Schödel, René: Zur Kinetik von Singulett- und Triplett-Anregungen im Lichtsammelkomplex des Photosystems II höherer Pflanzen (LHCII).

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Kapitel 2. Multiple Singulett-Anregungen im LHCII

2.1. Einleitung

Die Verfügbarkeit von Laserlichtimpulsen erweiterte das Spektrum der Meßmöglichkeiten zur Untersuchungen photosynthetischer Organismen bereits in den 70er Jahren. Dies betrifft die Möglichkeit qualitativ neue Anregungsbedingungen im Hinblick auf spektrale Güte, aber auch zeitliche Definiertheit zu erreichen. Zusätzlich bietet Laserlicht die Möglichkeit, hohe Intensitäten zu erzeugen, um mit der Methode der nichtlinearen Laserspektroskopie neue Erkenntnisse bei der Charakterisierung von Zustandsbesetzungen zu erhalten.

Messungen der Fluoreszenzquantenausbeute (an Chlorella) zeigten, daß diese mit steigender Anregungsintensität drastisch abnimmt. Dies war der Beginn einer in den nachfolgenden Jahren ausgiebig geführten Diskussion um Prozesse, die zur Vernichtung von Anregungsenergie in photosynthetischen Systemen führen (siehe unten). Es zeigte sich, daß bei Verwendung relativ kurzer Anregungsimpulse (7 ns FWHM in Mauzerall et al., 1976a, b) keine Sättigung der Fluoreszenz zu beobachten ist. Damit waren die gemessenen Abhängigkeiten nicht im Einklang mit einer ”single hit Poisson saturation“ (siehe Mauzerall et al., 1976a). Letzteres würde bedeuten, daß die Fluoreszenzquantenausbeute multipler Anregungszustände verschwindet. Der im Gegensatz dazu gefundene ”breite Charakter“ der Fluoreszenzquantenausbeute, d.h. deren Abfallen bei relativ geringen Intensitäten einerseits und das nicht sättigende Verhalten bei hohen Intensitäten andererseits, führten zu der Hypothese, daß Vernichtungsprozesse (beim Vorhandensein mehrerer Anregungszustände) auf einer vom Absorptionsakt unabhängigen Zeitskala ablaufen.

Die Ergebnisse von Messungen, die mit 20 ps Laserimpulsen durchgeführt wurden (Campillo et al., 1976 a,b), stimmten mit denen von Mauzerall nahezu überein. Daraus wurden gefolgert, daß für Dt ge 7 ns die Fluoreszenzausbeute als Funktion der Anregungsintensität unabhängig von der Dauer der verwendeten Anregungsimpulse ist. Folglich sollten Triplett-Zustände bei Einzelimpulsexperimenten (mit Dt ge 7 ns) keine Rolle für die Vernichtung von Anregungszuständen spielen. Unter den genannten Bedingungen wurde die Abnahme der Fluoreszenzausbeute der Wechselwirkung von angeregten Singulett -


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Zuständen zugeordnet (”singlet-singlet-exciton-annihilation“). Dabei betrachtet man Stöße zwischen jeweils zwei einfach angeregten Chlorophyll Anregungen, . Als Folgeprodukte entstehen ein Chlorophyll-Singulett-Grundzustand, , sowie entweder ein zweiter Grundzustand (siehe in Gl. (F1) ) oder ein höher angeregter Zustand, (siehe in Gl. (F1) ). Letzterer relaxiert sehr schnell in den Zustand (”internal conversion“).

(F1)

Die mit der Abnahme der Fluoreszenzausbeute einher gehende Verkürzung der Lebensdauer des fluoreszierenden Zustandes (Seibert und Alfons, 1974; Paschenko et al., 1975; Beddard et al., 1975; Campillo et al., 1976a, b) wurde ebenfalls ”Stößen“ diffundierender Exzitonen zugeordnet (zur Übersicht siehe Breton und Geacintov, 1980).

Ausgehend von der Idee einer Wechselwirkung zwischen Exzitonen wurden verschiedene Modelle entwickelt, um die obigen experimentellen Befunde quantitativ zu beschreiben. Abb. 8 skizziert die dabei jeweils zu Grunde gelegten Näherungen.

Die überwiegende Mehrzahl der Modelle geht von der Annahme (a) aus, daß sich sehr schnell eine zufällige räumliche Verteilung von Anregungszuständen einstellt (”random exciton distribution“). Demnach ist bei dieser Betrachtung unbedeutend, wie weit entfernt die jeweiligen Absorptionsvorgänge (die zu den später wechselwirkenden Exzitonen geführt haben) stattgefunden haben. Die Wahrscheinlichkeit für Stöße von jeweils zwei Exzitonen ergibt sich demnach aus der Anzahl möglicher Kombinationen . Paillotin et al. (1979) legen eine durch einen delta-Impuls erzeugte Anzahl i von Exzitonen zugrunde. Deshalb sind die Terme für die bimolekulare Annihilation gegeben durch:

(F2)

bezeichnet die bimolekularen Annihilationsraten mit für Prozeß und für (siehe Gl. (F1) ). Unter Vernachlässigung von Entleerungseffekten war es gelungen, ein entsprechendes System von Pauli Master Gleichungen analytisch zu lösen und damit sowohl die Daten der Fluoreszenzausbeute als auch die der Fluoreszenzkinetik als Funktion der Anregungsintensität zu beschreiben (siehe (aab) in Abb. 8). Als Grenzfall für unendlich große Systeme (wo gilt ) ergab sich das von Swenberg et al. (1976) vorgestellte Ratengleichungssystem (siehe (ab) in Abb. 8).

Es sei auf zwei drastische Näherungen hingewiesen, die zur Herleitung der analytischen Ausdrücke zur Beschreibung der genannten Meßgrößen von Paillotin et


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al. (1979) notwendig waren: i) Auf eine Berücksichtigung von Entleerungseffekten insbesondere der Grundzustandsentleerung wurde verzichtet. ii) Die Berechnungen gehen von einer willkürlich existierenden Anzahl von Exzitonen aus. Damit werden Effekte, die während der Anregung eine Rolle spielen könnten, von vornherein ausgeschlossen. Vom theoretischen Standpunkt aus gesehen stellen die Annahmen i) und ii) keinen Mangel des Paillotin’schen Modells. Jedoch sind Experimente, deren Ergebnisse mit diesem Modell erklärt wurden, kritisch bezüglich der genannten Punkte zu betrachten.

Abbildung 8
Schematische Darstellung der sich aus unterschiedlichen Voraussetzungen ergebenden Modelle zur quantitativen Beschreibung der Singulett - Singulett Vernichtung.

Ein völlig anderer Zugang zur Modellierung von Exziton-Exziton Vernichtungsprozessen ergibt sich, wenn man deren Vorgeschichte, d.h. dem Ort des Absorptionsaktes, eine Bedeutung zuschreibt. Dies ist der Fall, wenn die charakteristische Zeit für die zufällige Verteilung der Exzitonen vergleichbar (oder kleiner) wird als jene, welche die Annihilation beschreibt (siehe (b) in Abb. 8). Ausgehend von den Überlegungen von Agranovich und Galanin (1982) wurde eine Zeitabhängigkeit der ”Konstanten“ gamma (verantwortlich für die Stärke der Exziton-Exziton Annihilation, siehe Gl. (F2) ) zugelassen (Rubin und Paschenko, 1986). Die entsprechende Ratengleichung für die Besetzung von (einfach) angeregten Singulett - Zuständen wurde direkt mit den Meßergebnissen der Fluoreszenzkinetik verknüpft um die Zeitabhängigkeit zu berechnen. Valkunas et al. (1995) stellte ein erweitertes Modell dieser Beschreibung der Exziton-Exziton Annihilation für


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quasi-homogene und deshalb unendlich große photosynthetische Antennenkomplexe vor. Es werden ebenfalls zeitabhängige Annihilationsraten betrachtet, jedoch auch Prozesse während der Anregung sowie die Besetzung höher angeregter Zustände betrachtet (siehe Gl. (F1) ).

