2 Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Chemikalien

↓19

2.1.2 „Kits“

↓20

2.1.3 Enzyme

2.1.4 Proteine

2.1.5 Antikörper

↓21

2.1.6 Chromatographie

2.1.7 Bakterien

Für die Vervielfältigung von Plasmid-DNA wurde der E. coli Stamm TOP10F´ (Invitrogen, Produkt-Nr. C3030-03) verwendet. Abweichend dazu wurde der Stamm TOP10/P3 (Invitrogen, Produkt-Nr. C5050-03) für die Vervielfältigung von supF-Gen tragenden Plasmiden (z. B. pcDM8) verwendet. Für die Vervielfältigung von psiRNA-Vektoren wurde der E. coli Stamm GT116 Bakterien verwendet.

↓22

Für die Expression von Proteinen in E. coli wurden verschiedene BL21-Derivate benutzt, welche in Tab. 2.1 zusammengefasst sind.

Tab. 2.1: Verwendete Bakterienstämme zur Expression von Fusionsproteinen. Detaillierte Informationen zu verwendeten Bakterienstämmen wurden dem „pET System Manual, 10th Edition“ (Novagen, 2003) entnommen

Bakterienstamm

Eigenschaften

Resistenz

BL21

Besitzt kein Gen für T7 RNA Polymerase, nicht für Expression von Genen geeignet, die unter der Kontrolle von T7 Promotoren stehen.

-

BL21(DE3)

Stamm für die Expression von Genen, die unter der Kontrolle von T7 Promotoren stehen.

-

BL21(DE3)pLysS

Enthält pLysS, welches für T7 Lysozym kodiert. Reduziert die basale Expression von Zielgenen.

Chloramphenicol (34 µg/ml)

BL21(DE3)pLysE

Enthält pLysE. Reduziert die basale Expression von Zielgenen mit einer größeren Stringenz im Vergleich zu pLysS.

Chloramphenicol (34 µg/ml)

Rosetta2

B21-Derivat, welches zusätzlich das pRARE-Plasmid enthält. Dies ermöglicht die Expression von sieben in E. coli selten auftretenden tRNAs, welche die Translationseffizienz erhöhen.

Chloramphenicol (34 µg/ml)

2.1.8 Zellkultur

2.1.9 Zellinien

↓23

2.1.10 Laborgeräte

2.1.11 Oligonukleotidsequenzen und Vektoren

In Tab. 2.2 sind die für die Arbeit verwendeten Oligonukleotide aufgeführt. Alle Oligonukleotide wurden von der Firma BioTez (Berlin) synthetisiert und HPLC-gereinigt.

↓24

Tab. 2.2: Verwendete Oligonukleotide für Sequenzierungen, Klonierungen und Mutagenesen. Die jeweilige Nukleotidsequenz ist vom 5´-Ende dargestellt.

Name

Sequenz

T7

5´- TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG –3´

Sp6

5´- ATT TAG GTG ACA CTA TAG –3´

5´ pMSCV

5´- CCC TTG AAC CTC CTC GTT CGA CC –3´

3´ pMSCV

5´- GAG ACG TGC TAC TTC CAT TTG TC –3´

TAP hLAP* for

5´- CGC GGA TCC GCC GCC ATG GCA CAA CGC CTG GTG GCC TGG –3´

TAP hLAP for

5´- CGC GGA TCC GCC GCC ATG GAA GTG GCC AAC TTC TAC –3´

TAP hLIP for

5´- CGC GGA TCC GCC GCC ATG GCG GCG GGC TTC CCG TAC –3´

TAP hCR89 for

5´- CGC GGA TCC GCC GCC ATG GCG CCC TCG CAG GTC AAG AGC –3´

TAP h rev

5´- CGC GGA TCC GCA GTG GCC GGA GGA GGC GAG –3´

hCR567 BamH I for

5´- CGC GGA TCC GCC GCC ATG GAC CTC TTC TCC GAC GAC TAC –3´

hCR567 EcoR I rev

5´- GCG GAA TTC TCT TCT TGG CCT TGC TCT TGA C –3´

mPIAS3 C343S for

5´- GCC CTC ACC TCT GCC CAT CTG –3´

mPIAS3 C343S rev

5´- CAG ATG GGC AGA GGT GAG GGC –3´

mPIAS3 Xho I for

5´- CCG CTC GAG GCC GCC ATG GTG ATG AGT TTC CGA GTG –3´

mPIAS3 254 Xho I for

5´- CCG CTC GAG ATG GTC CCC AAC ACC ATC GTA GTT –3´

mPIAS3 260 Xba I rev

5´- CTA GTC TAG ACT AAA CTA CGA TGG TGT TGG GGA C –3´

mPIAS3 369 Xho I for

5´- CCG CTC GAG ATG TGT GAC AAG AAG GCT CCC TAT –3´

mPIAS3 end Xba I rev

5´- CTA GTC TAG ACT AGT CCA AGG AAA TGA CGT CTG A –3´

AP for (Kenner et al., 2004)

5´- CAC GCG ATG CAA CAC CAC TCA GG –3´

AP rev (Kenner et al., 2004)

5´- GCA TGT CCC CGG GCT CAA AGA –3´

Ocn for (Kenner et al., 2004)

5´- ACC CTG GCT GCG CTC TGT CTC T –3´

Ocn rev (Kenner et al., 2004)

5´- GAT GCG TTT GTA GGC GGT CTT CA –3´

Bsp for (Kenner et al., 2004)

5´- TAC CGG CCA CGC TAC TTT CTT TAT –3´

Bsp rev (Kenner et al., 2004)

5´- GAC CGC CAG CTC GTT TTC ATC C –3´

In Tab. 2.3 sind die viralen, eukaryotischen und prokaryotischen Expressionsvektoren aufgelistet, die im Rahmen dieser Arbeit verwendet wurden.

Tab. 2.3: Verwendete virale, eukaryotische und prokaryotische Expressionspla s m i de.

