und werden dem PSI bzw. dem PSII zugeordnet. Das photochemisch aktive Pigment des PSI besteht aus einem Chl a Dimer, das nach seinem


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Absorptionsmaximum bei etwa 700 nm P700 benannt wird. Das entsprechende Pigment im PSII wird als P680 bezeichnet. Da es sich auch hier sehr wahrscheinlich um ein Dimer handelt, wird häufig in Analogie zu den Reaktionszentren der anoxygenen Photosynthesebakterien die Bezeichnung “special pair“ verwendet.

Die elektronisch angeregten Singulett-Zustände induzieren eine Kette von Elektronen- und Protonen-Transportreaktionen. Dabei wird von dem 1 P680* zunächst ein Elektron auf den primären Elektronenakzeptor, das Pheophytin (Pheo), übertragen und das so gebildete Radikalpaar durch einen schnellen Transfer zum Chinonakzeptor, QA , stabilisiert. Das auf diese weise erzeugte reduziert ein zweites Chinon QB . Ist dieses zweifach reduziert, spaltet es sich vom Reaktionszentrum ab und diffundiert in der Thylakoidmembran zum Cytochrom b6f Komplex. Von dort werden die Elektronen über das Plastocyanin (PC) zum Photosystem I transportiert, wo das P700 wieder reduziert wird. Das Elektron des (vorher) oxidierten P700 wird über eine Kette von Elektronenakzeptoren zu den terminalen Eisen-Schwefel-Zentren übergeben. An der Ferredoxin-NADP+ -Oxidoreduktase (FNR) wird letztlich NADP+ zu NADPH reduziert. Die Reduktion von P680 erfolgt durch einen Tyrosin-Rest, der in seiner oxidierten Form seinerseits durch Elektronen reduziert wird, die durch die Oxidation von Wasser bereitgestellt werden. Weil die Oxidation von Wasser ein vier-Elektronen Prozeß ist (Wasserspaltung: ), ist eine viermalige Anregung des P680 erforderlich, um ein Sauerstoffmolekül zu erzeugen.

Die Reaktionszentren sind anisotrop in die Thylakoidmembran so eingebaut, daß die Akzeptorseite (QA , QB) zum Cytoplasma und die Donatorseite zum Periplasma hin orientiert sind. Dadurch führt der lichtinduzierte Ladungstransfer zum Aufbau einer elektrischen Potentialdifferenz über die Membran. Die mit den Redoxreaktionen gekoppelte Aufnahme und Abgabe von Protonen findet damit an unterschiedlichen Seiten der Membran statt. Die dadurch hervorgerufene Konzentrationsdifferenz für Protonen liefert zusammen mit der elektrischen Potentialdifferenz die Triebkraft für die ATP-Synthase aus ADP und Phosphat.

Die hier zusammengefaßten Reaktionsfolgen sollen nur einen Überblick über die Vielzahl von Elektronentransferschritten geben, die mit der Lichtreaktion verbunden sind. An diesem Teilgebiet der Photosyntheseforschung besteht großes Interesse, um insbesondere den Zusammenhang zwischen Struktur und Funktion besser zu verstehen. Die im Rahmen dieser Arbeit vorgestellten Messungen und aus den Ergebnissen abgeleiteten Modelle beschränken sich auf die Prozesse des Anregungsenergietransfers in der Antenne . Deshalb wird auf eine Darstellung der Prozesse der sich anschließenden Dunkelreaktion, die letztlich zur Bildung von Kohlenwasserstoffmolekülen führt, verzichtet.


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1.1.3. Der Lichtsammelkomplex des Photosystems II (LHCII)

1.1.3.1. Struktur und Funktion des LHCII

Das Schlüsselkonzept der Lichtabsorption und der Umwandlung in chemische Energie wurde durch Experimente von Emerson und Arnold (1932) entwickelt. Diese entdeckten an Chlorella-Zellen, daß an der Bildung eines Sauerstoffmoleküls in einer ”photosynthetic unit“ mindestens 2500 Chlorophyllmoleküle beteiligt sind. Berechnungen von Gaffron und Wohl (1936) führten zu der Schlußfolgerung, daß der überwiegenden Mehrzahl der Chlorophyllmoleküle eine “Antennen“-Funktion zukommt (für eine Übersicht siehe Renger, 1992, 1999b). Der Energietransfer zum Reaktionszentrum ist äußerst effektiv. Von 100 absorbierten Photonen lösen etwa 98 eine Ladungstrennung im special pair aus (Bassi and Dainese, 1990).

Um die zur Verfügung stehende Sonnenstrahlung optimal auszunutzen sowie eine Anpassung an variierende Lichtverhältnisse zu ermöglichen, bildeten sich im Laufe der Evolution geeignete Antennensysteme heraus. Diese bestehen aus Pigment-Protein-Komplexen, die entweder in die Thylakoidmembran eingebettet sind (intrinsisch) oder aber als extrinsische Einheiten an die Membran gebunden sind (siehe Gantt, 1986; Thornber et al., 1991; Irrgang, 1999).

Der am häufigsten vorkommende Lichtsammelkomplex (LHC) ist der LHCII, der dem Photosystem II zugeordnet wird /<1>. In ihm sind etwa 50 % des Gesamtchlorophyllgehaltes der Thylakoidmembran gebunden.

Abbildung 1
Vereinfachte Darstellung der Einbettung des LHCII in die Thylakoidmembran höherer Pflanzen (Quelle: Renger, 1992).