Eine wesentliche Erweiterung des Paillotin’schen Pauli-Master-Gleichungs-Formalismus (siehe oben) stellte das von Gülen et al. (1986) aufgestellte Modell dar (siehe (aaa) in Abb. 8). Dieses wurde speziell für Systeme entwickelt, die nur wenige Pigmente beinhalten. Ausgangspunkt waren die Ergebnisse der Messungen der Fluoreszenzkinetik an LHCII, die von Nordlund und Knox (1981) durchgeführt wurden. In letzteren zeigte sich bei einer nichtaggregierten (die Komplexe sind räumlich voneinander getrennt) dk1 LHCII Präparation (im Gegensatz zu einer aggregierten), daß die Lebensdauer des (fluoreszierenden) Singulett - Zustandes unabhängig von der Intensität der verwendeten 20 ps Anregungsimpulse ist. Gülen mußte demnach Prozesse, die während der Anregung stattfinden, berücksichtigen. Des weiteren wurde die Besetzung höher angeregter Singulett-Zustände sowie die Entleerung von Grund- und einfach angeregten Singulett-Zuständen explizit in das Pauli-Master-Modell mit einbezogen. Es wurde ein Rechteckimpuls variabler Länge angenommen. Mit diesem Modell konnte Gülen das von Nordlund und Knox (1981) gewonnene Ergebnis (keine Verkürzung der Fluoreszenzkinetik, siehe oben) durch eine instantan einsetzende Exziton-Exziton-Annihilation während des 20 ps Impulses dk2erklären. Daraus folgt, daß die integrale Fluoreszenz von solubilisiertem LHCII ein sättigendes Verhalten bezüglich der Abhängigkeit von der Anregungsintensität zeigen müßte. Diese Frage konnte im Rahmen dieser Arbeit geklärt werden und ist Gegenstand der folgenden Kapitel.


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2.2. Die Fluoreszenz von solubilisiertem LHCII als Funktion der Anregungsintensität

2.2.1. Das Prinzip der räumlichen Selektivität

Auf den Einfluß eines nicht homogenen Anregungsgebietes bei der Messung der intensitätsabhängigen Fluoreszenz hat bereits Paillotin et al. (1983a) hingewiesen. In der vorliegenden Arbeit wurde auf die Realisierung eines homogenen Anregungsgebietes höchstes Augenmerk gerichtet. Diese Homogenität wurde durch die räumliche Selektion eines definierten Bereiches erreicht, in dem die Anregungsintensität lediglich um ± 20% variiert.

Das folgende Beispiel soll die Notwendigkeit des Prinzips der räumlichen Selektion illustrieren: Betrachtet sei eine Probe, deren Fluoreszenz ein sättigbares Verhalten aufweist. Dieses Verhalten kann man sich analog zu einem fotografischen Film vorstellen, der ab einer bestimmten Belichtungsstärke überbelichtet ist. Als Anregung sei eine Gaußförmige Intensitätsverteilung angenommen, deren Halbwertsbreite etwa 60 µm beträgt. Bei geringer Anregungsintensität (linearer Bereich) ist die Stärke des von der Probe ausgesandten Fluoreszenzsignales direkt proportional zur Anregungsintensität. Deshalb ist die räumliche Intensitätsverteilung der Fluoreszenz in diesem Fall identisch zu der Verteilung der Anregungsintensität selbst (siehe Abb. 9a).

Abbildung 9
Räumliche Verteilung der Fluoreszenz bei verschiedenen Anregungsintensitäten
(Darstellung in der Probenebene bei identischer räumlicher Verteilung der Anregungsintensität)

A: Bei geringer Anregungsintensität

B: Bei Sättigung der Fluoreszenz (zentraler Bereich) durch erhöhte Anregungsintensität


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Bei den in dieser Arbeit vorgestellten Untersuchungen zur nichtlinearen Fluoreszenz ist diese Proportionalität bei höheren Intensitäten jedoch nicht mehr gegeben. Es kommt zu einer Sättigung der Fluoreszenz in einem sehr großen räumlichen Gebiet (siehe Abb. 9b). Dadurch liefern Randgebiete, die um Größenordnungen weniger stark angeregt werden als das Zentrum, einen erheblichen Beitrag zur Gesamtfluoreszenz. Eine Messung der Intensitätsabhängigkeit der gesamten Fluoreszenz würde in diesem Falle keinen großen Informationsgewinn erbringen, da eine Zuordnung der Fluoreszenz zu einer definierten Intensität nicht möglich ist.

In der vorliegenden Arbeit wurde eine Anordnung entwickelt, die eine räumliche Selektion der Fluoreszenz ermöglicht (siehe Abb. 10). Das Fluoreszenzgebiet wird auf eine Lochblende abgebildet, deren Durchmesser so gewählt wird, daß das Fluoreszenzlicht, das durch diese hindurchgeht, von einem Probengebiet ausgeht, dessen Anregungsintensität maximal um ca. ± 20% variiert. Als wichtige Nebenbedingung muß erfüllt sein, daß es durch die Dicke der Probe nicht zu Abbildungsverzerrungen kommt. Deshalb wurden nur Küvetten mit einer wirksamen Dicke von maximal 200 µm verwendet.

Abbildung 10
Prinzip der räumlich selektiven Messung der Fluoreszenz

Die Realisierung der räumlichen Selektivität wird unter anderem durch die Güte der optischen Abbildung begrenzt. Durch die Wahl eines geeigneten Objektives sowie einer Apertur, die einerseits groß genug ist, um möglichst viel Fluoreszenzlicht aufzunehmen, jedoch andererseits klein genug, um Öffnungsfehler gering zu halten, war es möglich, eine minimale Fleckgröße von ca. 60 µm zu erreichen. Mit einer Lochblende von 50 µm Durchmesser ist es bei dieser Fleckgröße möglich, räumlich selektive Fluoreszenzmessung selbst bei extrem hohen Anregungsintensitäten durchzuführen.


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2.2.2. Meßaufbau

Die Erzeugung hoher, definierter Anregungsintensitäten in einer stabilisieren Probenebene erfolgte entsprechend den Beschreibungen der Kapitel 1.3.2 und 1.3.3 (S. 20 und S. 22). Die Kenntnis der jeweils verwendeten Filterkombination ermöglicht die Bestimmung der Intensität vor der Probe. Das von der Probe isotrop emittierte Fluoreszenzlicht aus dem Gebiet maximaler Anregung wurde mittels der beschriebenen Anordnung räumlich selektiert (siehe Kapitel 2.2.1 ). Der vereinfachte Meßaufbau ist in Abb. 11 dargestellt. Um an der Probe gestreutes Anregungslicht vom Fluoreszenzlicht zu separieren, wurde eine spektrale Trennung mit dem Doppelmonochromator GDM 1000 durchgeführt. Außerdem ermöglichte der Einsatz des Monochromators eine Messung des Fluoreszenzspektrums. Um den Strahlengang am/im Monochromator vom bis dorthin verlaufenden Strahlengang zu entkoppeln, wurde ein Monofaser-Lichtleitkabel verwendet (siehe Abb. 11). Dieses besitzt die Eigenschaft, daß bei sorgfältiger Einkopplung in die 200 µm dicke Faser kaum Verluste auftreten (ca. 90 % Transmission).

Abbildung 11
Schematische Darstellung des Meßaufbaus zur Messung der intensitätsabhängigen Fluoreszenz

Die Art der Detektoren sowie die Auswerteelektronik ist in Kap. 1.3.5 auf S. 25 beschrieben.

Das Signal von Detektor 2 ist der integralen Fluoreszenz proportional, und Detektor 1 liefert ein der integralen Anregungsintensität proportionales Signal. Die bezüglich eines Untergrundsignals korrigierte Fluoreszenz ergibt sich somit aus:

(F3a)


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wobei die Pfeile den Zustand des Verschlusses (siehe Abb. 11) anzeigen ( : auf, : zu). Die Fluoreszenzausbeute ergibt sich aus dem Quotient:

(F3b)

ist die nach Gl. (E6) berechnete variable integrale Impulsintensität. Für die Darstellung der Ergebnisse von ist es üblich, auf zu normieren (wo keine Abhängigkeit von besteht). Das daraus resultierende Verhältnis wird im folgenden mit bezeichnet.

2.2.3. Ergebnisse der Messungen der intensitätsabhängigen Fluoreszenz

2.2.3.1. Wahl der Anregungswellenlänge

Die Raumtemperatur-Fluoreszenzspektren von solubilisiertem LHCII und Chl a in Lösung sind von der Anregungswellenlänge, , unbeeinflußt. Sogar jene Fluoreszenzspektren, die an der langwelligen Grenze des Absorptionsspektrums angeregt wurden, zeigten keine Veränderung verglichen mit kürzeren Anregungswellenlängen (Daten nicht gezeigt). An solubilisiertem LHCII wurden Messungen bis zu = 695 nm durchgeführt (bei noch größeren Wellenlängen war die Absorption zu gering, um ein meßbares Fluoreszenz-Signal zu erzeugen). Diese Wellenlänge ist ca. 15 nm oberhalb des Maximums im Fluoreszenzspektrum. Trotzdem blieb das spektrale Profil der Fluoreszenz unverändert gegenüber dem in Abb. 4 auf S. 16 gezeigten Raumtemperatur-Fluoreszenzemissionsspektrum.