Virale Expressionsvekt o ren

Beschreibung/Quelle

pZome

Cellzome

pZome-hLAP*-TAP

5´-BamHI-3´ PCR-Fragment

pZome-hLAP-TAP

5´-BamHI-3´ PCR-Fragment

pZome-hLIP-TAP

5´-BamHI-3´ PCR-Fragment

pZome-CR8-9-TAP

5´-BamHI-3´ PCR-Fragment

Eukaryotische Expressionsvekt o ren

Beschreibung/Quelle

pcDM8

Invitrogen

pcDM8-cC/EBPβ LAP*

(Kowenz-Leutz et al., 1994)

pcDM8-cC/EBPβ LAP

(Kowenz-Leutz et al., 1994)

pcDM8-cC/EBPβ LIP

(Kowenz-Leutz et al., 1994)

pcDM8-cC/EBPβ ΔCR567

(Kowenz-Leutz et al., 1994)

pcDM8-cC/EBPβ CR2389

Leutz Labor

pcDM8-cC/EBPβ CR489

Leutz Labor

pcDM8-cC/EBPβ ΔCR4

Leutz Labor

pcDM8-C/EBPβLAP* K155A

Leutz Labor

pcDNA3

Invitrogen

pcDNA3-cC/EBPβ-FLAG

(Kowenz-Leutz et al., 1994)

pcDM8-cC/EBPβ CR1-4-Gal4 DBD

Leutz Labor

pcDM8-cC/EBPβ CR1-3-Gal4 DBD

Leutz Labor

pcDM8-cC/EBPβ CR4-Gal4 DBD

Leutz Labor

pcDNA1-c-Myb

Leutz Labor

pcDNA3-HA-PIAS3

5´-XhoI, 3´-XbaI, PCR-Fragment

pcDNA3-HA-PIAS3 C343S

5´-XhoI, 3´-XbaI, PCR-Fragment

pcDNA3-HA-PIAS3 1-251

5´-XhoI, 3´-XbaI, PCR-Fragment

pcDNA3-HA-PIAS3 56-366

5´-XhoI, 3´-XbaI, PCR-Fragment

pcDNA3-HA-Ubc9

Zur Verfügung gestellt von Dr. Stefan Müller (MPI Biochemie, München)

pcDNA3-HA-SUMO-1

Zur Verfügung gestellt von Dr. Stefan Müller (MPI Biochemie, München)

pcDNA3-HA-SuPr-1

(Best et al., 2002)

pcDNA3-hG9a

(Nishio und Walsh, 2004)

pcDNA3-G9a-HA

(Nishio und Walsh, 2004)

pcDNA3-G9a ΔSET-HA

(Nishio und Walsh, 2004)

pCMV-GFP-G9a

(Nishio und Walsh, 2004)

pCMV-GFP-G9a ΔSET

(Nishio und Walsh, 2004)

pcDNA3-FLAG-Notch1 IC

(Ansieau et al., 2001)

pcDNA3-FLAG-Notch1 IC ΔRAM

(Ansieau et al., 2001)

pcDNA3-Gankyrin-HA

Zur Verfügung gestellt von Prof. Dr. U. Heinemann (MDC, Berlin)

pCMV-β-Galactosidase

Clontech

pM82

(Sterneck et al., 1992a; Sterneck et al., 1992b)

Hes-1 Reportergenkonstrukte

Zur Verfügung gestellt von Dr. Ryoichiro Kageyama (Nishimura et al., 1998)

RBP-Jκ Expressionsvektoren

Zur Verfügung gestellt von Dr. Hisanori Kurooka (Kyoto Universität, Japan)

pcDNA3-N-CoR

Leutz Labor

pCMX-N-CoR2/-SMRT

(Chen und Evans, 1995)

pVSV-G

Clontech

psiRNA-h7SK GFP zeo

Invivogen

psiRNA-h7SK GFP zeo siPIAS3

5´-BbsI 3´-BbsI

Prokaryotische Expressionsve k t o ren

Beschreibung

pGEX-2TK

Amersham

pGEX-2TK-hC/EBPβ CR1-4

5´-BamHI, 3´-EarI (blunt)

pGEX-2TK-hC/EBPβ CR567

5´-BamHI, 3´-EcoRI, PCR-Fragment

pGEX-4T1-cC/EBPβ

5´-BamHI, 3´-EcoRI, PCR-Fragment

pGEX-4T1-cC/EBPβ CR1-7

5´-BamHI, 3´-EcoRI, PCR-Fragment

pGEX-4T1-cC/EBPβ CR1-4

5´-BamHI, 3´-EcoRI, PCR-Fragment

pGEX-4T1-cC/EBPβ CR567

5´-BamHI, 3´-EcoRI, PCR-Fragment

pGEX-4T1-cC/EBPβ CR5-6

5´-BamHI, 3´-EcoRI, PCR-Fragment

pGEX-4T1-cC/EBPβ CR6-7

5´-BamHI, 3´-EcoRI, PCR-Fragment

pGEX-4T1-cC/EBPβ CR6

5´-BamHI, 3´-EcoRI, PCR-Fragment

pGEX-4T1-cC/EBPβ CR7

5´-BamHI, 3´-EcoRI, PCR-Fragment

pGEX-4T1-cC/EBPβ CR5+7

5´-BamHI, 3´-EcoRI, PCR-Fragment

pGEX-4T1-cC/EBPβ LIP

5´-BamHI, 3´-EcoRI, PCR-Fragment

pRHSUMO

(Mencia und de Lorenzo, 2004)

pBADE12

(Mencia und de Lorenzo, 2004)

pGEX-PIAS1

Zur Verfügung gestellt von Prof. Dr. G. Suske (Universität Marburg)

pGEX-PIAS3

Zur Verfügung gestellt von Prof. Dr. G. Suske (Universität Marburg)

pGEX-PIASy

Zur Verfügung gestellt von Prof. Dr. G. Suske (Universität Marburg)

pIX

Qiagen

pIX-HA-PIAS3

5´-NcoI, 3´-SmaI

pIX-HA-PIAS3 C343S

5´-NcoI, 3´-SmaI

pIX-HA-PIAS3 1-251

5´-NcoI, 3´-SmaI

pIX-HA-PIAS3 56-366

5´-NcoI, 3´-SmaI

pIX-HA-PIAS3 245-619

5´-NcoI, 3´-SmaI

pIX-HA-PIAS3 360-619

5´-NcoI, 3´-SmaI

pGEX-Sp100

Zur Verfügung gestellt von Dr. J. Seeler (Institut Pasteur, Paris)

pGEX-Sp100dN2

Zur Verfügung gestellt von Dr. J. Seeler (Institut Pasteur, Paris)

pRm-HA/FLAG-Sp3

Zur Verfügung gestellt von Prof. Dr. G. Suske (Universität Marburg)

(Sapetschnig et al., 2002)

p3730-His-Lef1

Zur Verfügung gestellt von Dr. J. Hülsken (ISREC, Lausanne)

2.2 Methoden

↓25

Die Durchführung vieler Experimente erfolgte unter Zuhilfenahme der „Current Protocols in Molecular Biology“ (Ausubel et al., 2005).