Der LHCII kann aus dem Photosyntheseapparat isoliert und damit für sich


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genommen untersucht werden. Durch die Entwicklung einer Vielfalt von biochemischen und spektroskopischen Untersuchungsmethoden konnten immer detailliertere Kenntnisse über den LHCII gewonnen werden (siehe z. B. Hemelrijk et al., 1992). Dieser ist, wie jeder Pigment-Protein-Komplex, als eine Einheit zu betrachten. Das heißt, die spektroskopischen Eigenschaften des LHCII werden sowohl durch die Pigmente selbst, als auch durch deren spezifische Anordnung bestimmt. Letztere wird durch die Proteinmatrix realisiert, in der die Pigmente nichtkovalent eingebunden sind.

Detaillierte Informationen über die Anordnung der Pigmente in der Proteinmatrix liefert das von Kühlbrand et al. (1994) auf der Grundlage von Elektronenbeugungsuntersuchungen entwickelte Strukturmodell. Dabei war es gelungen, 2-dimensionale Kristalle aus isoliertem LHCII zu erzeugen und durch die Methode der Elektronen-Kristallographie ein Modell mit 3.4 Å Auflösung zu erhalten. Bei dieser Auflösung ist es zwar noch nicht möglich, alle Pigmente genau zuzuordnen (nur indirekte Unterscheidung von Chl a und Chl b), jedoch konnten grundlegende Erkenntnisse gewonnen bzw. bestätigt werden. Der LHCII weist demnach eine trimere Struktur dreier symmetrisch angeordneten Monomere auf. Jedes Monomer besitzt drei Membran-spannende alpha - Helizes, mindestens 12 Chlorophylle (7 Chl a und 5 Chl b) und zwei Karotinoide. Die Chlorophyllmoleküle sind ungefähr in zwei Ebenen angeordnet und entsprechen in etwa der Ober - bzw. Unterseite der Lipid - Doppelschicht.

1.1.3.2. Die Pigmente des LHCII

Den größten Beitrag zur Absorption des Lichts in höheren Pflanzen liefern die Chlorophylle. Abb. 2 stellt die gemessenen Absorptionsspektren der in LHCII vorkommenden Chl a und Chl b - Moleküle (in azetonischer Lösung) dem Absorptionsspektrum des LHCII gegenüber. Die dabei verwendeten Chl-Konzentrationen in einer 1 mm Probenküvette waren vergleichbar groß (0.1 mg/ml für Chl a und Chl b in Lösung bzw. 0.2 mg(Chl a + b)/ml für LHCII). Zusätzlich ist das Absorptionsspektrum von den in LHCII vorkommenden Karotinoiden (siehe Kap. 1.2.2 auf S. 17), eingezeichnet (aus Siefermann-Harms, 1987; willkürliche OD-Einheiten).

Es wird ersichtlich, daß die spektralen Eigenschaften von Chl a, b und den Karotinoiden prägend für das Absorptionsverhalten des LHCII sind. Demnach wird das Absorptionsmaximum des LHCII bei 645 nm dem Chl b und jenes bei 675 nm dem Chl a zugeordnet. Die Verschiebung zu jeweils höheren Wellenlängen bei LHCII wird auf den Einfluß der Proteinumgebung (Unterschied zum organischen Lösungsmittel) sowie andere Wechselwirkungseffekte (siehe unten) zurückgeführt.


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Abbildung 2
Raumtemperatur-Absorptionsspektren von Chl a und Chl b (in azetonischer Lösung; eigene Messung mit ca. 0.1 mg Chl a, b /ml ) sowie den in LHCII vorkommenden Karotinoiden (aus Siefermann-Harms, 1987) in einer gemeinsamen Darstellung mit solubilisiertem LHCII (eigene Messung mit ca. 0.2 mg Chl a + b/ml). Eigene Messungen mit Shimadzu UVPC

Bei der Charakterisierung des Absorptionsspektrums von LHCII hat sich in der Literatur ein Sprachgebrauch durchgesetzt, der sehr stark an die Eigenschaften von Chl a und Chl b angelehnt ist. So wird die breite Bande im blauen Bereich des Absorptionsspektrums des LHCII als Soret-Bande bezeichnet, die in ihrer Bedeutung auf den Singulett-Übergang S0 rarr S3 von Chl a/b zurückgeht. Analog dazu sind Bezeichnungen wie Qx und Qy - Bande geläufig, um den roten Spektralbereich des Absorptionsspektrums von LHCII zu benennen. Diese gehen auf die Singulett-Übergänge S0 rarr S1 (Qy) sowie S0 rarr S2 (Qx) von Chl a/b Molekülen zurück. Das Absorptionsspektrum des LHCII läßt sich in Sub-Banden zerlegen. Letztere werden oftmals verschiedenen sogenannten “Chlorophyll-Formen“ zugeordnet, die ihre spektrale Position durch die jeweils individuelle Proteinumgebung erhalten sollen und damit “pigment-pools“ darstellen (z. B. Connelly et al., 1997). Durch Einbeziehung von weiteren spektroskopischen Untersuchungsmethoden (LD-, CD-, und Starkeffekt-Spektroskopie) wurden bis zu 12 “Chlorophyll - Formen“ pro Monomer erhalten (Nußberger et al. 1994). Damit wurde jedem einzelnen Chlorophyllmolekül im Monomer genau eine Bande im Absorptionsspektrum zugeordnet. Die Besetzung der angeregten Zustände der spektralen Formen von Chl a ist, unabhängig von der Anregungswellenlänge, in etwa thermisch verteilt, d.h. sie nimmt eine Bolzmann-Verteilung ( ) ein (Schrötter et al., 1994; Kehrberg et at., 1995; Voigt et al., 1996).


