Schödel, René: Zur Kinetik von Singulett- und Triplett-Anregungen im Lichtsammelkomplex des Photosystems II höherer Pflanzen (LHCII).

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Zusammenfassung

Das Anliegen dieser Arbeit bestand darin, die Kinetik von elektronischen Singulett- und Triplett-Anregungen innerhalb des solubilisierten Lichtsammelkomplexes des Photosystem II (LHCII) zu untersuchen.

Die Untersuchungen gliedern sich in die folgenden drei Teilkomplexe:

Klärung der Frage, in welchem Maß die gegenseitige Wechselwirkung zwischen angeregten Singulett-Zuständen (Singuletts) zu deren Vernichtung führt. Um dies zu analysieren, wurden Messungen zur nichtlinearen Fluoreszenz von LHCII in einem großen Bereich der Anregungsimpuls-Intensität durchgeführt (siehe unten). Dazu war es notwendig, eine Methode zu entwickeln, die es erlaubt, die von der Probe ausgesandte Fluoreszenz räumlich zu selektieren.

Untersuchung der Kinetik der Karotinoid-Triplett-Bildung in LHCII. Dazu wurde ein Meßaufbau für Pump-Test-Messungen der nichtlinearen Transmission mit optischer Zeitverzögerung zwischen Pump- und Test-Impuls realisiert. Dabei galt es, ein besonderes Augenmerk auf die Vermeidung von Meß-Artefakten zu legen und so dafür zu sorgen, daß Effekte, die nicht auf einer absorptionsbedingten Transmissionsänderung der Probe beruhen, keinen Einfluß auf das Meßsignal besitzen.

Untersuchung der Wechselwirkung von Singuletts mit langlebigen Tripletts anhand der Fluoreszenz des verzögerten Test-Impulses. Hier war wiederum die räumlich selektive Messung der Fluoreszenz von größter Bedeutung.

Die Ergebnisse der genannten Messungen sowie deren theoretische Aufarbeitung sind im folgenden zusammengefaßt:

1. Multiple Singulett-Anregungen im LHCII

Um die Wechselwirkung zwischen angeregten Singulett-Zuständen innerhalb solubilisierter LHCII-Komplexe zu untersuchen, wurden Messungen der Fluoreszenz als Funktion der Anregungsimpuls-Intensität durchgeführt. Auf die Realisierung eines homogenen Anregungsgebietes wurde höchstes Augenmerk gerichtet. Dies wurde durch die räumliche Selektion eines (kleinen) Teilbereichs innerhalb des angeregten Probengebiets realisiert, in dem die Anregungsintensität lediglich um ± 20% variiert. Dadurch war es erstmalig möglich, intensitätsabhängige Messungen in einem sehr weiten Bereich der Anregungsintensität durchzuführen.

Die Fluoreszenzspektren von LHCII sind nahezu unbeeinflußt von der Anregungsintensität. Im Gegensatz dazu nimmt die normierte Fluoreszenzausbeute


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mit zunehmender Intensität drastisch ab. Meßergebnisse der normierten Fluoreszenzausbeute von solubilisiertem LHCII, die bei unterschiedlicher räumlicher Selektivität gemessen wurden, zeigen deutlich, daß die unter vollständiger räumlicher Selektierung gemessene Kurven (bei hohen Intensitäten) um Größenordnungen von den anderen abweicht. Ein derart drastischer Abfall der Fluoreszenzausbeute um ca. 4 Größenordnungen war vorher nie beobachtet worden. Dies entspricht einem sättigenden Verhalten der Fluoreszenz von solubilisiertem LHCII (nur unwesentliche Zunahme für > 1016 ).

Messungen an Chl a in 80 % azetonischer Lösung wurden durchgeführt, um die Ergebnisse mit denen von solubilisiertem LHCII zu vergleichen. Die Kurvenform von stimmt in beiden Fällen nahezu überein. Zwischen beiden Verläufen existiert lediglich eine Verschiebung von ca. 1 - 1.5 Größenordnungen bezüglich der Anregungsintensität. Die Ergebnisse von Chl a in Lösung lassen sich in einem einfachen Ratengleichungssystem sehr gut durch eine drastische Entleerung der Grundzustandspopulation beschreiben.