2.2.1 DNA Methoden

2.2.1.1 Amplifikation von Plasmid-DNA

Kultivierung von Escherichia coli (E. coli) erfolgte mit Standardtechniken in LB Medium (Ausubel et al., 2005).

LB Medium

↓26

2.2.1.2 Transformation von E. coli

Transformation von kompetenten E. coli wurde nach dem „Transformation using calcium chloride“ Protokoll (Ausubel et al., 2005) durchgeführt. Hoch-effiziente Transformation wurde durch Elektroporation erreicht (Ausubel et al., 2005).

2.2.1.3 Präparation von Plasmid-DNA

Plasmid-DNA Präparation im grossen Maßstab wurde mit dem „QIAGEN Plasmid Maxi Kit“ nach den Angaben des Herstellers durchgeführt.

↓27

Plasmid-DNA Präparation im kleinen Maßstab wurde je nach Anwendungsbereich nach dem „Boiling Miniprep“ Protokoll (Ausubel et al., 2005) oder mit dem „Promega Wizard Plus SV Miniprep Kit“ (Produkt-Nr. A1460) nach Angaben des Herstellers durchgeführt.

2.2.1.4 Molekulare Klonierungen

Restriktionsendonukleasen wurden mit den optimalen Puffern benutzt. DNA-Fragmente wurden mittels Agarose-Gelelektrophorese entsprechend ihrer Größe und ihrem Retentionsverhalten aufgetrennt, mit Ethidiumbromid angefärbt und UV-Licht spezifischer Wellenlängen sichtbar gemacht.

DNA-Fragmente wurden aus Agarose-Gelen ausgeschnitten und mit dem „QIAquick Gel Extraction Kit“ aufgereinigt. Abweichend davon wurden DNA-Fragmente durch Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol-Extraktion aufgereinigt (Ausubel et al., 2005).

↓28

Ligationen wurden mit T4 DNA-Ligase in einem optimalen Puffer nach den Angaben des Herstellers durchgeführt.

DNA mit 3´- oder 5´-Überhängen wurden mit dNTPs und Klenow Enzym nach dem „repairing 3´ or 5´ overhanging ends to generate blunt ends“ Protokoll (Ausubel et al., 2005) aufgefüllt. Dies ist eine notwendige Voraussetzung, um Ligation von „blunt ends“ zu ermöglichen.

2.2.1.5 PCR

PCR wurde nach Standardprotokollen durchgeführt und für die jeweilige Anwendung modifiziert (Ausubel et al., 2005).

2.2.1.6 Mutagenese

↓29

Punktmutationen wurden mit „PfuTurbo“ DNA Polymerase unter Verwendung von Mutagenese-Oligonukleotiden eingefügt. Die Durchführung erfolgte nach den Protokollen des „QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit“. Abweichend davon wurde eine Modifikation des Protokolls durchgeführt (Wang und Malcolm, 1999).

2.2.1.7 DNA Sequenzierung

Rekombinante DNA wurde mit Hilfe des von Sanger (Sanger et al., 1977) beschriebenen Verfahrens unter Verwendung des „Thermo Sequenase Primer Cycle Sequencing Kits“ und eines „Li-Cor Automated Sequencers“ (Modell 4000L) analysiert. Alternativ wurde rekombinante DNA von der Firma Invitek (Berlin) und MWG (Ebersberg) sequenziert.

2.2.2 RNA Methoden

2.2.2.1 Isolation von RNA aus eukaryotischen Zellen

Die Extraktion von RNA wurde mit Guanidin-thiocyanat durchgeführt.

↓30

RNA Lysepuffer

Im Anschluß wurde eine Phenol-/Chloroform-Extraktion durchgeführt, die RNA mit Isopropanol gefällt und in ddH2O mit 0,1% SDS aufgenommen.

2.2.2.2 polyA-Selektion von mRNA

↓31

Die Selektion von polyA-haltigen Transkripten wurde mit Oligo(dT)25 Dynabeads nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Die Bindung der RNA erfolge in RNA-Bindungspuffer und das Waschen mit RNA-Waschpuffer.

RNA-Bindungspuffer

↓32

RNA-Waschpuffer

Nach dem Waschen wurden die Oligo(dT)25 Dynabeads in RNA-Probenpuffer aufgenommen und die RNA elektrophoretisch aufgetrennt.

↓33

RNA-Probenpuffer

2.2.2.3 Elektrophorese von RNA und Northern-Hybridisierung

RNA wurde mit MOPS-/Formaldehyd-haltigen Agarosegelen aufgetrennt und auf „Hybond-N+“ Nylonmembran geblottet. Die Hybridisierung der Membran erfolgte mit unterschiedlichen Sonden, welche durch Klenow-Polymerase mit dem „Megaprime DNA labelling system“ mit 32P-dCTP markiert wurden.

2.2.3 Biochemische Methoden

2.2.3.1 Eindimensionale SDS-Gelelektrophorese von Proteinen

↓34

SDS-Gelelektrophorese von Proteinen wurde nach der Laemmli-Methode durchgeführt (Ausubel et al., 2005).

2.2.3.2 Coomassie-Färbungen von SDS-Proteingelen

SDS-Polyacrylamidgele wurden in Coomassie-Färbelösung angefärbt.

Coomassie-Färbelösung

↓35

2.2.3.3 Silberfärbungen von SDS-Proteingelen (für die Massenspektrometrie)

Zur Silberfärbung von SDS-Proteingelen wurde ein auf der nachfolgenden Referenz basierendes Protokoll verwendet (Shevchenko et al., 1996). Dazu wurden die SDS-Proteingele für 30 min in Fixierlösung behandelt und anschließend häufig mit ddH2O gewaschen. Die Sensibilisierung erfolgte für 90 sec in Natriumthiosulfat (Na2S2O3•5 H2O, 20 mg/100 ml). Nach drei weiteren Waschschritten mit ddH2O für jeweils 30 sec erfolgte die Behandlung mit Silbernitrat (AgNO3, 200 mg/100 ml) für 30 min. Nach drei einminütigen Waschschritten mit ddH2O erfolgte die Entwicklung mit Entwicklungslösung solange, bis die Banden die richtige Färbung erhielten. Die Reaktion wurde mit 6% Essigsäure abgestoppt. Im Anschluß wurden die SDS-Proteingele ausgiebig mit ddH2O gewaschen und Proteinbanden mit einem Skalpell ausgeschnitten.