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Der Begriff “Chlorophyll-Formen“ wird ebenfalls im Zusammenhang mit Zuständen exzitonisch gekoppelter Pigmente (siehe Kapitel 1.1.3.3 ) gebraucht (Lokstein et al., 1995).

Einen zusätzlichen Beitrag zur Absorption des Lichtes im blauen und grünen Spektralbereich liefern Karotinoide (zur Übersicht siehe Siefermann-Harms; 1985; Frank und Cogdell, 1996). Im LHCII werden die Xanthophylle Lutein, Neoxanthin als auch Violaxanthin nachgewiesen. Die aufgenommene Energie wird sehr effektiv zu den Antennenchlorophyllen (Peterman et al., 1997b) und möglicherweise auch direkt zum Reaktionszentrum transferiert (Connelly et al., 1997b). Neben ihrer Funktion als zusätzliche Lichtabsorber sind Karotinoide auch wichtig für den strukturellen Zusammenhalt des LHCII (Heinze et al., 1997). Karotinoide spielen ebenfalls eine Schlüsselrolle im Violaxanthin-Zeaxanthin Zyklus beim Mechanismus des nichtphotochemischen Quenching (Lokstein et al., 1994; Demming-Adams et al., 1995; Horton et al., 1996).

Die wichtigste Funktion der Karotinoide ist jedoch der Schutz gegen den toxischen Singulett-Sauerstoff (zur Übersicht siehe Siefermann-Harms, 1987). In dieser Rolle üben sie eine Doppelfunktion aus: Erstens sorgen sie sehr effektiv für den Abbau von Chlorophyll-Tripletts (3Chl), die sonst zur Bildung von Singulett-Sauerstoff führen würden. Zweitens sind sie in der Lage, vorhandenen Singulett-Sauerstoff direkt abzubauen (Foote, 1976). Aus beiden Reaktionen gehen Karotinoid-Tripletts (3Car) hervor. Diese relaxieren strahlungslos in den Grundzustand. Der Triplett-Transfer von 3Chl zu Car ist Bestandteil der Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit (siehe Kap. 3 auf S. 59 und insbesondere Kap. 3.4. auf S. 73).

1.1.3.3. Anregungszustände und Energietransfer im LHCII

Durch die Absorption von Photonen werden elektronische Anregungszustände generiert, die im intakten Photosyntheseapparat zu den Reaktionszentren weitergeleitet werden. Die Lokalisation der Anregungsenergie am Reaktionszentrum wird als “trapping“ bezeichnet. Das photochemische trapping durch das P680 ist ein effektiver Prozeß (zur Übersicht siehe Renger, G., 1992, 1999; Holzwarth, 1989; van Grondelle et al., 1994). Die trapping-Zeiten sind kürzer (ps Bereich) als die reziproken Zeitkonstanten der Relaxation der ersten angeregten Singulett-Zustände im LHCII (einige ns). Es wurde gezeigt, daß es sich beim PSII um ein sogenanntes ”trap-limitiertes“ System handelt (siehe Renger, G., 1992). Durch das photochemische trapping werden die Reaktionszentren in ein Radikalpaar überführt und bleiben damit für eine gewisse Zeit für weiteres photochemisches trapping “geschlossen“. Anregungen, die währenddessen erzeugt werden, diffundieren entweder solange (Energietransfer), bis sie auf ein ”offenes“ Reaktionszentrum stoßen oder sie werden durch nichtphotochemische Abbaukanäle (Fluoreszenz, strahlungslose Prozesse) in den elektronischen Grundzustand überführt. Gleiches


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gilt für isolierte LHCII-Komplexe, da diese keine Reaktionszentren enthalten.

Trotz zahlreicher experimenteller und theoretischer Untersuchungen werden die Energietransferschritte und die Rolle der strukturellen Organisation im LHCII noch immer nicht hinreichend gut verstanden. Entsprechend dem Kühlbrandt’schen Modell (siehe oben) liegen die Mittelpunktsabstände benachbarter Pigmente im Bereich von 9 - 14 Å. Damit sind diese vergleichbar mit den geometrischen Ausdehnungen der Pigmente selbst, und deshalb ist zu erwarten, daß die gegenseitige Pigment-Pigment-Wechselwirkungen einen Einfluß auf die Energiezustände ausübt. Tatsächlich gibt es zahlreiche experimentelle und theoretische Untersuchungen, die einen starken Einfluß der exzitonischen Wechselwirkung zwischen den Pigment-Zuständen vermuten lassen. Tieftemperatur-CD-Spektren an LHCII (Kwa et al.; 1992) zeigen, daß eine komplizierte Struktur vorliegt, die als Summe von mehreren exzitonischen Zuständen interpretiert werden kann. Nussberger et al. (1994) kamen zu dem Ergebnis, daß eine exzitonische Wechselwirkung sogar dann eine Rolle spielt, wenn sich die (wechselwirkenden) Pigmente in verschiedenen monomeren Untereinheiten des LHCII befinden. Schubert et al. (1997) vermuten, daß sich die Ergebnisse der Messungen an LHCII, die mittels NPLF - Spektroskopie /<2> gewonnen wurden, mit einem Modell verstehen lassen, das die exzitonische Kopplung zwischen den Chlorophyllen berücksichtigt.

Der Charakter der Anregungszustände innerhalb des LHCII ist jedoch bis heute nicht hinreichend geklärt. Grund dafür ist die Unkenntnis der genauen Geometrie der Übergangsdipolmomente sowie die Vielzahl von Wechselwirkungsmöglichkeiten und Umgebungseffekten. Insbesondere ist ungeklärt, ob die exzitonische Kopplung von Pigmenten eine Delokalisierung der Anregungsenergie über mehrere Pigmente ermöglicht. Offene Fragen gibt es auch bezüglich der Rolle der Proteinschwingungen beim Anregungsenergietransfer.

