Schödel, René: Zur Kinetik von Singulett- und Triplett-Anregungen im Lichtsammelkomplex des Photosystems II höherer Pflanzen (LHCII).

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Kapitel 3. Triplett-Zustände im LHCII

3.1. Einleitung

Besetzte Chlorophyll-Triplett-Zustände (im folgenden Chlorophyll-Tripletts genannt) werden durch intersystem crossing aus angeregten Chlorophyll-Singulett-Zuständen gebildet. Bei Pigmenten in Lösung (z.B. Chl a/b in azetonischer Lösung) folgt dem Aufbau eine sehr langsame Relaxation der Triplett-Population (im ms-Zeitbereich) zurück in den Singulett-Grundzustand. In diesem Fall können Chl-Tripletts als metastabile Zustände angesehen werden. Sie treten besonders dann in Erscheinung, wenn die Moleküle über längere Zeit einer Lichtanregung ausgesetzt sind (cw-Anregung, lange Lichtimpulse). Drastische Triplett-Besetzungen werden ebenfalls beobachtet, wenn hochrepititive kurze Laserimpulse zur Anregung verwendet werden (Geacintov et al., 1978).

Auch bei der Anregung mit kurzen Einzelimpulsen werden Tripletts gebildet. Dies äußert sich in langlebigen Absorptionsänderungen. Um Tripletts von Chl a und Chl b in azetonischer Lösung und in LHCII zu charakterisieren, wurden Absorptionsänderungen als Funktion der Beobachtungswellenlänge untersucht (siehe unten). Die erhaltenen sogenannten Triplett-minus-Singulett-Spektren (T - S-Spektren) von Chl a/b unterscheiden sich drastisch von dem des LHCII. Dafür sind die Karotinoide verantwortlich, denn in LHCII werden Chlorophyll-Triplett-Zustände durch Karotinoide sehr effektiv vernichtet (siehe Kap. 1.1.3.2 auf S. 11). Als Folge des damit verbundenen Triplett-Transfers kommt es zur Bildung von Karotinoid-Tripletts.

Der Triplett-Energietransfer von 3Chl zu Car erfordert eine Austauschwechselwirkung zwischen den Pigmenten (Dexter-Typ-Wechselwirkung). Dafür sind sehr geringe Pigmentabstände erforderlich (siehe Renger, G., 1992; van Grondelle, 1994). In dem von Kühlbrandt et al. (1994) aufgestellten Strukturmodell des LHCII (siehe Kap. 1.1.3.1 auf S. 10) beträgt der geringste Abstand zwischen den beiden Xanthophyllen (die als Luteine identifiziert wurden und eine interne Querverbindung herstellen) und den nächstliegenden Chlorophyllen etwa 4 Å. Deshalb sind die Bedingungen für einen Dexter-Mechanismus des Triplett-Transfer von 3Chl zu Car erfüllt.

Tatsächlich ist die Effizienz der Chlorophyll-Triplett-Vernichtung durch Karotinoide (bei Raumtemperatur) nahezu 100 % (Peterman et al., 1995). Die Rate für den Triplett-Transfer von 3Chl zu Car wurde von Kramer und Mathis (1980)


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abgeschätzt auf (10 ns)-1. Dieser Wert ist mit der Rate der Chlorophyll-Triplett-Bildung durch intersystem crossing vergleichbar und ist um mindestens eine Größenordnung kleiner als im Rahmen dieser Arbeit abgeschätzt wurde (siehe Schödel et al., 1998 und Kap. 3.4. auf S. 73).

Die Relaxation angeregter (Chl-)Singuletts führt zur Besetzung von (Chl- und letztlich Car-)Triplett-Zuständen. Durch Pump-Test-Messungen ist es möglich, die Wechselwirkung der Pump-Impuls-induzierten Tripletts mit den später durch einen schwachen Test-Impuls erzeugten (Chl-)Singuletts zu analysieren. Zahlreiche Untersuchungen an photosynthetischen Proben ergaben, daß (Chl-)Singuletts durch die Wechselwirkung mit Tripletts vernichtet werden (Breton et al., 1979, Breton and Geacintov, 1980, Mathis and Paillotin, 1981, Paillotin et al., 1983b, Kolubajev et al., 1985 und darin enthaltene Zitate)dk7. Die Vernichtung angeregter (Chl-)Singuletts äußert sich durch die Verringerung der Fluoreszenzausbeute des Test-Impulses, d.h. eine Fluoreszenz-Löschung.

Es ist üblich (z.B. Breton et al., 1979), Triplett-Effekte durch einen langen spektral breiten Test-Impuls zu analysieren, der einem kurzen Pump-Impuls folgt. Im allgemeinen finden dazu Blitzlampen Verwendung, die ms-Impulse liefern. Durch Variation des Beobachtungszeitfensters (Boxcar-Technik) bzw. durch oszillographische Aufzeichnung ist es dann möglich, Absorptionsänderungen in dem durch den Test-Impuls überdeckten Zeitbereich zu beobachten. Dies hat den Vorteil, daß es prinzipiell möglich ist, aus einem einzigen dem Pump-Impuls folgenden ms-Test-Impuls alle nötigen zeitlichen Informationen zu erhalten. Ein großer Nachteil dieser Methode besteht jedoch darin, daß die integrale Intensität des Test-Impulses relativ groß gewählt werden muß, um geringe Absorptionsänderungen zu definierten Zeiten nachzuweisen. Ein Einfluß des Test-Impulses auf die zu beobachtenden Absorptionsänderungen kann damit nicht vollständig ausgeschlossen werden.

Im Rahmen dieser Arbeit wird die Fluoreszenz-Löschung, d. h. die Pump-Impuls-induzierte Verringerung der Fluoreszenzquantenausbeute von solubilisiertem LHCII, auf einer µs-Zeitskala untersucht (siehe Kap. 3.5. auf S. 83). Es wurde ein grundsätzlich anderer Weg beschritten, um sowohl die Fluoreszenz-Löschung als auch zeitabhängige Absorptionsänderungen zu analysieren. Anstelle eines zeitlich und spektral breiten Blitzlampen-Test-Impulses wurde ein zeitlich definierter und spektral schmaler ns-Laser-Impuls verwendet (siehe unten). Die durch diesen schwachen Impuls erzeugte zeitlich integrale Fluoreszenz wurde benutzt, um die Wechselwirkung der Pump-Impuls-induzierten Tripletts mit den später durch einen Test-Impuls erzeugten (Chl-)Singuletts zu untersuchen. Hervorgehoben sei an dieser Stelle, daß die im Rahmen dieser Arbeit entwickelte räumlich selektive Messung der Test-Fluoreszenz (siehe Kap. 2.2.1. auf S. 31) die Grundvoraussetzung für aussagekräftige Meßdaten darstellte.


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3.2. Eigenschaften von Chlorophyll-Tripletts in organischem Lösungsmittel und in vitro

3.2.1. Experimenteller Aufbau zur Charakterisierung von Triplett-Zuständen

Abb. 20 stellt den experimentellen Aufbau dar. Als Test-Impuls steht ein kurzer Laser-Impuls zur Verfügung. Da sich die zeitliche Position des Test-Impulses (bzgl. des Pump-Impulses) beliebig verschieben läßt, kann die Pump-Impuls-induzierte Absorptionsänderung in einem ausgedehnten Zeitbereich spektral schmal und variabel ”getestet“ werden. Die integrale Intensität des Test-Impulses ist dabei sehr gering (ca. 1012 ).

Es wurden zwei prinzipiell selbständige Lasersysteme verwendet. Als Pump-Laser diente der in Tab. 1 (S. 19) aufgeführte Nd3+-YAG-Laser gepumpte Farbstoff-Laser. Dieser wurde bei einer Wellenlänge von 645 nm betrieben. Ein bezüglich des Pump-Impulses definiertes Trigger-Signal wurde benutzt, um das Test-Laser-System zu starten. Letzteres besteht aus einem N2-Laser gepumpten Farbstoff-Laser (siehe Tab. 1), dessen Wellenlänge im Bereich 400 - 700 nm variiert wurde (Verwendung der Laser-Farbstoffe Stilben 3, Coumarin 2, Coumari 307, Rhodamin 6G, DCM (Lambda Physik) und Pyridin). Die Impulsdauer beider Laser (Pump- und Test-) ist etwa gleich (ca. 2 ns).

Abbildung 20
Schematische Darstellung des Meßaufbaus zur Charakterisierung von Tripletts

Um die Zeit zwischen Pump- und Test-Impuls einzustellen, wurde das Trigger-Signal definiert verzögert. Dazu diente eine programmierbare elektronische Verzögerungseinheit.


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Das Beobachtungszeitfenster (des BCI 280) für die Auswertung des elektronischen Signals (Transmission) wurde mit dem Test-Laser synchronisiert. Die Art der Detektoren sowie die Auswerteelektronik ist in Kap. 1.3.5 auf S. 25 beschrieben.

Die Erzeugung definierter Pump-Impuls-Intensitäten in einer stabilisieren Probenebene erfolgte entsprechend den Beschreibungen der Kap 1.3.2 und 1.3.3 (S. 20 und S. 22). Die Kenntnis der jeweils verwendeten Filterkombination ermöglichte die Bestimmung der Intensität vor der Probe. Die Ausblendung Pumpstrahl-bedingter Einflüsse am Test-Detektor, die nicht auf Absorptionsänderungen in der Probe zurückzuführen sind, wurde entsprechend den Erläuterungen in Kap. 1.3.4 (S. 23) vorgenommen.

Die Änderung der Transmission der Probe wirkt sich auf die Intensität des transmittierten Test-Impulses aus. Die relative Transmission ist gegeben durch: . Dabei ist die Intensität des transmittierten Teststrahls, die in Abwesenheit des Pump-Impulses den Wert annimmt.

Experimentell wurde die relative Transmission bestimmt aus:

(T1)

Dabei kennzeichnet S das Signal am Test-Detektor (siehe Abb. 20) und die Pfeile den Zustand der Verschlüsse 1 und 2 (Pump : Verschluß 1 auf/zu; Test : Verschluß 2 auf/zu).

Gl. (T1) liefert wegen die für die Auswertung anschaulicheren Werte für die Änderung der optischen Dichte der Probe:

(T2)

Der hier beschriebene Meßaufbau wurde im wesentlichen für die Messung von DOD als Funktion der Test-Wellenlänge (T - S-Spektren; Kap. 3.2.2. und 3.2.3. ) bzw. Pump-Impuls-Intensität (Kap. 3.3.2. ) bei konstanter Verzögerungszeit sowie von DOD als Funktion der Verzögerungszeit im sub-µs und µs-Bereich (Kap. 3.2.4. und 3.3.1. ) verwendet.

