1 Einleitung

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Die eukaryotische Expression von Genen wird durch Transkriptionsfaktoren gesteuert, welche an cis-regulatorische DNA-Sequenzen binden. Diese Transkriptionsfaktoren werden in ihrer Aktivität durch eine Vielzahl von Proteinen beeinflusst. Der Transkriptionsfaktor C/EBPβ interagiert mit verschiedenen Koaktivatoren oder
-repressoren, wie Chromatin-modifizierenden Molekülen, Enzymen und Komplexen, die Bindungen an die basale Transkriptionsmaschinerie vermitteln. Um die Zell-, Gen- und Promotor-spezifische Regulation von C/EBPβ bei der Entwicklung und Homöostase zu verstehen, ist es notwendig, die signalabhängige zeitliche Abfolge der Interaktionen zwischen dem Transkriptionsfaktor und neuen bzw. bekannten Multiproteinkomplexen in der Zelle zu entschlüsseln.

1.1 Struktur und Funktion der CCAAT/Enhancer Binding Proteine

CCAAT/Enhancer Binding Proteine (C/EBPs) sind Transkriptionsfaktoren, welche die Genexpression bei unterschiedlichen biologischen Prozessen wie Proliferation, Differenzierung und Apoptose regulieren. C/EBPs werden in verschiedenen Geweben und Zellarten exprimiert, unter anderem im Fettgewebe, in der Leber, der Lunge, im Darm und in mononukleären Zellen des peripheren Blutes (Ramji und Foka, 2002). Sie sind entscheidend für die Entwicklung und Funktion von diversen Zelltypen wie zum Beispiel Hepatozyten (Buck et al., 1999), Adipozyten (Cao et al., 1991), Osteoblasten (Hata et al., 2005) und Makrophagen (Screpanti et al., 1995).

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Die Familie besteht aus mindestens sechs funktionell verwandten DNA-bindenden Proteinen (C/EBPα-C/EBPζ), wobei die Mitglieder C/EBPα, C/EBPβ, C/EBPδ und C/EBPε einen ähnlichen Aufbau ihrer funktionellen Domänen besitzen (Ramji und Foka, 2002). Sequenzvergleiche zwischen verschiedenen Spezies und Mitgliedern der Proteinfamilie zeigen neun konservierte Bereiche („conserved regions“, CR1-9), welche durch Alanin-, Glycin und Prolin-reiche Sequenzen getrennt sind (Kowenz-Leutz et al., 1994). Die konservierten Bereiche können in eine transaktivierende Region (CR1-4), eine negativ regulatorische Region (CR567), eine DNA-bindende (CR8) und eine dimerisierende Region (CR9) eingeteilt werden. CR8 und CR9 bilden zusammen die bZIP-Domäne der Proteine (siehe auch Kap. 1.1.1). Nach funktionellen Kriterien sind C/EBPβ Proteine aus Mensch, Maus, Ratte und Huhn praktisch nicht zu unterscheiden. Abb. 1.1 zeigt schematisch die Position der konservierten Domänen von C/EBPβ des Huhns mit dazugehöriger Aminosäureposition.

Abb. 1.1: Schematische Darstellung von C/EBP β des Huhns (modifiziert nach Kowenz-Leutz et al. , 1994). Aminosäurepositionen (AS) sind oben, konservierte Regionen („conserved regions“, CR) sind unterhalb des Proteins dargestellt. Die konservierten Regionen sind in blau (CR1), grün (CR2-4), rot (CR567) und dunkelgrau (CR8-9) dargestellt. Dazwischen liegen hellgraue Bereiche mit einem geringen Grad an Konservierung und einem hohen Anteil an Alanin, Glycin und Prolin. Die konservierten Regionen 2, 3 und 4 sind Bestandteile der transaktivierenden Region. Die rot markierten Bereiche 5, 6 und 7 bilden die regulatorische Region. Dunkelgraue Bereiche zeigen die DNA-Bindungs- und Dimerisierungsregion (CR8-9). CR1, AS 1-13; CR2, AS 18-38; CR3, AS 42-63; CR4, AS 99-113; CR 5, AS 118-131; CR6, AS 145-179; CR7, AS 184-222; CR8-9, AS 243-317.

Von dem C/EBPβ Transkript werden drei Protein-Isoformen, LAP*, LAP und LIP, durch alternative Translationsinitiation exprimiert (Calkhoven et al., 2000). Die zwei transkriptionell aktiven Isoformen, LAP* und LAP unterscheiden sich in einem kurzen N-terminalen Stück (CR1). Die kürzeste Isoform, LIP, besitzt nur einen Teil der zentralen regulatorischen Region (CR7) und den bZIP Dimerisierungs- und DNA-bindenden Teil des Proteins. Diese Isoform wird als transkriptioneller Repressor angesehen (Descombes und Schibler, 1991).

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Mäuse mit einer Deletion des C/EBPβ Gens zeigen Veränderungen der Glucose Homöostasis (Croniger et al., 1997) und weisen Störungen in der Makrophagenfunktion auf (Tanaka et al., 1995). Die Tiere entwickeln lymphoproliferative Erkrankungen (Screpanti et al., 1995; Chen et al., 1997) und die Weibchen zeigen Infertilität (Sterneck et al., 1997). Der Einfluss von C/EBPβ auf so vielfältige physiologische Prozesse zeigt die Wichtigkeit des Transkriptionsfaktors für die normale Entwicklung und Funktion von Organismen.

1.1.1 Die C/EBPβ „basic leucine zipper“ Domäne

C/EBP gehört zur Familie der „basic leucine zipper“ (bZIP) Proteine. Die C-terminalen Regionen der Proteine zeigen eine Identität ihrer Aminosäuresequenz von über 90 % und bestehen aus einer basischen DNA-bindenden Domäne und einer Dimerisierungsdomäne (leucine zipper). Leucine zipper finden sich unter anderem in einer Reihe von Transkriptionsfaktoren und vermitteln die Fähigkeit homo- und heteromerer Interaktionen. Sie bilden eine amphipathische Helix aus, bei der sich an jeder siebenten Position ein konserviertes Leucin befindet. Die Leucin-Reste stehen aus der α-Helix an einer Flanke heraus und können mit den Leucin-Resten des anderen Proteins interagieren. Auf diese Weise bilden sich coiled-coil Strukturen aus. Zwei rechts-gewundene Helices sind dabei so miteinander verwunden, dass alle 3,5 Aminosäurereste eine Windung entsteht und sich das Muster alle sieben Aminosäuren wiederholt. Die zwei leucine zipper bilden den Stamm einer Y-förmigen Struktur und die basischen Regionen der dimerisierenden Proteine zweigen davon ab. Diese basischen Aminosäuren sind für die Bindung an DNA verantwortlich. Die Erkennungssequenz ist folglich palindromisch und wird von jedem bZIP-Faktor erkannt. Die Fähigkeit der Proteine zur Dimerisierung ist somit eine notwendige Voraussetzung für die Bindung an DNA und die Funktion als Transkriptionsfaktor (Landschulz et al., 1989). Die räumliche Struktur der bZIP-Domäne in Verbindung mit DNA wurde bereits aufgeklärt (Tahirov et al., 2002). Abb. 1.2 zeigt die Kristallstruktur eines bZIP-Homodimers, welches an ein DNA-Oligonukleotid gebunden ist.