Zur quantenmechanischen Charakterisierung von angeregten Zuständen müssen alle diese Wechselwirkungen in den Hamilton-Operator einbezogen werden. Dies stellt eine extreme Herausforderung dar, der sich die Theoretische Physik mit zunehmendem Interesse widmet (z. B. Mukamel and Rupasov 1995, Renger, T und May, 1997). Viele quantentheoretische Studien gehen von einer Coulomb-Wechselwirkungen in Punktdipolnäherung zwischen verschieden Pigmenten aus (siehe Renger, T, 1998 und darin enthaltene Zitate). In diesem Bild sind Prozesse wie Exzitonen-Transfer sowie die Annihilation (Fusion) von Exzitonen einheitlich durch Dichtematrixelemente beschreibbar.

Aus jüngsten Modellrechnungen wurde geschlossen, daß jeweils Paare aus Chl a und Chl b in sehr engem Kontakt zueinander stehen und damit Hetero-Dimere bilden


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Renger, T, 1998. Es war jedoch noch nicht möglich, die Wechselwirkung des Dimers mit den restlichen Pigmenten des LHCII zu berücksichtigen oder gar eine Beschreibung zu finden, die die Pigmente im LHCII als Multimer auffaßt. /<3>.

Neben der Coulomb’schen Wechselwirkung werden auch andere Pigment-Pigment-Wechselwirkungen innerhalb von Lichtsammelkomplexen diskutiert (z. B. Harcourt et al., 1994; Scholes et al., 1997) : i) In Abhängigkeit von der Überlappung der Wellenfunktionen (und damit vom geometrischen Abstand) können Ladungstransfer-Wechselwirkungen einen signifikanten Anteil an der elektronischen Wechselwirkung darstellen ii) Auch Dexter-Typ Wechselwirkungen führen zu einer Delokalisation der Elektronen zwischen den (wechselwirkenden) Pigmenten und zu einer Verzerrung der Elektronendichte.

Ungeachtet der tatsächlich vorherrschenden Komplexität der Zusammenhänge ist eine einfache Charakterisierung der elektronischen Anregungszustände des LHCII anhand der Zuordnung zu den Zuständen der beteiligten Pigmentmoleküle üblich. Abb. 3 zeigt das sich daraus ergebende vereinfachte Bild aller am (Singulett-) Anregungsenergietransfer (Excitation Energy Transfer, EET) beteiligten Zustände der Pigmente.

Abbildung 3
Singulett-Anregungszustände (S0 , S1 , Sn ) im LHCII. In dieser Darstellung wird die Bedeutung der Pigment-Pigment und Pigment-Protein Wechselwirkung für die Spezifik der Zustände nicht berücksichtigt (siehe Text). Durch Absorption von Photonen (h _ ny) in bestimmten Spektralbereichen werden angeregte Singulett-Zustände von Chl a, Chl b und Car erzeugt (Sn mit n ge 1). Interne Konversionsprozesse (IC) und direkte Anregung führen zum Zustand . Von Chl b nach Chl a sowie von Car nach Chl a findet Anregungsenergietransfer (EET) statt.

Das dargestellte Schema vermittelt ein auf Pigmentzustände reduziertes Bild des Energietransfers im LHCII. Nicht gekennzeichnet ist dabei der Energietransfer zwischen verschiedenen Chlorophyll-Formen (siehe Kap. 1.1.3.2 auf S. 11). Jeder angeregte Zustand wird, ungeachtet der Anregungswellenlänge, zu Chl a transferiert, von wo aus die Fluoreszenz des LHCII zu beobachten ist. Die Spektren der Fluoreszenz von solubilisiertem LHCII bei verschiedenen Temperaturen sind in


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Abb. 4 dargestellt. Es gibt keinen Hinweis auf eine Fluoreszenz anderer Pigmente als Chl a. Quantitative Interpretationen bzw. Analysen von Spektren und deren Temperaturabhägigkeit sind eine Möglichkeit, Informationen über die Struktur elektronischer Zustände zu gewinnen (z. B. Voigt et al., 1994).

Abbildung 4
Fluoreszenzemissionsspektren des LHCII bei verschiedenen Temperatur (Die Messung erfolgte bei geringen Anregungsintensitäten mit Doppelmonochromator GDM 1000 bei lambdaexc =645 nm)

DK5Der Energietransfer von Chl b nach Chl a war Gegenstand vieler Untersuchungen, mit denen man in immer kürzere Zeitbereiche vorgedrungen ist. Seit einigen Jahren stehen Laserimpulse mit ca. 50 fs Impulsdauer zur Verfügung. In Pump-Test-Experimenten wird im Chl b-Bereich gepumpt (d.h. Absorption bei 645 nm). “Getestet“ wird im Chl a-Bereich. Dabei sind zwei prinzipiell unterschiedliche Meßprinzipien einsetzbar: (i) Zeitaufgelöste Messungen der Chl a-Fluoreszenz. Dabei geht man davon aus, daß die Fluoreszenz des LHCII ausschließlich von Chl a emittiert wird (siehe oben). Um eine hohe zeitliche Auflösung zu erhalten muß hier die Methode der Fluorescence-Upconversion (z. B. Du et al., 1994) verwendet werden. (ii) Zeitaufgelöste Messungen der Transmissionsänderung im Bereich der Chl a Absorption (z. B. Bittner et al. 1994). Beide Methoden ergaben, daß die Reaktion im Chl a-Bereich (Chl a-Fluoreszenz bzw. Absorptionsänderung) nahezu instantan mit der Anregung im Chl b Bereich zu beobachten ist (Du et al., 1994: 200 - 300 fs; Bittner et al., 1994: 150 fs). Es wird nicht ausgeschlossen, daß die auf diese Weise ermittelten ultrakurzen Zeiten durch die zeitliche Auflösung der Apparatur begrenzt sind. Du et al. (1994) weisen auf das generelles Problem dieser Messungen hin, das darin besteht, daß die Chl a-Absorption bei der Pump-Wellenlänge von 645 nm nicht verschwindet (vergleiche Abb. 2).dk6. Die gemessene ultra-schnelle Änderung der Chl a-Absorption bzw. die quasi instantan auftretende Chl a-Fluoreszenz entspräche dann lediglich einer internen Schwingungsrelaxation in Chl a-Molekülen.