Silber-Fixierlösung

↓36

Entwicklerlösung

2.2.3.4 Immunoblot und Immunodetektion

↓37

Nach erfolgter SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurden Proteine auf „Nitrocellulose Transfer Membran“ geblottet. Dafür wurde das „Protein Blotting with Semidry Systems“ Protokoll verwendet (Ausubel et al., 2005). Abweichend davon wurden die im Folgenden aufgeführten Transferpuffer verwendet.

Kathodenpuffer

↓38

Anodenpuffer I

Anodenpuffer II

↓39

Die auf die Nitrocellulose-Membran transferierten Proteine wurden mit Ponceau S Lösung gefärbt und durch mehrfaches Waschen mit ddH2O entfärbt.

Ponceau S Lösung

↓40

0,5 g Ponceau S in 1 ml 100% Essigsäure lösen und auf 100 ml mit ddH2O auffüllen

Nach dem Transfer wurden die Nitrocellulose-Membranen für 30 min mit Roti-Block Lösung inkubiert. Alle Antikörperverdünnungen wurden in Roti-Block Lösung durchgeführt. Die Inkubation mit dem primären Antikörper erfolgte über Nacht bei 4°C, die Inkubation mit dem sekundären HRP-gekoppelten Antikörper für 1 h bei RT. Alle Waschschritte erfolgten in PBS mit 0,1% Tween 20. Die Detektion gebundener Antikörper erfolgte durch das „ECL Western blotting detection reagents and analysis system“ nach den Angaben des Herstellers.

In einem ersten Detektionsschritt gebundene Antikörper können von den Nitrocellulose-Membranen entfernt werden. Dafür wird die Membran mit Elutionspuffer bedeckt und bei 70°C für 30-90 min inkubiert. Anschließend steht die Membran für eine erneute Inkubation mit einem Primärantikörper zur Verfügung.

↓41

Elutionspuffer

2.2.3.5 Koimmunopräzipitation

Um physikalische Protein-Interaktionen mit Hilfe von Antikörpern in vivo nachzuweisen, bedient man sich der Koimmunopräzipitation von Proteinen (Ausubel et al., 2005). Antigene und damit assoziierte Proteine werden dabei mit einem spezifischen Antikörper gebunden. Diese Antigen-Antikörper-Komplexe können an eine sedimentierbare Matrix gebunden und somit aus Lösungen präzipitiert werden. Als Ausgangsmaterial wurden verschiedene eukaryotische Zellen verwendet, von denen Gesamtextrakt hergestellt wurde. Dazu wurden die Zellen geerntet, zwei Mal in PBS gewaschen und 20 min in Lysepuffer aufgeschlossen. Der unten angegebene Lysepuffer wurde je nach untersuchter Protein-Interaktion leicht modifiziert.

↓42

Lysepuffer (Standard)

Das unlösliche Zellmaterial wurde anschließend pelletiert (13000 rpm, 10 min) und der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Ein Aliquot wurde zur Expressionskontrolle entnommen und der Rest des Überstandes mit 1-5 µg Antikörper für
2 h inkubiert. Die Protein-Antikörper-Komplexe wurden mit Protein A/G-Sepharose für 1 h präzipitiert. Nach erfolgter Inkubation wurde die Affinitätsmatrix abzentrifugiert (1800 rpm, 1 min, 4°C) und vier Mal mit Lysepuffer gewaschen. Abschließend wurde die Affinitätsmatrix mit 4x SDS-PAGE Probenpuffer versetzt, bei 95°C 3 min aufgekocht und durch SDS-PAGE und Immunoblotting analysiert. Alternativ zu diesem Protokoll erfolgte die Kopräzipitation von Proteinen mit FLAG-Epitop mittels „Anti-FLAG M2 Affinity Gel Freezer-Safe“ nach den Angaben des Herstellers.

2.2.3.6 Expression von Proteinen in E. coli

↓43

Die Expression von Proteinen in E. coli wurde wie beschrieben durchgeführt (Ausubel et al., 2005). Eine 50 ml Vorkultur (LB Medium mit 100 µg/ml Ampicillin) wurde mit einer Einzelkolonie inokuliert und 12-15 h bei 37°C in einem Schüttler angezogen. Mit 5 ml dieser Vorkultur wurde eine 500 ml Expressionskultur (LB Medium mit 100 µg/ml Ampicillin) angeimpft und diese bis zu einer OD von 0,6 bei 37°C in einem Schüttler inkubiert. Proteinexpression wurde durch Zugabe von IPTG (Endkonzentration 0,1-1 mM) induziert und die Bakterien wurden bei Temperaturen von 16-30°C für 3-8 h inkubiert. Nach dieser Zeitspanne wurden die Bakterien durch Zentrifugation (3500 rpm, 10 min, 4°C) geerntet und die Sedimente bei -70°C eingefroren. Zur Expressionskontrolle wurde 1 ml Bakterienkultur entnommen und die Bakterien abzentrifugiert (13000 rpm, 1 min, RT). Der Überstand wurde verworfen und das Pellet mit 50 μl 2x SDS-PAGE Probenpuffer versetzt. Die Proben wurden
5 min bei 95°C gekocht und anschließend sonifiziert.

Die Analyse der Proteinexpression erfolgte durch SDS-PAGE anschließende Färbung mit Coomassie.

2x SDS-PAGE Probenpuffer

↓44

Die Expression und Lyse von GST-PIAS3 Fusionsproteinen wurde nach einem Protokoll für RING-Finger Ubiquitin-Ligasen durchgeführt (Yang et al., 2005). Die Anwesenheit von ZnCl2 in dem Kulturmedium (bis 250 µM) und in den verwendeten Puffern (bis 25 µM) ist dabei entscheidend für die Expression von aktivem Protein.

2.2.3.7 Expression SUMOylierter Proteine in E. coli

SUMOylierung und DeSUMOylierung von Proteinen ist ein sehr dynamischer Prozess in eukaryotischen Zellen. Um für biochemische Studien ausreichend SUMO-modifiziertes Substrat herzustellen, wurde ein Protokoll von Mencía und de Lorenzo verwendet (Mencia und de Lorenzo, 2004). Mit dem von ihnen beschriebenen System lässt sich SUMO-1 in vivo in E. coli spezifisch an Proteine konjugieren. Dafür müssen in den Bakterien ausreichende Mengen der SUMOylierungsmaschinerie zur Verfügung stehen. Diese wird auf den Plasmiden pKRSUMO (SUMO-1) bzw. pBADE12 (His-Aos1-Ubc9-Uba2, polycistronisch) kodiert. pKRSUMO vermittelt den Bakterien zusätzlich Kanamycin-Resistenz und pBADE12 Chloramphenicol-Resistenz. Das zu SUMOylierende Plasmid war in der Regel ein pGEX-Plasmid. Kolonien, die nun auf Ampicillin/Kanamycin/Chloramphenicol-haltigen Platten wuchsen, enthielten sowohl die SUMOylierungsmaschinerie als auch die entsprechenden Proteinsubstrate. Lysate dieser Bakterien enthalten dementsprechend eine Mischung aus unmodifiziertem und SUMO modifiziertem Substrat.