Abb. 1.2: Kristallstruktur einer dimerisierten bZIP-Region (CR8-9) von C/EBP β gebunden an DNA. Der zwei bZIP-Proteine sind in blau und türkis dargestellt. Die DNA-Stränge sind in grün und gelb gezeigt. Die .pdb-Datei, welche die Daten der Kristallstruktur enthält, wurde aus Tahirov et al. (2002) entnommen und mit dem Programm 3D-Mol dargestellt.

1.1.2 Die C/EBPβ transaktivierende Domäne

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Im Gegensatz zu den DNA-bindenden Domänen ist relativ wenig über die Struktur von transaktivierenden Domänen (TAD) bekannt. Die amino-terminal gelegenen konservierten Regionen CR1-4 bilden die transaktivierende Domäne von C/EBPβ. CR1 ist in der Lage den SWI/SNF Komplex zur ATP-abhängigen Remodellierung von Nukleosomen zu rekrutieren (Kowenz-Leutz und Leutz, 1999). Die C/EBPβ transaktivierende Domäne ist dabei in der Lage, die Kernkomponente des SWI/SNF-Komplexes, hBrm/BRG1 (SWI2 Homolog), zu binden und auf diese Weise transkriptionell abgeschaltete Gene durch Veränderung der lokalen Chromatinstruktur zu aktivieren.

Durch Acetylierung von Histon-Proteinen kann es zu einer Auflockerung der Chromatinstruktur und transkriptionellen Aktivierung von Genen kommen. Deacetylierung hingegen wird mit einer Repression der Genexpression in Verbindung gebracht. C/EBPβ ist in der Lage, die Histon-Acetyltransferase p300/CBP über seinen Amino-Terminus zu binden (Oelgeschlager et al., 1996; Mink et al., 1997). Bei diesen Proteinen handelt es sich um Koaktivatoren, welche verschiedene Transkriptionsfaktoren mit der basalen Transkriptionsmaschinerie verbinden. Diese Assoziation wird durch regulatorische virale Proteine wie Adenovirus E1A oder SV40 T verhindert. C/EBPβ bindet an p300/CBP über dessen E1A-Interaktionsmodul.

Neben aktivierenden werden auch reprimierende Proteinkomplexe über die C/EBPβ TAD rekrutiert. Die Interaktion zwischen der TAD von C/EBPβ und SMRT/N-CoR2 konnte kürzlich gezeigt werden (Ki et al., 2005). N-CoR und das eng verwandte SMRT/N-CoR liegen in makromolekularen Proteinkomplexen unterschiedlicher Komposition vor und sind mit Histon-deacetylierenden Enzymaktivitäten assoziiert.

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Die Transaktivierungsregion von C/EBPβ ist also in der Lage, unterschiedliche Koaktivatoren und Korepressoren zu binden, welche die Chromatinstruktur verändern und die Genexpression beeinflussen können.

1.1.3 Die C/EBPβ regulatorische Domäne

Die konservierten Regionen 5, 6 und 7 bilden die regulatorische Domäne (RD) von C/EBPβ. In Reportergenstudien konnte gezeigt werden, dass eine interne Deletion der Aminosäuren 116-229 (CR5, 6 und 7) die Transaktivierung von C/EBPβ fünf- bis siebenfach im Vergleich zum Gesamtprotein verstärkt (Kowenz-Leutz et al., 1994). Deshalb wurde für diese Region eine negativ-regulatorische Funktion postuliert. Eine Deletion von Region 5, 7 oder einer Kombination aus 5 und 7 führten ebenfalls zu einer fünf- bis siebenfachen Aktivierung des Proteins (Kowenz-Leutz et al., 1994). Die Motive 5 und 7 reprimieren also einen Teil des transaktivierenden Potentials von C/EBPβ. Im Gegensatz dazu scheint CR6 den inhibitorischen Effekt der Regionen 5 und 7 zum Teil aufzuheben. Eine Deletion der Region 6 führt zu einer starken Reduktion der Reporterexpression. Die Anwesenheit der CR6 hingegen führt zu einer Maskierung des negativen Effektes der Regionen 5 bzw. 7. Die aktivierenden und reprimierenden Funktionen von C/EBPβ sind dabei unabhängig von den C-terminal gelegenen Dimerisierungs-/DNA-Bindungsregionen. Die CR6 scheint demnach für die Derepression von C/EBPβ von entscheidender Bedeutung zu sein.

Eine Derepression kann auf physiologischem Wege durch Phosphorylierung über den Ras-MAPK-Signalweg erreicht werden (Kowenz-Leutz et al., 1994). Diese Phosphorylierung an der MAPK Phosphoakzeptorsequenz in der CR7 an Aminosäureposition T220 führt zu einer Konformationsänderung des Proteins und der amino-terminal gelegenen Transaktivierungsdomäne. Das Repressormolekül wird so durch das Ras Onkoprotein in einen Aktivator überführt. Aktive und reprimierte C/EBPβ-Formen interagieren mit Mediator Multiproteinkomplexen über deren CRSP complex subunit 3 (CRSP130/Sur2) Untereinheit. Die CRSP complex subunit 3 Untereinheit findet sich in zwei unterschiedlichen Typen von Mediator-Komplexen: CRSP70-haltige Komplexe werden mit transkriptioneller Aktivierung, CDK8-haltige Komplexe vorwiegend mit transkriptioneller Repression in Verbindung gebracht. Phosphorylierung über den Ras-Signalweg führt zur Assoziation von C/EBPβ mit dem aktiven, CRSP70-haltigen Mediator-Komplex, welcher den Transkriptionsfaktor mit der basalen Transkriptionsmaschinerie verbinden und zelluläre Stimuli in Genexpression
übersetzen kann (Mo et al., 2004).