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1.2. Charakterisierung der verwendeten Proben

1.2.1. Vorbemerkung

Voraussetzung für die in dieser Arbeit vorgestellten Messungen war das Vertrauen in die Qualität der Untersuchungsobjekte. Die von Dr. Klaus Irrgang bereitgestellte Präparation des LHCII in solubilisierter Form wird allen experimentellen Ansprüchen vorzüglich gerecht. Das betrifft Eigenschaften wie Reproduzierbarkeit, optische Qualität sowie Vergleichbarkeit mit Präparationen, die in anderen Laboren Verwendung fanden. Der hier benutzte solubilisierte LHCII wurde mit zahlreichen experimentellen Techniken untersucht, deren Ergebnisse sich in einer Vielzahl von Veröffentlichungen wiederfinden. Für die Messungen im Rahmen dieser Arbeit wurden keine zusätzlichen Veränderungen an Parametern der Präparation vorgenommen (bzgl. Detergenzkonzentration etc.).

1.2.2. LHCII Präparation

PS II Membranfragmente wurden nach der Methode von Berthold et al. (1981) mit einigen Modifikationen (nach Völker et al., 1985) aus Spinatblättern isoliert. Die Isolation von LHCII wurde in Gegenwart von beta-Dodecylmaltoside durchgeführt (beschrieben in Irrgang et al., 1988). Die LHCII Präparation wurde bei Raumtemperatur anhand des Absorptionsspektrums charakterisiert. Die Lage der Absorptionsmaxima (im roten Spektralbereich) war: 652 ± 1 und 675 ± 1 nm. Die Pigmentkonzentrationen von Chl a und Chl b wurden mittels der Methode von Porra et al. (1989) bestimmt. Das sich daraus ergebende Chl a/Chl b Verhältnis war 1.35 ± 0.05. Der relative Anteil von Apoproteinen der verschiedenen Pigment-Protein-Komplexe, die im LHCII enthalten sind, wurde mittels eines Silber gefärbten SDS/urea/Polyacrylamid-Gels abgeschätzt (Desaga Quick Scan Densitometer). Demnach konnten 84.7 % der Apoproteine den lhcb1-3 Genprodukten und 12.6 % den untergeordneten lhcb5/6 zugeordnet werden (von lhcb4 wurden nur Spuren gefunden).

Die LHCII Präparation wurde in einem Puffer gelöst. Dieser enthielt folgende Bestandteile: 30 mM MES - NaOH, pH = 6.5, 10 mM CaCl2 , 20 % w/v Sacharose und 0.025 % w/w beta-Dodecylmaltoside. Die Gesamtchlorophyllkonzentration in der Probe betrug 0.20 mg Chl/cm3.

Der Gehalt an beta-Karotin und der Xanthophylle wurde spektroskopisch bestimmt


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(Messung der Absorption bei 470 nm in 80 % v/v Azeton und Berechnung nach den Gleichungen von Wellburn und Lichtentaler, 1984). Die Karotinoid-Zusammensetzung der Proben wurde durch RP-HPLC mittels einer Nucleosil 100 C - 18 Säule (Knauer; 25 cm × 4 mm; ID: 5 µm) in Kombination mit dem Lösungsmittelsystem Methanol/Tetrahydrofuran (v/v: 9/1) analysiert. Die Pigmente wurden bei einer Flußrate von 1 ml/min getrennt. Als Standard wurden Chl a (Fluka), Lutein (Sigma) und beta-Karotin (Fluka) verwendet. Die aus der HPLC - Analyse resultierende mittlere Pigmentzusammensetzung von zehn LHCII Proben war: 0.2 Lutein, 0.078 Violaxanthin, 0.078 Neoxanthin und 0.015 beta-Karotin pro Chl a (mol/mol). Diese Werte sind mit denen von Peterman et al. (1997b) und Bassi et al. (1997) vergleichbar. Dabei wies der Gehalt an Neoxanthin die höchste Variabilität auf. Bei einigen Proben konnte kein Neoxanthin nachgewiesen werden. Diese wurden nicht für die im Rahmen dieser Arbeit vorgestellten Messungen benutzt. Eine Labilität bezüglich Neoxanthin wurde auch von Kühlbrandt et al. (1994) nachgewiesen. Möglicherweise ist Neoxanthin in peripheren Bereichen des Pigment-Protein-Komplexes lokalisiert.

Die LHCII Präparation enthält solubilisierte nicht-aggregierte trimere Komplexe (siehe auch Vasil’ev et al., 1997a).

1.2.3. Chl a und Chl b in Lösung

Die als Vergleichsstandard verwendeten Chl a- und Chl b-Proben lagen zunächst in trockener Form vor (Sigma) und wurden je nach gewünschter Konzentration in einer definierten Menge Azeton (80 % v/v) aufgelöst.