Um die Kinetik der Karotinoid-Triplett-Bildung bzw. den Einfluß der gebildeten Tripletts auf die Fluoreszenz (Kap. 3.4. bzw. 3.5. ) zu untersuchen, wurden Erweiterungen vorgenommen, die in den entsprechenden Unterkapiteln beschrieben sind (siehe Kap. 3.4.1. auf S. 73 und Kap. 3.5.1. auf S. 83).


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3.2.2. T - S-Spektren von Chl a und Chl b in azetonischer Lösung

Die folgenden Messungen an Chl a und Chl b in Lösung wurden durchgeführt, um Aussagen über Triplett-Absorptionsquerschnitte zu gewinnen, die in Kap. 3.4.3. (S. 77) benötigt werden und um den Unterschied zum LHCII (siehe Kap. 3.2.3. ) zu verdeutlichen. Mit dem beschriebenen Meßaufbau ergaben sich die in Abb. 21 dargestellten T - S-Spektren (DOD) von Chl a/b. Diese spiegeln offensichtlich das spektrale Verhalten der Grundzustands-Absorption (OD0) wider. Daher treten die gebildeten Chlorophyll-Tripletts hauptsächlich indirekt durch die Entleerung der Chlorophyll-Grundzustands-Besetzung in Erscheinung. Eine ausgeprägte spektrale Charakteristik der Triplett-Absorption ist daher nicht zu erwarten.

Abbildung 21
Pump-Impuls induzierte Änderung der optischen Dichte (DOD) gemessen nach 50 ns an Chl a (A) und Chl b (B) in 80 % azetonischer Lösung. Zum Vergleich sind die entsprechenden Absorptionsspektren (OD0) dargestellt.
Pump-Intensität: ca. 1017 Photonen cm-2 Impuls-1 bei 645 nm

Dies wird im folgenden explizit anhand von Absorptionsquerschnitten gezeigt:

Die Extinktionskoeffizienten (für den Grundzustand) von Chl a/b in wässrig-azetonischer Lösung wurden von Porra et al. (1989) bestimmt:

Chl a: epsilon(663,6)=76.79 mM-1 cm-1 ; Chl b: epsilon(646,6)=47.04 mM-1 cm-1

Durch die Beziehung (NA, Avogadro-Konstante) ergeben sich die Grundzustands-Absorptionsquerschnitte bei den entsprechenden Wellenlängen:

Chl a: <SPAN CLASS=@@>(</SPAN> 663,6) = 2.94 _ 10-16cm2 ; Chl b: (646,6) = 1.8 _ 10-16cm2

Die Kenntnis dieser Werte erlaubt die Berechnung der Spektren für die Grundzustands-Absorptionsquerschnitte von Chl a und Chl b aus dem Absorptionsspektrum (OD0(lambda) ) in azetonischer Lösung. Diese sind in Abb. 22 als gestrichelte Linien eingezeichnet.

Der Chlorophyll-Triplett-Absorptionsquerschnitt, , läßt sich ebenfalls berechnen. Er ergibt sich aus sowie der relativen Änderung der optischen


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Dichte . Da 50 ns nach dem Pump-Impuls jegliche Chl-Singulett Besetzung relaxiert ist, ist der Absorptionskoeffizient durch folgenden Ausdruck gegeben: (N: Gesamt -Chl (a/b)-Konzentration, : Population von Chl (a/b)- Triplett-Zuständen). Wegen , und ergibt sich:

(T3)

Die relative Triplett-Besetzung ( ) kann mit Gl. (T12) (siehe S. 76) berechnet werden. Bei der verwendeten Pump-Intensität ergeben sich die Werte 0.41 (Chl a) und 0.57 (Chl b). Die durchgezogenen Linien in Abb. 22 stellen die nach Gl. (T3) berechneten spektralen Verläufe von dar.

Abbildung 22
Darstellung der nach Gl. (T3) berechneten Absorptionsquerschnitte der Triplett-Zustände von Chl a (A) und Chl b (B) (durchgezogene Linien). Zum Vergleich sind die Grundzustands-Absorptionsquerschnitte eingezeichnet (gestrichelte Linien).

Sowohl für Chl a (Abb. 22A) als auch für Chl b (Abb. 22B) ist zu erkennen, daß das Absorptionsverhalten der entsprechenden Tripletts bezüglich der Wellenlänge wie erwartet sehr unstrukturiert ist. Der Fehler von hängt sehr stark von einer Verstimmung der lambda - Achse von DOD bezüglich derer von OD0 ab. Schon eine sehr geringe Verstimmung Dlambda führt zu scheinbar ausgeprägten Banden von wie sie von Shepanski et al. (1984) aus Meßdaten berechnet wurden.

3.2.3. Das T - S-Spektrum von solubilisiertem LHCII

Abb. 23 zeigt die durch den Pumpstrahl hervorgerufene Änderung der optischen Dichte gemessen nach 50 ns. Die Fluoreszenz-Lebensdauer des verwendeten LHCII beträgt 4.3 ns (Vasil’ev et al., 1997b). Deshalb enthält das DOD -Spektrum nach 50 ns (wie im Fall von Chl a/b in Lösung) keine Beiträge, die auf Pump-Impuls-induzierte Singuletts zurückzuführen sind. Die durchgezogene Linie in Abb. 23 kann darum als T - S-Spektrum verstanden werden.


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Abbildung 23
Pump-Impuls induzierte Änderung der optischen Dichte (DOD) gemessen nach 50 ns an solubilisiertem LHCII (durchgezogene Linie). Zum Vergleich ist das Absorptionsspektren (OD0) des verwendeten LHCII dargestellt.
Pump-Intensität: ca. 1017 Photonen cm-2 Impuls-1 bei 645 nm

Die Form des in Abb. 23 dargestellten T - S-Spektrums von LHCII ist nahezu identisch mit den von Nechushtai et al. (1988) und Peterman et al. (1995) bestimmten Spektren. Im Vergleich mit Chlorophyll in Lösung (siehe Kap. 3.2.2. auf S. 63) weist es eine völlig andere spektrale Charakteristik auf. Das ausgeprägte Maximum bei ca. 507 nm ist auf die Absorption gebildeter Karotinoid-Tripletts zurückzuführen. Bis auf das geringe Ausbleichen im Qy-Bereich (um 675 nm) ist das Spektrums von LHCII typisch für ein T - S-Spektrum von Karotinoiden.

Deshalb kann der Wert von DOD bei 507 nm als Maß für die Besetzung von Karotinoid-Triplett-Zuständen (3Car) angesehen werden. Dies ermöglicht es, den Einfluß experimenteller Parameter auf die 3Car-Besetzung zu untersuchen. So wird im folgenden Kapitel die Verzögerungszeit zwischen Pump- und Test-Impuls variiert, um Aussagen über die Lebensdauer der 3Car- Besetzung in dem verwendeten LHCII zu gewinnen.

3.2.4. Relaxation von Karotinoid-Tripletts in solubilisiertem LHCII

Die Lebensdauer von Karotinoid-Tripletts ist abhängig von der Sauerstoffkonzentration in der Probe. Um dies an dem verwendeten solubilisiertem LHCII zu untersuchen, wurden Messungen der Relaxationskinetik von DOD bei 507 und 530 nm unter verschiedenen Bedingungen durchgeführt.


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Abb. 24 zeigt Kurven in Sauerstoff-freien und Luft-gesättigten Proben. In beiden Fällen ist die Relaxation unabhängig von der Test-Wellenlänge. Ein Wert von 9 µs für den Abbau von 3Car in Sauerstoff-freier Probe ist in guter Übereinstimmung mit Ergebnissen von Peterman et al. (1995) und Siefermann-Harms und Angerhofer (1995, 1998).

Abbildung 24
Pump-Impuls-induzierte Absorptionsänderungen bei 507 nm (links) und 530 nm (rechts) als Funktion der Verzögerungszeit zwischen Pump- und Test-Impuls in solubilisiertem LHCII unter Sauerstoff-freien (oben) und Luft-gesättigten Bedingungen (unten). Die durchgezogenen Linien zeigen mono-exponentielle Anpassungen mit entsprechender Lebensdauer.

Unterschiede existieren bezüglich der Werte, die unter Luft-gesättigten Bedingungen gemessen wurden. Dem mono-exponentiellen Abklingen mit ca. 2 µs (Abb. 24 unten) steht das Ergebnis von Peterman et al. (1995) gegenüber, wo ein bi-exponentielles Verhalten mit tau1 = 2 µs und tau2 = 4 µs gefunden wurde, das von der Test-Wellenlänge abhängt (tau1 dominiert bei 505 nm und tau2 bei 528 nm). Eine noch langsamere Relaxation in Luft-gesättigter Probe wurde von Siefermann-Harms und Angerhofer (1995, 1998) gemessen. Werte von 7 µs wurden erst durch die Zugabe von Fettsäure auf ca. 4 µs reduziert /<11>.

Die genannten Differenzen in der Relaxationskinetik unter Luft-gesättigten Bedingungen sind höchstwahrscheinlich auf Unterschiede in Bezug auf die Zugänglichkeit von Sauerstoff zurückzuführen, die von der jeweiligen Proben-Isolation abhängen kann (Proben-Heterogenität).


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3.3. Der Einfluß der Pump-Intensität auf die Karotinoid-Triplett-Besetzung in solubilisiertem LHCII

3.3.1. Die Relaxation von Karotinoid-Tripletts bei verschiedenen Pump-Impuls-Intensitäten

Abb. 25 zeigt, daß die Pump-Impuls-Intensität keinen Einfluß auf die Relaxation der Pump-Impuls-induzierten Änderung der optischen Dichte bei 507 nm und damit der Karotinoid-Tripletts ausübt. Die Lebensdauer letzterer (in einer weder Luft-gesättigten noch Sauerstoff-freien Probe) bleibt unverändert etwa 4.3 µs.

Abbildung 25
Normierte Relaxationskinetik von DOD bei 507 nm bei verschiedenen Pump-Impuls-Intensitäten.

Dieses Ergebnis führt zu der Schlußfolgerung, daß es innerhalb der solubilisierten LHCII Komplexe selbst bei extrem hohen Intensitäten keine destruktive Wechselwirkung zwischen Karotinoid-Tripletts gibt. Anderenfalls müßte man bei Erhöhung von ein nichtexponentielles Abklingverhalten der 3Car-Population beobachten.