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Computer-gestützte Analysen zeigen eine potentielle SUMO-Akzeptorsequenz (ΨKXE, Ψ steht für eine hydrophobe Aminosäure; siehe auch Kap. 1.2) in allen C/EBP-Proteinen. Das Lysinmolekül, an welches SUMO konjugiert wird, ist in allen Mitgliedern der C/EBP-Familie und zwischen verschiedensten Spezies konserviert (Berberich-Siebelt et al., 2006). Dieser hohe Grad an Konservierung lässt auf eine wichtige biologische Funktion dieses Motivs schließen. SUMOylierung von C/EBPα (Subramanian et al., 2003), C/EBPβ (Eaton und Sealy, 2003; Berberich-Siebelt et al., 2006) und von C/EBPε (Kim et al., 2002) konnte bereits in vivo nachgewiesen werden. Mutationen der SUMO-Akzeptorsequenzen haben Änderungen der Proteinaktivitäten zur Folge.

1.2 Modifikation durch „Small Ubiquitin-like Modifiers“

Ubiquitin und Ubiquitin-verwandte Proteine („ubiquitin-like proteins“, Ubls) werden kovalent an Proteine gebunden, ändern die Eigenschaften der durch sie modifizierten Substrate und führen zu einer Erhöhung der Komplexität des Proteoms (Hay, 2005). Der „Small Ubiquitin-like Modifier“ (SUMO) ist ein ca. 100 Aminosäuren großer Vertreter dieser Familie, welcher nur etwa 20 % Sequenzhomologie zu Ubiquitin zeigt, jedoch über eine ähnliche räumliche Struktur verfügt (Bayer et al., 1998). Die Verteilung der geladenen Aminosäuren auf der Oberfläche und der N-terminale Teil des Proteins unterscheiden sich stark voneinander und deuten auf einen funktionellen Unterschied zwischen SUMO und Ubiquitin hin. SUMO Proteine finden sich in vielfältigen eukaryotischen Organismen wie z. B. Hefen, Nematoden, Fruchtfliegen und Säugern (Johnson, 2004). In multizellulären Organismen findet SUMO-Konjugation in allen Geweben und allen Entwicklungsstadien des Organismus statt (Johnson, 2004). Die SUMO-Familie umfasst vier Mitglieder in Säugern: SUMO-1, -2, -3 und -4. SUMO-1 besitzt keine weiteren SUMOylierungsmotive; SUMO-2 bis -4 hingegen besitzten weitere SUMO-Akzeptorsequenzen und können somit verzweigte Vernetzungen (Analog zur Ubiquitinierung) bilden. Die kovalente Konjugation findet an einem oder mehreren Lysinresten von Substratproteinen statt. Als konservierte SUMO-Akzeptorsequenz wurde das Motiv ΨKXE ermittelt, wobei Ψfür eine große hydrophobe Aminosäure (Leucin, Isoleucin, Valin oder Phenylalanin) steht und K das SUMOylierte Lysin. Darüber hinaus findet Konjugation von SUMO an davon abweichende Motive statt.

Seit der Entdeckung von SUMO vor ca. 10 Jahren konnte SUMO-Modifikation an vielen Proteinen festgestellt werden. Die modifizierten Substrate spielen eine Rolle bei unterschiedlichsten zellulären Funktionen wie z. B. Transkription, DNA-Reparatur, Kerntransport, Signaltransduktion und Zellzykluskontrolle (Johnson, 2004). Genetische Studien haben darüber hinaus auf einen möglichen Einfluß von SUMO auf die Dynamik von Chromatin-Strukturen hingewiesen. Die gemeinsame Eigenschaft von SUMO in all diesen Prozessen ist die Änderung der Substrat-Interaktionen mit anderen Makromolekülen. Dieser Einfluß ist jedoch für jedes SUMO-Substrat spezifisch.

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Dieser Prozess der SUMOylierung findet analog zur Ubiquitinierung statt, erfordert also neben SUMO-Proteinen drei enzymatische Funktionen (Abb. 1.3). Der erste Schritt wird durch die SUMO-aktivierenden Enzyme Aos1 und Uba2 (E1-Funktion), der zweite durch das SUMO-konjugierende Enzym Ubc9 (E2-Funktion) und der dritte Schritt durch die SUMO Protein-Ligasen PIAS, RanBP2 oder Pc2 (E3-Funktion) katalysiert.

Abb. 1.3: Schematische Darstellung des SUMO Reaktionsweges (modif i ziert nach Jaffray und Hay, 2006). Das unprozessierte SUMO-Vorläuferprotein wird durch eine SUMO-spezifische Protease gespalten und es entstehen zwei endständige Glycine am C-Terminus des Proteins. Das prozessierte Protein wird durch das E1-Enzym (Uba2/Aos1) gebunden und mit ATP aktiviert. Durch eine Transesterifizierungsreaktion wird SUMO nachfolgend auf das E2 SUMO-konjugierende Enzym (Ubc9) übertragen. SUMO kann nun an das Substratprotein konjugiert werden. Dieser Schritt wird bei einigen Substratproteinen durch E3-Ligasen (PIAS, RanBP2 oder Pc2) unterstützt. Die SUMOylierung kann durch SUMO-spezifische Proteasen vom Substratprotein entfernt werden.

Katalyiert wird die SUMOylierung durch eine Enzymkaskade in Abhängigkeit von ATP. Um die SUMO-Proteine kompetent für die nachfolgenden Reaktionen zu machen, müssen mehrere Aminosäuren von ihrem C-Terminus proteolytisch entfernt werden, so dass zwei endständige Glycine entstehen. Das SUMO-aktivierende Enzym E1, bestehend aus einem Uba2-Aos1-Heterodimer, bindet daraufhin die C-terminal trunkierten SUMO-Moleküle. Es entsteht eine energiereicher Thioester zwischen SUMO und Uba2. Nachfolgend wird SUMO auf das einzig bekannte E2-Enzym, Ubc9, transferiert. Es entsteht erneut eine Thioester-Bindung zwischen Ubc9 und SUMO. Durch strukturelle Untersuchungen eines Substrat-Ubc9-Komplexes konnte gezeigt werden, dass Ubc9 für die direkte Erkennung der Konsensus-Sequenz und SUMO-Konjugation verantwortlich ist (Bernier-Villamor et al., 2002). In vitro kann eine SUMOylierungs-Reaktion deshalb mit rekombinanten E1, E2 und SUMO-1-GG in Abhängigkeit von ATP durchgeführt werden. Die Anwesenheit einer E3-Ligase ist nicht erforderlich, um einen Transfer auf das Substratprotein zu ermöglichen. Die SUMO E3s wirken eher als Adaptoren, welche mit Ubc9-SUMO interagieren und den Transfer von SUMO auf spezifische Substratproteine verstärken.

