4 Diskussion

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Die Aktivität der Transkriptionsfaktors C/EBPβ bei der Expression von Genen wird durch verschiedene Kofaktoren verändert. Die Identifikation und Charaktierisierung dieser Proteine ermöglicht Rückschlüsse auf die Funktion von C/EBPβ bei Wachstum, Differenzierung und Homöostase in unterschiedlichen Organsystemen.

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Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden wichtige neue Bindungspartner der transaktivierenden Region und der regulatorischen Domäne von C/EBPβ in ihrer SUMOylierten und nicht-SUMOylierten Form identifiziert und die Funktion dieser assoziierten Proteine zum Teil entschlüsselt. Es konnte gezeigt werden, dass die Lysin-Methyltransferase G9a/H3-K9-HMTase 3 für die Methylierung von C/EBPβ verantwortlich ist und das diese Modifikation zur Repression des Transkriptionsfaktors führt. Darüber hinaus konnte ein funktioneller Zusammenhang zwischen dem Notch-Signalweg und C/EBPβ aufgedeckt werden. Zudem wurde der Mechanismus zur SUMOylierung von C/EBPβ und der Bindung der SUMO E3-Ligase PIAS3 teilweise aufgeklärt.

4.1 Tandem affinity purification führte nicht zur Identifikation von neuen Interaktionspartnern

Zur Identifikation von Bestandteilen biologischer Komplexe ist ein hoher Reinheitsgrad der Präparation erforderlich. Die tandem affinity purification (TAP) wurde 1999 erstmalig beschrieben und führte zur Aufreinigung makromolekularer Komplexe unter nativen Bedingungen (Rigaut et al., 1999). Die TAP-Strategie wurde in dieser Arbeit verwendet, um C/EBPβ-assoziierte Proteinkomplexe zu isolieren und nachfolgend zu identifizieren. Ein mit einem TAP-tag versehenes C/EBPβ konnte über zwei Affinitätsschritte aus verschiedenen Zellinien aufgereinigt und assoziierte Proteine visualisiert werden. Die nachfolgende Identifikation der Proteine durch massenspektrometrische Untersuchungen gelang jedoch nicht (siehe auch Kap. 3.1.2).

Die TAP-Methode wurde zuerst in Hefen erfolgreich durchgeführt (Rigaut et al., 1999). In diesem Organismus können leicht große Mengen Ausgangsmaterial gewonnen werden. Darüber hinaus kann man sich die hohe Effizienz der homologen Rekombination nutzbar machen. Durch sie ist ein Austausch des zu untersuchenden Gens durch eine mit einem TAP-Epitop markierte Variante leicht möglich. Die Genexpression findet dann auf dem physiologischen Niveau statt. In eukaryotischen Zellen ist dies schwieriger zu erreichen, z. B. durch die Generierung transgener Mäuse. Eine weitere Schwierigkeit der Methode ist die Aufreinigung regulatorischer Proteine, die Kernprozesse wie Wachstum und Differenzierung steuern. Diese werden meist durch unterschiedliche zelluläre Kontrollen in ihrer Menge beschränkt und sind bei der Aufreinigung durch eine große Menge struktureller Proteine oder metabolischer Enzyme überlagert. Darüber hinaus eignet sich die Methode nicht zur Detektion transienter Interaktionen oder Interaktionen, die nur in speziellen physiologischen Zuständen existieren. Das TAP-tag hat ein relativ großes Molekulargewicht von ca. 20 kD, welches zur Bildung artifizieller Proteinkomplexe führen kann (Gavin et al., 2002). Ein weiteres Problem scheint die Detektion kleiner Proteine unter 15 kD zu sein (Gavin et al., 2002).

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Die letzten Versuche zur TAP-Affinitätsreinigung von C/EBPβ-assoziierten Proteinkomplexen wurden Anfang 2004 durchgeführt. Mittlerweile stehen am MDC deutlich sensitivere Massenspektrometer zur Verfügung, die eine erfolgreiche Durchführung der Methode ermöglichen könnten.