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1.3. Allgemeines zum experimentellen Aufbau und zum Ablauf der Messungen

Im folgenden sollen die grundlegende Elemente des experimentellen Aufbaus vorgestellt werden. Weiterhin werden einige im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Methoden erläutert, die für alle später vorgestellten Messungen von Bedeutung sind. Weitere Methoden, die nur für bestimmte Messungen entwickelt wurden, sind in die entsprechenden Kapitel eingebunden.

1.3.1. Verwendete Laser

Die in der vorliegenden Arbeit vorgestellten Messungen wurden mit verschiedenen ns-Lasersystemen durchgeführt. Tabelle 1 zeigt die wichtigsten Spezifikationen sowie die Art der Messungen, die mit dem jeweiligen System durchgeführt wurden.

Tabelle 1

Lasersystem

Verwendung

Zwei Farbstoff - Laser (LAS LDL 105)
gepumpt durch einen Nd3+-YAG- Laser:

  • Durchstimmbarer Bereich: 550 nm bis 740 nm
  • Impulsdauer: ca. 2.5 ns
  • spektrale Breite: 0.04 cm-1 (ca. 0.002 nm)
  • maximale Impulsenergie: ca. 500 µJ
  • Strahldivergenz: <0.5 mrad

Als Anregungslaser bei Einstrahl-Experimenten

Als Pump- und Testlaser bei Pump-Test-Experimenten ohne Verzögerung und mit optischer Verzögerung

Kompaktes Lasersystem VSL-Dye (Laser Science Inc.) bestehend aus einem N2 - Lasermodul mit nachgestelltem Farbstofflaser:

  • Durchstimmbarer Bereich: 350 nm bis 700 nm
  • Impulsdauer: ca. 2.5 ns
  • spektrale Breite: 6 cm-1 (ca. 0.3 nm)
  • maximale Impulsenergie: ca. 30 µJ
  • Strahldivergenz: ca. <1 mrad

Als Pump- und Testlaser bei Pump-Test-Experimenten mit optischer Verzögerung

Als Testlaser bei Pump-Test-Experimenten mit elektronischer Verzögerung


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Der zeitliche Verlauf der Laserimpulse, , wurde mit einem Hochfrequenz-Oszilloskop (Tektronix 684A) im Einzelschußbetrieb gemessen. Trotz geringfügiger Abweichungen kann für beide Lasersysteme näherungsweise als Gauß-Impuls der Form mit dem Parametern Delta = 1.1 ns und I (variable integrale Intensität) angesehen werden:

(E2)

Die Kalibrierung des Kompaktlasersystems VSL Dye bezüglich der Wellenlänge erfolgte mittels des hochauflösenden Spektrometers PGS2.

1.3.2. Die Stabilisierung des Anregungsgebietes

Die Variation der Anregungsintensität (bzw. Pump-Intensität) ist ein Grundprinzip fast aller in der vorliegenden Arbeit vorgestellten Messungen. Grundsätzlich kann es zu beträchtlichen Meßfehlern kommen, wenn die Geometrie der Anordnung nicht auf das Verhalten der optischen Elemente abgestimmt ist. Aus diesem Grund wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Methode entwickelt, die es gestattet, ein wohl definiertes Anregungsgebiet innerhalb der Probenebene zu erzeugen, das nur minimalen Schwankungen unterlegen ist. Im folgenden wird darauf genauer eingegangen.

Um einen möglichst großen Intensitätsbereich zu erhalten, ist es nötig, dessen obere Grenze zu maximieren. Die Intensität des Lichtes wird durch die Anzahl von Photonen je cm2 und Laser-Impuls bestimmt. Deshalb stellt eine Verringerung der Anregungsfläche bei vorhandener (stets begrenzter) Impulsenergie die einzige Möglichkeit dar, hohe Intensitäten zu erzeugen. Dies wird durch Fokusierung des Anregungsstrahles erreicht. Wie in Abb. 5 dargestellt, reduziert sich der Durchmesser eines parallelen Strahlenbündels vom Wert bildseitig im Brennpunkt auf einen Minimalwert . Die Größe dieses Wertes ist lediglich von Abbildungsfehlern der Linse sowie durch die Divergenz innerhalb des Parallelstrahlenbündels abhängig. Abbildungsfehler konnten durch den Einsatz spezieller Objektive (Newport) minimiert werden. Bei den meisten Messungen kam ein Objektiv mit 140 mm zum Einsatz. Messungen des Strahlquerschnitts in dessen Fokus ergaben Werte von ca. 20 µm. Ordnet man diesem Wert eine Strahldivergenz zu, so ergibt sich ein (sehr geringer) Wert von 0.15 mrad. Letztere ist in Abb. 5 durch den Winkel alpha verdeutlicht. Nach Abb. 5 ist gegeben durch: . Außerhalb der Brennebene ergibt sich der folgende Strahlquerschnitt:

(E3)

wobei den Abstand zur Brennebene darstellt. Zum Beispiel ergibt sich bei einem


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Strahlquerschnitt von 5 mm und einem Abstand 1 mm von der Fokusebene eines 140 mm Objektives ein Durchmesser von ca. 100 µm.

Abbildung 5
Fokussierung eines Parallelstrahlenbündels. Die Strahldivergenz alpha ist stark übertrieben eingezeichnet. Abbildungsfehler sind nicht berücksichtigt.

