Institut für Biologie

Identification of the tumour-associated gene S100A14 and analysis of its regulation

DISSERTATION

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

Diplom-Biotechnologin Agnieszka Pietas
geb. am 14. April 1975 in Lublin, Polen

Dekan: Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Thomas Buckhout, PhD

Gutachter/innen:
1. Prof. Dr. Harald Saumweber
2. PD Dr. Christine Sers
3. Prof. Dr. Iver Petersen

eingereicht:28.6.2004

Datum der Promotion:22.11.2004

Zusammenfassung

Durch Analyse der Subtraktion-cDNA Bibliothek einer humanen Lungentumor Zelllinie haben wir ein neues Mitglied der S100 Genfamilie identifiziert und charakterisiert, welches S100A14 benannt wurde. Die vollständige cDNA hat eine Länge von 1067 bp und kodiert für ein Protein von 104 Aminosäuren, welches die S100-spezifische Kalzium-bindende Domäne enthält und die größte Homologie zu S100A13 zeigt. Das Gen wird in normalen humanen Epithelien ubiquitär exprimiert, zeigt jedoch Expressionsverluste in vielen Tumorzelllinien aus unterschiedlichem Gewebe. Im Gegensatz zu Tumorzelllinien ist S100A14 auf mRNA- und Proteinebene in vielen humanen Primärtumoren stärker exprimiert, unter anderem in Lungen- und Brustkarzinomen. Das Protein ist vorzugsweise in der Region der Plasmamembran und im Zytoplasma lokalisiert.

Das Gen liegt auf Chromosom 1 im Bereich der Bande 1q21, einer Region mit hoher chromosomaler Instabilität in Malignomen, in der sich auch mindestens 16 weitere S100 Gene befinden. Es ist aus vier Exons und drei Introns aufgebaut und erstreckt sich über 2165 bp genomischer DNA.

In der 5´ Region proximal der transkriptionellen Initiationsstelle des S100A14 Gens wurde mit Hilfe von Deletionsmutationen eine minimale Promoteregion identifiziert, die vermutlich zur basalen Promoteraktivität beiträgt.

Um den Mechanismus der erhöhten S100A14 Expression in Lungen- und Brustkarzinomen zu verstehen, haben wir die Effekte des EGF (epidermal growth factor) und des TGF-α (transforming growth factor-α) untersucht. Beide Faktoren sind Liganden des ERBB Rezeptors und induzieren in der immortalisierten bronchialen Epithelzelllinie S100A14 Expression. Unter Verwendung spezifischer Inhibitoren konnte gezeigt werden, dass für die EGF-vermittelte transkriptionelle Induktion der ERK1/2 Signalweg (extracellular signal-regulated kinase) verantwortlich ist und eine de novo Proteinsynthese erfordert. Diese Ergebnisse unterstützend konnte immunhistologisch eine signifikante Korrelation zwischen der Überexpression von ERBB2 und S100A14 in primären Brustkarzinomen nachgewiesen werden.

Phorbolester-12-Myristat-13-Acetat (PMA) verstärkte gleichfalls die S100A14 mRNA Expression in 9442 Zellen, was eine Regulation durch die Protein Kinase C (PKC) vermuten lässt. Die PMA-induzierte Expression von S100A14 wird ebenso wie die TGF-αEGF-Induktion durch die Aktivierung des ERK1/2 Signalweges vermittelt.

In Anbetracht der großen Bedeutung der ERK1/2 und PKC Signalwege in der Tumorentstehung und Tumorprogression ist zu vermuten, dass S100A14 über die aberrante Regulation dieser Signalwege an die maligne Transformation gekoppelt ist.

Schlagwörter: S100A14, S100, EGF, TGF-α, PKC, PMA, ERK1/2

Abstract

By analysing a human lung tumour cell line subtraction cDNA library, we have identified and characterized a novel member of the human S100 gene family that we designated S100A14. The full-length cDNA is 1067 bp and encodes a putative protein of 104 amino acids. The predicted protein contains the S100-specific EF-hand calcium-binding domain and shares the highest sequence homology to S100A13. The gene is ubiquitously expressed in normal human tissues of epithelial origin, with the highest expression in colon. S100A14 transcript was found to be down-regulated in many immortalized and tumour cell lines from diverse tissues. In contrast to the tumour cell lines, S100A14 shows up-regulation at the mRNA and protein level in many human primary tumours, including lung and breast carcinomas. S100A14 protein localizes predominately to the plasma membrane and the cytoplasm.

We localized the S100A14 gene to a region of chromosomal instability on human chromosome 1q21, where at least 16 other S100 genes are clustered. We subsequently resolved the gene structure of S100A14 in human by demonstrating its organization of four exons and three introns spanning a total of 2165 bp of genomic sequence. By analysing the proximal 5’ upstream region of the S100A14 transcription initiation site, we identified the minimal promoter region which possibly contributes to the basal activity of the promoter fragment.

To elucidate mechanisms whereby S100A14 expression is enhanced in lung and breast tumours, we studied the effects of epidermal growth factor (EGF) and transforming growth factor-α (TGF-α) on its expression. Both are ligands of ERBB receptor and induced S100A14 expression in the immortalized bronchial epithelial cells. By use of specific inhibitors, we found that EGF-mediated transcriptional induction of S100A14 involves extracellular signal-regulated kinase (ERK1/2) signalling and requires de novo protein synthesis. In support of these findings, we demonstrated by immunohistochemistry a significant correlation between ERBB2 and S100A14 protein overexpression in primary breast carcinomas.

Our studies showed that the phorbol ester 12-myristate 13-acetate (PMA) increases S100A14 mRNA expression in immortalized bronchial epithelial cells suggesting regulation by protein kinase C (PKC). Similar to TGF-α/EGF induction, the PMA-induced S100A14 expression was also mediated by activation of the ERK1/2 signalling cascade.

Considering the importance of the ERK1/2 and PKC signalling pathways in tumour development and progression we suggest that it is the aberrant regulation of these signalling cascades that couples S100A14 to malignant transformation.

Keywords: S100A14, S100, EGF, TGF-α, PKC, PMA, ERK1/2

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