4.2 Identifikation von neuen Interaktionspartnern auf Protein-Macroarrays

Da die TAP-Methode nicht zur Identifikation unbekannter interagierender Komplexe geführt hat, wurde eine andere Methode gesucht, mit der Interaktionspartner in einem genomischen Kontext gefunden werden können. Es wurde ein Verfahren gewählt, bei dem durch Verwendung radioaktiv markierter Proteinsonden auf Protein-Macroarrays cDNAs von verschiedenen Proteinen, die mit C/EBPβ interagieren,
identifiziert und isoliert werden können. Dabei zeigte sich, dass die Methode auch für die Identifikation von Interaktionspartnern einzelner Domänen oder posttranslational modifizierter Bereiche verwendet werden kann. Die Protein-Protein-Interaktionen besitzen in den meisten Fällen eine viel geringere Affinität als beispielsweise Antigen-Antikörper-Interaktionen und erfordern deshalb sensitivere Detektionsmethoden
(z. B. Radioaktivität).

Die Tatsache, dass theoretisch nur 1/6 der aufgebrachten Klone über ein korrektes Leseraster und die richtige Orientierung für die Generierung eines natürlich vorkommenden Proteins verfügt, macht eine hohe Komplexität der Bibliothek von mindestens 106 erforderlich (Bussow et al., 1998). Für die Experimente wurden entweder eine Human Colon Protein Expression Library mit 18432 Proteinen/Array oder eine Human Lung Protein Expression Library mit 24576 Proteinen/Array verwendet. Die Anzahl der korrekten Proteine liegt demnach bei 3000-4000 pro Membran. Dies ist ein Bruchteil der tatsächlich exprimierten Proteine einer Zelle. Geht man von ca. 30000 menschlichen Genen und folglich Genprodukten aus, so können mit dieser Methode nur ca. 10% der tatsächlich existierenden Interaktionen detektiert werden. Realistischerweise wird von jedem Gen jedoch nicht nur ein Protein synthetisiert, sondern es existieren unterschiedliche Isoformen, posttranslational modifizierte Formen usw., welche die Komplexität des Proteoms deutlich erhöhen. Optimalerweise müssten also sehr viel mehr Membranen verwendet werden oder Membranen, auf denen alle Genprodukte zumindest einmal korrekt aufgebracht worden sind. Die
Identifikation aller physiologischen Interaktionspartner von C/EBPβ wird auf diesem Wege nicht erreicht und erfordert den Einsatz weiterer Screening-Technologien.

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Ein großer Vorteil der Technologie im Vergleich zu anderen (z. B. λgt11 Bibliotheken (Young und Davis, 1983)) ist die Verbindung zwischen DNA-Sequenzinformation und Proteinexpression als eine Ressource für die Zukunft. Unbekannte Genprodukte, die auf dem Protein-Macroarray identifiziert wurden, können zu einem späteren Zeitpunkt im Falle einer Annotation erste funktionelle Daten zu dem entsprechenden Protein liefern.

Eine Alternative zur Expression der cDNA-Bibliothek in E. coli wäre die Proteinexpression in Insektenzellen mit Hilfe des Baculovirus-Systems oder in Säugerzellen. Dies würde die Wahrscheinlichkeit erhöhen, dass die aufgetüpfelten eukaryotischen Proteine ihre korrekte Konformation und die richtigen posttranslationalen Modifikationen (proteolytische Prozessierung, Phosphorylierung, Glykosylierung usw.) für die Interaktion mit der Proteinsonde besitzen. In Hefen oder Bakterien können sich die Modifikationen unterscheiden und dadurch Bindungen nicht nachweisbar sein.