Die absolute Besetzung von 3Car steigt jedoch mit zunehmender Pump-Intensität drastisch an. Diese Beobachtung soll im folgenden Kapitel ausführlich untersucht werden.


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3.3.2. Die Karotinoid-Triplett-Besetzung als Funktion der Pump-Intensität

Bei diesen Messungen wurde die Änderung der optischen Dichte bei 507 nm und konstanter Verzögerung von 50 ns als Funktion der Pump-Intensität untersucht. Diese Zeit ist lang genug, um zu erreichen, daß die Triplett-Bildung in LHCII abgeschlossen ist und daß der Einfluß angeregter Chlorophyll-Singuletts vernachlässigt werden kann. Andererseits sind 50 ns Verzögerungszeit kurz genug, um Relaxationseffekte der gebildeten Karotinoid-Tripletts ausschließen zu können (siehe Kap. 3.2.4. auf S. 65).

Abbildung 26
DOD/OD0 bei 507 nm und 50 ns Verzögerung zwischen Pump- und Testimpuls als Funktion der Pump-Intensität in solubilisiertem LHCII.
Die Fehlerkreuze stellen die gemessenen Daten dar. Bei der durchgezogenen Linie wurde der Effekt abnehmender Pump-Intensität innerhalb der Probe eliminiert (siehe Text).

Abb. 26 zeigt die experimentellen Daten der relativen Änderung der optischen Dichte, , bei 507 nm als Funktion von (Fehlerkreuze). Die dargestellten Daten wurden an einer 1 mm Proben-Küvette gemessen. Die Absorption der Probe bei der Pump-Impuls-Wellenlänge von 645 nm führt dazu, daß die Pump-Intensität beim Durchgang durch die Probe auf ca. 36 % absinkt. Deshalb beziehen sich die Fehlerkreuze in Abb. 26 und damit die Besetzung von 3Car auf eine mittlere Pump-Impuls-Intensität innerhalb der Probe. Um eine genauere Zuordnung von DOD zu einer definierten Pump-Intensität zu bekommen, wurde dieser Mittelungs-Effekt eliminiert. Dies ist im Anhang A3 auf S. 105 beschrieben. Die durchgezogene Linie in Abb. 26 stellt das Ergebnis dieser Berechnung dar.

Sogar bei extrem hohen Pump-Intensitäten ist keine Sättigung der Karotinoid-Triplett-Besetzung zu beobachten. Es stellt sich die Frage, warum dies so ist und auf


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welchem Wege Tripletts in LHCII bei hohen Pump-Intensitäten gebildet werden. Dem ist das folgende Kapitel gewidmet.

3.3.2.1. Wege der Karotinoid-Triplett-Bildung in solubilisiertem LHCII bei hohen Pump-Intensitäten

Im folgenden soll von zwei Voraussetzungen ausgegangen werden:

  1. Bei der Pump-Impuls-Wellenlänge von 645 nm erfolgt die Bildung von Karotinoid-Triplett-Zuständen ausschließlich durch Triplett-Transfer aus Chlorophyll-Tripletts, die wiederum aus angeregten Chlorophyll-Singuletts hervorgehen.
  2. Die Änderung der optischen Dichte bei 507 nm ist ein lineares Maß für die Besetzung von Karotinoid-Triplett-Zuständen in LHCII.

Die erste Voraussetzung ist deshalb erfüllt, weil Karotinoid-Grundzustände nicht zur Absorption bei 645 nm beitragen.

Die zweite Annahme wird dadurch bewiesen, daß die Relaxation von Karotinoid-Tripletts nicht von der Pump-Impuls-Intensität abhängt (siehe Kap. 3.3.1. auf S. 67).

Deshalb kann die relative Besetzung von Karotinoid-Tripletts , , aus der relativen Änderung der optischen Dichte bei 507 nm bestimmt werden. Wie ausführlich in Anhang A4 auf S. 106 beschrieben, ergibt sich:

(T4)

Zur Berechnung von müssen in Gl. (T4) die hinsichtlich der inhomogenen -Verteilung korrigierten Daten von Abb. 26 (durchgezogene Linie) verwendet werden.

Geht man davon aus, daß Karotinoid-Tripletts ausschließlich aus Chlorophyll-Tripletts gebildet werden, die aus einfach angeregten Chlorophyll-Singuletts hervorgehen, was bei geringen Pump-Impuls-Intensitäten mit Sicherheit der Fall ist, so erhält man folgenden Ausdruck (siehe Anhang A9 auf S. 110):

(T5)

wobei die relative Besetzung einfach angeregter Chlorophyll-Singuletts zum Zeitpunkt t’ und bei der Pump-Intensität darstellt.

Das in Gl. (T5) enthaltene Integral ist durch die folgende unabhängige Meßgröße gegeben: die zeitlich integrale Pump-Fluoreszenz . Denn diese wird ausschließlich durch Relaxation einfach angeregter Chlorophyll-Singuletts in den Grundzustand hervorgerufen (siehe Kap. 2.2.3.2. auf S. 35). Zum Zeitpunkt t = 50 ns


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ist dieser Vorgang vollständig abgeschlossen, da die Lebensdauer der Population in solubilisiertem LHCII etwa 4.3 ns beträgt (Vasil’ev et al., 1997b). Deshalb gilt:

(T6)

Die Gegenüberstellung der experimentellen Ergebnisse (siehe Kap. 2.2.3. auf S. 34) und (siehe Gl. (T4) ) erlaubt es demnach, zu prüfen, ob Gl. (T5) erfüllt ist.

Abbildung 27
Doppelt logarithmische Darstellung der relativen Karotinoid-Triplett-Besetzung nach Gl. (T4) (durchgezogene Linie; entspricht durchgezogener Linie von Abb. 26) und der integralen Pump-Fluoreszenz (gestrichelte Linie, dargestellt ist eine kontinuierliche Funktion berechnet aus den Datenpunkten von Abb. 15 auf S. 44) als Funktion der Pump-Impuls-Intensität. Letztere wurden mit einem konstanten Faktor skaliert, um die Übereinstimmung bei geringen Pump-Intensitäten zu verdeutlichen.

Abb. 27 zeigt, daß bei geringen Pump-Intensitäten von <sub> </sub> < 1015 eine gute Übereinstimmung der Abhängigkeiten von und , gegeben ist. Für < 1014 sind beide Größen proportional zur Pump-Intensität (optisch lineares Bereich).

Bei höheren Pump-Intensitäten wird eine Abweichung und deutlich. Im Gegensatz zu dem sättigenden Verhalten der Pump-Fluoreszenz nimmt die Besetzung von Karotinoid-Tripletts kontinuierlich zu. Für > 1015 ist demnach Gl. (T5) nicht erfüllt.

Es sind zwei Interpretationen für den zusätzlichen Weg der Karotinoid-Triplett-


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Bildung bei hohen Pump-Impuls-Intensitäten denkbar: i) Die paarweise Auslöschung von angeregten Chlorophyll-Singuletts (singlet-singlet-annihilation) könnte zu einem bestimmten Teil Chlorophyll-Tripletts hervorbringen, die schließlich zur Bildung von 3Car führen. ii) Ergebnisse der Messungen der intensitätsabhängigen Transmission von solubilisiertem LHCII weisen darauf hin, daß es bei hohen zu einer nennenswerten Population von doppelt angeregten Chlorophyll-Singulett-Zuständen kommt (siehe Kap. 2.2.6.2. auf S. 51). Im folgenden wird deshalb angenommen, daß ein Teil dieser Zustände in einen Chlorophyll-Triplett-Zustand relaxiert. Dieser Mechanismus wurde kürzlich an Zn-Phtalozyaninen beobachtet (Rückmann et al., 1997). Obwohl es sich dabei um ein unterschiedliches System handelt, könnte dies auch im LHCII eine Rolle spielen. Die zusätzlich erzeugten Chlorophyll-Tripletts tragen letztlich zur Erzeugung von Karotinoid-Tripletts bei. Die Population liefert jedoch keinen Beitrag zur Fluoreszenz .

Es ergibt sich folgendes Ratengleichungssystem:

(T7a)

(T7b)

wobei die Relaxation von Tripletts in den Grundzustand weggelassen wurde (t le 50 ns). Die relative Besetzung von Chlorophyll-Tripletts, , ist selbst bei sehr hohen nahezu Null. Wäre das nicht der Fall, dann würde DOD/OD0 bei 675 nm nicht verschwindend klein bleiben (siehe Abb. 23 auf S. 65 und Abb. 37 auf S. 89). Deshalb gilt für Gl. (T7a) die quasi-stationäre Näherung, woraus folgt:

(T8)

Aus Gl. (T8) und Gl. (T6) ergibt sich:

(T9)

wobei D eine willkürliche Konstante und C der Skalierungsfaktor zwischen und ist, der in Abb. 27 gewählt wurde, um eine Übereinstimmung für geringe Pump-Impuls-Intensitäten zu bekommen (Verschiebung der -Kurve entlang der logarithmischen Y-Achse von Abb. 27).

Die in Gl. (T9) enthaltenen Terme sind in Abb. 28 als Funktion der Pump-Intensität aufgetragen.


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Abbildung 28
Einfach logarithmische Darstellung von (durchgezogene Linie, identisch mit durchgezogener Linie von Abb. 27), die skalierte Pump-Fluoreszenz (gestrichelte Linie, identisch mit gestrichelter Linie von Abb. 27) und die Differenz aus beiden (gepunktete Linie, siehe Gl. (T9) ).

Abb. 28 zeigt deutlich, daß die integrale Besetzung der angenommenen nichtstrahlenden doppelt angeregter Chlorophyll-Singuletts kontinuierlich zunimmt (gepunktete Linie).


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3.4. Untersuchungen zur ns-Kinetik der Karotinoid-Triplett-Bildung im LHCII

Entsprechend den Ergebnissen der vorangegangenen Kapitel zeigt das 50 ns nach dem Pump-Impuls gemessene T - S-Spektrum von solubilisiertem LHCII, daß Karotinoid-Triplett Zustände erzeugt wurden (siehe Kap. 3.1. auf S. 59). Dabei kann man davon ausgehen, daß diese indirekt über Chl-Tripletts entstehen. Da DOD als Funktion der Verzögerungszeit eindeutig die Relaxation von 3Car reflektiert, kann man davon ausgehen, daß der Triplett-Transfer von 3Chl zu Car zu diesem Zeitpunkt vollständig abgeschlossen ist.