Für die Messungen der nachfolgenden Kapitel wurde die Anregungswellenlänge 645 nm gewählt. Dies geschah aus folgendem Grund: Die bei der Wellenlänge 645 nm bei Raumtemperatur emittierte Fluoreszenz des LHCII beträgt lediglich ca. 1% des Maximalwertes (siehe Abb. 4 auf S. 16). Dies ist auch für Chl a in Lösung der Fall (siehe Schödel, 1993). Die stimulierte Emission hängt ebenso wie die Fluoreszenz von der energetischen (spektralen) Verteilung der Besetzung der Anregungszustände ab. Deshalb kann davon ausgegangen werden, daß die stimulierte Emission bei 645 nm eine zu vernachlässigende Rolle spielt (anders als im Fall = 680 nm; wo ein effektiver Querschnitt, , für die stimulierte Emission betrachtet werden muß; siehe Kap. 2.2.6.3 auf S. 54). Dies ist für die spätere Beschreibung der intensitätsabhängigen Daten von Vorteil (Wegfall der unbekannten Größe ).


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2.2.3.2. Einfluß der Anregungsintensität auf die Fluoreszenzspektren

Um spektrale Einflüsse zu charakterisieren, wurden Fluoreszenzspektren von solubilisiertem LHCII und Chl a in acetonischer Lösung bei verschiedenen Intensitäten aufgenommen (nicht gezeigt). Diese wurden unter Bedingungen der räumlichen Selektivität gemessen. Es zeigte sich, daß - sogar bei den höchsten Intensitäten - die Spektren im wesentlichen unabhängig von der Anregungsintensität sind (geringfügige Abweichungen können auf lokale Erhitzungen und eine intensitätsabhängige Reabsorption zurückgeführt werden). Damit sind die Daten der Fluoreszenzausbeute als Funktion der Anregungsintensität frei von Einflüssen, die durch eine Veränderung (z.B. Verschiebung) des Fluoreszenzspektrums zurückzuführen wären.

Die Unabhängigkeit der Fluoreszenzspektren von der Anregungsintensität rechtfertigt außerdem die Annahme, daß selbst bei hohen Intensitäten die Fluoreszenz immer auf dem gleichen Wege erzeugt wird, d. h. durch Relaxation einfach angeregter Chl a-Singulett-Zustände in den Grundzustand.

Für LHCII sei noch auf folgendes hingewiesen: Bei der Anregungswellenlänge 645 nm überwiegt zwar die Absorption durch Chl b, die absorbierte Energie wird jedoch sehr effektiv zu Chl a transferiert, so daß es selbst bei hohen Anregungsintensitäten zu keiner nennenswerten Besetzung von elektronisch angeregten Chl b-Singulett-Zuständen kommen sollte. Die Unabhängigkeit der LHCII-Fluoreszenzspektren von der Anregungsintensität liefert den experimentellen Beweis dieser Annahme. Es kann so ausgeschlossen werden, daß Chl b Moleküle Fluoreszenz emittieren.

Die Tatsache, daß selbst bei extrem hohen Intensitäten keine Veränderung des Fluoreszenzspektrums auftritt ist ein zusätzlicher Beleg dafür, daß eine destruktive Veränderung der Proben bei den Messungen zur Fluoreszenz von solubilisiertem LHCII ausgeschlossen werden kann.

2.2.3.3. Die normierte Fluoreszenzausbeute von solubilisiertem LHCII

Abb. 12 zeigt die Meßergebnisse der Fluoreszenzausbeute von solubilisiertem LHCII, die bei unterschiedlicher Selektivität gemessen wurden. Es ist deutlich zu erkennen, daß die unter vollständiger räumlicher Selektierung (entsprechend obiger Beschreibung) gemessene Kurve (bei hohen Intensitäten) um Größenordnungen von den anderen abweicht.

Ein derart drastischer Abfall der Fluoreszenzausbeute um ca. 4 Größenordnungen war vorher nie beobachtet worden. Dahingegen sind die übrigen Kurven in Abb. 12 ( und ) eher vergleichbar mit den in der Literatur diskutierten Ergebnissen


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(”breiter Charakter“ z.B. Mauzerall et al, 1976) /<4>. Eine andere Darstellung der Daten ( ) ist in Abb. 15 (siehe S. 44) gegeben. Dort ist (nach Gl. (F3a) ) anstelle von (nach Gl. (F3b) ) aufgetragen und das sättigende Verhalten der Fluoreszenz von solubilisiertem LHCII direkt erkennbar.

Abbildung 12
Normierte Fluoreszenzausbeute von solubilisiertem LHCII als Funktion von IP bei unterschiedlicher räumlicher Selektivität

2.2.3.4. Die normierte Fluoreszenzausbeute von Chl a in Lösung

Es wurden Messungen an Chl a in 80 % azetonischer Lösung durchgeführt, um die Ergebnisse mit denen von solubilisiertem LHCII zu vergleichen. Abb. 13 zeigt, daß die Kurvenform in beiden Fällen nahezu übereinstimmt. Zwischen beiden Verläufen existiert nur eine Verschiebung von ca. einer Größenordnung bezüglich der Anregungsintensität.

Da es sich bei Chl a in azetonischer Lösung um ein relativ einfaches System handelt, läßt sich die intensitätsabhängige Fluoreszenzausbeute unkompliziert modellieren. Dies ist im folgenden Kapitel beschrieben.


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Abbildung 13
Normierte Fluoreszenzausbeute als Funktion der Anregungsintensität in solubilisiertem LHCII und Chl a in Lösung. Die Messungen erfolgten unter Nutzung des Prinzips der räumlichen Selektivität. Die durchgezogene Linie ist zeigt eine Anpassung der experimentellen Daten von für Chl a in Lösung. Dabei wurden das Ratengleichungssystem Gl. (F4) und Gl. (F5) sowie aus der Literatur bekannte Parameter zugrunde gelegt (siehe Kap. 2.2.4. ).

2.2.4. Beschreibung der intensitätsabhängigen Fluoreszenz für Chl a in azetonischer Lösung

Bei der verwendeten Konzentration von 0.2 mg/ml (0.22 mM) können Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Chl a Molekülen ausgeschlossen werden. Der Absorptionsquerschnitt, , der Moleküle bestimmt die sogenannte ”Trefferrate“ (”hit rate“), . Diese gibt an, wie viele angeregte Zustände durch einen kurzen Impuls mit integraler Intensität , siehe Gl. (E2) ) erzeugt werden können, wenn keine Entleerung des Grundzustandes auftritt.

Für die Beschreibung bei höheren Intensitäten sowie zur Berücksichtigung des zeitlichen Anregungsprofiles, (siehe Gl. (E2) ), und von Relaxationsprozessen (Relaxation in den Grundzustand sowie ”intersystem crossing“ in einen langlebigen Triplettzustand) ist es notwendig und möglich (keine Wechselwirkung zwischen den Molekülen), das folgende Ratengleichungssystem zu betrachten:

(F4a)

(F4b)

(F4c)


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Dabei sind die relativen Populationen des Grundzustandes (i = 0), des angeregten Singulett - Zustandes (i = 1) sowie des metastabilen Triplett-Zustandes von Chl a. ist die reziproke Lebensdauer der (fluoreszierenden) Population . Diese beträgt (5.5 ns)-1 (Vasil’ev et al., 1997b). Es gilt: , wobei die Rate für direkten Übergang 1 rarr 0 ist. Die ”intersystem crossing“ Rate beträgt (7 ns)-1 (Bowers and Porter, 1967). Die Rate der Triplett-Relaxation ( ) ist um Größenordnungen kleiner als die übrigen Relaxationsraten (siehe Renger, G., 1992), weshalb der Term in Gl. (F4) vernachlässigbar klein ist. Der Betrag des Absorptionsquerschnittes, , bei der verwendeten Anregungswellenlänge von 645 nm kann aus dem molekularen Extinktionskoeffizienten (Porra et al., 1989) berechnet werden (siehe Schödel et al., 1996). Es ergibt sich: (645 nm) cong 0.63 _ 10-16cm2. Damit ist das durch Gl. (F4a-c) gegebene Ratengleichungssystem vollständig beschrieben.

Gl. (F4a-c) vernachlässigt die Population höher angeregter Singulett - Zustände., da diese sehr schnell in den einfach angeregten Zustand relaxieren (sub - ps Zeitskala) und eine indirekte Besetzung höher angeregter durch eine gegenseitige Wechselwirkung einfach angeregter Zustände bei der verwendeten Konzentration von Chl a in Lösung ausgeschlossen werden kann /<5>.