Gl. (E3) ermöglicht die Abschätzung geometrischer Parameter in Bezug auf die Größe eines Anregungsgebietes. Dementsprechend läßt sich die Intensität abschätzen, die sich bei der Wahl bestimmter Werte für , und bei gegebener Impulsenergie ergibt. Es sei jedoch darauf hingewiesen, daß die Intensitätsverteilung in der Probenebene durch separate Messungen ermittelt wurde (siehe Kapitel 1.3.3 ).

Die Variation der Anregungsintensität erfolgte durch definierte Abschwächung der maximalen Intensität. Dazu wurden Kombinationen verschiedener (reflektierender) Neutraldichtefilter (Melles Griot bzw. Newport) verwendet. Auf diese Weise war es möglich, einen Dynamikbereich von ca. 8 Größenordnungen zu erhalten. Bezüglich der Abhängigkeit von der Anregungswellenlänge bieten diese Filter sehr gute Eigenschaften (Transmission nahezu konstant bezüglich der Wellenlänge). Allerdings erfährt ein Parallelstrahl beim Durchgang durch einen dieser Neutralfilter eine bestimmte Ablenkung. Die Gesamtablenkung beim Durchgang durch mehrere Filter war etwa 2 mrad.

Abb. 6 zeigt, wie sich diese Richtungsänderung auswirkt. Dargestellt sind zwei Parallelstrahlenbündel, die eine (stark übertrieben gezeichnete) Winkeländerungen erfahren haben (verursacht durch jeweils unterschiedliche Neutralfilter). In der Brennebene ergibt sich eine um den Wert versetzte Position der Strahlenbündel. Messungen in dieser Ebene, in der der Querschnitt der Bündel minimal ist, führen zu extrem großen Meßwertschwankungen bei verschiedenen Intensitätswerten und sind deshalb unbrauchbar.

Unabhängig davon, welche Ablenkung ein Strahlenbündel erfährt, gibt es eine definierte Position, an der die optische Achse bildseitig geschnitten wird (Länge ). Dieser Schnittpunkt ergibt sich aus der Abbildung des objektseitigen Schnittpunktes (Länge ) mit der optischen Achse nach der Abbildungsgleichung: .


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Abbildung 6
Schematische Darstellung des Einflusses der Richtungsänderung des Anregungsstrahles auf die Position in der Brennebene.

Ein gegenüber beliebiger Winkeländerung invariantes Strahlprofil befindet sich demnach im Abstand vom (bildseitigen) Brennpunkt. An dieser Stelle ergibt sich nach Gl. (E3) der Querschnitt:

(E4)

Will man die Größe eines (stabilisierten) Anregungsgebietes vorgeben, so muß die optische Anordnung entsprechend Gl. (E4) gewählt werden. Offensichtlich muß gewählt werden, anderenfalls wird der Strahlquerschnitt zu groß um hohe Intensitäten zu erhalten.

Diese Methode fand im Rahmen dieser Arbeit bei allen Messungen Anwendung. Dadurch konnten, im Vergleich zu früheren Messungen, Meßfehler drastisch reduziert werden.

1.3.3. Die Bestimmung der Anregungsintensität in definierten Bereichen der Probenebene

Die Stabilisierung des Anregungsgebietes nach der im vorigen Kapitel beschriebenen Methode ist lediglich der erste Schritt auf dem Weg zu definierten Anregungsbedingungen. Innerhalb der Probenebene liegt eine Verteilung der Anregungsintensität vor, die Meßgrößen sollen jedoch bestimmten Intensitäten zugeordnet werden können. Das heißt, daß Bereiche innerhalb des Strahlprofils selektiert werden müssen, um das Verhalten der Meßgrößen innerhalb dieser Auswahl zu untersuchen. Die Auswahl eines begrenzten Gebietes, dem man eine nahezu konstante Anregungsintensität zuordnen kann, hängt von der Art der Messung ab und ist in den entsprechenden Kapiteln beschrieben. Im folgenden ist lediglich erläutert, wie die Berechnung der Intensität erfolgte.

Um das Strahlprofil visuell beurteilen zu können, wurde statt der Probe ein Proben-


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normal verwendet, dessen Oberfläche sich in der Objektebene eines Mikroskops befand. Auf gleicher Höhe wie die zu messende Probenebene befand sich eine Lochblende (Durchmesser: 5 µ). Durch seitliche Verschiebung des Meßtisches (Translationselemente) wurde diese in die Probenebene gebracht. Abweichungen in Richtung der optischen Achse machten sich dadurch bemerkbar, daß das Bild der Lochblende im Mikroskop unscharf war. Dies wurde durch entsprechende Justage der Position der Lochblende korrigiert. Hinter der Lochblende befindet sich ein Detektor. Nach dem Start des Meßprogramms wurde die Position der Lochblende innerhalb eines festgelegten Bereiches mittels Schrittmotoren verändert und die Detektor-Signale aufgenommen. Das Ergebnis dessen war eine diskrete Verteilung der Anregungsintensität in der Probenebene.

Entsprechend der Größe des durch die nachfolgende Messung ausgezeichneten Gebietes wurde innerhalb des Gesamtprofiles ein Bereich B ausgewählt, dessen Detektor-Daten summiert wurden. Setzt man diesen Wert zur Summe über die Detektor-Daten des gesamten Strahlprofiles in Relation so erhält man den Anteil EB der Gesamtenergie der Anregungsimpulse. Letztere wurde mit dem Energiemesser DigiRad bestimmt. Somit ist der Teil der Energie bekannt, der auf den ausgewählten Bereich der Fläche auftrifft. Entsprechend der Wellenlänge ergibt sich die (zeitlich integrale) Intensität der Impulse:

(E5)

Der Index ”max“ deutet an, daß es sich hier um die ungeschwächte (also maximale) Intensität handelt. Die im Rahmen dieser Arbeit beschriebenen Messungen wurden bei variabler Intensität durchgeführt. Dies wurde durch die Variation von Neutralfiltern erreicht. Damit ergibt sich:

(E6)

Hierbei ist der Wert der (leicht) von der Wellenlänge abhängigen optischen Dichte (Summe aller verwendeten Neutralfilter).