Die Beschreibung der experimentellen Daten der intensitätsabhängigen Fluoreszenz von LHCII mußte von einer gegebenen Anzahl von Pigmenten, aleph, innerhalb der räumlichen begrenzten solubilisierten Komplexe und deren destruktiv wechselwirkenden angeregten Zuständen ausgehen. Um dem gerecht zu werden, wurde das von Gülen et al. (1986) entwickelte Pauli-Master-Gleichungsmodell an die experimentellen Gegebenheiten angepaßt. Das daraus resultierende Modell ist numerisch für beliebige Impulsformen anwendbar. Damit war es möglich, die intensitätsabhängige Fluoreszenz von solubilisiertem LHCII durch ein erweitertes auf Pauli-Master-Gleichungen basierendem Model zu beschreiben.

Bei der Anpassung der intensitätsabhängigen Fluoreszenz von LHCII zeigte sich, daß die Form der berechneten Kurven fast ausschließlich durch den Parameter bestimmt wird, der die Wechselwirkung zwischen angeregten Singuletts festlegt. Der sättigende Verlauf der Meßdaten wird nur für extrem große Werte von > (1 ps)-1 erreicht. In diesem Fall besitzt die Zahl aleph der im Komplex enthaltenen Grundzustände keinen direkten Einfluß auf die berechnete Fluoreszenz. aleph hat lediglich im Produkt mit eine Bedeutung und bestimmt so die Position der berechneten Kurven bezüglich der Intensitätsachse. Die Anpassung der experimentellen Daten von solubilisiertem LHCII liefert somit einen Gesamtabsorptionsquerschnitt: =(2.3 ± 0.6) _ 10-15cm2. Zusammen mit dem aus der Kurvenform bestimmten Parameter > (1 ps)-1 ist es damit möglich, den Verlauf der intensitätsabhängigen Fluoreszenz durch ein auf gegenseitiger Wechselwirkung zwischen angeregten Singulett- Zuständen basierendem Modell sehr gut zu beschreiben.

Das Ergebnis der extrem großen Annihilationsrate > (1 ps)-1 bedeutet


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anschaulich, daß i > 1 elektronische Anregungszustände in einem Komplex mit aleph Gesamtzuständen quasi-instantan vernichtet werden.

Andererseits wird gezeigt, daß ein Komplex mit > (1 ps)-1 und > (1 ps)-1 unter Wirkung eines ns-Impulses durch ein ”Cluster“ mit aleph = 1 ersetzt werden kann, um die Meßdaten anzupassen. Absorbiert ein bereits angeregtes Cluster ein weiteres Photon, kommt es zur Besetzung des doppelt angeregten Zustandes, der sehr schnell relaxiert. Dieser Relaxationsprozeß beschreibt die effiziente Vernichtung von Mehrfachanregungen in solubilisierten LHCII Komplexen im Rahmen des ”Cluster-Modells“.

Unter der Bedingung läßt sich das Pauli-Master-Gleichungssystem für beliebige aleph in ein Ratengleichungssystem umschreiben. In diesem Fall treten quadratische Glieder in Verbindung mit auf. Die Pauli-Master-Gleichungs-Analyse der Ergebnisse zur intensitätsabhängigen Fluoreszenz von solubilisiertem LHCII im Rahmen dieser Arbeit führt allerdings zu dem Schluß, daß die Wechselwirkung zwischen (einfach) angeregten Zuständen so schnell zu deren Vernichtung führt ( > (1 ps)-1 ), daß die mittlere Anzahl einfach angeregter Zustände im Komplex, , selbst bei extrem hohen Intensitäten sehr gering bleibt ( <2). Die Bedingung ist damit für solubilisierten LHCII keineswegs erfüllt.

Die aus der Anpassung der intensitätsabhängigen Daten der LHCII-Fluoreszenz gewonnen Aussagen werden durch die Ergebnisse anderer Messungen gestützt. Nimmt man zum Beispiel einen kurzen (ps - bzw. sub-ps -) Impuls und > (1 ps)-1 an, so ergeben die Berechnungen auf der Grundlage von Pauli - Master Gleichungen die von Nordlund und Knox (1981) gefundene Unabhängigkeit der Fluoreszenzabklingkinetik von der Intensität des Anregungsimpulses.

Aus den Untersuchungen lassen sich Rückschlüsse über den Transfer der Anregungsenergie innerhalb des LHCII-Komplexes ziehen. Dieser muß extrem schnell sein, um die quasi-instantane Vernichtung von Anregungszuständen zu ermöglichen. Es muß also gelten: > (1 ps)-1, wobei die Rate für den Transfer der Anregungsenergie innerhalb des solubilisierten LHCII-Komplexes symbolisiert. Aussagen über den Charakter des Energietransfers sind dabei allerdings nicht möglich.

2. Triplett-Zustände im LHCII

Zur Charakterisierung von Triplett-Zuständen wurde ein Meßaufbau realisiert, der aus zwei selbständigen Lasersystemen besteht. Eine elektronische Zeitverzögerung erlaubte die Einstellung einer definierten Zeit zwischen Pump- und Test-Impuls.