Die normierte Fluoreszenzausbeute kann aus der Lösung von Gl. (F4) berechnet werden:

(F5)

Das Ergebnis ist in Abb. 13 als durchgezogene Linie eingezeichnet. Es ist zu erkennen, daß die Meßergebnisse von Chl a in Lösung durch das Gleichungssystem Gl. (F4a-c) sehr gut beschrieben werden. Dieses Resultat verdeutlicht das von Chl a zu erwartende (allerdings niemals vorher in diesem weiten Bereich der Anregungsintensität gemessene) Verhalten der Fluoreszenzausbeute, das durch eine drastische Entleerung der Grundzustandspopulation geprägt ist. Ein sehr wichtiger Aspekt, der sich aus der Übereinstimmung der experimentellen mit der berechneten Chl a - Kurve ergibt, ist die Tatsache, daß die experimentelle Anlage Daten liefert, welche von dem Chl a Testmolekül erwartet werden.


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2.2.5. Theoretische Beschreibung der intensitätsabhängigen Fluoreszenz für solubilisierten LHCII

In diesem Abschnitt soll das Verhalten der intensitätsabhängigen Fluoreszenz von solubilisiertem LHCII quantitativ beschrieben werden. Ein Augenmerk soll hierbei auf die gemessene Kurvenform, d.h. das sättigende Verhalten der Fluoreszenz (für > 1016 ),. aber auch die Position bezüglich der Intensitätsachse gelegt werden.

2.2.5.1. Ein Pauli-Master Gleichungsmodell

Zunächst wird von dem von Gülen et al. (1986) entworfenen Modell (siehe (aaa) in Abb. 8, S. 29) ausgegangen. Dort wurde allerdings ein Rechteck-förmiger Anregungsimpuls vorausgesetzt.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Modell so erweitert, daß es für beliebige Impulsformen anwendbar ist. Damit ist es nun möglich, die intensitätsabhängige Fluoreszenz von solubilisiertem LHCII unter Beachtung der experimentellen Bedingungen durch ein erweitertes, auf Pauli - Master - Gleichungen basierenden, Model zu beschreiben. Dies ist im folgenden ausführlich dargestellt.

Es wird ein Komplex betrachtet, in dem sich aleph Pigmente befinden. Durch Absorption von Photonen kommt es zur Bildung von i einfach elektronisch angeregten Zuständen. Die gegenseitige Wechselwirkung von jeweils zwei einfach angeregten Zuständen (siehe S. 28) führt zur Vernichtung des einen und zur Überführung des anderen in einen höher angeregten Zustand. Höher angeregte Zustände können auch direkt durch Absorption aus einfach angeregten Zuständen hervorgehen. In beiden Fällen sind mindestens zwei absorbierte Photonen nötig, um höher angeregte Zustände zu erzeugen. Deshalb werden diese (wie auch in Gülen et al., 1986) im folgenden ”doppelt angeregte Zustände“ genannt. Im Prinzip absorbieren doppelt angeregte Zustände ebenfalls, was zur Erzeugung dreifach angeregter Zustände usw. führt. Da letztere jedoch extrem schnell relaxierendk3, müssen sie nicht explizit berücksichtigt werden (siehe Gülen et al., 1986). Die Anzahl doppelt angeregter Zustände wird mit j bezeichnet. Relaxationsprozesse führen zum Abbau doppelt bzw. einfach angeregter Zustände und damit zur Verringerung von i und j.

Im Pauli - Master - Gleichungs - Formalismus wird die Wahrscheinlichkeit betrachtet, mit der sich in dem Komplex i einfach angeregte und j doppelt angeregte Zustände befinden.


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Dabei ist die Indexmenge gegeben durch:

für die gilt: glf6 (F6)

Die Anzahl der Mitglieder von M, , ergibt demnach: . Für einen Komplex mit aleph = 12 ergeben sich also 91 zu berechnende Wahrscheinlichkeiten.

Abbildung 14
Zusammenfassende Darstellung aller betrachteten Prozesse, die einen Einfluß auf die Wahrscheinlichkeit, , dafür besitzen, daß sich in einem Komplex mit aleph Gesamtzuständen (Chlorophyllen) i einfach und j doppelt angeregte Zustände befinden.

Abb. 14 stellt schematisch alle Prozesse dar, die einen Einfluß auf besitzen. Der obere Teil der Abbildung umfaßt alle Prozesse, die im Prinzip zu einer Erniedrigung der Indizes i oder j führen (teilweise geht eine Erniedrigung des einen mit einer Erhöhung des anderen einher). In entsprechender Weise bewirken die gleichen Prozesse (unterer Abbildungsbereich) eine Erhöhung von i oder j.

In Abwesenheit von Photonen befindet sich der Komplex im Zustand . Deshalb kann als Anfangsbedingung für die nachfolgenden Berechnungen folgendes gesetzt werden:


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(F7)

Hierbei wurde auf -5 _ Delta festgelegt (siehe Gl. (E6) auf S. 23).

Die Bedeutung der in Abb. 14 enthaltenen Parameter und deren Wirkung auf die Indizes i und j sind in folgender Tabelle zusammengefaßt:

Tabelle 2
Übersicht über Parameter, die für den im Pauli - Master Formalismus behandelten Komplex mit aleph absorbierenden Grundzuständen von Bedeutung sind. Die rechte Spalte zeigt an, ob feste Werte angegeben werden können oder ob der Parameter als variabel anzusehen ist.

Beschreibung des Parameter

Wirkung bzgl.
i und j

Vorgabewert (siehe Text)

sigma01

Grundzustands - Absorptionsquerschnitt (bei 645 nm)

i rarr i+1

(645 nm)
cong 1.32 _ 10-16 cm2
(siehe Anhang A1 , S.103)

sigma12

Absorptionsquerschnitt von einfach angeregten Singuletts

(i, j) rarr (i-1, j+1)

ap bei 645 nm
(siehe Hillmann, 1995)

Abbau - Rate von einfach angeregten Singuletts

i rarr i-1

(4.3 ns)-1
(Vasil’ev et al., 1997b)

Abbau - Rate von doppelt angeregten Singuletts unter Bildung von einfach angeregten Singuletts

(i, j) rarr (i+1, j-1)

> (1 ps)-1
(siehe z.B. Gülen et al., 1986)

Abbau - Rate von doppelt angeregten Singuletts unter Bildung von Singulett - Grundzuständen

j rarr j-1

variabel

Rate für die paarweise Annihilation von einfach angeregten Singuletts.

(i, j) rarr (i-2, j+1)

variabel

Rate für die Annihilation von einfach angeregten durch doppelt angeregte Singuletts.

(i, j) rarr (i-1, j) /<6>

variabel /<7>


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Damit ergibt sich ein Pauli-Master-Gleichungssystem von alephM gekoppelten Differentialgleichungen für die jeweils gilt:

glf8 (F8)





für alle

Im Gegensatz zu Gülen et al. (1986), wo an dieser Stelle zwei Zeitbereiche definiert werden ( in und sonst, siehe oben) und die Lösung über die Berechnung von Eigenwerten ermittelt wird, wurde bei den im folgenden beschriebenen Berechnungen die Zeitabhängigkeit der Anregungsintensität (nach Gl. (E2) auf S. 20) explizit berücksichtigt.

Durch das Erstellen umfangreicher Datenbanken aus den numerisch berechneten Ergebnissen der Pauli-Master-Gleichungen war es möglich, Gl. (F8) für eine Vielzahl von Parametern zu berechnen, um damit die Meßdaten der intensitätsabhängigen Fluoreszenz zu beschreiben. Letzteres ist im folgenden beschrieben.

Die von dem Komplex emittierte zeitabhängige Fluoreszenz ist der mittleren Zahl einfach angeregter Zustände, , proportional (doppelt angeregte Zustände relaxieren strahlungslos). Diese ergibt sich aus der Lösung des Pauli-Master-Gleichungssystems:

(F9)

Die vom Komplex ausgesandte (zeitlich) integrale Fluoreszenz ergibt sich aus:

(F10)

Auf der Grundlage dieser Gleichungen wurde der Vergleich mit den experimentell ermittelten Daten der (zeitlich) integralen Fluoreszenz vollzogen. Darauf soll im folgenden näher eingegangen werden.

Der Verlauf der berechneten Kurven für die Abhängigkeit der Fluoreszenz von der Anregungsimpuls-Intensität wird auf unterschiedliche Weise von den in Tab. 2 zusammengefaßten Parametern beeinflußt.


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Es zeigte sich insbesondere, daß die Kurvenform fast ausschließlich durch den Parameter bestimmt wird. Dahingegen wird die Position der berechneten Kurven bezüglich der - Achse durch das Produkt aus der Anzahl der Pigmente (pro Komplex) mit deren Grundzustandsabsorptionsquerschnitt und damit durch einen Grundzustands - Gesamtabsorptionsquerschnitt bestimmt (siehe unten).

Die Werte aller übrigen Parameter (siehe Tab. 2) sind entweder bekannt (z.B. <SPAN CLASS=@@>=</SPAN> (4.3 ns)-1 ), an bestimmte Bedingungen geknüpft (z.B. > (1 ps)-1) oder ihre Wirkung auf den Verlauf der Fluoreszenz-Kurve als Funktion von ist gering ( , ), weshalb auf deren Einfluß hier nicht näher eingegangen werden soll.