Die für diese Arbeit verwendete Methode zur Identifikation von proteom-weiten Interaktionspartnern hat eine Reihe von Vorteilen im Vergleich zu konventionellen Screening-Methoden wie beispielsweise dem Hefe-Zwei-Hybrid-System (Yeast 2-hybrid-System). Zum einen können Proteinsonden flexibler gewählt werden. Es können zum Beispiel Domänen mit transaktivierenden Eigenschaften verwendet werden, was im Hefe-Zwei-Hybrid-System nicht möglich ist. Dies wurde beispielhaft für die C/EBPβ TAD gezeigt. Zum anderen können rekombinante Proteinsonden gezielt posttranslational modifiziert werden und somit der Einfluß der Modifikation auf Protein-Protein-Interaktionen untersucht werden. Dies wurde in der vorliegenden Arbeit mit der SUMOylierten und der nicht-SUMOylierten Form der regulatorischen Region von C/EBPβ gezeigt. Für zukünftige Anwendungen der Technologie könnte C/EBPβ in phosphorylierter, methylierter oder acetylierter Form auf Protein-Macroarrays gegeben werden und Interaktionspartner in Abhängigkeit von posttranslationalen Modifikationen identifiziert werden.

4.3 Neue Interaktionspartner der C/EBPβ TAD

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Es folgt eine kurze Beschreibung der mit der C/EBPβ TAD gefundenen Interaktionspartner und eine Zusammenfassung der Daten, die für das jeweilige Protein in Zusammenhang mit C/EBPβ zur Verfügung stehen.

4.3.1 Mitglieder der Polycomb-Familie

Als Mitglieder der Polycomb-Familie konnten die Proteine Chromatin-modifying protein 1a, CBX2 und L(3)MBT identifiziert werden. Sie sind in Tab. 4.1 zusammengefasst.

Tab. 4.1: Interaktionspartner der C/EBP β TAD - Polycomb-Familie. Die Tabelle zeigt drei Interaktionspartner, die zur Polycomb-Familie gehören oder damit funktionell assoziiert sind.

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CBX2/hPc1 und Chromatin-modifying protein 1a (CHMP1a):

Polycomb group Proteine (PcG) erhalten den transkriptionell reprimierten Status vieler Gene, vor allem den der Hox-Gene, während der Entwicklung des Organismus (Ringrose und Paro, 2004). PcG Proteine können in Gruppen eingeteilt werden, je nachdem mit welchem multimeren Komplex sie assoziiert sind. Man unterscheidet dabei vor allem die Polycomb repressive complexes 1 und 2 (PRC1 und PRC2), wobei es Hinweise auf weitere PcG-haltige Komplexe gibt. Das Polycomb-Protein CBX2 ist ein Bestandteil des Chromatin-assoziierten PRC1-Komplexes. Als Kernkomponenten gelten die Proteine Polycomb (PC), Polyhomeotic (PH), Posterior Sex Combs (PSC) und Sex Combs Extra (SCE). Durch massenspektrometrische Untersuchungen konnten folgende Proteine als Bestandteile des humanen PRC-1-Komplexes identifiziert werden: PCGF2/RNF110, PCGF4/BMI1, CBX2/hPc1/M33, CBX4/hPc2, CBX8/hPc3, PHC1, PHC2, PHC3, SCMH1, RING1 und RNF2/RING2 (Levine et al., 2002). Der PRC1-Komplex bindet die Trimethylierungsmarke an Lysin-27 in Histon H3 über die Chromodomäne der CBX/hPc-Proteine (Fischle et al., 2003; Min et al., 2003). Über sie können PRC1-Komplexe an ihrer jeweiligen Zielgene binden, in welchen die Methylierungsmarke stark verbreitet ist (Schwartz et al., 2006).

PRC1 kann unterschiedliche Funktionen ausüben, vor allem die Remodellierung von Chromatin und die Modifikation von Histonen. Der Komplex katalysiert die Monoubiquitinierung von Histon H2A Lysin-119 und führt damit zu einer Veränderung der Chromatin-Kondensation.