2.2.3.8 Affinitätsreinigung von Glutathion-S-Transferase Fusionsproteinen

↓45

Die Bakterienpellets der Proteinexpressionskulturen wurden mit 20 ml Lysepuffer aufgeschlossen.

Lysepuffer

↓46

Alternativ dazu erfolgte der Aufschluss mit „BugBuster-Reagenz“ nach den Angaben des Herstellers.

Die Lyse erfolgte bis die trübe Zellsuspension klar wurde. Die Lysate wurden für 10-30 sec sonifiziert und anschließend zentrifugiert (9500 rpm, 20 min, 4°C).

Die Aufreinigung von GST-Fusionsproteinen erfolgte mit „Glutathione Sepharose 4B“ in Chromatographiesäulen („Disposable Columns, 5 ml“) nach Angaben des Herstellers.

2.2.3.9 Enzymatische Spaltung von Glutathion-S-Transferase Fusionsproteinen mittels Thrombin Protease

↓47

Der N-terminal gelegene GST-Anteil der Fusionsproteine wurde mit Thrombin Protease in PBS geschnitten. Die Reaktion erfolgte für 0,5 h - 22 h bei 4°C oder 25°C. Die Thrombin Protease wurde auf 1 U/μI mit PBS verdünnt. Zum Entfernen der Thrombin Protease aus dem Reaktionsansatz wurde „Benzamidine Sepharose 6B“ nach den Angaben des Herstellers benutzt. Abgespaltene GST-Moleküle wurden mit „Glutathione Sepharose 4B“ aus der Lösung entfernt.

2.2.3.10 Affinitätsreinigung von His-Fusionsproteinen

Der Aufschluß der Bakterienpellets der Proteinexpressionskulturen erfolgte wie unter 2.2.3.8 für Glutathion-S-Transferase Fusionsproteine beschrieben.

Die Reinigung von His-Fusionsproteinen aus E. coli Lysaten erfolgte mit „Nickel Sepharose High Performance“ nach den Angaben des „QIAexpressionist Handbuchs“ (Qiagen, 2001). Für die vorliegende Arbeit wurde dabei ausschließlich unter nativen Bedingungen gearbeitet.

↓48

Lysepuffer

Waschpuffer

↓49

Elutionspuffer

2.2.3.11 Dialyse von Proteinlösungen

↓50

Die eluierten Proteine wurden in Dialyseschläuche gefüllt und mit Klammern an den Enden verschlossen. Die Dialyse erfolgte über Nacht mit häufigem Pufferwechsel.

Dialysepuffer

2.2.3.12 Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford (Mikrotiterplattenformat)

↓51

Die Quantifizierung von Proteinen wurde im 96-well Format durchgeführt. Dazu wurden je 5 μl BSA-Standardlösungen verschiedener Konzentration (0,1; 0,5; 1,0 und 1,6 μg/μl BSA) und 5 μl Probe unbekannter Konzentration in die Vertiefungen vorgelegt. Die Vertiefungen wurden anschließend mit jeweils 250 μl Bradford-Reagenz versetzt und nach 15 min Inkubationszeit bei RT die OD bei 595 nm in einem „Molecular Devices Spectra Max 250“ Mikrotiterplattenlesegerät bestimmt. Anhand der linearen Eichgeraden wurde die Proteinkonzentration der unbekannten Probe bestimmt.

2.2.3.13 Expression von Proteinen im zellfreien System (Reticulozyten)

Die Expression von Proteinen im zellfreien System wurde mit dem „TnT T7 Coupled Reticulocyte Lysate System“ nach den Angaben des Herstellers durchgeführt.

2.2.3.14 GST-Bindungsstudien

In GST-Bindungsstudien kann eine Interaktion zwischen einem GST-Fusionsprotein und einem anderen Protein untersucht werden (Ausubel et al., 2005). Unterschiedliche Mengen GST-Proteine werden dabei wie beschrieben an Glutathion-Sepharose gebunden (siehe Kap. 2.2.3.8). Diese gebundenen Fusionsproteine werden in der Regel mit in vitro translatierten und 35S-radioaktiv markierten Proteinen inkubiert (siehe Kap. 2.2.3.13). Anschließend werden nicht-spezifische Bindungspartner durch häufiges Waschen entfernt und gebundene Proteine durch SDS-PAGE aufgetrennt. Durch Autoradiographie können dann die gebundenen radioaktiv markierten Proteine sichtbar gemacht werden.

2.2.3.15  In vitro Phosphorylierung mit Erk1 Kinase

↓52

Rekombinantes Erk1 wurde kommerziell erworben. Die Reaktionsbedingungen wurden entsprechend den Angaben des Herstellers durchgeführt.

Enzym Verdünnungspuffer

↓53

Kinasepuffer

2.2.3.16  In vitro Methylierung mit immunopräzipitiertem G9a

↓54

pCMV-GFP-G9a bzw. pCMV-GFP-G9a ΔSET wurden transient in HEK-293 transfiziert, die Zellen nach 48 h geerntet und lysiert. Die GFP-Fusionsproteine wurden mit einem anti-GFP-Antikörper für 3 h immunopräzipitiert und direkt in die Methylierungsreaktion eingesetzt. Pro Reaktion wurde 1 µCi S-Adenosyl-L-[methyl-3H]-methionin zur Markierung von Substratproteinen in die Reaktion eingesetzt. Als Substrat wurden 1-5 µg Substratprotein eingesetzt. Die Reaktion erfolgte für 3 h bei 30°C in Reaktionspuffer (Chin et al., 2005).