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Die Isopeptid-Bindung wird letztendlich zwischen der endständigen Carboxylgruppe des letzten Glycins von SUMO und der γ-Aminogruppe des Lysins in einem SUMO-Motiv geknüpft. SUMOylierte Substrate können durch SUMO-spezifische Isopeptidasen der SENP-Familie dekonjugiert werden. Dies ist für eine dynamische Regulation SUMO-abhängiger Prozesse von entscheidender Bedeutung: In einer eukaryotischen Zelle liegt zu jeder Zeit nur ein kleiner Anteil (1-5 % der Gesamtproteinmenge) eines bestimmten Substrats in der SUMOylierten Form vor. Bei einer Lyse der Zellen bewirken die Proteasen eine rasche Dekonjugation assoziierter SUMO-Proteine.

Bisher konnte für drei Proteinfamilien eine E3-Ligase-Aktivität gezeigt werden: RanBP2 (Pichler et al., 2002), das Polycomb-Protein Pc2 (Kagey et al., 2003) und die PIAS Proteine (Johnson und Gupta, 2001; Kahyo et al., 2001; Sachdev et al., 2001). Die E3-Ligasen besitzen spezifische subzelluläre Lokalisationen: RanBP2 ist mit dem Kernporenkomplex assoziiert (Pichler et al., 2002), die PIAS-Proteine befinden sich im Nukleoplasma (Sachdev et al., 2001; Kotaja et al., 2002) und Pc2-Proteine lokalisieren in „Polycomb bodies“ (Kagey et al., 2003). Die Lokalisation der SUMO E3-Ligasen vermittelt demnach vermutlich funktionelle Spezifität.

1.3 Funktionelle Änderungen von Transkriptionsfaktoren durch SUMOylierung

Extrazelluläre Stimuli beeinflussen die posttranslationale Modifikation von Transkriptionsfaktoren über unterschiedliche Signalwege und modulieren dadurch die Aktivität dieser Proteine. Dies führt zu dynamischen Veränderungen bei der Genexpression. Die funktionellen Konsequenzen der Phosphorylierung für die Regulation der Aktivität von Transkriptionsfaktoren konnte bereits in vielen Fällen gezeigt werden. In den letzten Jahren wurde darüber hinaus deutlich, dass weitere posttranslationale Modifikationen wie Acetylierung, Methylierung, Ubiquitinierung und SUMOylierung die Aktivität von Transkriptionsfaktoren zusätzlich beeinflussen können. Die Modifikation mit SUMO hat vielfältige Konsequenzen für Mitglieder dieser Proteinfamilie. Sie ändert die Stabilität, die intrazelluläre Lokalisation, die Aktivität und die DNA-bindenden Eigenschaften der Substratproteine (Gill, 2003).

1.3.1 Repression durch SUMO-Konjugation

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In den meisten Fällen scheint eine Konjugation von SUMO die Aktivität von Transkriptionsfaktoren zu reprimieren (Gill, 2003). Dies wurde für eine Vielzahl von Proteinen, wie z. B. Sp3 (Ross et al., 2002; Sapetschnig et al., 2002), Elk-1 (Yang et al., 2003), c-Myb (Bies et al., 2002), C/EBP (Kim et al., 2002; Subramanian et al., 2003) und Steroidhormonrezeptoren (Poukka et al., 2000; Abdel-Hafiz et al., 2002; Tian et al., 2002) gezeigt. Die SUMO-Akzeptorsequenz liegt dort meistens in einer Domäne mit inhibitorischer Funktion. Die SUMO-Modifikation scheint jedoch nicht zu einer Änderung der DNA-bindenden Eigenschaften zu führen (Sachdev et al., 2001; Sapetschnig et al., 2002), sondern die Ausbildung neuer Protein-Protein-Wechselwirkungen zu ermöglichen. Dies führt in der Regel zur Inhibition des Transkriptionsfaktors, da neue Bindungsstellen für Korepressormoleküle, wie beispielsweise Histon-Deacetylasen (HDACs), geschaffen werden (Gill, 2004). SUMOylierung des Transkriptionsfaktors Elk-1 verstärkt die Assoziation mit der Histon-Deacetylase HDAC2 (Yang und Sharrocks, 2004). SUMO-modifiziertes p300, nicht jedoch unmodifiziertes p300, ist in der Lage, mit HDAC6 zu assoziieren (Girdwood et al., 2003). Die Repression von Transkriptionsfaktoren durch SUMOylierung kann durch die Wirkung spezifischer SUMO-Proteasen, wie z. B. SuPr-1, aufgehoben werden. Auf diese Weise können Proteine wie p300, Sp3 oder Elk-1 de-reprimiert werden (Ross et al., 2002; Girdwood et al., 2003; Yang et al., 2003).

1.3.2 Aktivierung durch SUMO-Konjugation

Die SUMOylierung von Transkriptionsfaktoren führt in der Regel zu deren Repression. Es gibt jedoch auch Beispiele für eine Aktivierung durch SUMOylierung. Dies konnte zum einen für die „heat shock factors“ HSF1 und HSF2 (Goodson et al., 2001; Hong et al., 2001; Hietakangas et al., 2003) und zum anderen für den Transkriptionsfaktor Tcf-4 gezeigt werden (Yamamoto et al., 2003). Die Tcf-4-abhängige Transkription wird durch Koexpression von β-Catenin und PIASy verstärkt und diese Aktivierung ist bei einer Mutation der SUMO-Akzeptorsequenz reduziert.

1.3.3 Änderung der subnukleären Lokalisation durch SUMO

SUMO-Konjugation ist ein Mechanismus zur Regulation der subnukleären Lokalisation von Transkriptionsfaktoren, welcher indirekt Einfluß auf deren transkriptionelle Eigenschaften nimmt.