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Auffällig ist der funktionelle Zusammenhang zwischen der PRC1-Komponente PCGF4/BMI1 und CHMP1a (siehe Tabelleneintrag Nr. 39). CHMP1a ist am Prozess der Chromosomen-Kondensation beteiligt. Es rekrutiert das Polycomb-Protein PCGF4/BMI1 zu stark kondensierten Bereichen des Chromatins (Stauffer et al., 2001). Eine direkte Bindung zwischen C/EBPβ und Komponenten des PRC-1-Komplexes könnte auf eine Beteiligung von C/EBPβ bei der transkriptionellen Kontrolle von bestimmten Zielgenen durch PcG-Komplexe hindeuten.

L(3)MBT:

PcG-Proteine spielen unter anderem eine wichtige Rolle in der Hämatopoiese. Eine Untergruppe von PcG enthalten eine mbt-Domäne, welche zuerst im Drosoph i la lethal(3)malignant brain tumor (l(3)mbt) Protein beschrieben wurde. Das homologe humane l(3)mbt Gen (H-L(3)MBT) ist auf Chromosom 20q12 lokalisiert. Ein Verlust dieses Abschnittes wird mit myeloiden hämatopoietischen Erkrankungen in Verbindung gebracht. Es könnte also ein Zusammenhang zwischen mbt-haltigen PcG-Proteinen und der Hämatopoiese bestehen. Kürzlich wurde l(3)mbt als Bestandteil von Myb-E2F2/RBF Repressorkomplexen identifiziert (Lewis et al., 2004). Durch die Kollaboration von C/EBPβ und c-Myb bei der Genaktivierung kann auf einen funktionellen Zusammenhang zwischen den Transkriptionsfaktoren und dem postulierten Repressorkomplex geschlossen werden. Eine Überexpression von l(3)mbt führt darüber hinaus zur Induktion von mehrkernigen Zellen, was die Vermutung nahelegt, dass l(3)mbt für den korrekten Ablauf der Mitose mitverantwortlich ist. L(3)mbt zeigt keine Kolokalisation mit dem PcG-Protein BMI1. Es ist deshalb vermutlich kein konstitutiver Bestandteil von humanen PRC1-Komplexen. C/EBPβ könnte demnach in der Lage sein, verschiedene Polycomb-Komplexe zu rekrutieren.

4.3.2 Interaktionspartner die auf neue posttranslationale Modifikationen von C/EBPβ hinweisen

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Posttranslationale Modifikationen verändern die Eigenschaften der durch sie modifizierten Proteine. Serin-, Threonin- und Tyrosinreste können phosphoryliert werden. Acetylierung erfolgt an Lysinresten. Methylierung kann an Arginin- und Lysinresten vorkommen, wobei Arginine monomethyliert oder symmetrisch bzw. asymmetrisch dimethyliert und Lysine mono-, di- oder trimethyliert sein können. Ubiquitinierung und SUMOylierung erfolgen an Lysinresten. Jede Modifikation wird durch spezifische Enzyme oder Enzymklassen katalysiert. Nachfolgend sind die Proteine beschrieben, die C/EBPβ auf verschiedene Arten modifizieren könnten.

Tab. 4.2: Interaktionspartner der C/EBP β TAD - posttranslationale Modifikat o ren. Die Tabelle zeigt sechs Interaktionspartner, die den posttranslationalen Modifikatoren zugeordnet werden können. Sie besitzen entweder enzymatische Funktionen oder sind Bestandteile von Multiproteinkomplexen mit enzymatischen Funktionen.

Egl-9 homolog1, SM-20:

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Der transkriptionale Koaktivator hypoxia-inducible factor alpha (HIF-α) wirkt als globaler Regulator der zellulären O2 Homöostasis. Unter nicht-hypoxischen Bedingungen wird HIF-α ubiquitiniert und der proteosomalen Degradationsmaschinerie zugeführt. Dieser Prozess wird unter hypoxischen Bedingungen in der Zelle inhibiert.