Lysepuffer

↓55

Reaktionspuffer

2.2.3.17  In vitro SUMOylierung

Für die in vitro SUMOylierung wurden folgende Komponenten gemischt und die Reaktion für 1 h bei 30°C durchgeführt:

↓56

10x ME-Puffer

2.2.3.18 Tandem affinity purification

↓57

Die tandem affinity purification (TAP) wurde zur Reinigung von Proteinkomplexen unbekannter Komposition, Aktivität oder Funktion entwickelt (Rigaut et al., 1999). Unter Verwendung von massenspektrometrischen Untersuchungen können so Proteinkomponenten identifiziert werden, die mit einem bestimmten Zielprotein assoziiert sind. Die TAP-Technologie kombiniert zwei Affinitätsreinigungsschritte unter nativen Pufferbedingungen und erreicht so eine effiziente und spezifische Reinigung. Das TAP-tag besteht aus zwei IgG-Bindungsdomänen von Protein A aus Staphylococcus aureus (ProtA) und dem calmodulin-binding peptide (CBP). Das CBP bindet reversibel an Calmodulin in Abhängigkeit von Ca2+. Eine Elution von Calmodulin ist deshalb unter milden Bedingungen unter Verwendung von Komplexbildnern möglich. Im Gegensatz dazu eluiert ProtA von matrix-gebundenen IgG nur unter sauren Bedingungen. Zur Abspaltung der Proteinkomplexe von der IgG-Matrix befindet sich eine Spaltsequenz für die „tobacco etch virus“ Protease (TEV Protease) zwischen CBP und ProtA. Das TAP-tag wird C- oder N-terminal an das Zielprotein fusioniert und in geeignete Zellen eingebracht. Die Methode wurde ursprünglich für Hefen entwickelt und dort erfolgreich zur Identifikation von unbekannten Protein-Protein-Interaktionen eingesetzt (Rigaut et al., 1999; Puig et al., 2001). TAP-tags wurden jedoch auch für die Isolation von Proteinkomplexen aus höheren Eukaryoten verwendet (Cox et al., 2002). Bei einer Überexpression von Fusionsproteinen kann es zu unphysiologischer Proteinkomplexbildung kommen. Deshalb wird versucht, eine Expression auf möglichst endogenem Niveau zu erreichen. In Hefen wird dies durch homologe Rekombination und Expression des Fusionsproteins von seinem normalen Lokus erreicht. In Säugerzellen wird das Konstrukt idealerweise durch retrovirale Integration in das Genom eingebracht. Die Expression erfolgt dort unter Verwendung eines schwachen viralen Promotors. Das Fusionsprotein und assoziierte Proteinkomponenten werden in einem ersten Schritt aus dem Zellextrakt isoliert und durch Affinitätschromatographie an einer IgG-Matrix gebunden. Nach gründlichem Waschen erfolgt die Zugabe von TEV Protease in einem nativen Puffer um gebundene Komplexe abzuspalten. Das Eluat wird nachfolgend mit Calmodulin-gebundener Matrix inkubiert um die TEV Protease und andere Verunreinigungen zu entfernen. Nach einem erneuten Waschschritt können gebundene Komplexe mit EGTA-haltigem Puffer eluiert werden. Die Auftrennung der Komplexe erfolgt mittels eindimensionaler SDS-PAGE. Die Proteinbanden können durch Silberfärbung sichtbar gemacht werden, aus dem Gel isoliert und massenspektrometrisch analysiert werden.

Abb. 2.1: Aminosäuresequenz des TAP-tags. Dargestellt ist die Peptidsequenz des TAP-tags vom N-terminalen Bereich aus. CBP- und ProtA-Interaktionsdomänen sind fett dargestellt, die TEV Proteasesequenz ist fett und unterstrichen dargestellt. Das dargestellte Peptid ist für C-terminale Fusionen geeignet.

Abb. 2.2: Reinigungsschema der TAP-Methode (modifiziert nach Rigaut et al. , 1999). Dargestellt sind die vier Arbeitsschritte der TAP-Methode. 1) Das Zielprotein liegt mit einem C-terminalen TAP-tag in Zellen vor und ist mit anderen Proteinen komplexiert. Das TAP-Epitop besteht aus einem calmodulin binding peptide (CBP), einer Schnittstelle für die TEV Protease und zwei IgG-Bindungsdomänen von ProtA. 2) In einem ersten Affinitätsschritt wird das TAP-Fusionsprotein an eine IgG Affinitätsmatrix gebunden und Verunreinigungen entfernt. Die Elution erfolgt mit TEV-Protease. 3) Im zweiten Affinitätsschritt wird das CBP-Fusionprotein in Abhängigkeit von Ca2+ an eine Calmodulin-Matrix gebunden. Die TEV-Protease und Fremdproteine werden ausgewaschen. 4) TAP-Fusionsproteine und assoziierte Komplexpartner können mit EGTA von der Säule eluiert und identifiziert werden.

↓58

Als Ausgangsmaterial für die Aufreinigung dienten 1x108 bis 1x109 Zellen. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und bei 2000 rpm für 15 min bei 4°C pelletiert. Das PBS wird entfernt und das Gesamtzellvolumen bestimmt. Dies diente bei den Aufreinigungsschritten als Richtwert für die verwendeten Puffermengen. Zu den Zellen wurden 5 Volumina hypotonischer Puffer pipettiert und die Zellen für 3-5 min auf Eis quellen gelassen. Danach wurden die Zellen mit einem Douncer aufgeschlossen und die Zellkerne pelletiert (5 min, 14.000 rpm, 4°C). Die Zellkerne wurden in 1-2 Gesamtzellvolumina hypertonischem Puffer aufgenommen und 20 min auf Eis inkubiert. Die Kerne wurden durch erneutes „douncen“ aufgeschlossen und durch Zentrifugation (30 min, 14.000 rpm, 4°C) in Nukleoplasma und unlösliche Kernbestandteile fraktioniert. Für die Bindung an die IgG-Affinitätsmatrix wurde das Nukleoplasma mit IgG Verdünnungspuffer auf optimale Bedingungen eingestellt.

Die IgG-Matrix wurde mit 2-3 Säulenvolumen der folgenden Lösungen äquilibriert:

  1. 0,5 M Essigsäure (pH3,4) (eingestellt mit Ammoniumacetat)
  2. TST (50 mM Tris•Cl (pH7,6); 150 mM NaCl; 0,05% Tween 20)
  3. 0.5 M Essigsäure (pH3,4)
  4. TST
  5. IgG Waschpuffer

↓59

Das verdünnte Nukleoplasma wurde nun für mindestens eine Stunde an die equilibrierte IgG-Affinitätssäule gebunden. Nach dem Binden wurde das Säulenmaterial mit IgG Waschpuffer gewaschen. Anschließend wurde zweimal mit TEV Proteasepuffer gewaschen. Für die proteolytische Reaktion wurden pro 90 μl IgG-Matrixvolumen je 400 μl TEV Proteasepuffer und 10 μl (100 U) TEV Enzym hinzugegeben und für 1-12 h bei 4°C gespalten. Das Eluat enthält nun das CBP-Fusionsprotein, der ProtA-Teil des Proteins bleibt an der Säule gebunden. Die geschnittene IgG-Matrix wurde mit 2x100 μl TEV Proteasepuffer ausgewaschen und mit der Elutionsfraktion vereinigt. Das Eluat wurde auf die optimalen Pufferkonditionen für die Bindung an die Calmodulin-Säule mit Imidazol und 2-Mercaptoethanol eingestellt (Endkonzentration 10 mM 2-Mercaptoethanol und 0,7 mM Imidazol).