Mit dem in Abb. 20 (S. 61) dargestellten Meßaufbau ist es nicht möglich, die Generierung der 3Car Besetzung zeitlich aufzulösen, da die Fremd-Triggerung des Test-Lasers und die elektronisch erzeugte Verzögerung ein zeitliches Jitter von ca. ± 20 ns zwischen Pump- und Test-Impuls hervorruft.

Deshalb mußte ein Meßaufbau realisiert werden, bei dem der zeitliche Verlauf von Pump- und Test-Impuls sich lediglich durch eine wohl definierte zeitliche Verschiebung unterscheidet. Dieser Aufbau ist im folgenden Kapitel beschrieben.

3.4.1. Meßaufbau mit optischer Verzögerung

Abb. 29 zeigt die geometrische Anordnung des Meßaufbaus mit optischer Verzögerung. Dabei dient der N2-Laser mit integriertem Farbstoff-Laser (Tab. 1 auf S. 19) sowohl als Pump- als auch Test-Laser. Kernstücke sind die Strahlteiler 1 und 2 sowie der Retroreflektor mit variabler Position entlang der optischen Achse. Die Schwierigkeit bestand darin, dafür zu sorgen, daß die Lage und Position des Teststrahles völlig unabhängig vom Ort des Retroreflektors ist. Voraussetzung dafür war zunächst die Qualität des Teststrahls selbst. Dessen Divergenz war sehr gering /<12>, außerdem war dafür Sorge zu tragen, daß der Teststrahl auf unendlich ”fokussiert“ ist. Um dies zu erreichen, wurde ein Teleskop verwendet.


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Abbildung 29
Meßaufbau für Pump- Test Messung der Transmission mit optischer Zeitverzögerung des Test-Impulses

Die Bewegungsrichtung des Retroreflektors wurde mit der des Teststrahles genau in Übereinstimmung gebracht. Auf diese Weise gelang es, das Bild des Teststrahls in der Probenebene auf einem ca. 10 m langen ”Weg“ des Retroreflektors zu erreichen. Dies entspricht einer Verzögerungszeit von t = 30 ns. Der Zeitpunkt t = 0 ns wurde zunächst aus dem Vergleich der Lichtwege von Pump- und Teststrahl ermittelt.

Die prinzipielle Vorgehensweise bei der Pump-Test-Messung ist in Kap. 3.2.1. auf S. 61. beschrieben.

3.4.2. Messungen an Chl b in Lösung zur Bestimmung der Apparatefunktion

Um das zeitliche Verhalten des experimentellen Aufbaus (Abb. 29) zu untersuchen, war ein Modell-System nötig: Als solches wurde Chl b in 80% azetonischer Lösung gewählt, da es bei einer Wellenlänge von 460 nm ein starkes Ausbleichen des Grundzustandes aufweist (siehe Abb. 21B auf S. 63), das nur sehr wenig von der Anregungszustandsabsorption gebildeter (angeregter) Singuletts sowie Tripletts abgeschwächt wird (siehe quantitative Abschätzung auf S. 75).

Es wurden Messungen der Pump-Impuls-induzierten Absorptionsänderung bei 460 nm als Funktion der Verzögerungszeit zwischen Pump- und Test-Impuls durchgeführt.

Abb. 30 zeigt die experimentellen Daten für die Pump-Impuls-induzierte Absorptionsänderung DOD(460 nm, t ) als Funktion der Verzögerungszeit zwischen Pump- und Test-Impuls.


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Abbildung 30
Pump-Impuls-induzierte Absorptionsänderungen bei 460 nm von Chl b in Lösung als Funktion der optischen Verzögerungszeit zwischen Pump- und Test-Impuls. Die durchgezogene Linie stellt eine berechnete Modellkurve für DOD(t ) bei Verwendung des (gestrichelt) dargestellten zeitlichen Verlaufes des Pump-Impulses dar (siehe Text).

Vernachlässigt man die Besetzung höherer Singulett-Zustände (geringe Pump-Intensität, schnelle Relaxation höherer Singuletts), so ergibt sich der Absorptionskoeffizient aus:

(T10)

wobei ni für die Besetzungszahldichte (in cm-3) des ersten angeregten Singulett-Zustandes (i = 1) und des Triplett-Zustandes (i = T) von Chl b steht. , und <SPAN CLASS=@@> </SPAN> sind die Absorptionsquerschnitte des Grund-, ersten angeregten Singulett- und des Triplett-Zustandes. Die Pump-Impuls-induzierten Änderungen von sind durch gegeben, wobei für den linearen Absorptionskoeffizienten steht. Deshalb kann durch folgende Gleichung beschrieben werden:

(T11)

Der Betrag von bei 460 nm ist nach Abb. 22 (S. 64) bekannt und damit etwa um einen Faktor fünf kleiner als bei der gleichen Wellenlänge.

Der Absorptionsquerschnitt kann aus Messungen bei t = 0 abgeschätzt werden (nicht gezeigt): Da zu diesem Zeitpunkt die Relaxation in den Triplett-Zustand nur zu einem geringen Teil erfolgt ist, kann davon ausgegangen werden, daß wesentlich größer als ist und daß dadurch durch den Term dominiert wird. Deshalb erhält man das Verhältnis aus wobei entsprechend Gl. (T12a, b) berechnet wird (siehe unten). Setzt man , dann ergibt sich,


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daß ungefähr 0.1 ist (obere Grenze: 0.3). Basierend auf diesem Ergebnis sowie ap 0.2 (siehe oben) bei 460 nm, wurde nach Gl. (T11) berechnet. Da die abgeschätzten Werte für und deutlich kleiner sind als , spielt die Anregungszustandsabsorption und Triplett-Absorption eine untergeordnete Rolle. Deshalb kann die gemessene zeitliche Abnahme der optischen Dichte bei 460 nm als fortschreitende Grundzustandsentleerung verstanden werden.

Die Bildung einfach angeregter Singuletts und Tripletts in Chl b wird durch folgende Gleichung beschrieben:

(T12a)

(T12b)

wobei k die reziproke Lebensdauer von Chl b Singuletts darstellt, die in azetonischer Lösung etwa 3 ns beträgt (Pfarrherr et al. 1991). Zusammen mit einer Triplett-Ausbeute von 88% für Chl b in vitro (Bowers and Porter 1967) ergibt sich die Rate für intersystem crossing zu kISC = (3.4 ns)-1. ist der zeitliche Verlauf des Pump-Impulses entsprechend Gl. (E2) auf S. 20. Ein Einfluß des Test-Impulses auf die Zustandsbesetzungen kann aufgrund dessen geringer Intensität vernachlässigt werden (siehe Kap. 3.2.1. auf S. 61).

Um den zeitlichen Verlauf der gemessenen Änderung der optischen Dichte, DODMeß, zu beschreiben, ist es notwendig, das Profil der ns-Impulse, , explizit zu berücksichtigen (siehe Anhang A2 auf S. 104) :

(T13)

Bei der Anpassung der Meßdaten wurde eine zusätzliche willkürliche zeitliche Verschiebung delta bezüglich der geometrisch bestimmten Zeitachse zugelassen. Für den besten Fit (durchgezogene Linie von Abb. 30) ergab sich: delta = -0.2 ns. Diese geringe Abweichung entspricht einem Fehler von lediglich ca. 8 cm Lichtwegdifferenz zwischen Pump- und Test-Impuls. Um die Anpass-Prozedur zu testen, wurde ebenfalls die Breite des Gauß-Impulses variiert. Für den besten Fit ergab sich Delta = 1.1 ns, was mit dem unabhängig ermittelten Wert übereinstimmt (siehe S. 20).

Die zeitliche Entwicklung der angeregten Singulett- und Triplett-Zustände bestimmt gemeinsam die beobachtete Entleerung von Chl b Grundzuständen. Dies ist in Anhang A4 auf S. 108 illustriert. Abb. 40 zeigt (siehe S. 108), daß die normierte Kinetik der Chl b - Triplett- Besetzung verzögert ist zur gemessenen Grundzustandsentleerung, da letztere zunächst (bei ) durch die gebildeten angeregten Singuletts verursacht wird.


77

Das in diesem Abschnitt bestimmte Verhalten von Chl b in azetonischer Lösung entspricht dem von dieser Modellsubstanz erwarteten zeitlichem Verhalten, das überwiegend durch Grundzustandsentleerung geprägt ist und damit in etwa einer zeitlichen Integration über den Pump-Impuls entspricht.

3.4.3. Messungen mit optischer Verzögerung an solubilisiertem LHCII, kinetische Beschreibung und Diskussion

Die Messungen wurden bei der Wellenlänge von 507 nm durchgeführt, wo das T-S- Spektrum der Karotinoide ein deutliches Maximum aufweist (siehe Abb. 23 auf S. 65). Basierend auf den obigen Messungen an Chl b in Lösung müssen die Daten um den Wert delta = -0.2 ns verschoben werden.

Um Sättigungseffekte zu minimieren, wurde die Pump-Intensität so gering wie möglich gehalten. Eine Intensität von 1015 war jedoch nötig, um ein akzeptables Signal-Rauschverhältnis zu erhalten. Auf den (geringen) Einfluß nichtlinearer Effekte auf die Bildung von Karotinoid-Tripletts wird weiter unten eingegangen.

Abbildung 31
bei 507 nm als Funktion der Verzögerungszeit zwischen Pump- (1015 Photonen cm-2 Impuls-1) und Test-Impuls in solubilisiertem LHCII (Datenkreuze). Die gestrichelte Linie zeigt die an der Zeitachse gespiegelte Chl b Kurve (siehe Abb. 30). Die Punkte stellen Werte dar, die bei einer Wellenlänge von 550 nm und gleicher Dichte absorbierter Photonen gemessen wurden.

Abb. 31 zeigt den zeitlichen Verlauf von DOD bei 507 nm. Zum Vergleich ist das (an der Zeitachse gespiegelte) Verhalten von Chl b in Lösung eingezeichnet (vergleiche Abb. 30). Der zeitliche Aufbau von DOD bei 507 nm in LHCII ist damit deutlich langsamer als die Apparatefunktion.


78

Um das gemessene zeitliche Verhalten von DOD bei 507 nm theoretisch zu beschreiben, ist ein detailliertes Modell notwendig.