Das Enzym Egl-9 homolog 1 katalysiert die Bildung von 4-Hydroxyprolin in HIF-α und markiert somit das Protein für die proteasomale Degradation durch den Hippel-Lindau Ubiquitinierungskomplex unter normoxischen Bedingungen (Semenza, 2001). HIF-1α und HIF-2α werden an verschiedenen Aminosäuren modifiziert und diese Modifikationen verändern die Interaktion mit Kofaktoren. So konnte beispielsweise gezeigt werden, dass die Bindung von HIF-1α an CBP/p300 durch Hydroxylierung eines konservierten Asparaginrestes in HIF-1α gesteuert wird (Pouyssegur et al., 2006). Die Interaktion zwischen Egl-9 homolog 1 und C/EBPβ könnte auf eine Hydroxylierung des Transkriptionsfaktors hindeuten.

FBXW5:

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FBXW5 ist ein Bestandteil des ternären E3-Ubiquitin Ligase Komplexes SCF (SKP1-CUL1-F-box protein). Das Protein ist für die Substraterkennung verantwortlich. Der Komplex ist damit in der Lage, die Stabilität verschiedenster Proteine zu beeinflussen und somit unterschiedlichste zelluläre Prozesse zu kontrollieren. Die F-box ist eine ca. 50 Aminosäuren große Domäne, welche der Protein-Protein Interaktion dient. Das F-box Motiv verbindet FBXW5 mit den anderen Komponenten des SCF-Komplexes, vor allem mit der Kernkomponente SKP1. Im carboxy-terminalen Teil des Proteins befinden sich drei WD Motive, die zu weiteren Protein-Protein-Interaktionen in der Lage sind. Sie binden phosphorylierte Substrate an den SCF-Komplex. Der SCF-Komplex könnte somit bei der Ubiquitinierung von C/EBPβ eine Rolle spielen und damit die Stabilität des Proteins regulieren.

HDAC10:

Ein weiterer Bindungspartner der transaktivierenden Region von C/EBPβ ist die Histon-Deacetylase HDAC10. Dabei handelt es sich um eine Histon-Deacetylase vom Typ 2. Dieses Enzym ist für die Deacetylierung von Lysinen an den N-terminal gelegenen Abschnitten der Histone (H2A, H2B, H3 und H4) verantwortlich. Deacetylierung von Histonen führt zu epigenetischer Repression und ist damit für transkriptionelle Regulation, Zellzykluskontrolle und Entscheidungen in Entwicklungsprozessen verantwortlich. Histon-Deacetylasen wirken in großen Multiproteinkomplexen mit einem Gewicht von mehreren Megadalton. HDAC10 ist in der Regel mit HDAC2, HDAC3 und N-CoR2 assoziiert. Die Tatsache, dass die Interaktionen zwischen N-CoR2 und HDAC10 einerseits (Fischer et al., 2002) und zwischen C/EBPβ und N-CoR2 andererseits (Ki et al., 2005) bereits beschrieben sind, lässt die Vermutung zu, dass die drei Proteine Bestandteile des gleichen repressiven Komplexes sind.

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Histon-Lysin N-methyltransferase, H3 Lysin-9 spezifisch 3 / G9a:

H3-K9-HMTase 3 (G9a) gehört zur Familie SET-Domänen-haltiger Lysin-Methyltransferasen. Diese evolutionär konservierte Domäne umfasst ca. 140 Aminosäuren und wurde ursprünglich in den Drosophila m. Proteinen Suppressor of variegation 3-9 (Su(var)3-9), Enhancer-of-zeste (E(z)) und Trithorax (trx) beschrieben. Su(var)3-9 ist ein mit Heterochromatin assoziiertes Protein, welches bei „position effect variegation“ (PEV) eine Rolle spielt. Bei der PEV werden euchromatische Gen-Regionen nach Verlagerung in einen neuen Genlokus in unmittelbare Nähe von konstitutivem Heterochromatin selber heterochromatisiert und damit transkriptionell stillgelegt. E(z) gehört zur Gruppe der Polycomb-Gene, welche für den Erhalt Segment-spezifischer Repression von homöotischen Genen verantwortlich sind. Im Gegensatz dazu ist trx das namensgebende Gen der Trithorax-Familie, welches für segment-spezifische Aktivierung homöotischer Gene verantwortlich ist.