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Um Aussagen über Triplett-Absorptionsquerschnitte von Chl a und Chl b zu gewinnen, wurden die entsprechenden DOD-Spektren mit 50 ns Verzögerung gemessen. Die sich ergebenden T-S-Spektren von Chl a und Chl b in azetonischer Lösung spiegeln offensichtlich das spektrale Verhalten der Grundzustands-Absorption (OD0) wider. Sowohl für Chl a als auch für Chl b ist zu erkennen, daß das Absorptionsverhalten der entsprechenden Tripletts bezüglich der Wellenlänge wie erwartet sehr unstrukturiert ist.

Die Form des T-S-Spektrums von solubilisiertem LHCII weist eine völlig andere spektrale Charakteristik auf. Das ausgeprägte Maximum bei ca. 507 nm ist auf die Absorption gebildeter Karotinoid-Tripletts zurückzuführen. Bis auf das geringe Ausbleichen im Qy-Bereich (um 675 nm) ist das Spektrum von LHCII typisch für ein T-S-Spektrum von Karotinoiden. Der Wert von DOD bei 507 nm kann als Maß für die Besetzung von Karotinoid-Triplett-Zuständen (3Car) angesehen werden. Dies ermöglichte es, den Einfluß experimenteller Parameter auf die 3Car-Besetzung zu untersuchen.

Die Pump-Impuls-Intensität übt keinen Einfluß auf den Relaxationsverlauf der Pump-Impuls-induzierten Karotinoid-Tripletts, 3Car, aus. Dieses Ergebnis führt zu der Schlußfolgerung, daß es innerhalb der solubilisierten LHCII Komplexe selbst bei extrem hohen Intensitäten keine destruktive Wechselwirkung zwischen Karotinoid-Tripletts gibt. Die absolute Besetzung von 3Car steigt jedoch mit zunehmender Pump-Intensität drastisch an. Sogar bei extrem hohen Pump-Intensitäten ist keine Sättigung der Karotinoid-Triplett-Besetzung zu beobachten. Im Gegensatz zu dem sättigenden Verhalten der Pump-Fluoreszenz nimmt die Besetzung von Karotinoid-Tripletts kontinuierlich zu. Es sind zwei Mechanismen denkbar, die zu einer vermehrten Bildung von 3Car bei hohen Intensitäten führen könnten: i) Möglicherweise gehen aus der paarweisen Auslöschung von angeregten Chlorophyll-Singuletts (singlet-singlet-annihilation) Chlorophyll-Tripletts hervor, die schließlich zur Bildung von 3Car führen. ii) Doppelt angeregte Chlorophyll-Singuletts könnten zu einem gewissen Teil in einen Chlorophyll-Triplett-Zustand relaxieren und letztlich ebenfalls zur Besetzung von Karotinoid-Triplett-Zuständen beitragen.

Um die Bildung der 3Car Besetzung zeitlich aufzulösen, wurde ein Meßaufbau mit optischer Verzögerung zwischen Pump- und Test-Impuls realisiert. Als Modellsubstanz wurde Chl b in 80% azetonischer Lösung gewählt. Es wurden Messungen der Pump-Impuls-induzierten Absorptionsänderung bei 460 nm als Funktion der Verzögerungszeit zwischen Pump- und Test-Impuls durchgeführt. Die zeitliche Entwicklung der angeregten Singulett- und Triplett-Zustände bestimmt gemeinsam die beobachtete Entleerung von Chl b Grundzuständen und entspricht damit im wesentlichen einer zeitlichen Integration über den Pump-Impuls. In solubilisiertem LHCII spiegelt die zeitliche Änderung der Absorption bei 507 nm die Kinetik der


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Karotinoid-Triplett-Bildung wider. Bei der Modellierung der Daten wurde die Rate für den Triplett-Transfer von 3Chl nach Car variiert. Die beste Anpassung ergibt den Grenzfall . Als untere Grenze kann im Rahmen der Meßgenauigkeit ein Wert von (0.5 ns)-1 angegeben werden. Dieser Wert ist mehr als eine Größenordnung größer, als der noch vor kurzer Zeit akzeptierte Wert von Kramer und Mathis (1980). Dieses Ergebnis zeigt, daß die Wechselwirkung zwischen Chlorophyllen und Karotinoiden in LHCII wesentlich stärker ist, als bisher angenommen wurde.