Abb. 15 zeigt als Fehlerkreuze die Daten der experimentell bestimmten Fluoreszenz als Funktion von . Diese sind den in Abb. 13 (S. 37) dargestellten Daten der Fluoreszenzquantenausbeute komplementär. In dieser Darstellung ist das sättigende Verhalten der Fluoreszenz von solubilisiertem LHCII am deutlichsten zu erkennen. In Abb. 15 sind zum Vergleich Kurven gezeigt, die mit dem beschriebenen Pauli-Master-Modell (Gl. (F10) ) für verschiedene Parameter berechnet wurden. Offensichtlich existiert ein starker Einfluß auf die Kurvenform. Es ist zu erkennen, daß der sättigende Verlauf der Meßdaten nur für extrem große Werte von

> (1 ps)-1

erreicht wird. In diesem Fall besitzt die Zahl aleph der absorbierenden Grundzustände (bzw. im Komplex enthaltenen Grundzustände) keinen direkten Einfluß auf die berechnete Fluoreszenz. aleph hat lediglich im Produkt mit eine Bedeutung und bestimmt damit die Position der berechneten Kurven. wurde variiert, um die durchgezogene Linie in Abb. 15 in Übereinstimmung mit den experimentellen Daten zu bringen. Als Ergebnis ergibt sich:

=(2.3 ± 0.6) _ 10-15 cm2

Dieses Produkt gibt den Wert eines Gesamtabsorptionsquerschnittes des solubilisierten LHCII Komplexes an.

Zusammen mit dem aus der Kurvenform bestimmten Parameter > (1 ps)-1 ist es damit möglich, den Verlauf der experimentellen Daten im gesamten Untersuchungsbereich von sehr gut zu beschreiben (siehe Abb. 15). Es ist jedoch nötig, eine extrem große Annihilationsrate anzunehmen, um das sättigende Verhalten der Fluoreszenz als Funktion von zu erklären. Das bedeutet anschaulich, daß eine Besetzung von mehreren (i > 1) elektronischen Anregungszuständen (in einem Komplex mit aleph Gesamtzuständen) sehr effektiv vernichtet wird.


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Abbildung 15
Das sättigende Verhalten der Fluoreszenz: Die Fehlerkreuze entsprechen den gemessenen Daten von solubilisiertem LHCII und sind den Werten der Fluoreszenzausbeute (siehe Abb. 13 auf S. 37) komplementär. Die dargestellten Kurven wurden mit dem Pauli-Master-Model berechnet. Dabei wurde das zeitliche Profil des Anregungsimpulses explizit berücksichtigt. Scharparameter ist die (die Kurvenform bestimmende) bimolekulare Singulett-Singulett-Annihilationsrate (siehe Legende). Die übrigen Parameter lauten: =2.3 _ 10-15cm², = (4.3 ns)-1, , =(0.5 ps)-1, = 0.1 _ , = .

Abb. 16 illustriert dieses Verhalten anhand der zeitabhängigen Darstellung aller von Null verschiedenen Wahrscheinlichkeiten bei = 5 _ 1018 . Die Parameter des Systems entsprechen denen der durchgezogenen Linie von Abb. 15. Bei nicht so extrem hoher Laserimpulsintensität (z. B. <sub> </sub> =5 _ 1017 ) sind um so mehr vernachlässigbar klein. Zustände der Form (z.B. , , in Abb. 16) werden dann durch die Wirkung von quasi-instantan (das heißt noch während des Impulses) vernichtet. Da auch Zustände mit j > 0 sehr schnell abgebaut werden ( > (1 ps)-1 ) wird der Komplex hauptsächlich durch den Zustand beschrieben. Aus diesem Grund ist auch kein Einfluß der Anregungsintensität auf die Fluoreszenzabklingkinetik von solubilisiertem LHCII zu erwarten. Dies wurde von Nordlund und Knox (1981) experimentell nachgewiesen (siehe Diskussion auf S. 30).


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Abbildung 16
Zeitabhängige Darstellung von bei IP =5 _ 1018 Photonen cm-2 Impuls-1 entsprechend den Parametern der durchgezogenen Linie von Abb. 15. Alle weiteren Lösungen ergeben Null.

Aufgrund der Eigenschaften von solubilisiertem LHCII kann von folgendem Bild ausgegangen werden: Die überwiegend bei 645 nm (Anregungswellenlänge) absorbierenden Chl b Moleküle transferieren die aufgenommene Anregungsenergie sehr schnell (Du et al., 1994; Bittner et al., 1994) zu Chl a Molekülen. Damit tragen diese (die Chl b Moleküle) effektiv zur Erzeugung von Chl a Anregungszuständen bei. Deshalb kann der Absorptionsquerschnitt mit dem effektiven Absorptionsquerschnitt, (645 nm), von Chl a Molekülen innerhalb der solubilisierten LHCII Komplexe identifiziert werden. Eine Abschätzung ergibt: (645 nm) cong 1.32 _ 10-16 cm2 (siehe Anhang A1 , S.103). Dem steht der Gesamtabsorptionsquerschnitt von =(2.3 ± 0.6) _ 10-15cm2 gegenüber, der aus der Anpassung der experimentellen Daten gewonnen wurde (siehe durchgezogene Linie in Abb. 15). Nach Voraussetzung entspricht die Anzahl aleph der Anzahl von Chl a Molekülen im Komplex, . Aus dem Vergleich von und läßt sich dementsprechend abschätzen, wie viele Chl a Moleküle sich innerhalb des Komplexes befinden. Es ergibt sich:

= 18 ± 5

Geht man davon aus, daß es sich bei dem im Rahmen dieser Arbeit untersuchten solubilisierten LHCII tatsächlich um Trimere handelt, dann ist diese Zahl konsistent mit der von Kühlbrandt et al. (1994) angegebenen Gesamtzahl von ca. 21 Chl a


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Molekülen pro Trimer (siehe Kap. 1.1.3. auf S. 10).

Die Beschreibung der Fluoreszenzquantenausbeute von solubilisiertem LHCII durch das in diesem Abschnitt beschriebene Pauli-Master Gleichungsmodell führt damit zu der Hypothese, daß doppel- Anregungen von Chl a Molekülen innerhalb von LHCII-Trimeren (direkte und indirekte Anregung) quasi-instantan vernichtet werden. Dementsprechend können noch höhere Anregungen (dreifach etc.) ausgeschlossen werden. Diese Hypothese stellt ein ”vernünftig erscheinendes“ Ergebnis dar. Allerdings basiert sie auf der Annahme von Anregungszuständen, die ausschließlich den einzelnen Pigmenten zugeordnet werden. Effekte, die auf einem kollektiven Verhalten der Pigmente basieren, sind scheinbar nicht enthalten. Das Pauli-Master Gleichungsmodell läßt jedoch kollektive Effekte zu, wenn man den Absorptionsquerschnitt nicht den einzelnen Pigmenten (Chl a), sondern einer Gruppe von Pigmenten zuordnet. Dies betrifft den Fall einer starken exzitonischen Kopplung zwischen den Pigmenten, wie sie beim bakteriellen Lichtsammelkomplex LH2 angenommen wird (siehe Stiel et al., 1997). Die Größe dieses kollektiven Absorptionsquerschnittes hat keinen Einfluß auf die berechneten Kurven der Fluoreszenz als Funktion von solange gilt: =(2.3 ± 0.6) _ 10-15cm2 (siehe oben). Dabei stellt aleph die Anzahl der (kollektiv absorbierenden) Grundzustände und deren Absorptionsquerschnitt dar.

Aus einer Vielzahl von möglichen Zuständen sind nur wenige wirklich von Bedeutung. Durch den drastisch hohen Wert von hat die Anzahl aleph der im Komplex enthaltenen Zustände (Pigmente) nahezu keinen Einfluß auf die berechneten Kurven (siehe Abb. 15). Im Extremfall kann sogar 1 gesetzt werden. Dies führt auf eine qualitativ neue Stufe der Betrachtungen, da in diesem Falle eine paarweise Wechselwirkung zwischen angeregten Zuständen unmöglich ist (aleph < 2). Im folgenden Kapitel wird gezeigt, wie sich die Ergebnisse der Fluoreszenzquantenausbeute von solubilisiertem LHCII innerhalb dieses Modells auf sehr einfache Weise beschreiben lassen.