Zunächst sei nochmals darauf hingewiesen, daß Karotinoid-Tripletts in LHCII, die für DOD bei 507 nm verantwortlich sind, nicht direkt aus Karotinoid-Grundzuständen hervorgehen, sondern ausschließlich durch den Triplett-Transfer von Chlorophyll zu Karotinoiden gebildet werden. Grund dafür ist zum einen die sehr geringe intersystem crossing Rate von angeregten Karotinoid-Singuletts (Frank und Cogdell, 1996; Koyama et al., 1996). Zum anderen bleibt die Besetzung der Karotinoid-Singuletts selbst sehr gering, weil diese ihre Energie sehr schnell zu den Chlorophyllen transferieren. (Connelly et al., 1997, Peterman et al., 1997b).

Der wellenlängenabhängige Absorptionskoeffizient von solubilisiertem LHCII ist durch folgende Terme gegeben:

glt6(T14)

wobei die Besetzungszahldichten (in cm-3 ) der Singulett- (i = 1) und Triplett- (i = T) Zustände von Chlorophyll (Chl) beziehungsweise Karotinoiden (Car) bezeichnen. , und sind die Absorptionsquerschnitte von Grund-, angeregten Singulett- und Triplett-Zuständen. Der lineare Absorptionskoeffizient von LHCII, , ergibt sich aus:

(T15)

Aus Gl. (T14) und Gl. (T15) erhält man die Pump-Impuls-induzierte Änderung des Absorptionskoeffizienten ( ):

(T16)

Term C in Gl. (T16) beschreibt den Beitrag der Karotinoid-Tripletts, der offensichtlich für die Änderung der optischen Dichte bei 507 nm verantwortlich ist (siehe z.B. Kapitel 3.2.4. auf S. 65). Der Einfluß der Terme A und B muß jedoch abgeschätzt werden. Dazu wurden vergleichende Messungen von bei 550 nm durchgeführt, wo der Beitrag von Term C nahezu null ist (siehe Abb. 23 auf S. 65). Die Beiträge der Terme A und B sollten sich jedoch bei 550 nm kaum von 507 nm unterscheiden, da sowohl der Absorptionsquerschnitt der Chlorophyll-Tripletts, , (siehe Abb. 22) als auch angeregter Chlorophyll-Singuletts, , (den Blanken et al., 1983) im Bereich 505 - 550 nm nur schwach variiert. Die Ergebnisse der Messungen bei 550 nm sind als Punkte in Abb. 31 eingezeichnet. Es sei darauf


79

hingewiesen, daß die Dichte absorbierter Photonen bei der Messung bei 550 nm etwa der bei 507 nm entsprach (etwas höhere Pump-Intensität, wegen geringerer Absorption). Innerhalb des Meßfehlers konnte keine Änderung der optischen Dichte bei 550 nm nachgewiesen werden. Folglich können die Beiträge der Terme A und B zur Absorptionsänderung bei 507 nm in Gl. (T16) vernachlässigt werden.

Die zeitliche Änderung der Absorption bei 507 nm spiegelt damit die Kinetik der Karotinoid-Triplett-Bildung wider.

Die bei 507 nm absorbierenden Karotinoid-Grundzustände besitzen ebenfalls keinen Einfluß auf die Kinetik der Karotinoid-Triplett-Bildung. Wegen des ultra-schnellen Singulett-Singulett-Transfers von Car nach Chl (Peterman et al. 1997b) liefern diese lediglich einen Beitrag zum linearen Absorptionskoeffizienten bei 507 nm (siehe Anhang A5 ).

Deshalb kann die Besetzung von Chlorophyll-Singuletts durch folgende Gleichung beschrieben werden:

(T17)

wobei k für die reziproke Lebensdauer von n1 steht. ist das zeitliche Profil des Pump-Impulses (Gl. (E2) auf S. 20).

Der zeitliche Verlauf der Besetzung von Chlorophyll-Singuletts wird nach Gl. (T17) durch zwei Faktoren bestimmt: i) den Wert von k und ii) die Intensität und Form des Pump-Impulses. Die Rate k hängt sehr stark vom Aggregationszustand der verwendeten Probe ab. Da es sich bei dem verwendeten LHCII um eine vollständig solubilisierte Probe handelt, können Aggregationseffekte ausgeschlossen werden. Die Singulett-Relaxationszeit beträgt damit 4.3 ± 0.2 ns (Liu et al. 1993, Vasil’ev et al. 1997a, b).

Bezüglich des Einflusses der Intensität und der Form des Pump-Impulses auf den zeitlichen Verlauf von sei daran erinnert, daß für ein akzeptables Signal-Rauschverhältnis bei den Messungen von eine Pump-Intensität von 1015 verwendet wurde. Bei dieser Intensität ist die Fluoreszenzausbeute von solubilisiertem LHCII bereits um 50 % vermindert (siehe Kapitel 2.2.3. auf S. 34). Dies kann als ein Effekt der teilweisen Sättigung von LHCII Grundzuständen verstanden werden (siehe Kapitel 2.2.5. auf S. 39). Ein Einfluß der Pump-Intensität auf die Singulett-Lebensdauer ist jedoch nicht zu erwarten. Dies wurde durch Messungen von Liu et al. (1993) bestätigt und entspricht dem von kleinen Pigment-Protein-Komplexen erwartetem Verhalten (siehe S. 30 sowie Mauzerall, 1976, Gülen et al., 1986; Schödel et al. 1996).

Der Einfluß der Sättigung der Chlorophyll-Singuletts bei verschiedenen Pump-Intensitäten ist in Anhang A7 auf S. 109 dargestellt. Der normierte zeitliche Verlauf


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der Besetzung angeregter Chlorophyll-Singuletts bei der verwendeten Intensität von 1015 weicht nur wenig von dem Verhalten bei sehr geringen Intensitäten (d. h. vom optisch linearen Fall) ab und kann deshalb durch Gl. (T17) von S. 79 beschrieben werden.

Bei der verwendeten Pump-Intensität von 1015 verändert sich die optische Dichte bei 507 nm nur sehr wenig (ca. 3%) im Vergleich zur maximal erreichten DOD (siehe Abb. 25 auf S. 67). Deshalb ist auch die maximale Karotinoid-Triplett-Besetzung, , deren Zeitverlauf in Abb. 31 dargestellt ist, weit von einer Sättigung entfernt. Folglich können die Triplett-Besetzungen im LHCII für = 1015 durch folgende Differentialgleichungen beschrieben werden:

(T18a)

(T18b)

wobei die intersystem crossing - Rate von angeregten Chlorophyll-Singuletts (Besetzung ) in den Chlorophyll-Triplett-Zustand (Besetzung ) bedeutet. Die Raten sind für die Relaxation der entsprechende Triplett-Besetzungen verantwortlich. Der Einfluß letzterer ist auf der ns-Zeitskala von Abb. 31 vernachlässigbar klein, da die Relaxation über im µs bzw. im ms Zeitbereich abläuft.

Die Konstante bezeichnet die Rate für den Triplett-Transfer von 3Chl nach Car.

Gl. (T18a, b) liefert demnach die Karotinoid-Triplett-Besetzung, die zu folgender Änderung des Absorptionskoeffizienten bei 507 nm führt: (siehe oben, insbesondere Gl. (T16) auf S. 78)

Um jedoch die Daten von bei 507 nm (Abb. 31) zu modellieren, ist es notwendig, die zeitliche Überlappung mit dem Test-Impulses zu berücksichtigen. Dies geschieht analog zu Chl b in Lösung durch Anwendung von Gl. (T13) (siehe S. 76).

Abb. 32 zeigt die experimentellen Daten aus Abb. 31 gemeinsam mit Modellkurven. Letztere wurden nach Gl. (T13) sowie dem oben beschriebenen Modell berechnet. Der einzige Parameter, der den berechneten (normierten) Zeitverlauf von DOD und damit die Karotinoid-Triplett-Besetzung beeinflußt, ist die Rate für den Triplett-Transfer von 3Chl nach Car. Deshalb sind Kurven bei verschiedenen Werten von dargestellt.


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Abbildung 32
Anpassung der gemessenen Daten von bei 507 nm (Fehlerkreuze) durch das beschriebene Modell bei verschiedenen Raten für den Triplett-Transfer in solubilisiertem LHCII. Der Fall = (0.01 ns)-1 stellt den Grenzfall dar.

Wird der von Kramer und Mathis (1980) gefundene Parameter von = (10 ns)-1 benutzt, so ergibt sich keine Übereinstimmung mit den gemessenen Daten (gepunktete Kurve in Abb. 32). Es sei nochmals darauf hingewiesen, daß eine Variation des Parameters keinen Einfluß auf die dargestellten berechneten Kurven besitzt (siehe Anhang A9 auf S. 110).

Die durchgezogene Linie in Abb. 32 stellt eine sehr gute Anpassung an die experimentellen Daten dar. Der dort verwendete Wert von <sub> </sub> = (0.01 ns)-1 entspricht dem Grenzfall eines unendlich schnellen Triplett-Transfers ( ). Das heißt, eine weitere Vergrößerung von zeigt keine Wirkung mehr auf die berechnete Kurve. In diesem Fall wird die zeitliche Besetzung von Karotinoid-Tripletts durch das Integral über angeregte Chlorophyll-Singuletts beschrieben (siehe Anhang A9 auf S. 110).

Als untere Grenze kann im Rahmen der Meßgenauigkeit angegeben werden:

(0.5 ns)-1

Dieser Wert ist mehr als eine Größenordnung größer, als der noch vor kurzer Zeit akzeptierte Wert von Kramer und Mathis (siehe oben).


82

3.4.4. Schlußfolgerungen für die Funktionalität des LHCII

Die detaillierte Untersuchung von Pump-Impuls-induzierten Absorptionsänderungen bei 507 nm führt zu einer unteren Grenze für die Rate des Triplett-Transfers von 3Chl zu Car. Das Ergebnis (0.5 ns)-1 zeigt, daß die Wechselwirkung zwischen Chlorophyllen und Karotinoiden in LHCII offensichtlich stärker ist, als bisher angenommen wurde. Diese Feststellung erklärt nicht nur den schnellen Singulett-Singulett-Energietransfer von Car zu Chl, sondern illustriert die Fähigkeit der Karotinoide, den LHCII sehr effektiv vor einer Zerstörung durch Singulett-Sauerstoff zu schützen.


83

3.5. Untersuchungen zum Einfluß gebildeter Tripletts auf die Fluoreszenz von solubilisiertem LHCII

Die Anwesenheit von Tripletts (sowohl 3Car als auch 3Chl) führt zur Löschung strahlend relaxierender angeregter Chlorophyll-Singuletts (siehe S. 59 in Kap. 3.1. ). Dieses auch Fluoreszenz-Quenching genannte Phänomen soll in den folgenden Kapiteln an solubilisiertem LHCII untersucht werden. Die Meßmethode besteht darin, einen schwachen Test-Impuls verzögert zum Pump-Impuls auf ein definiertes Probengebiet zu senden und das Verhalten der durch der ”Test-Fluoreszenz“ zu untersuchen. Ziel ist es, einen Zusammenhang zwischen Triplett-Besetzungen und der Löschung der Test-Fluoreszenz von solubilisiertem LHCII herzustellen.