Die Calmodulin-Matrix wurde vor der Verwendung mit Calmodulin Bindungspuffer äquilibriert. Das durch die TEV Protease abgespaltene Protein wurde für mindestens 1 h an die Calmodulin-Säule gebunden. Es folgten drei Waschschritte mit Calmodulin Bindungspuffer. Die Elution von der Calmodulin-Säule wurde mit Calmodulin Elutionspuffer erreicht. Die eluierten Proteine wurden in Probenpuffer aufgenommen und durch eindimensionale SDS-PAGE getrennt. Die Detektion der Proteine erfolgte durch Silberfärbung des Gels (Ausubel et al., 2005).

Hypotonischer Puffer

↓60

Hypertonischer Puffer

↓61

IgG Waschpuffer

IgG Verdünnungspuffer

↓62

TEV Proteasepuffer

↓63

Calmodulin Bindungspuffer

Calmodulin Elutionspuffer

↓64

2.2.4 Identifikation von Interaktionspartnern auf RZPD Protein-Macroarrays

Für die proteom-weite Identifikation von Interaktionspartnern wurden RZPD Protein-Macroarrays verwendet. Als Proteinsonden wurden durch in vitro Phosphorylierung radioaktiv markierte PKA-C/EBPβ-Fusionsproteine verwendet. Nach dem Inkubationsschritt erfolgte die Detektion gebundener Proteine mittels Autoradiographie. Die Identifikation der gefundenen Klone erfolgte im Anschluß daran über Datenbankanalysen. Eine detailliertere Beschreibung der Arbeitsschritte erfolgt im Ergebnisteil (siehe Kap. 3.2).

2.2.4.1 Herstellung einer radioaktiv markierten Proteinsonde

Herstellung von Proteinkinase A Lösung

↓65

1 μg lyophilisierte Proteinkinase A wurde in 20 μl 6 mg/ml DTT in H2O gelöst (38,8 μl 1M DTT in 1 ml H2O). Da lyophilisiertes Material nur 0,09 % aktives Protein enthält, wurden 1,1 mg lyophilisiertes Material in 20 μl 6 mg/ml DTT in H2O gelöst (Endkonzentration 0,05 mg/ml Protein). Die Proteinlösung wurde vor Benutzung 10 min bei RT inkubiert.

In vitro Phosphorylierung mittels Proteinkinase A

Die direkte Phosphorylierung von C/EBPβ (LAP Isoform) mittels PKA wurde bereits beschrieben (Trautwein et al., 1994). Dieses Protokoll wurde für die in vitro Phosphorylierung der PKA-C/EBPβ—Fusionsproteine in leicht modifizierter Form angewendet.

↓66

Abtrennung freier 32 P γ -ATP Moleküle

Der gesamte Reaktionsansatz wurde auf eine zentrifugierbare „Microcon YM-10“ Filtersäule mit einer Ausschlußgröße von 10 kD pipettiert und 50 μl Kinasepuffer hinzugegeben. Die Säule wurde 10 min bei 14000xg zentrifugiert und erneut 50 μl Kinasepuffer hinzugegeben. Nach zwei weiteren Zentrifugationsschritten wurde das Filtrat in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Die inkorporierte Menge an Radioaktivität wurde mit einem Beckman LS6000LL Flüssig-Szintillationszähler gemessen und die Qualität der Sonde mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestimmt (siehe Abb. 3.7). Die gereinigten Proteinsonden wurden in 50 ml Blocklösung (siehe 2.2.4.2) aufgenommen.

2.2.4.2 Hybridisierung der RZPD Protein-Macroarray PVDF-Membran

↓67

Die Protein-Macroarray Membranen wurden mit 96 % Alkohol bei RT gereinigt und anschließend wiederholt mit ddH2O abgespült. Die Membranen wurde mit TBS-T-T angefeuchtet und Reste der aufgetüpfelten Bakterienkolonien mit Papiertüchern vorsichtig abgewischt. Die überexprimierten His-getaggten Proteine waren zu diesem Zeitpunkt schon an die Membran gebunden. Die Macroarrays wurden zweimal 10 min bei RT mit TBS-T-T gewaschen. Anschließend wurden die Membranen wiederholt mit TBS abgespült und zweimal 10 min bei RT mit TBS gewaschen. Die Macroarrays wurden zwei Stunden bei RT in Blocklösung inkubiert. Die Hybridisierung der Membran mit der radioaktiv markierten Proteinsonde erfolgte über Nacht bei RT.

TBS

↓68

TBS-T (TBS + Tween)

TBS-T-T (TBS + Tween + Triton X-100)

↓69

Blocklösung

2.2.4.3 Detektion gebundener Proteine

↓70

Die Hybridisierungslösung wurde verworfen und die Macroarrays viermal 10 min bei RT mit TBS-T gewaschen. Anschließend wurde zweimal 10 min mit TBS bei RT gewaschen. Die Membranen wurden nun auf Whatman Papier getrocknet, in Saran-Folie verpackt und bei -70°C exponiert.

2.2.4.4 Identifikation von Interaktionspartnern

Die Auswertung der Autoradiogramme wurde nach den „Instructions for scoring high-density protein macroarrays 5x5 duplicate“ (RZPD Berlin, 2003) durchgeführt. Auf den 22 cm x 22 cm PVDF-Membranen sind Klone in Duplikaten in Blöcken zu je 5x5 Klonen aufgebracht worden. Bei einer erfolgreichen Hybridisierung müssen auf dem Autoradiogramm doppelte Punkte zu erkennen sein. Diese Doppelpunkte müssen einem der in Abb. 3.8 dargestellten 12 Muster entsprechen. Die absolute Position eines Punktes auf dem Filter ergibt sich dann nach der Formel:

x1 = 5(X-1) + x´

↓71

y1 = 5(Y-1) + y´

Die Position eines entsprechenden Duplikats ergibt sich nach der Formel:

x2 = 5(X-1) + x´´

↓72

y2 = 5(Y-1) + y´´

Tab. 2.4: Anleitung zur Bestimmung der absoluten Position eines Klons auf dem RZPD Protein-Macroarray.