Die erste Histon-Lysin-Methyltransferase wurde im Jahr 2000 entdeckt (Rea et al., 2000). Seitdem wurden dutzende Proteine dieser Enzymklasse durch biochemische oder genetische Studien entdeckt. Im Säugergenom existieren alleine mehr als 50 Proteine mit einer katalytischen SET-Domäne (Zhang und Reinberg, 2001). Die Proteine unterscheiden sich in ihrer Substratspezifität und in der Fähigkeit, Mono-, Di- oder Trimethylierung herbeizuführen (Zhang et al., 2003).

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Die Proteine der Suvar3-9 Familie methylieren präferenziell Lysin-9 in Histon H3 in vitro (Tachibana et al., 2001). H3K9-Methylierung wird als ein spezifisches Merkmal einer epigenetischen transkriptionellen Repression angesehen. Eine Reduktion der Genaktivität kann durch Induktion von lokalen dimethyl-H3K9 und trimethyl-H3K9-Markierungen in Promotorregionen erreicht werden, welche auch wieder entfernt werden können (Wysocka et al., 2005). Neben G9a (Tachibana et al., 2002) können mehrere euchromatische Histon-Methyltransferasen, wie beispielsweise GLP/Eu-HMTase1 (Ogawa et al., 2002), Eset/Setdb1 (Wang et al., 2003) und Riz (Kim et al., 2003) diese Katalyse durchführen. Biochemische Studien mit aufgereinigtem G9a bzw. G9a mit einer Deletion der SET-Domäne zeigen, dass das Protein Mono-, Di- und Trimethylierung von N-terminal gelegenen Peptiden des Histons H3 katalysieren kann (Patnaik et al., 2004; Collins et al., 2005). Die Trimethylierung ist dabei der geschwindigkeitsbestimmende Schritt. H3K9-Methylierung schafft eine Bindungsstelle für das Heterochromatin Protein 1 (HP1) an Histone und ist somit an der Modulation der Chromatinstruktur beteiligt. In Säugerzellen scheint G9a die vorherrschende euchromatische H3K9-Methyltransferase zu sein, denn eine Deletion des Gens verringert den H3K9-Methylierungsstatus in euchromatischen chromosomalen Bereichen (Tachibana et al., 2002). In heterochromatischen Bereichen hingegen ist die Suv39h Enzymfamilie für die Generierung und Aufrechterhaltung methylierter N-Termini von Histonen verantwortlich (Rea et al., 2000). Neben der H3K9-Modifikation sind Lysin-Methyltransferasen für die Modulation der Genaktivität und Veränderungen in der Chromatin-Struktur durch andere Modifikationen verantwortlich. Die N-terminalen Regionen der Histone H3 und H4 sind im hohen Maße modifiziert. Die Lysine-4, -27 und -36 in H3 und das Lysin-20 in H4 können ebenfalls in methylierter Form vorliegen (Lachner et al., 2003). H3 Lysin-79 kann ebenfalls methyliert vorliegen und ist die einzige Methylierungsstelle, die im Kernbereich der Histone liegt.

G9a besitzt neben der SET-Domäne als weiteres strukturelles Merkmal sieben Ankyrin repeats. Ankyrin repeats sind häufig vorkommende und modulare Protein-Protein-Interaktionsmotive. Als Bindungspartner von G9a wurden verschiedene DNA-bindende Proteine wie z. B. E2F6, MAG, MAX und DP1 isoliert, welche G9a in der Nähe von Histonen positionieren können (Ogawa et al., 2002). Darüber hinaus ist G9a direkt mit DNMT1 assoziiert, um eine Synchronisation von DNA- und Histon-Methylierung während der S-Phase des Zellzyklus zu gewährleisten (Esteve et al., 2006).