1.3.4. Aufbau zur Vermeidung von Meß- Artefakten bei Pump-Test-Messungen der Transmission

Da der Intensitätsunterschied zwischen Pump- und Teststrahl bei den vorliegenden Messungen bis zu 6 Größenordnungen beträgt, besteht die Hauptschwierigkeit der Pump-Test Messungen darin, einen Beitrag des Pumpstrahles zum Mess-Signal auszuschalten bzw. zu minimieren. Wie in Abb. 7 skizziert, wurde dazu ein nicht paralleler Strahlengang zwischen beiden Strahlen gewählt. Der Winkel mußte allerdings klein genug sein, um eine Veränderung der Pump-Intensität innerhalb der


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Probe in Richtung des Teststrahles gering zu halten.

Es wurde eine Anordnung aufgebaut, die mit Hilfe von Blenden ein Optimum für das Verhältnis aller beteiligten Öffnungswinkel schafft. Das Öffnungsverhältnis des Pumpstrahles muß groß sein, um die Stabilität des Anregungsgebietes bei variabler Pump-Intensität zu gewährleisten (siehe Kapitel 1.3.2 ). Demzufolge ist Blende 1 relativ groß, jedoch notwendig, um zu verhindern, daß Randbereiche des Pumpstrahles direkt durch Blende 3 gelangen können (siehe Abb. 7).

Bei hohen Pump-Intensitäten ist die Streuung des Pumpstrahles an dem in Abb. 7 dargestellten Spiegel signifikant. Um den Strahlengang dieses isotrop ausgesendeten Anteiles (z. B. gestrichelte Linie) zu unterbrechen, wurde eine Halbblende vor der Probe angebracht, die Blende 3 von dieser Strahlung abschattet.

Bei den Vorbereitungen zu den in dieser Arbeit vorgestellten Pump-Test-Messungen stellte sich heraus, daß die Geometrie des Teststrahles (nach der Probe) durch den Pumpstrahl beeinflußt wird. Bei hohen Pump-Intensitäten ist in der Ebene der Blende 3 eine Deformation des Teststahlprofils sogar visuell feststellbar. Bedingt durch diese Deformation vergrößert sich das Öffnungsverhältnis des Teststrahles - er wird aufgeweitet.

Abbildung 7
Schematische Darstellung der Geometrie zur Abtrennung des Pumpstrahles bei Pump-Test-Messungen der Transmission

Die Berücksichtigung dieses Effektes ist von großer Bedeutung. Einerseits muß Blende 3 möglichst klein sein, um den Anteil des durch die Probe isotrop gestreuten Pumpstrahles so gering wie möglich zu halten. Andererseits darf es nicht dazu kommen, daß eine Pumpstrahl- bedingte Veränderung der Geometrie des Teststrahles zur Folge hat, daß aufgeweitete Anteile nicht durch Blende 3 gelangen können. Letzteres würde zu einer Verfälschung der Meßergebnisse führen, denn Ziel der Untersuchungen ist der Einfluß des Pumpstrahles auf die Transmission des Teststrahles innerhalb der Probe. Gelöst wurde das Problem dadurch, daß das Öffnungsverhältnis des Teststrahles mittels Blende 2 sehr gering gehalten wurde. Blende 3 wird im Vergleich dazu sehr groß gewählt. Wie Testmessungen zeigten, ist


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dann auch die absolute Deformation des Teststrahles geringer. Der Erfolg dieser Methode besteht darin, daß selbst ein stark deformierter Teststrahl ungehindert die Blende 3 passieren kann. Es sei darauf hingewiesen, daß die Deformation des Teststrahles ebenso bei dessen Abbildung auf die Empfängerdiode berücksichtigt wurde. Zum Einsatz kam dabei eine kurzbrennweitige Linse, deren Fokus etwa 2 mm hinter der Diode liegt.

Zur weiteren Reduzierung des Pump-Streuanteiles im Strahlengang des Teststrahles wurde optional ein geeigneter Farbglasfilter verwendet.

1.3.5. Verarbeitung der elektronischen Detektorsignale

Als Detektoren dienten kompakte Dioden-Verstärker-Module (Analog Modules) mit Silizium- bzw. Avalanche-Diode. Die Detektorsignale wurden zeitlich integriert (BCI 280 mit 10 ns Torbreite), digitalisiert (Advantech PCL 812) und an das (selbst erstellte) PC (Turbo-Pascal-)Steuerprogramm weitergeleitet.


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Fußnoten:
<1>

/ Ein Teil des LHCII (der sich in seinen biochemischen Eigenschaften nicht vom übrigen LHCII unterscheidet) wird mittlerweile als selbständiger Membran-Proteinkomplex angesehen und ist damit nicht mehr nur dem PSII zugeordnet.

<2>

/ NPLF steht für “Nichtlineare Polarisationsspektroskopie in der Frequenzdomäne“

<3>

/ Es sei darauf hingewiesen, daß Begriffe wie Dimer, Trimer usw. sowohl für Proteine als auch Pigmente verwendet werden. Im Rahmen dieser Arbeit wird der Begriff Pigment-Multimere nur für Pigmentaggregate innerhalb des Protein- Monomers verwendet.


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