2.2.5.2. Mathematische Grenzfälle des Pauli-Master Gleichungsmodells und deren Anwendbarkeit

2.2.5.2.1. Das ”Cluster - Modell“ für solubilisierten LHCII

Die Stärke der destruktiven Wechselwirkung zwischen angeregten Chlorophyll-Singulett-Zuständen wird durch die Konstante (siehe Gl. (F8) ) bestimmt. Ist diese sehr groß ( > (1 ps)-1 ), so werden Zustandswahrscheinlichkeiten mit i > 1 praktisch Null. Zum Beispiel wird der Zustand, dessen Wahrscheinlichkeit beträgt (zwei einfach angeregte Singuletts pro Komplex), quasi instantan in überführt. Die Wahrscheinlichkeit der auf diese Weise erzeugten


47

doppelt angeregten Zustände bleibt ebenfalls sehr gering, da die Rate für deren Abbau gleichermaßen sehr groß ist ( > (1 ps)-1 ). Deshalb treten Besetzungswahrscheinlichkeiten nur bei sehr hohen Intensitäten in Erscheinung (siehe Abb. 16 auf S. 45).

Der Komplex wird sich also in den meisten Fällen in einem der folgenden drei Zustände befinden:

Dies entspricht genau dem Fall aleph = 1 (siehe Gl. (F6) auf S. 40).

Ein Komplex mit > (1 ps)-1 und > (1 ps)-1 unter Wirkung eines ns-Impulses kann demnach durch eine Art ”Cluster“ mit aleph = 1 beschrieben werden. Naturgemäß verschwinden in einem ”Cluster - Modell“ alle bimolekularen Wechselwirkungsterme via gamma* (siehe Gl. (F8) auf S. 42). Deshalb läßt sich das ”Cluster - Modell“ auf kinetische Gleichungen zurückführen (Gl. (F11) ) und damit drastisch vereinfachen.

Es läßt sich explizit zeigen, daß Gl. (F8) unter den genannten Bedingungen in das folgende einfache System von Ratengleichungen übergeht:


(F11)

Dabei sind die zeitabhängigen definiert durch: , , .

Die Parameter haben die gleiche Bedeutung wie in Kap. 2.2.5.1. auf S. 39. Die Absorptionsquerschnitte (Grundzustand) und (angeregter Zustand) sind jedoch dem Cluster zugeordnet.

Betrachtet man ein Ensemble aus diesen (nicht wechselwirkenden) Clustern mit einer Dichte von N Cluster (in Einheiten cm-3 ), so kann mit der relativen Besetzung von Clustern im Grundzustand (k = 0), einfach angeregten Zustand (k = 1) und doppelt angeregten Zustand (k = 2) identifiziert werden (vergleiche das Ratengleichungssystem für nicht wechselwirkende Chl a Moleküle in Lösung in Kap. 2.2.4. auf S. 37). Die Fluoreszenz wird ausschließlich von einfach angeregten Clustern ausgesandt und ist folglich proportional dem Integral:

(F12)


48

Abb. 17 zeigt die experimentellen Daten der intensitätsabhängigen Fluoreszenz von solubilisiertem LHCII zusammen mit einer mittels Gl. (F12) berechneten Kurve. Der Wert von wurde gleich dem des (oben bestimmten) Gesamtabsorptionsquerschnittes von (2.3 ± 0.6) _ 10-15cm2 gesetzt. Es ergibt sich eine gute Übereinstimmung der Modellkurve mit den experimentellen Daten. Der Verlauf dieser mit Gl. (F12) berechneten Kurve ist demnach nahezu identisch mit der in Abb. 15 (S. 44) dargestellten durchgezogenen Linie, für die gilt: > (1 ps)-1 und =(2.3 ± 0.6) _ 10-15cm2.

Abbildung 17
Anpassung der gemessenen intensitätsabhängigen Fluoreszenz durch das ”Cluster - Modell“. Es wurden die folgenden Parameter benutzt: =2.3 _ 10-15cm², = (4.3 ns)-1, , =(0.5 ps)-1, = 0.1 _ .

Das Verhalten der intensitätsabhängigen Fluoreszenz ist also durch ein viel einfacheres Modell erklärbar. In diesem - hier ”Cluster - Modell“ genannten System- werden mögliche Anregungszustände identischen (nicht wechselwirkenden) Clustern zugeordnet. Die Absorption eines Photons durch ein Cluster führt zur Emission von Fluoreszenz. Absorbiert ein bereits angeregtes Cluster ein weiteres Photon, so kommt es zur Besetzung des doppelt angeregten Zustandes, der sehr schnell relaxiert. Dieser, bei Absorption von mehr als einem Photon pro Cluster einsetzende (der Anregungszustandsabsorption folgende) Relaxationsprozeß, sorgt für die effiziente Vernichtung von Mehrfachanregungen innerhalb der solubilisierten LHCII Komplexe.

2.2.5.2.2. Ratengleichungen mit quadratischen Termen

Nutzt man die im Pauli-Master-Gleichungssystem enthaltenen Wahrscheinlichkeiten (siehe Gl. (F8) auf S. 42) zur Definition von mittleren Erwartungswerten, so erhält man eine anschauliche Darstellung, die sich unter Umständen in ein Ratengleichungssystem umschreiben läßt. Dies soll im folgenden genauer gezeigt


49

werden:

Die mittlere Anzahl einfach angeregter Zustände ist gegeben durch:

(F13a)

Entsprechendes gilt für die mittlere Anzahl doppelt angeregter Zustände:

(F13b)

Die zeitliche Ableitung von ist direkt durch die Pauli-Master-Gleichung gegeben (siehe Gl. (F8) auf S. 42). Deshalb ist es möglich, bei Vorgabe der Gesamtzahl von aleph Pigmenten, die zeitlichen Ableitungen von und explizit zu berechnen:

und glf18 (F14)

Das Ergebnis dieser Berechnungen läßt sich so formulieren:

(F15a)

(F15b)

wobei gilt: und

Es ist tatsächlich so, daß die Konstante in Gl. (F15a) nicht in Verbindung mit dem Faktor 1/2 auftritt. Diese Eigenschaft tritt durch die Hinzunahme doppelt angeregter Zustände in Erscheinung.

Unter folgenden Bedingungen gehen die Gleichungen Gl. (F15a, b) in ein einfaches Ratengleichungssystem (siehe unten) über:

  1. Die Wechselwirkung einfach angeregter Zustände mit doppelt angeregten Zuständen über die Konstante muß vernachlässigt werden.
  2. Es muß gelten: .

Ohne Beschränkung der Allgemeinheit sei angenommen, daß Bedingung i) erfüllt ist. Dazu sei bemerkt, daß die Besetzung doppelt angeregter Pigment-Zustände nur bei extrem hohen Anregungsintensitäten eine Rolle spielt, da deren Relaxation über und sehr schnell ist.

Läßt man eine Abweichung von ca. 25 % zu, dann ist auch die Bedingung ii) erfüllt wenn gilt . Dann erhält man aus Gl. (F15a, b) folgende einfache kinetische


50

Gleichungen für die Besetzung von Zuständen:

(F16a)

(F16b)

wobei die relative Besetzung einfach angeregter (k = 1) bzw. doppelt angeregter (k = 2) Zustände bezeichnet. Es wurde gesetzt: und . Die Konstante steht für das Produkt: . Alle weiteren Konstanten sind identisch mit denen von Tab. 2 (siehe S. 41).

Gl. (F16a, b) ist ein einfaches System kinetischer Gleichungen für die Berechnung der Besetzung von einfach und doppelt angeregten Zuständen innerhalb eines Komplexes. Das Markante hierbei ist das Auftreten von quadratischen Gliedern, die für die Vernichtung von einfach angeregten Zuständen zugunsten eines Grund- und eines doppelt angeregten Zustandes sorgen. Gleichungen dieser Art lassen sich mit geringem Aufwand (numerisch) lösen. Deshalb fanden solche Lösungsansätze schon vor Jahrzehnten Verwendung.

So nutzte z. B. Swenberg et al. (1976) ein sehr einfaches kinetisches Modell mit quadratischem Term zur Beschreibung der intensitätsabhängigen Fluoreszenz von Chloroplasten. Die Erzeugung doppelt angeregter Zustände und sogar die Grundzustandsentleerung wurde vernachlässigt (siehe Abb. 8 auf S. 29) und damit das intensitätsabhängige Verhalten vollständig auf den quadratischen Term reduziert. Bis heute sind kinetische Gleichungen mit quadratischen Termen verbreitet, um Vernichtungsprozesse von Anregungszuständen auch in umfangreicheren Modellen zu beschreiben (z. B. Stiel et al., 1997).

Kinetische Gleichungen mit quadratischen Termen (siehe Gl. (F16a, b) ) sind nur unter der Bedingung gerechtfertigt. Dafür muß gelten: (siehe oben). Die Pauli-Master-Gleichungs-Analyse der Ergebnisse zur intensitätsabhängigen Fluoreszenz von solubilisiertem LHCII führt allerdings zu dem Schluß (siehe Kap. 2.2.5.1. auf S. 39), daß die Wechselwirkung zwischen einfach angeregten Zuständen so schnell zu deren Vernichtung führt, daß es praktisch nicht möglich ist, mehr als einen einfach angeregten Zustand im Komplex zu erzeugen. Die Bedingung ist damit keineswegs erfüllt, und es wäre nicht gerechtfertigt, das obige System kinetischer Gleichungen (Gl. (F16a, b) ) zu verwenden.