3. Singulett-Triplett-Wechselwirkung

Um die Wechselwirkung der gebildeten Tripletts (sowohl 3Car als auch 3Chl) mit angeregten Singuletts in solubilisiertem LHCII zu untersuchen, wurde die Fluoreszenz des zeitlich verzögerten Test-Impulses gemessen. Die Anwesenheit der Pump-Impuls-induzierten Tripletts führt zu einer Fluoreszenz-Löschung. Dabei wurde ein neuer Weg beschritten, um die Fluoreszenz-Löschung im Zusammenhang mit zeitabhängigen Absorptionsänderungen zu analysieren. Anstelle eines zeitlich und spektral breiten Blitzlampen-Test-Impulses wurde ein zeitlich definierter und spektral schmaler ns-Laser-Impuls verwendet. Die Messung der Test-Fluoreszenz erfolgte in einem Probengebiet, in dem die Pump-Intensität nur sehr gering variierte. Um dies zu erreichen, wurde wiederum eine räumliche Selektion des zu untersuchenden fluoreszierenden Probenbereiches (siehe oben) durchgeführt. Das Verhältnis der relativen Ausbeute der normierten Test-Fluoreszenz, , wurde bei konstanter Verzögerungszeit von ca. 50 ns als Funktion der Pump-Impuls-Intensität bestimmt. Die Test-Fluoreszenz nimmt drastisch ab und erreicht bei hohen Intensitäten wenige Prozent des Ausgangswertes. Das Zurückkehren von zum Ausgangswert wurde als Funktion der Verzögerungszeit bei verschiedenen Pump-Intensitäten gemessen. Da diese Daten nicht durch Beiträge der Pump-Fluoreszenz verfälscht sind, konnten sie mit Hilfe der Stern-Volmer Gleichung direkt zur Berechnung der quenchenden Populationen benutzt werden. Die Relaxation der ”totalen Quencher-Konzentration“ kann für Pump-Impuls-Intensitäten von bis zu 1015 sehr gut durch eine mono-exponentielle Anpassung beschrieben werden, die nahezu identisch ist mit der Relaxationskinetik von Karotinoid-Tripletts ( 7.1 µs). Daraus kann geschlußfolgert werden, daß bei vergleichsweise geringen Pump-Impuls-Intensitäten ausschließlich den Karotinoid-Tripletts zugeordnet werden kann. Dies erlaubt die Berechnung der entsprechenden Quenching-Rate, , durch die Anpassung der experimentellen Daten von im Bereich geringer Pump-Intensitäten. Eine sehr gute Anpassung ergibt sich für = 7 ± 2, wobei


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die reziproke Lebensdauer (einfach) angeregter Singulett-Zustände in Abwesenheit von Tripletts ist.

Bei hohen Pump-Impuls-Intensitäten ( ge 1016 ) wurde in eine zusätzliche und wesentlich kürzere zeitliche Komponente ( 1.1 µs) beobachtet, deren Amplitude mit steigender deutlich zunimmt. Zur Identifikation dieses zusätzlichen Quenchers, wurden DOD-Experimente bei 675 nm durchgeführt. Die Kinetik von DOD bei 675 nm bei <sub> </sub> = 6 _ 1017 läßt sich durch die Summe zweier exponentieller Abklingkomponenten beschreiben: Es dominiert eine Komponente mit ca. 0.9 µs gegenüber einer mit ca. 7.1 µs.

Der Vergleich der Werte der kurzen Zeitkonstanten von DOD bei 675 nm (0.9 µs) und (1.1 µs) legt nahe, daß beide Ergebnisse auf die Bildung von Chlorophyll-Tripletts bei hohen Intensitäten zurückzuführen sind. Ausgehend von dieser Hypothese läßt sich die Konstante für das Quenching der Fluoreszenz durch Chlorophyll-Tripletts in LHCII berechnen. Es ergibt sich ein sehr großer Wert von =100 ± 40.

Als Schlußfolgerung der im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen Aussagen ergibt sich eine Erweiterung des Spektrums der Erkenntnisse zur Struktur-Funktions-Beziehung im Lichtsammelkomplex des Photosystem II höherer Pflanzen (LHCII). Dies betrifft zum einen die Konsequenzen aus den Untersuchungen zur nichtlinearen Fluoreszenz, die ergeben, daß die absorbierte Lichtenergie extrem schnell innerhalb der LHCII Komplexe transferiert wird. Zum anderen verdeutlichen die Ergebnisse der Untersuchungen zum Triplett-Transfer und zur Fluoreszenz-Löschung wie wirksam Karotinoide beim Schutz vor dem toxischen Singulett-Sauerstoff agieren. Einige wichtige biologisch relevante Fragen konnten so physikalisch verstanden werden.


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