3.5.1. Meßaufbau für Pump-Test-Messungen der Fluoreszenz

Abb. 33 stellt die neu aufgebaute Anordnung zur Messung Pump-Impuls-induzierter Änderungen der Test-Fluoreszenz dar. Um den Zusammenhang mit parallel durchgeführten Messungen von DOD zu verdeutlichen, sind zusätzlich die Komponenten des in Abb. 20 (siehe S. 61) dargestellten Aufbaus enthalten. Im folgenden sei lediglich auf Aspekte eingegangen, die im Zusammenhang mit den genannten Fluoreszenz-Messungen stehen. Für weiteres sei auf Kap. 3.2.1. (S. 61) verwiesen.

Abbildung 33
Schematische Darstellung des Meßaufbaus bei Pump - Test - Messungen der Fluoreszenz


84

Die durch den Pump-Impuls hervorgerufenen Änderung der Fluoreszenzquantenausbeute der Probe wurde durch die Messung der Fluoreszenz des Test-Impulses bestimmt. Die Test-Impuls-Intensität wurde auf etwa 1013 eingestellt. Als Test-Impuls-Wellenlänge wurde 430 nm gewählt.

Die Messung der Test-Fluoreszenz erfolgte in einem Probengebiet, in dem die Pump-Intensität nur sehr gering variierte. Um dies zu erreichen, war es unerläßlich, die in Kap. 2.2.1. (siehe S. 31) beschriebene räumliche Selektion des zu untersuchenden fluoreszierenden Probenbereiches durchzuführen. Das Fluoreszenzlicht gelangte über ein Lichtleitkabel mit entsprechender Optik und einen Doppelmonochromator zum Detektor (für näheres siehe Kap. 2.2.2. auf S. 32).

Ein wichtiger zusätzlicher Vorteil der räumlichen Selektion der Fluoreszenz ist die Unterdrückung der Pump-Fluoreszenz bei hohen Intensitäten. Auf diese Weise wurde erreicht, daß die Pump-Fluoreszenz von solubilisiertem LHCII ab ca. 1016 nur noch unwesentlich ansteigt (siehe Abb. 15 auf S. 44). Ein Verzicht auf räumliche Selektivität bei der Fluoreszenzmessung hätte zur Folge, daß das zusammen mit der Test-Fluoreszenz den Detektor erreichende Signal der Pump-Fluoreszenz bei hohen Intensitäten sehr drastisch ansteigt (siehe Abb. 12 auf S. 36). Dies würde zu einer Übersteuerung des Fluoreszenz-Detektors führen und damit eine Messung der Test-Fluoreszenz unmöglich machen.

Die zeitliche Verzögerung zwischen Pump- und Test-Impuls war ge 50 ns. Da die Lebensdauer einfach angeregter Chlorophyll-Singuletts in solubilisiertem LHCII etwa 4.3 ns beträgt (Vasi’lev et al., 1997b), ist die Pump-Fluoreszenz bei diesen Verzögerungszeiten vernachlässigbar gering. Trotzdem kann die Pump-Fluoreszenz für t ge 50 ns bei hohen Pump-Intensitäten das elektronische Signal am Detektor beeinflussen, da diese um Größenordnungen höher ist als die Test-Fluoreszenz. Dies kann jedoch dadurch korrigiert werden, daß das Signal bei ausgeschaltetem Test-Impuls berücksichtigt wird. Deshalb wurde die Pump-Impuls induzierte relative Änderung der Test-Fluoreszenz bestimmt aus:

(T19)

Dabei kennzeichnet S das bezüglich des Test-Impulses synchronisierte Signal am Fluoreszenz-Signal-Detektor (Pump : Verschluß 1 auf/zu; Test : Verschluß 2 auf/zu; siehe Abb. 33).

Auf diese Weise konnten Einflüsse der Pump-Fluoreszenz auf die zu bestimmende Fluoreszenzausbeute des Test-Impulses beseitigt werden.

Um zu prüfen, ob Gl. (T19) den Einfluß des Signals wirksam beseitigt und daß Meßartefakte ausgeschlossen werden können, wurden folgende


85

Testexperimente durchgeführt:

Die Probe wurde durch eine streuende Oberfläche ersetzt, und es wurde die gleiche Wellenlänge am Pump-Laser, Test-Laser und am Monochromator eingestellt. Die elektronischen Signale am Fluoreszenz-Signal-Detektor wurden so eingestellt wie sie bei den Fluoreszenz-Messungen an LHCII auch bei sehr hohen Pump-Intensitäten vorgefunden wurden (siehe Kap. 3.5.2 ). Es ergab sich, daß der entsprechend Gl. (T19) berechnete Ausdruck sowohl unabhängig von der Pump-Intensität als auch der gewählten Verzögerungszeit zwischen Pump- und Test-Impuls ist (Daten nicht gezeigt).

Die im weiteren gewonnenen experimentellen Ergebnisse sind demnach nicht durch elektronische Meßartefakte verfälscht.

3.5.2. Ergebnisse der Messungen der Test-Fluoreszenz von solubilisiertem LHCII als Funktion der Pump-Impuls-Intensität sowie der Verzögerungszeit

Durch Messung der durch den verzögerten schwachen Test-Impuls hervorgerufenen Fluoreszenz (Test-Fluoreszenz) ist es möglich, die Wechselwirkung der Pump-Impuls-induzierten Tripletts mit den später erzeugten angeregten Chlorophyll-Singuletts zu analysieren (siehe S. 60).

Das Verhältnis der relativen Ausbeute der Test-Fluoreszenz (siehe Gl. (T19) auf S. 84) wurde bei konstanter Verzögerungszeit von ca. 50 ns als Funktion der Pump-Impuls-Intensität bestimmt. Abb. 34 zeigt die Ergebnisse dieser Messungen in einer doppelt logarithmischen Darstellung. Die Test-Fluoreszenz nimmt stark ab und erreicht bei hohen Intensitäten wenige Prozent des Ausgangswertes.

Abbildung 34
Doppelt logarithmische Darstellung des Verhältnisses .


86

Es sei hierbei nochmals auf die Wichtigkeit der räumlich selektiven Messung der Fluoreszenz hingewiesen (siehe Kap. 3.5.1. auf S. 83), ohne die es unmöglich gewesen wäre, den gesamten dargestellten Bereich der Pump-Intensität abzudecken.

Abb. 35 zeigt das Zurückkehren von mit fortschreitender Verzögerung zum Ausgangswert bei verschiedenen Pump-Intensitäten.

Abbildung 35
Das Verhältnis als Funktion der Verzögerungszeit (t ge 50 ns) bei verschiedenen Pump-Intensitäten.

Im folgenden soll dieses zeitabhängige Verhalten detailliert untersucht werden.

3.5.3. Die Löschung der Test-Fluoreszenz von solubilisiertem LHCII auf einer µs Zeitskala

Da die Daten der Test-Fluoreszenz in Abb. 34 und 35 nicht durch Beiträge der Pump-Fluoreszenz verfälscht sind, können diese direkt zur Berechnung der Quench-Effizienz benutzt werden.

In Abwesenheit des Pump-Impulses ist die Fluoreszenz-Quantenausbeute des Test-Impulses, , gegeben durch , wobei die Ratenkonstante für die strahlende Emission und die reziproke Lebensdauer des einfach angeregten Chlorophyll-Singulett-Zustandes darstellen.

Sorgt der Pump-Impuls für eine Besetzung von Quenchern, deren Lebensdauer wesentlich größer als die der angeregten Singuletts ist, so reduziert sich die Fluoreszenz-Quantenausbeute zum Zeitpunkt des Test-Impulses auf den folgenden Wert: , wobei die einer relativen Quencher-Population,


87

, zugeordnete Quenching-Rate bezeichnet. Dies führt auf die wohlbekannte Stern-Volmer Gleichung:

(T20)

Die Summe in Gl. (T20) enthält die gewichteten Anteile aller löschenden Populationen und wird deshalb im weiteren als ”totale Quencher-Konzentration“, , bezeichnet.

Die Fluoreszenz-Quantenausbeute in Gl. (T20) ist definiert als das Verhältnis von emittierten zu absorbierten Photonen: . Bei der verwendeten Test-Impuls-Wellenlänge von 430 nm (siehe Kap. 3.5.1. auf S. 83) und einer Pump-Impuls Intensität von 1017 ist die relative Änderung der optischen Dichte, DOD/OD0 , etwa - 0.01 (siehe Abb. 23 auf S. 65). Im Vergleich dazu ist die relative Änderung der ´Test-Fluoreszenz, , bei <sub> </sub> = 1017 sehr groß (ap 0.3, siehe Abb. 34). Folglich bleibt die Anzahl der durch die Probe absorbierten Test-Impuls-Photonen (Iabs) nahezu unbeeinflußt vom Pump-Impuls. Deshalb kann in Gl. (T20) durch ersetzt werden. Letzteres entspricht den reziproken Werten der Daten von Abb. 34 bzw. 35. Deshalb erhält man aus den experimentellen Daten der Test-Fluoreszenz einen unabhängigen Ausdruck für :

(T21)

Abb. 36 zeigt die normierten Zeitverläufe von , die mit Gl. (T21) aus den Daten von Abb. 35 berechnet wurden. Die Relaxation von kann bei geringen Pump-Impuls-Intensitäten von bis zu 1015 sehr gut durch eine mono-exponentielle Anpassung mit tau = 7.1 µs beschrieben werden. Diese berechnete Kinetik ist nahezu identisch mit der Kinetik von Karotinoid-Tripletts, die an derselben Probe gemessen wurde (DOD bei 507 nm, siehe oben rechts in Abb. 36). Es sei darauf hingewiesen, daß letztere nicht von der Pump-Intensität abhängt (siehe Kap. 3.3.1. auf S. 67). Daraus kann geschlußfolgert werden, daß bei vergleichsweise geringen Pump-Impuls-Intensitäten die Population ausschließlich den Karotinoid-Tripletts zugeordnet werden kann, d.h.:

(T22)


88

Abbildung 36
Normierte Darstellung des Zeitverlaufes der ”totalen Quencher-Konzentration“ in solubilisiertem LHCII bei verschiedenen Pump-Impuls-Intensitäten. Die Datenpunkte wurden mit Gl. (T21) aus den experimentellen Daten von Abb. 35 (siehe S. 86) berechnet. Das Bild oben rechts zeigt die Kinetik der Karotinoid-Tripletts, die an derselben Probe wie in Abb. 35 gemessen wurde. Die durchgezogenen Linien entsprechen einer Anpassung mit zwei exponentiell abfallenden Komponenten. Zu einer konstant bleibenden 7.1 µs- Komponente entwickelt sich mit steigender Pump-Intensität eine 1.1 µs- Komponente (gestrichelte Linie). Siehe Text für Einzelheiten.