Frühere Messungen an solubilisiertem LHCII (Schödel et al., 1994) sowie Ergebnisse anderer Arbeitsgruppen (für eine Übersicht siehe Breton und Geacintov. 1980) ergaben keine Sättigung der Fluoreszenz bei hohen Anregungsintensitäten. Dies war auf unzureichende bzw. fehlende räumliche Selektivität zurückzuführen.


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Die fehlerhaften Meßergebnisse ließen sich sehr gut durch kinetische Gleichungen mit quadratischem Term anpassen und führten damit zu Fehlinterpretationen.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde besonderes Augenmerk auf räumliche Selektivität gelegt (siehe Kap. 2.2.1. auf S. 31 sowie Abb. 12 auf S. 36).

2.2.6. Vergleich mit den Ergebnissen anderer Meßmethoden

In diesem Abschnitt soll geprüft werden, ob die in Kap. 2.2. gewonnenen Erkenntnisse mit den Ergebnissen anderer Messungen konsistent sind.

2.2.6.1. Abklingkinetik der Fluoreszenz

Obwohl die Intensitätsabhängigkeit der Fluoreszenzabklingkinetik an photosynthetischen Systemen Gegenstand zahlreicher Untersuchungen war (siehe Kap. 2.1. auf S. 27), ist lediglich eine Meßreihe bekannt (Nordlund und Knox, 1981), die an einer definitiv nicht aggregierten (d.h. an einer solubilisierten) Präparation von LHCII durchgeführt wurde. Es sei darauf hingewiesen, daß mit einem Lasersystem gearbeitet werden muß, dessen Impulsfrequenz (Repititionsrate) hinreichend klein ist, um Effekte durch Tripletts ausschließen zu können. Die Ergebnisse der Messungen zeigen, daß sich die Fluoreszenzabklingkinetik nicht verändert, wenn die Intensität des Anregungsimpulses erhöht wird.

Dieses Ergebnis wird durch den experimentellen Befund der intensitätsabhängigen Fluoreszenz der vorliegenden Arbeit gestützt. Schon Gülen et al. (1986) sagten ein sättigendes Verhalten der Fluoreszenz bezüglich der Anregungsintensität für nicht aggregierten LHCII voraus (siehe S. 30).

Auch aus den Ergebnissen der Berechnungen auf der Grundlage von Pauli - Master Gleichungen (siehe Kap. 2.2.5.1. ) folgt, daß die Fluoreszenzabklingkinetik bei Annahme eines kurzen (ps - bzw. sub-ps -) Impulses nicht von dessen Intensität abhängt, wenn gilt: > (1 ps) -1 dk4 (nicht gezeigt).

Das ”Cluster - Modell“ (siehe Kap. 2.2.5.2. ) liefert dieses Verhalten schon nach Voraussetzung (keine bimolekularen Terme).

2.2.6.2. Die intensitätsabhängige Absorption

Die Erzeugung von Anregungszuständen beeinflußt nicht nur das Verhalten der Fluoreszenz, sondern führt auch zu einer Änderung der Absorption. Die Thematik der instantanen Änderung der Absorption war und ist Gegenstand anderer Arbeiten (z.B. Schrötter, 1992; Hillmann, 1995). Deshalb soll hier nur ein spezieller Punkt untersucht werden: Die (instantane) Änderung der Absorption (bzw. der optischen Dichte), die durch den Anregungsimpuls (bei 645 nm) hervorgerufen wird.

Die Beschreibung der relative Änderung der optischen Dichte auf der Grundlage der


52

Ergebnisse der Berechnungen mit Pauli - Master Gleichungen (siehe Kap. 2.2.5.1. auf S. 39) soll im folgenden kurz erklärt werden.

Ausgangspunkt ist das Vorhandensein der drei Populationen für den:

Die Populationen sind in Einheiten cm-3 gegeben. Der (makroskopische) Absorptionskoeffizient lautet: . Dabei ist der Grundzustandsabsorptionsquerschnitt, derjenige für den einfach angeregten Zustand und der Absorptionsquerschnitt für den doppelt angeregten Zustand. Letzterer kann zwar für die Berechnung der Populationsdichten vernachlässigt werden (siehe S. 39), es ist jedoch anzunehmen, daß doppelt angeregte Zustände ebenfalls absorbieren.

Im Falle geringer Intensitäten erhält man den linearen Absorptionskoeffizienten: /<8>. Deshalb ergibt sich für die relative Änderung des Absorptionskoeffizienten:

(F17)

Hierbei ist die relative Besetzung von einfach angeregten und die von doppelt angeregten Zuständen ( ). Es sei darauf hingewiesen, daß aufgrund der Wellenlänge von 645 nm kein Querschnitt für die induzierte Emission in Gl. (F17) berücksichtigt ist (die Fluoreszenz von LHCII bei 645 nm ist marginal).

Gemessene Änderungen der optischen Dichte ( ) entsprechen damit folgenden zeitlich integralen Ausdrücken (siehe Anhang A2 a auf S. 104):

(F18)

wobei d für die Dicke der Probenküvette steht. Abb. 18 zeigt die von Hillmann (1995) bei 645 nm gemessenen Daten zusammen mit einer nach Gl. (F18) berechneten Kurve. Die in Gl. (F17) enthaltenen relativen Besetzungen wurden hierbei den Ergebnissen der obigen Pauli-Master-Gleichungsanalyse entnommen (siehe Abb. 15 auf S. 44).


53

Dabei gilt:

(F19a)

(F19b)

Die in Abb. 18 dargestellte berechnete Kurve ergibt sich, wenn gilt: > (1 ps)-1 und beschreibt die experimentellen Daten gut. Hierbei wurde etwas größer (siehe Bildunterschrift) als gewählt, um die Zunahme der Absorption im Bereich von = 1015 - 1017 (durch Anregungszustandsabsorption) zu beschreiben /<9>.

Abbildung 18
Experimentelle Daten (Fehlerkreuze) der relativen Änderung der optischen Dichte bei 645 nm in solubilisiertem LHCII als Funktion der Laserimpulsintensität (aus Hillmann 1995). Die durchgezogene Linie wurde auf Grundlage der Pauli - Master Gleichungen berechnet (siehe Text). Dabei wurden die Parameter der durchgezogenen Linie von Abb. 15 (S. 44) und folgendes gesetzt: sigma12 = 1.3 _ sigma01; sigma2n = 0.8 _ sigma01 .

Ein identisches Verhalten der intensitätsabhängigen Absorption ergibt sich, wenn man das oben dargestellte ”Cluster-Modell“ zugrunde legt (siehe Kap. 2.2.5.2. auf S. 46) und die in Abb. 17 und 18 enthaltenen Parameter benutzt.

In jedem Fall wird die Abnahme der Absorption bei extrem großen Intensitäten durch die Besetzung doppelt angeregter Zuständen hervorgerufen. Diese hängt zunächst hauptsächlich von der Relaxationsrate ab, wird jedoch durch die Größe von skaliert. Wird vernachlässigt, so findet man genau einen Wert für , mit dem sich die Daten in Abb. 18 anpassen lassen (Schödel et al., 1996). Läßt man einen von Null verschiedenen Wert von zu, gilt dies nicht mehr. Aus diesem


54

Grund soll hier nicht genauer auf weitere Effekte (geringerer Ordnung) eingegangen werden, welche einen Einfluß auf die zu beschreibende Meßgröße besitzen /<10>.

Der in Abb. 18 dargestellte Vergleich zwischen Theorie und Experiment zeigt, daß die aus den Messungen der intensitätsabhängigen Fluoreszenz von solubilisiertem LHCII gewonnenen Ergebnisse konsistent mit dem intensitätsabhängigen Verhalten der (instantan beobachteten) Änderung der optischen Dichte sind.

2.2.6.3. sub-ps-Kinetik von Absorptionsänderungen

Für diese Betrachtung werden die Ergebnisse der sub-ps Pump-Test Messungen an solubilisiertem LHCII von Bittner et al. (1994) benutzt. Betrachtet sei die Wellenlänge der Test-Impulse bei 680 nm. Die Messungen zeigen ein schnelles Abklingverhalten (Abnahme der Absorption), das mit steigender Pump-Intensität zunimmt. Erst danach erfolgte die Relaxation mit der üblichen Zeitkonstante von 4.3 ns (Vasil’ev et al., 1997a).

Die Berechnung von DOD auf der sub-ps Zeitskala auf der Grundlage der Pauli-Master-Gleichungen sei im folgenden kurz beschrieben.