Legende

Beispiel

5x5 Punktmuster

5

X; Y

X Koordinate

Y Koordinate

eines 5x5 Blocks

X = 3

Y = 2

x´; y´

x´´; y´´

x´ Koordinatenpunkt

y´ Koordinatenpunkt

x´´ Koordinatenpunkt Duplikat

y´´ Koordinatenpunkt Duplikat

innerhalb eines 5x5 Blocks

x´ = 5

y´ = 1

x´´ = 4

y´´ = 4

x1; y1

x2; y2

x Koordinatenpunkt

y Koordinatenpunkt

x Koordinatenpunkt Duplikat

y Koordinatenpunkt Duplikat

absolute Position auf dem Macroarray

x1 = 5(3-1) + 5 = 15

y1 = 5(2-1) + 1 = 6

x2 = 5(3-1) + 4 = 14

y2 = 5(2-1) + 4 = 9

Folgende Macroarrays wurden nach diesem Verfahren verwendet:

↓73

Tab. 2.5: Übersicht über die verwendeten Protein-Macroarrays und die hybrid i sierten Protei n sonden.

Protein Array

Proteinsonde

RZPD library no 829:

Human Colon Protein Expression Library,

18432 Proteine/Array

PKA-hC/EBPβ CR 1-4

RZPD library no 828:

Human Lung Protein Expression Library,

24576 Proteine/Array

PKA-hC/EBPβ CR 5-7

RZPD library no 828:

Human Lung Protein Expression Library,

24576 Proteine/Array

PKA-hC/EBPβ CR567 SUMO-1

2.2.5 Reportergenstudien

Für Luciferase-Reportergenstudien wurde das Plasmid pM82 verwendet, welches über zwei invertierte C/EBPβ Bindungsstellen aus dem cMGF-Promoter verfügt (Sterneck et al., 1992a; Sterneck et al., 1992b). Optional dazu wurden Reportergenkonstrukte verwendet, bei denen die zwei C/EBPβ-Bindungsstellen gegen vier Gal4-Bindungsstellen ausgetauscht wurden (Kowenz-Leutz et al., 1994). Darüber hinaus wurden ein CSL-/RBP-Jκ-abhängige Hes-1 Reportergenkonstrukte verwendet (zur Verfügung gestellt von Ryoichiro Kageyama). Verschiedene Expressionsvektoren wurden zusammen mit Luciferase Reportergenkonstrukten in eukaryotische Zellen transfiziert. Die Reaktionsansätze wurden dabei stets auf gleiche DNA-Mengen mit pcDNA3 Plasmid aufgefüllt. Die Zellen wurden nach 36-48 h lysiert und die Lichteinheiten in Doppelwerten in einem Berthold Lumat LB9501 bestimmt. Zur Normalisierung der Lichteinheiten gegen die jeweilige Transfektionseffizienz wurden gleiche Mengen pCMV-β-Galactosidase kotransfiziert, die gebildete Menge an
β-Galactosidase gemessen und mit den relativen Lichteinheiten verrechnet.

Lysepuffer

↓74

Reaktionspuffer

↓75

Substratpuffer

Abb. 2.3: Schematische Darstellung der pM82 Reportergenkonstrukte. pM82 besitzt invertierte C/EBPβ-Bindungsstellen aus dem cMGF-Minimalpromotor. Optional wurden diese durch vier Gal4-Bindungsstellen ausgetauscht (modifiziert nach Kowenz-Leutz et al., 1994).

2.2.6 Zellkultur

2.2.6.1 Zellinien

↓76

Alle verwendeten Zelllinien wurden nach Angaben der ATCC (www.atcc.org) kultiviert und passagiert. Als Standardmedien wurden folgende Lösungen verwendet:

DMEM mit 10% FCS, 1% P/S (für Cos-7, Hek-293, HeLa)

DMEM mit 8% FCS, 2% Chicken Serum, 1% P/S (für QT6)

↓77

RPMI mit 10% FCS, 1% P/S (für Jurkat und HL-60)

2.2.6.2 Transiente Transfektion

Eukaryotische Zellen wurden transient nach der Calcium-Phosphat-Methode transfiziert (Ausubel et al., 2005). Für spezielle Zelltypen wurden transiente Transfektionen mit dem „Metafectene Transfektionsreagenz“ für Säugerzellen nach Angaben des Herstellers durchgeführt.

2.2.6.3 Virale Infektionen

Virale Infektionen wurden weitestgehend nach dem „Retroviral Gene Transfer and Expression Manual“ (Clontech, Protokoll-Nr. PT3132-1, Version-Nr. PR23868) nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Es wurde ein pantropisches retrovirales Expressionssystem verwendet. Als Verpackungszelllinie wurde GP2-293 benutzt. Die Zellen wurde mit pZome bzw. pBabe-puro Konstrukten zusammen mit dem pVSV-G Vektor transfiziert.

2.2.7 Immunofluoreszenz

↓78

Für die Immunofluoreszenz wurde eine unterschiedliche Anzahl von Zellen auf Glasplättchen ausgesäht. Die Fixierung der Zellen für die Immunofluorezenz erfolgte mit 4% Formaldehydlösung (Roth Histofix) für 10 min bei RT nach zweimaligem Waschen mit PBS. Die Zellen wurden danach mit 0,1%-0,5% Triton X-100 in PBS für 2-10 min permeabilisiert und erneut mit PBS gewaschen. Zur Blockierung nicht-spezifischer Bindungen wurde 1% BSA-Lösung in PBS für 30 min zu den Glasplättchen pipettiert und anschließend mit dem Primärantikörper in Blocklösung über Nacht bei 4°C inkubiert. Der Primärantikörper wurde durch wiederholtes Waschen entfernt, die Inkubation mit Sekundärantikörper erfolgte für 1 h bei RT. Mit drei weiteren Waschschritten wurde ungebundene Antikörperlösung entfernt. Ein letzter Waschschritt mit ddH2O diente zur Entfernung von Salzen. Die Plättchen waren nun bereit zum Aufbringen auf Objektträger. Optional erfolgte eine Färbung der Kern-DNA mit 0,1-1 mg/ml DAPI für 1 min. Die Konzentrationen der Antikörper-Lösungen variierten je nach Art des benutzen Antikörpers.


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23.01.2008