Bei höheren Pump-Impuls-Intensitäten (ge 1016 ) tritt zusätzlich zu 7.1 µs eine kürzere zeitliche Komponente mit 1.1 µs in Erscheinung). Die Amplitude dieser Komponente nimmt mit steigender Pump-Impuls-Intensität zu (siehe gestrichelte Linien in Abb. 36). Die entsprechenden Amplituden lauten:

A1.1 µs = 0.25, 0.35, 0.65 bei <sub> </sub> = 1016, 1017, 1018 .

Die Invarianz der Relaxation von Karotinoid-Tripletts bezüglich auf der einen und das Relaxationsverhalten von für verschiedene auf der anderen Seite führen zu der Frage, worauf die schnellere 1.1 µs Komponente von bei höheren zurückzuführen ist. Da bei Verzögerungszeiten von ge 50 ns zwischen Pump- und Test-Impuls angeregte Chlorophyll-Singuletts keine Rolle spielen (siehe oben), kann man davon ausgehen, daß bei hohen eine zusätzliche Quenching-Komponente gebildet wird.


89

Zur Identifikation des zusätzlichen Quenchers, wurden die im folgenden beschriebenen Experimente bei 675 nm durchgeführt.

3.5.4. Vergleichende Messungen von
DOD bei 507 nm und 675 nm

Das in Abb. 23 (S. 65) dargestellte Spektrum von DOD von solubilisiertem LHCII, das 50 ns nach dem Pump-Impuls gemessen wurde, zeigt deutlich das Verhalten von Karotinoid-Tripletts (siehe Kap. 3.2.4. aus S. 65). Das genannte DOD-Spektrum weist jedoch auch ein leichtes Ausbleichen im Bereich des Qy -Absorptionsmaximums bei etwa 675 nm auf. Dieses Verhalten wurde ebenfalls von Peterman et al. (1995) beobachtet und auf die Wechselwirkung von Karotinoid-Tripletts mit Chlorophyll-Grundzuständen (siehe van der Vos et al., 1991) zurückgeführt. Bestätigung fand diese These durch die Beobachtung, daß die Relaxationskinetik von DOD bei 675 nm identisch war mit dem Verhalten bei 507 nm (Peterman et al., 1995).

Sollte es jedoch zur Bildung von Chlorophyll-Tripletts bei hohen Pump-Intensitäten kommen (siehe Kap. 3.5.3. auf S. 86), so führt dies zwingend zu einer Änderung der optischen Dichte bei 675 nm (Chlorophyll-Grundzustandsentleerung). Aus diesem Grund wurden Messungen von DOD bei 675 nm durchgeführt.

Abb. 37 zeigt DOD bei 675 nm bei 50 ns Verzögerung zwischen Pump- und Test-Impuls als Funktion der Pump-Impuls-Intensität.

Abbildung 37
DOD/OD0 bei 675 nm und 50 ns Verzögerung zwischen Pump- und Test-Impuls als Funktion der Pump-Intensität in solubilisiertem LHCII.
Die Fehlerkreuze stellen die gemessenen Daten dar. Bei der durchgezogenen Linie wurde der Effekt abnehmender Pump-Intensität innerhalb der Probe eliminiert (siehe Text).

Die in Abb. 37


90

dargestellten Meßdaten (Kreuze) wurden analog zu DOD bei 507 nm (siehe Kap. 3.3.2. ) hinsichtlich abnehmender Pump-Intensität innerhalb der Probe korrigiert. Das Ergebnis dessen ist als durchgezogene Linie eingezeichnet (siehe auch Anhang A3 auf S. 105).

Die relative Änderung der optischen Dichte bei 675 nm ist nach Abb. 37 wesentlich kleiner als bei 507 nm (vergleiche Abb. 26). Deshalb gestalteten sich die Messungen der Relaxationskinetik bei 675 nm schwierig. Diese wurden an derselben Probe wie bei den in Abb. 36 dargestellten Messungen zur Quenching-Kinetik der Test-Fluoreszenz durchgeführt.

Abb. 38 zeigt die mono-exponentielle Relaxation der Karotinoid-Tripletts (oben, anhand der 7µs-Kinetik von DOD bei 507 nm) und die Kinetik von DOD bei 675 nm (unten) in solubilisiertem LHCII. Letztere wurde bei einer Pump-Impuls-Intensität von 6 _ 1017 gemessen.

Die experimentellen Daten der in Abb. 38 dargestellten Kinetik von DOD bei 675 nm lassen sich durch die Summe zweier exponentieller Abklingkomponenten beschreiben. Einer langsameren 7.1 µs Komponente, die der Relaxation von Karotinoid-Tripletts zugeordnet werden kann (siehe Kap. 3.5.5. ) steht eine zweite Komponente mit einer wesentlich kleineren Zeitkonstante von 0.9 µs gegenüber.

Abbildung 38
Normierte Kinetik der Pump-Impuls-induzierten Absorptionsänderungen, DOD, gemessen bei der Pump-Intensität von 6 _ 1017 Photonen cm-2 Impuls-1 und bei 507 nm bzw. 675 nm (Punkte).
Die durchgezogenen Linien stellen folgende mono- bzw. bi-exponentielle Anpassungen an die experimentellen Daten dar:
507 nm: = 7.1 µs
675 nm: a1 = -0.48; = 0.9 µs; a2 = -0.52; = 7.1 µs.


91

Aufgrund der kleinen Absolutwerte von DOD bei 675 nm konnte keine geringere Pump-Impuls-Intensität verwendet werden. Deshalb war es nicht möglich, die Amplitude der gefundenen 0.9 µs-Komponente systematisch bei verschiedenen Pump-Intensitäten zu untersuchen. Es ist lediglich bekannt, daß bei geringen Pump-Intensitäten keine kurze Komponente von DOD bei 675 nm auftritt (Peterman et al., 1995).

Demnach sind zwei verschiedene Mechanismen denkbar, die zur Änderung der optischen Dichte bei 675 nm führen: i) die Wechselwirkung von Chlorophyll-Grundzuständen mit gebildeten Karotinoid-Tripletts (siehe van der Vos et al., 1991) und ii) eine Entleerung der Population von absorbierenden Chlorophyll-Grundzuständen bei hohen Pump-Intensitäten.

3.5.5. Identifikation der Fluoreszenz-löschenden Populationen

Bei geringen Pump-Impuls-Intensitäten stimmt die Kinetik der Fluoreszenz-Quencher mit der Karotinoid-Triplett-Relaxationskinetik überein (siehe Kap. 3.5.3. auf S. 86). Dies führte auf Gl. 22 (siehe S. 87) für die Beschreibung der ”totalen Quencher-Konzentration“, , für le 1015 .

Vergleicht man den Wert der kurzen Zeitkonstanten von DOD bei 675 nm (0.9 µs) mit der aus den Test-Fluoreszenz-Messungen folgenden schnellen Quenching-Komponente von 1.1 µs (siehe Abb. 36 auf S. 88), dann liegt die Vermutung nahe, daß beide Ergebnisse auf dasselbe Phänomen zurückzuführen sind: Die Bildung von Chlorophyll-Tripletts bei hohen Intensitäten. Denn zum einen äußert sich die Bildung von Chlorophyll-Tripletts in der Entleerung des Chlorophyll-Grundzustandes (siehe Kap. 3.2.2. auf S. 63), zum anderen ist bekannt, daß das Vorhandensein von Chlorophyll-Tripletts zu einer drastischen Verringerung der Fluoreszenzausbeute führt (siehe Breton und Geacintov, 1980).

Die Annahme, daß es 50 ns nach dem Pump-Impuls eine Wahrscheinlichkeit für die Existenz einer sehr geringen Population von Chlorophyll-Tripletts in solubilisiertem LHCII gibt, stellt keinen Widerspruch zu bisher gewonnenen Ergebnissen dar:

Die intensitätsabhängigen Untersuchungen von Kap. 3.3.2. (siehe S. 68) führen zu dem Ergebnis, daß die Population von Karotinoid-Tripletts mit steigender Pump-Impuls-Intensität kontinuierlich zunimmt. Selbst bei extrem hohen kommt es zu keiner Sättigung der 3Car Besetzung. Wäre letzteres der Fall, hätte man eine drastische Zunahme einer Chlorophyll-Triplett-Population beobachten müssen, die sich dann in einer deutlichen Änderung der optischen Dichte bei 675 nm geäußert hätte. Dahingegen ist die gemessene relative Änderung von OD bei 675 nm und 50 ns Verzögerung extrem gering. Dieses Ergebnis ist also einerseits konsistent mit dem erwähnten nicht-sättigenden Verhalten von 3Car, schließt aber andererseits


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nicht aus, daß eine geringe Population von Chlorophyll-Tripletts aufgebaut werden kann.

Die Untersuchungen mit optischer Verzögerung (siehe Kap. 3.4.3. auf S. 77) führen zu dem Resultat, daß die Rate für den Triplett- Transfer von 3Chl zu Car in solubilisiertem LHCII sehr groß ist ( (0.5 ns)-1 ). Dieses Ergebnis folgte aus DOD-Messungen bei 507 nm mit der relativ geringen Pump-Impuls-Intensität von 1015 , bei der nicht nachweisbar ist (siehe Abb. 37 auf S. 89) und wo die Karotinoid-Triplett-Besetzung etwa ein zehntel des bei maximaler Pump-Intensität bestimmten Wertes beträgt (siehe Abb. 26 auf S. 68). Bei hohen ist mit einer geringen Wahrscheinlichkeit damit zu rechnen, daß der Triplett-Transfer von 3Chl zu Car dadurch behindert wird, daß Karotinoide bereits im Triplett-Zustand sind und deshalb die Energie der Chlorophyll-Tripletts nicht aufnehmen können, sodaß ein bestimmter Anteil von Tripletts zunächst bei 3Chl verbleibt bevor dieser zu Car transferiert wird. Daß dieser Anteil auch bei extrem hohen so gering bleibt (wie die experimentellen Daten von zeigen) ist ein erstaunliches Ergebnis und keineswegs ein Widerspruch zum schnellen Triplett-Transfer von 3Chl zu Car.