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SUMOylierung von RanGAP1 stimuliert die Assoziation mit RanBP2 am Kernporenkomplex und reguliert so die subzelluläre Lokalisation von RanGAP1 (Mahajan et al., 1998; Matunis et al., 1998). Die subnukleäre Lokalisation von Transkriptionsfaktoren kann ebenfalls durch SUMO-Modifikation reguliert sein. Dies wurde beispielsweise für den Transkriptionsfaktor Sp3 gezeigt (Ross et al., 2002). Reprimiertes, SUMO-modifiziertes Sp3 akkumuliert an der nukleären Peripherie und in „nuclear dots“. Transkriptionell aktives, nicht-SUMOyliertes Sp3 hingegen zeigt ein diffuses Verteilungsmuster im Kern. Promyelocytic leukemia (PML) ist das namensgebende Protein der PML-Kernkörperchen und integraler Bestandteil dieses subnukleären Kompartiments. Es handelt sich hierbei um ein Tumorsuppressor, welcher in promyelozytischer Leukämie in mutierter Form vorliegt. SUMOylierung von PML ist eine notwendige Voraussetzung für die Bildung von PML-Körperchen und die Rekrutierung transkriptioneller Regulatoren, wie beispielsweise Sp100 oder CBP, in diese nukleären Strukturen (Sternsdorf et al., 1999). Es wurde deshalb vorgeschlagen, dass PML-Körperchen Orte zur Lagerung SUMOylierter Substrate sind (Hay, 2005). Die Funktion der PML-Körperchen ist nicht abschließend geklärt. Viele Transkriptionsfaktoren, Koaktivatoren und Korepressoren kolokalisieren jedoch mit diesen Strukturen und scheinen an der Regulation von Transkriptionsfaktoraktivität beteiligt zu sein (Zhong et al., 2000). Sp100 ist eine Komponente der PML-Körper und interagiert mit HP1a. Diese Assoziation wird in vitro durch SUMOylierung verstärkt. HP1a ist in der Lage, repressive Chromatinstrukturen auszubilden. SUMOylierung könnte in diesem Zusammenhang einen Mechanismus zur Rekrutierung von Kernproteinen in repressive Chromatinbereiche darstellen (Hay, 2005).

1.3.4 Änderung der Proteinstabilität durch SUMO

Lysinreste können posttranslational acetyliert, ubiquitiniert, methyliert und SUMOyliert werden. SUMO kompetitiert demnach mit anderen posttranslationalen Modifikationen um Substrat-Lysine (Gill, 2003).

Die Aktivität des Transkriptionsfaktors NF-κB wird auf unterschiedlichen Ebenen reguliert, vor allem aber durch die Bindung an das Inhibitormolekül IκBα im Cytoplasma. Durch extrazelluläre Signale wird IκBα an einem bestimmten Lysinrest ubiquitiniert und degradiert. SUMOylierung an dem gleichen Lysinrest kann die Ubiquitinierung verhindern und stabilisiert so das Protein (Desterro et al., 1998). Auf diese Weise kann die Repression von NF-κB aufrechterhalten werden. Für den Transkriptionsfaktor Sp3 konnte gezeigt werden, dass ein bestimmter Lysinrest entweder SUMOyliert oder acetyliert werden kann und diese Modifikationen einen Einfluss auf die Aktivität des Proteins haben (Braun et al., 2001).

1.3.5 Änderung der Proteinkonformation durch SUMO

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SUMOylierung kann jedoch auch eine Änderung der Konformation des Substratproteins bewirken. Dies wurde bislang nur für das DNA-Reparaturenzym Thymin-DNA-Glykosylase (TDG) gezeigt (Steinacher und Schar, 2005). Eine konformationelle Änderung von Transkriptionsfaktoren durch SUMO wurde hingegen noch nicht beschrieben.

1.4 SUMOylierung führt zur Modulation von Protein-Protein-Interaktionen

Posttranslationale Modifikationen, wie beispielsweise Phosphorylierung und Ubiquitinierung, verändern Protein-Protein-Interaktionen. Dies scheint auch für SUMOylierung der Fall zu sein. Die Interaktion zwischen RanBP2 und Ran-GAP1 kann beispielsweise nur stattfinden, wenn letzteres Protein in seiner SUMOylierten Form vorliegt (Mahajan et al., 1997; Matunis et al., 1998). Die SUMO-1 Konjugation an p300 führt zur Rekrutierung von HDAC6 (Girdwood et al., 2003), die Modifikation von Elk-1 zur Bindung von HDAC2 (Yang und Sharrocks, 2004). Daher liegt die Schlußfolgerung nahe, dass die Modifikation durch SUMO neue Bindungsstellen für Interaktionspartner schafft. Eine direkte Modulation der Aktivität der modifizierten Proteine durch eine Konformationsänderung scheint dabei eher eine Ausnahme zu sein. Die SUMO-Konjugationsmotive befinden sind nämlich in der Regel in unstrukturierten Proteinbereichen, wie im Fall von p53 (Rodriguez et al., 1999), oder an herausragenden Schleifenstrukturen, wie für Ran-GAP1 gezeigt wurde (Bernier-Villamor et al., 2002). Darüber hinaus scheinen die Modifikationsstellen keine spezifische Sekundärstruktur zu besitzen (Lin et al., 2002). Wenn SUMO also eine Bindungsmöglichkeit für neue Interaktionspartner schafft, so könnte in diesen Proteinen ein SUMO-bindendes Motiv vorhanden sein. Dieses konnte unter Zuhilfenahme von NMR-Technologie und „site-directed mutagenesis“ auf das Motiv (V / I-X-V / I-V / I) eingegrenzt werden, welches sich in unterschiedlichsten SUMO-bindenden Proteinen wie z. B. PIASx, PML, SAE2/Uba2 und RanBP2 findet (Song et al., 2004). Interessanterweise findet sich dieses Motiv neben PIASx auch in allen Mitgliedern der PIAS-Familie, mit Ausnahme von PIASy (siehe Abb. 1.4). PIASy scheint demnach nicht die Fähigkeit zu besitzen, SUMO-Peptide zu binden. Trotzdem ist eine E3-Ligase-Funktion für PIASy postuliert worden (Sachdev et al., 2001) und PIASy kann selbst an Lys-35 mit SUMO modifiziert werden (Ihara et al., 2005).