Bei 680 nm muß der Querschnitt für die induzierte Emission, ebenfalls berücksichtigt werden. Deshalb ergibt sich die relative Änderung der optischen Dichte entsprechend der Gleichung (vergleiche obige Gl. (F17) ):

(F20)

Die Berechnung der relativen Besetzungen erfolgte entsprechend Gl. (F19a/b).

Abb. 19 zeigt, daß es möglich ist, Pump-Test-Messungen auf einer sub-ps Zeitskala (insbesondere das Auftreten des schnell relaxierenden Anteiles von DOD bei 680 nm) mit Hilfe der obigen Modelle und den gewonnenen Parametern qualitativ zu beschreiben. Es sei jedoch darauf hingewiesen, daß kohärente Effekte, die in diesem Zeitbereich von Bedeutung sein könnten (Voigt und Redlin, Publikation in Vorbereitung) nicht berücksichtigt wurden.


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Abbildung 19
Berechnung von Absorptionsänderungen bei 680 nm auf einer sub - ps Zeitskala mit Hilfe des Pauli - Master Gleichungs - Formalismus (Gl. 20). Dabei wurden die Parameter der durchgezogenen Linie von Abb. 15 (S. 44) benutzt und sigma12 = 0.7 _ sigma01; sigma2n = 0.5 _ sigma01 ; sigma10 =sigma01 gesetzt . Zugrunde gelegt wurde ein Pump-Impuls von 0.13 ps Länge und verschiedene Pump-Intensitäten entsprechend den experimenellen Bedingungen in Bittner et al. (1994).


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2.3. Schlußfolgerungen für den Energietransfer im LHCII

Der Lichtsammelkomplex des Photosystem II (LHCII) hat die Aufgabe, möglichst viel Licht zu absorbieren und die Energie absorbierter Photonen so effektiv wie möglich zum Reaktionszentrum weiterzugeben. Dies erfordert, daß der Energietransfer so schnell wie möglich stattfindet, da sonst Energieverlustprozesse auftreten (siehe Kap. 1.1.3.3 auf S. 13).

Um Aussagen zum Energietransfer im LHCII zu gewinnen wurden zahlreiche zeitaufgelöste Messungen durchgeführt (siehe S. 16). Diese sollen Aufschluß zum Transfer der Anregungsenergie von Chl b nach Chl a geben. Abgesehen von dem Problem, daß die Chl a - Absorption bei der Pump - Wellenlänge von 645 nm nicht verschwindet (siehe S. 16) ergeben diese Messungen, daß der Chl b rarr Chl a Transfer der Anregungsenergie im sub-ps Zeitbereich erfolgt. Aussagen über Zeitkonstanten des Energietransfers in einem größeren Bereich des LHCII (z. B. innerhalb solubilisierter LHCII Komplexe) können aus diesen Messungen nicht gewonnen werden.

Die im Rahmen dieser Arbeit unter sorgfältiger Beachtung der räumlichen Selektivität erhaltene Abhängigkeit der Fluoreszenz von der Laserimpulsintensität an solubilisiertem LHCII (siehe Kap. 2.2.3. auf S. 34) weist ein sättigbares Verhalten auf. Die Daten lassen sich durch ein Pauli-Master-Gleichungs-Modell beschreiben (siehe Kap. 2.2.5. auf S. 39), wobei die Vernichtung der Anregungszustände unabhängig vom Ort ihrer Erzeugung stattfindet und durch paarweise Wechselwirkung zwischen angeregten Zuständen erfolgt (exciton-exciton-annihilation, siehe Kap. 2.1. auf S. 27).

Zunächst ist festzustellen, daß die beschriebenen Ergebnisse keine direkten Aussagen über eine mögliche Delokalisation der Anregungsenergie über mehrere Pigmente zulassen. Letzteres würde zu einer Erhöhung der Absorptionquerschnitte im Vergleich zu denen einzelner Pigmenten führen. Dieser Fall ist in dem beschriebenen Pauli-Master-Gleichungs-Modell (siehe Kap. 2.2.5. auf S. 39) enthalten: Statt einzelner Pigmente treten Pigmentgruppen mit gemeinsamen Grundzustand (und dessen Absorptionsquerschnitt) auf. Die Zahl aleph entspricht dann nicht mehr der Anzahl von Pigmenten, sondern von Pigmentgruppen pro Komplex. Die über wechselwirkenden (einfach) angeregten Zustände werden durch Absorption von Photonen durch die Pigmentgruppen erzeugt. Das Ergebnis der Beschreibung der Abhängigkeit der Fluoreszenz von führt in diesem Fall jedoch zum gleichen Ergebnis wie die Rechnung für einzelne Pigmente: > (1 ps)-1 und


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=(2.3 ± 0.6) _ 10-15 cm2.

Aus dem Ergebnis für die Rate der dissipativen Wechselwirkungen zwischen (einfach) angeregten Zuständen, > (1 ps)-1, folgt, daß bei Absorption von mehr als einem Photon durch einen solubilisierten Komplex eine sehr schnelle (quasi-instantanen) Vernichtung des zweiten einfach angeregten (Singulett-) Zustandes erfolgt. Wenn man voraussetzt, daß der Vernichtungsprozeß an einem Pigment erfolgt, so lassen sich Rückschlüsse über den Transfer der Anregungsenergie innerhalb des LHCII-Komplexes ziehen. Dieser muß extrem schnell sein, um die quasi-instantane Vernichtung von Anregungszuständen zu ermöglichen. Es muß also gelten: > (1 ps)-1, wobei die Rate für den Transfer der Anregungsenergie innerhalb des solubilisierten LHCII-Komplexes symbolisiert. Aussagen über den Charakter des Energietransfers sind dabei allerdings nicht möglich. Die Bedingungen für einen reinen Förster-Transfer (Förster, 1948) sind aufgrund der geringen Molekülabstände und der deshalb versagenden Punkt-Dipol-Näherung nicht erfüllt (siehe auch Kap. 1.1.3.3. auf S. 13).

> (1 ps)-1 entspricht auch dem alternativen Grenzfall, bei dem der LHCII als Gesamtensemble wirkt. Dies zeigt der Übergang vom Pauli-Master-Gleichungs-Modell zum ”Cluster-Modell“ (siehe Kap. 2.2.5.2. auf S. 46). Die gewonnenen experimentellen Ergebnisse können demnach durch einen Gesamtabsorptionsquerschnitt des LHCII-Komplexes beschrieben werden. Obwohl dies unabhängig davon ist, welche Rolle eine mögliche Delokalisation der Anregungsenergie spielt (siehe oben), belegt es doch den für natürliche Bedingungen günstigsten Fall, nämlich einen sehr effektiven und ultra-schnellen Transfers der Anregungsenergie, der bei Vorhandensein von photochemisch aktiven Pigmenten (Reaktionszentren) die nachfolgenden Reaktionen der Photosynthese in Gang setzt.


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Fußnoten:
<4>

/ Nach dem Erscheinen der Ergebnisse (Schödel et al., 1996) teilte mir Prof. David Mauzerall (Rockefeller University, New York) persönlich seine Freude über das entwickelte Prinzip der räumlichen Selektivität mit.

<5>

/ Die Hinzunahme von zusätzlichen Prozessen sowie Zuständen stellt keine Schwierigkeit dar. Es soll hier jedoch das einfachste Modell für die Beschreibung der Fluoreszenzausbeute von Chl a in Lösung betrachtet werden, um die für diese Meßgröße wesentlichen Prozesse klar hervorzuheben.

<6>

/ Der Index j bleibt hier unbeeinflußt, weil davon ausgegangen wird, daß die über diesen Prozeß aus doppelt angeregten Zuständen gebildeten höher angeregten Zustände sehr schnell relaxieren (siehe S. 39).

<7>

/ Da doppelt angeregte Zustände sehr schnell relaxieren, bleibt deren Besetzungswahrscheinlichkeit sehr gering im Vergleich zu einfach angeregten Zuständen. Deshalb kommt der bimolekularen Wechselwirkungsrate eine untergeordnete Rolle zu (verglichen mit )

<8>

/ Man beachte, daß N eine makroskopische Größe für die Konzentration von Zuständen bezeichnet und deutlich verschieden ist von der mikroskopischen Anzahl aleph von Pigmenten pro Komplex.

<9>

/ Dieser geringe Unterschied zu im Master-Gleichungsmodell angenommenen sigma12 = sigma01 hat praktisch keine Auswirkung auf die relative Besetzung x2 , da letztere hauptsächlich durch die Größe der Rate k21 bestimmt wird.

<10>

/ So wird in Schödel et al. (1996) der Einfluß der Intensitätsabhängigkeit des Absorptionskoeffizienten innerhalb der Probe bei der Beschreibung der Transmission explizit berücksichtigt.


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