Die oben geäußerte Hypothese, daß Chlorophyll-Tripletts für die schnelle Komponente in der Kinetik des Fluoreszenz-Quenching verantwortlich sind führt auf folgende Gleichung für (siehe Kap. 3.5.3. auf S. 86):

(T23)

wobei und die Ratenkonstanten für das Quenching der Test-Fluoreszenz bezeichnen. Die relative Besetzung von Karotinoid-Tripletts, , kann aus DOD/OD0 bei 507 nm als Funktion der Pump-Impuls-Intensität berechnet werden. Es gilt demnach näherungsweise: (siehe Kap. 3.3.2.1. auf S. 69 sowie Angang A4 auf S. 106)

Die relative Besetzung von Chlorophyll-Tripletts, , kann nur für die Pump-Intensität 6 _ 1017 abgeschätzt werden, bei der die Relaxationskinetik von DOD bei 675 nm bestimmt wurde (siehe Anhang A2 auf S. 107). Es ergibt sich: .


93

3.5.6. Bestimmung der Ratenkonstanten für die Löschung der Fluoreszenz durch Tripletts in solubilisiertem LHCII

3.5.6.1. Karotinoid-Triplett-induziertes Fluoreszenz-Quenching bei geringen Pump-Intensitäten

Die Übereinstimmung der Karotinoid-Triplett-Relaxation mit der Kinetik von bei geringen Pump-Intensitäten führte zu der Hypothese, daß für le 1015 die Population ausschließlich den Karotinoid-Tripletts zugeordnet werden kann (siehe S. 87).

Der Vergleich von Gl. (T21) von S. 87 mit Gl. (T22) von S. 87 liefert:

(T24)

Hierbei ist die experimentell bestimmte Pump-Impuls-induzierte Abnahme der Test-Fluoreszenz (siehe Abb. 34 und 35 auf S. 85, 86). Die relative Karotinoid-Triplett-Besetzung, , geht ebenfalls aus experimentellen Daten hervor (siehe Kap. 3.3.2.1. auf S. 69 sowie Angang A4 auf S. 106). Die reziproke Lebensdauer ist (4.3 ns)-1 in solubilisiertem LHCII. Demzufolge ist die Quenching-Rate die einzige unbekannte Größe in Gl. (T24). Letztere wurde variiert, um die Daten von (siehe Abb. 34 auf S. 85) bestmöglich durch anzupassen. Das Ergebnis dieser Prozedur lautet: = 7 ± 2 und ist in Abb. 39 dargestellt.

Abbildung 39
Experimentelle Daten für die Pump-Impuls-induzierte Abnahme der Test-Fluoreszenz (Kreuze) und Anpassung der Daten für IP le 1015 Photonen cm-2 Impuls-1 durch Gl. (T24) mit = 7.


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Die Anpassung im Bereich geringer Pump-Intensitäten ist sehr gut. Die Abweichung bei höheren Pump-Impuls-Intensitäten ist auf die Bildung einer zusätzlichen Quencher-Population zurückzuführen, die durch Gl. (T24) nicht berücksichtigt wird. Diese wurde in Kap. 3.5.5. (siehe S. 91) einer geringen Population von Chlorophyll-Tripletts zugeordnet. Im folgenden Kapitel soll die Rate für das Quenching der Test-Fluoreszenz durch 3Chl bestimmt werden.

3.5.6.2. Chlorophyll-Triplett-induziertes Fluoreszenz-Quenching

Die kurzen Zeitkonstanten von DOD bei 675 nm (0.9 µs) und bei höheren Pump-Impuls-Intensitäten (ge 1016 ) stimmen nahezu überein. Daraus wurde geschlußfolgert, daß beide Ergebnisse auf die Bildung von Chlorophyll-Tripletts zurückzuführen sind (siehe Kap. 3.5.5. ). Diese konnte nicht als Funktion der Pump-Impuls-Intensität bestimmt werden, da DOD bei 675 nm auch Beiträge von Karotinoid-Tripletts beinhaltet (7 µs-Komponente in Abb. 38 auf S. 90) und eine Messung der Relaxationskinetik von DOD bei 675 nm für < 6 _ 1017 nicht möglich war (siehe Kap. 3.5.4. auf S. 89). Deshalb soll die Berechnung des Fluoreszenz-Quenching durch Chlorophyll-Tripletts in solubilisiertem LHCII nur aus den Daten bei der Pump-Intensität = 6 _ 1017 .

Die Einbeziehung von Chlorophyll-Tripletts in das Quenching der Test-Fluoreszenz führt über Gl. (T21) von S. 87 und Gl. (T23) von S. 92 zu folgender Gleichung für das Verhältnis der Quenching-Raten von Chlorophyll-Tripletts zu der Karotinoid-Tripletts:

(T25)

Alle auf der rechten Seite von Gl. (T25) stehenden Größen sind bekannt: folgt aus bei 507 nm (siehe Kap. 3.3.2.1. auf S. 69). Für die relative Besetzung von Chlorophyll-Tripletts ergab sich: (siehe Kap. 3.5.5. auf S. 91). Das Verhältnis = 7 (siehe Kap. 3.5.6.1. auf S. 93) ergibt = 0.15. folgt aus den Daten von Abb. 34 (siehe S. 85). Aus Gl. (T25) kann also das Verhältnisses berechnet werden. Es ergibt sich der folgende Wert (zur Interpretation siehe Kap. 3.5.7. ): =100 ± 40


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Der hier angegebene Fehler von ± 40 % bezieht die Unsicherheit bei der Berechnung der Chlorophyll- und Karotinoid-Triplett-Besetzung mit ein.

3.5.7. Schlußfolgerungen für die Funktionalität des LHCII

Bei relativ geringen Pump-Impuls-Intensitäten von le 1015 ist das Fluoreszenz-Quenching auf der µs-Zeitskala ausschließlich auf die Bildung von Karotinoid-Tripletts zurückzuführen. Dieses Ergebnis ist konsistent mit Messungen an Chloroplasten (Breton et al., 1979) und impliziert, daß alle durch intersystem crossing aus angeregten Chlorophyll-Singuletts gebildeten Chlorophyll-Tripletts sehr schnell und vollständig zur Bildung von Karotinoid-Tripletts führen. Dies ist konsistent mit dem Ergebnis von Peterman et al. (1995), daß der Triplett-Transfer in LHCII eine Ausbeute von nahezu 100 % besitzt und mit dem Ergebnis der Untersuchungen dieser Arbeit (siehe Kap. 3.4. auf S. 73), welches besagt, daß die Rate für den Triplett-Transfer in LHCII extrem groß ist, d.h. .

Die quantitative Analyse der Ergebnisse der Messungen der Test-Fluoreszenz-Löschung erlaubte die Abschätzung der Quenching-Rate . Demnach reduziert sich die Lebensdauer von angeregten Chlorophyll-Singuletts durch die Anwesenheit von Karotinoid-Tripletts deutlich ( = 7 ± 2). Karotinoid-Tripletts sorgen also nicht nur für die Vernichtung von Chlorophyll-Tripletts (und so für den Schutz vor Singulett-Sauerstoff), sondern tragen auch dazu bei, daß überschüssige angeregte Chlorophyll-Singuletts strahlungslos vernichtet werden.

Bei hohen Pump-Impuls-Intensitäten tritt eine zusätzliche Quencher-Population in Erscheinung. Diese ist höchstwahrscheinlich eine sehr geringe Population von Chlorophyll-Tripletts, 3Chl, zurückzuführen, die ein starkes Fluoreszenz-Quenching aufweist. Die Lebensdauer dieser 3Chl-Population ist mit ca. 1 µs mehr als zwei Größenordnungen kleiner als 3Chl in Lösung (siehe Chibisov, 1969, Mathis and Setif, 1981, Durrant et al., 1990) oder wie man es von Protein-gebundenen Chlorophyllen, die vom Triplett--Transfer ausgeschlossen sind, erwarten würde (siehe Breton et al., 1979). Die relative Besetzung von Chlorophyll-Tripletts bleibt jedoch auch bei maximal verwendeter Pump-Impuls-Intensität sehr gering. Da letztere jedoch hauptverantwortlich für das Quenching der Test-Fluoreszenz bei hohen Pump-Intensitäten sind, ergibt sich aus der quantitativen Analyse der experimentellen Daten eine um etwa zwei Größenordnungen höhere Rate für das Fluoreszenz-Quenching durch Chlorophyll-Tripletts verglichen mit dem Quenching durch Karotinoid-Tripletts: =100 ± 40. Dies entspricht der Idee von Breton et al. (1979) für Chloroplasten. Es wurde allerdings kein Wert für berechnet. Untersuchungen an Photosynthesebakterien (Monger und Parson, 1976)


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ergaben einen Wert von etwa 4 für das Verhältnis . Es sei jedoch darauf hingewiesen, daß es bei den hier zitierten Untersuchungen im Gegensatz zur vorliegenden Arbeit nicht möglich war, das Quenching der Test-Fluoreszenz durch Tripletts zu einem Zeitpunkt t zu untersuchen, wo noch nicht relaxiert ist (in dieser Arbeit: t = 50 ns; Breton et al., 1979: t = 4 µs; Monger und Parson, 1976: t = 2 µs).

Abschließend sei bemerkt, daß die Ergebnisse der Untersuchungen zur Wechselwirkung von Singuletts mit Tripletts sehr hilfreich für die Bewertung von Messungen an Reaktionszentren des PSII sind. Die dort beobachteten transienten Änderungen der Fluoreszenzausbeute geben Aufschluß über die ablaufenden Redox-Reaktionen (siehe Reifarth et al., 1997; Christen et al., 1998). Dabei spielen sowohl die zu untersuchende Reduktion von P680 als auch die Relaxation von Karotinoid-Tripletts eine entscheidende Rolle.


Fußnoten:
<11>

/ Daraus wurde geschlußfolgert, daß die Proteinmatrix in vivo eine Sauerstoff-Barriere darstellt, welche den Kontakt von Karotinoiden mit Sauerstoff verhindert.

<12>

/ Die geringe Strahldivergenz wird durch die Verwendung des Lasers sichergestellt. Es wäre unmöglich, statt dessen mit Blitzlampen oder ähnlichem zu arbeiten.


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