1.5 SUMOylierung ist essentiell für die Organisation und Funktion des Zellkerns

Die Inaktivierung von Ubc9 und der damit verbundene vollständige Verlust der zellulären SUMOylierung führt zu drastischen phänotypischen Effekten. Ubc9-defiziente Embryos sterben in einer frühen Entwicklungsphase durch schwere Chromosomenkondensations- und Segregationsdefekte (Nacerddine et al., 2005). Zudem kommt es zu Störungen der nukleären Organisation durch Fehlentwicklung der Kernmembran, der Nukleoli und PML-Körperchen. RanGAP1 kann in Ubc9-/--Zellen nicht mehr mit dem Kernporenkomplex assoziieren und es kommt zu einer fehlerhaften Verteilung von Ran.

1.6 „Protein inhibitor of activated STAT“

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„Protein inhibitor of activated STAT“ (PIAS) Proteine wurden als spezifische Kofaktoren identifiziert, die die DNA-bindenden Eigenschaften und transkriptionelle Aktivierung der STAT Transkriptionsfaktoren reduzieren (Chung et al., 1997). Im Laufe der Zeit wurde deutlich, dass PIAS-Proteine transkriptionelle Koregulatoren in unterschiedlichsten zellulären Signaltransduktionskaskaden sind (Shuai und Liu, 2005). Neben dem STAT Signalweg werden z. B. Steriodhormon-Signalwege beeinflusst. Abhängig vom biologischen Kontext kann es zu einer Aktivierung oder Repression eines bestimmten Signalwegs kommen.

PIAS Proteine besitzen E3 SUMO-Ligase Aktivität. Es wird angenommen, dass sie die Interaktion zwischen dem energiereichen Ubc9-SUMO Thioester und dem Substrat stabilisieren und so die Katalyse beschleunigen. Darüber hinaus besitzt PIAS im C-terminalen Teil des Proteins SUMO-bindende Motive, mit denen SUMO direkt gebunden werden kann. Studien an funktionell inaktiven PIAS-Proteinen führten zu der Vermutung, dass PIAS-Proteine zudem eine E3 SUMO Ligase-unabhängige Funktion besitzen (Sachdev et al., 2001; Megidish et al., 2002; Gross et al., 2004).

Bislang wurden fünf PIAS-Proteine in Säugetieren identifiziert: PIAS1, PIAS3, PIASx und PIASy. Soweit bekannt existieren von allen PIAS-Proteinen, mit Ausnahme von PIAS1, jeweils zwei Isoformen, die sich nur geringfügig voneinander unterscheiden: PIAS3 und PIAS3L, PIASxα und PIASxβ und PIASy und PIASyE6-. Die Proteine der PIAS-Familie zeigen eine über 40%ige Übereinstimmung ihrer Aminosäuresequenz. Verschiedene funktionelle Domänen und Motive sind zwischen den Mitgliedern der Familie konserviert (Abb. 1.4).

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Abb. 1.4: Schematische Darstellung der PIAS Proteine. Die obere Abb. zeigt die Domänenstruktur von PIAS3. Sie zeigt die N-terminal gelegene SAP-Domäne, das PINIT Motiv, die für die SUMO-Katalyse relevante SP-RING Domäne, die saure Region („acidic region“, AR) mit dem SUMO-bindenden Motiv und die C-terminal gelegene Serin/Threonin-reiche Region (S/T). Diese Domänenstruktur ist auch bei den hier nicht gezeigten Vertretern der Proteinfamilie (PIAS1, PIASxα und PIASxβ) stark konserviert. Abweichend davon zeigt PIASy eine C-terminale Verkürzung des Proteins und ein Fehlen des SUMO-bindenden Motives.

N-terminal gelegen befindet sich eine SAP-Domäne. Dabei handelt es sich um ein 35 Aminosäuren große Domäne, welche nach den Proteinen SAF-A/B, Acinus und PIAS (SAP) benannt wurde. Proteine mit SAP-Domänen können an unterschiedlichen Prozessen wie Transkription, DNA-Reparatur, RNA-Prozessierung und Degradation des Chromatins bei Apoptose beteiligt sein. SAP-Domänen können A+T-reiche DNA-Sequenzen erkennen und binden, welche in „scaffold-attachment regions“ (SARs) vorhanden sind. Diese SARs könnten dafür verantwortlich sein, Chromatinschleifen an der nukleären Matrix zu verankern und somit indirekt einen Einfluß auf die Transkription ausüben. In vitro konnte eine Bindung von PIAS1 und PIASy an A+T-reiche DNA bereits gezeigt werden (Sachdev et al., 2001). Die Struktur der SAP-Domäne von PIAS1 wurde mittels NMR-Spektroskopie gelöst und zeigt eine „four-helix-bundle“ Struktur (Okubo et al., 2004). Innerhalb dieser konservierten Domäne befindet sich ein LXXLL-Koregulator Motiv, welches beispielsweise für die transkriptionelle Repression von STAT1 oder den Androgen-Rezeptor durch PIASy verantwortlich ist (Gross et al., 2001; Liu et al., 2001).

Die katalytische Funktion der E3-Ligase befindet sich in der SP-RING-Domäne der PIAS-Proteine. Neben PIAS besitzen die Hefeproteine Siz1 und Siz2 diese RING-Finger-ähnliche Zink-bindende Domäne (SP-RING steht für Siz/PIAS-RING) (Johnson und Gupta, 2001). Dem SP-RING-Finger fehlen zwei der Cysteine, welche in allen RING-Finger Proteinen konserviert sind. Darüber hinaus weicht der Abstand der einzelnen Zink-koordinierenden Cysteine in der SP-RING-Domäne von dem in RING-Domänen von E3-Ubiquitin-Ligasen ab. Durch Mutation von nur einer konservierten Aminosäure kann die SUMO-E3-Ligase Aktivität der PIAS-Proteine ausgeschaltet werden (Kotaja et al., 2002). PIAS ist in der Lage über seinen SP-RING sowohl mit Ubc9 als auch dem Substrat zu interagieren und so die SUMOylierungsreaktion zu erleichtern.

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Zusätzlich enthalten PIAS-Proteine ein PINIT-Motiv. Dieser konservierte Bereich scheint für die Retention von PIAS3 im Kern verantwortlich zu sein (Duval et al., 2003), eine Isoform des PIASy-Proteins ohne PINIT-Motiv (PIASyE6-) hingegen ist auch im Nukleus lokalisiert (Wong et al., 2004).

Die weiter C-terminal gelegene Region ist reich an sauren Aminosäuren. Sie spielt eine Rolle bei Protein-Protein-Interaktionen und hat einen Einfluß auf die E3-Ligase-Aktivität des Proteins, vermutlich durch das SUMO-bindende Motiv in dieser Domäne. PIASy und PIASyE6- besitzen dieses Motiv nicht, zeigen jedoch auch E3-SUMO-Ligase Aktivität wie die anderen Mitglieder der Proteinfamilie (Sachdev et al., 2001; Wong et al., 2004). Am C-terminalen Ende der Proteine befindet sich ein Serin-/Threonin-reicher Sequenzabschnitt, dessen Funktion jedoch unklar ist.

In „yeast two-hybrid“ Untersuchungen und Koimmunopräzipitationsstudien konnte gezeigt werden, dass PIAS1 mit STAT1, PIAS3 mit STAT3 und PIASx mit STAT4 interagieren kann. Diese PIAS-STAT-Interaktionen werden Cytokin-abhängig induziert. In Reportergenstudien wurde darüber hinaus deutlich, dass PIAS die STAT-abhängige Genaktivierung inhibiert. Neben PIAS1 ist auch PIASy in der Lage, mit STAT1 zu interagieren und die STAT-abhängige Genaktivierung zu hemmen. Dies geschieht jedoch durch unterschiedliche Mechanismen. PIAS1 blockiert die DNA-bindende Aktivität von STAT1, PIASy hingegen scheint als Korepressor von STAT1 zu wirken. Diese Versuche legen nahe, dass die einzelnen PIAS-Proteine sowohl redundante als auch spezifische Funktionen zeigen.

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Zur Klärung der physiologischen Funktionen der PIAS-Proteine wurden unterschiedliche „knock-out“ Mäuse generiert. PIAS1-/- Mäuse zeigen einen verstärkten Schutz vor pathogen-induzierten Infektionen. Die IFN-γ- bzw. IFN-β-vermittelte Induktion von STAT1 kann hier nicht mehr negativ beeinflusst werden (Liu et al., 2004). In der Folge zeigen die Tiere eine verstärkte Immunantwort nach viraler oder bakterieller Infektion. PIASx wird stark in testikulärem Gewebe exprimiert und es existieren zwei Splicevarianten, PIASxα und PIASxβ. Es kann demnach auf eine Funktion von
PIASx bei der Spermatogenese geschlossen werden. PIASx-/- Mäuse zeigen ein reduziertes Testisgewicht, eine erhöhte Apoptoserate testikulärer Zellen und reduzierte Spermienanzahl. Die Tiere sind jedoch fertil und haben eine normale Qualität der Spermien (Santti et al., 2005). PIASy-/- Mäuse scheinen phänotypisch normal zu sein (Roth et al., 2004; Wong et al., 2004). Einer neuen Studie zufolge führt die Überexpression von PIASy in humanen Fibroblasten jedoch zu zellulärer Seneszenz durch Veränderung von p53- und Rb-Tumor-Suppressor-Signalwegen (Bischof et al., 2006).

Von PIAS3 hingegen ist keine „knock-out“ Maus publiziert worden, deshalb existieren zu diesem Protein recht wenige Daten, die Hinweise auf die physiologische Funktion des Proteins geben. PIAS3 wird im Verlauf der Adipogenese und im ausdifferenzierten weißen Fettgewebe konstitutiv exprimiert und während dieses Prozesses aus dem Zellkern exportiert (Deng et al., 2006). Erhöhte Expressionsniveaus von PIAS3 wurden zudem im weißen Fettgewebe von „obese“ (ob/ob) Mäusen gefunden. PIAS3 könnte deshalb an der Pathophysiologie der Fettleibigkeit beteiligt sein. Konstitutive nukleäre Expression von PIAS3 in 3T3-L1 Präadipozyten führte zudem zu einer Inhibition der Expression Adipozyten-spezifischer Gene (Deng et al., 2006).

In Drosophila melanogaster existiert nur ein PIAS-Gen: dPIAS/Zimp/Su(var)2-10. Ein Verlust der dPIAS-Allele geht mit Abnormalitäten bei der Chromosomenkondensation und Segregation einher. dPIAS scheint daher unterschiedliche Funktionen bei der Etablierung und dem Erhalt der Chromosomenorganisation in Interphasekernen zu übernehmen (Hari et al., 2001). Darüber hinaus wurde ein Defekt bei der Augen- und Blutentwicklung in Drosophila beobachtet, falls kein dPIAS in den Zellen exprimiert wird (Betz et al., 2001). Die Autoren dieser Studie postulieren, dass dPIAS als Tumorsuppressorgen wirkt. Unterschiedlichste Arbeiten zeigen, dass aktives STAT3 in einer Reihe von humanen Tumoren vorliegt (Jove, 2000) und als Onkogen wirkt (Bromberg et al., 1999). Mutationen in humanem PIAS3 könnten also eine ständige Aktivierung von STAT3 ermöglichen, welche zur Ausbildung von Tumoren führen könnte.

1.7 Posttranslationale Modifikationen von C/EBPβ

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Posttranslationale Modifikationen, wie z. B. Phosphorylierung, Acetylierung, Ubiquitinierung und SUMOylierung, spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation der Stabilität und der transkriptionellen Aktivität von Transkriptionsfaktoren.

Auf die funktionelle Modulation von C/EBPβ durch ras-MAPK Phosphorylierung wurde bereits in Kapitel 1.1.3 eingegangen. Diese Phosphorylierungsstelle an Thr-220 im Huhn ist auch in anderen Spezies konserviert (Thr-235 im Menschen (Nakajima et al., 1993) und Thr-188 in der Ratte (Hanlon et al., 2001). Neben dieser wurden weitere Akzeptorsequenzen identifiziert, welche durch unterschiedliche Kinasen phosphoryliert werden können: „Glycogen-synthase kinase 3“ (GSK-3) phosphoryliert Ser-184 in murinem LAP (Ser-33 in LIP) (Piwien-Pilipuk et al., 2001), „calcium/calmodulin-dependent protein kinase“ phosphoryliert Ser-276 (Wegner et al., 1992), Proteinkinase C (PKC) phosphoryliert Ser-105 und Ser-240, Proteinkinase A (PKA) phosphoryliert Ser-105, Ser-299 und Ser-240 von LAP (Trautwein et al., 1993; Trautwein et al., 1994; Chinery et al., 1997), „p90 ribosomal S kinase“ (p90rsk) phosphoryliert Ser-105 im C/EBPβ der Ratte und Thr-217 von murinem LAP (Buck et al., 1999) und Cdk2 und Cdc2 phosphorylieren Ser-64 und Thr-189 (Shuman et al., 2004). In unserer Arbeitsgruppe wurde eine Reihe weiterer Phosphorylierungstellen durch massenspektrometrische Analysen von affinitätsgereinigtem C/EBPβ identifiziert. Zusammenfassend wird C/EBPβ durch unterschiedliche Signalwege an verschiedenen Positionen phosphoryliert und in seiner Aktivität verändert.

Die Acetylierung von C/EBPβ wurde in zwei unterschiedlichen Publikationen vorgeschlagen (Xu et al., 2003; Joo et al., 2004). In einer detailierteren Studie wurde der Einfluss von Acetylierung an Position Lys-39 der murinen Sequenz untersucht (Cesena et al., 2007). Dabei stellte sich heraus, dass die Mutation der N-terminalen Acetylierungsstelle von C/EBPβ die transkriptionelle Aktivierung des C/EBPα-, des C/EBP konsensus- und des c-fos-Promotors vermindert.

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C/EBPα kann an Lysin-159 mit SUMO-1 oder SUMO-3 modifiziert werden und die Mutation K159A führt zu einem Verlust der SUMO Konjugationsmöglichkeit (Subramanian et al., 2003). Folglich ist K159 die einzige SUMO-Akzeptorsequenz in C/EBPα. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass C/EBPα mit Ubc9 interagiert und in vitro SUMOyliert werden kann. Die E3-Ligase PIASy kann die Konjugation von SUMO-1 und SUMO-3 an C/EBPα in vitro und in vivo verstärken. Für C/EBPε konnte gezeigt werden, dass eine kovalente Bindung von SUMO-1 an Lysin-121 in der regulatorischen Region I erfolgen kann (RDI inhibitory domain). Diese Modifikation wurde mit einem Verlust der inhibitorischen Funktion der regulatorischen Domäne in Verbindung gebracht (Kim et al., 2002).

Um die in vivo Relevanz der SUMOylierung von C/EBPβ zu verstehen, wurden „knock-in“ Mäuse mit einer Mutation in der SUMO-Akzeptorsequenz generiert (K133A) (Begay und Leutz, unpubliziert). Diese Tiere werden derzeit charakterisiert.

Arbeiten in unserer Forschungsgruppe haben darüber hinaus gezeigt, dass C/EBPβ durch Methylierung an Argininresten modifiziert werden kann (Kowenz-Leutz, Knoblich, Vermeulen, Mann und Leutz, unpubliziert) und das Mutationen dieser Seitengruppen die Aktivität und die biologische Funktion von C/EBPβ verändern können (Kowenz-Leutz und Leutz, unpubliziert). Bislang konnten zwei methylierte Arginine durch massenspektrometrische Untersuchungen identifiziert werden (R60 und R295). Katalysiert werden diese Modifikationen durch verschiedene Protein-Arginin-N-Methyltransferasen (PRMTs), welche Mono- sowie symmetrische und asymmetrische Dimethylierung der Guanidino-Stickstoffatome bewirken können.

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Durch massenspektrometrische Untersuchungen an immunopräzipitiertem C/EBPβ konnte außerdem Methylierung an verschiedenen Lysin-Resten identifiziert werden (Knoblich, Vermeulen, Mann und Leutz, unpubliziert). Bisher konnte monomethyliertes Lysin an zwei Positionen nachgewiesen werden (K39 und K168). K39 kann interessanterweise auch in acetylierter Form vorliegen (Cesena et al., 2007). Eine kompetitive Situation zwischen den beiden Modifikationen an dieser Stelle ist demnach sehr wahrscheinlich.

C/EBPβ wird also an vielen Positionen durch vielfältige posttranslationale Modifikationen verändert. Für einige der Phosphorylierungsstellen des Proteins sind die Signalwege, die beteiligten Enzyme und funktionellen Konsequenzen der Modifikationen z. T. bekannt. Bei SUMOylierung und Acetylierung sind die Folgen für das Protein nicht abschließend verstanden und die Signalwege, die diese Modifikationen steuern, sind unzureichend charakterisiert. Methylierungen an Arginin- oder Lysinresten stellen eine vollkommen neue Klasse von posttranslationalen Modifikationen an Transkriptionsfaktoren dar. Die funktionellen Konsequenzen für die Proteine sind weitgehend unbekannt.

1.8 Ziele der Arbeit

Der ubiquitär exprimierte Transkriptionsfaktor CCAAT/Enhancer Binding Protein β (C/EBPβ) verfügt über drei funktionelle Module. Der N-terminale Bereich bildet die Transaktivierungsdomäne. Im zentralen Bereich des Moleküls befindet sich eine regulatorische Region und C-terminal schließt sich die bZIP-Region mit einer DNA-Bindungs- und einer Dimerisierungsdomäne an. C/EBPβ ist mit unterschiedlichen Koaktivator- bzw. Korepressorkomplexen assoziiert, wie z. B. dem SWI/SNF-Komplex und unterschiedlichen Mediator-Komplexen, die die Aktivität des Transkriptionsfaktors regulieren.

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In dieser Studie sollten weitere Interaktionspartner von C/EBPβ identifiziert werden, um die Mechanismen bei der Gen- und Chromatinregulation durch C/EBPβ zu verstehen. In einem proteom-weiten Ansatz sollte die Frage beantwortet werden, welche Proteine bzw. Proteinkomplexe an die amino-terminal gelegene transaktivierende Region und an die zentral im Protein gelegene regulatorische Region in Abhängigkeit ihres SUMOylierungsstatus gebunden werden können. Diese putativen Interaktionspartner sollten zunächst in Gruppen eingeteilt werden und die Bindung der interessantesten Kandidaten in unabhängigen Studien überprüft werden. Anschließend sollte ihre Funktion im Kontext von C/EBPβ geklärt werden und somit neue Aspekte der Biologie von C/EBPβ entschlüsselt werden.

C/EBPβ wird durch vielfältige posttranslationale Modifikationen in seiner Aktivität reguliert. SUMOylierung der zentralen regulatorischen Region scheint dabei eine Schlüsselmodifikation zu sein, welche nachfolgende Modifikationen beeinflusst. Darüber hinaus ist C/EBPβ in der Lage, zwei Enzyme der SUMOylierungsmaschinerie, Ubc9 und PIAS3, zu binden. Die funktionellen Konsequenzen der Modifikation durch SUMO und die Interaktion mit der SUMO E3-Ligase PIAS3 wurden im zweiten Teil der Arbeit untersucht.


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23.01.2008