Neben der Methylierung von Lysinen in Histonen rückt die Methylierung Nicht-Histon-Proteinen in den Fokus aktueller Untersuchungen. So konnte bereits gezeigt werden, dass Trimethylierung von Lysinresten des Retinsäurerezeptors α (RARα) die Interaktion mit dessen Kofaktoren, wie z. B. P/CAF, verändern kann (Huq et al., 2007). Zudem wurde die Lysin-Methylierung des Tumorsuppressorproteins p53 nachgewiesen. Diese wird durch die Histon-Methyltransferase Set9 katalysiert und führt zur Veränderung der Stabilität des Proteins (Chuikov et al., 2004). Set9 ist darüber hinaus in der Lage, TAF10 an einem Lysinrest zu monomethylieren. Dies erhöht die Assoziation dieses TBP-assoziierten Proteins mit der RNA-Polymerase II (Kouskouti et al., 2004). Die Identifikation von Enzymen, die für die Methylierung von Lysinen in Nicht-Histonproteinen verantwortlich sind, wird damit zunehmend wichtiger.

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Vor kurzem konnte das erste Enzym mit demethylierender Aktivität identifiziert werden (Shi et al., 2004). LSD1 (histone-lysine-specific demethylase 1) besitzt Sequenzidentität mit einer Aminoxidase und demethyliert mono- und di-methyl-Lysin-4 in Histon H3 mit FAD als Kofaktor. Dabei wird H2O2 und Formaldehyd gebildet. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass LSD1 auch die Demethylierung von mono- und dimethyliertem Lysin-9 Histon H3 herbeiführen kann (Metzger et al., 2005). LSD1 ist ein Bestandteil des repressiven CtBP(C-terminal binding protein)-Komplexes (Shi et al., 2003). Verblüffenderweise enthält dieser Komplex neben den Histon-Deacetylasen HDAC1 und 2 die Lysin-Methyltransferasen G9a und EuHMT. In diesem Komplex sind also sowohl Lysin-9 Histon H3 methylierende als auch demethylierende Aktivitäten miteinander verbunden. Die Suche nach weiteren demethylierenden Enzymen im Genom hat zur Identifikation der JmjC domain-containing histone demethylase 1 (JHDM1) geführt, welche für die Demethylierung von dimethyl-Lysin-39 in Histon H3 verantwortlich ist (Tsukada et al., 2006). In derselben Arbeitsgruppe konnte ein weiteres JmjC Domänen-haltiges Protein, JHDM2A, identifiziert werden, welches unter anderem dimethyl-Lysin-9 in Histon H3 demethylieren kann (Yamane et al., 2006). Die Methylierung von Lysinresten ist somit reversibel und kann durch Demethylasen unterschiedlicher Proteinfamilien herbeigeführt werden.

Durch massenspektrometrische Analyse von aufgereinigtem C/EBPβ konnte Monomethylierung an Lysinen festgestellt werden (Knoblich, Vermeulen, Mann und Leutz, unpubliziert). Bislang konnten Lys-39 und Lys-168 in monomethylierter Form nachgewiesen werden. Diese Entdeckung warf direkt die Frage auf, durch welches Enzym diese posttranslationale Modifikation katalysiert wird. Die Beobachtung, dass G9a/H3-K9-HMTase 3 mit der TAD von C/EBPβ auf Protein-Macroarrays (Kap. 3.2.2), in GST-Bindungsstudien und Koimmunopräzipitationsstudien interagieren kann (Kap. 3.4.1) und die Proteine im Zellkern kolokalisieren (Kap. 3.4.4), führte zur der Vermutung, dass diese Methyltransferase für die Lysin-Modifikationen verantwortlich ist. Die Tatsache, dass G9a dabei trotz einer Deletion der SET-Domäne immer noch in der Lage war, die TAD von C/EBPβ zu binden, legt die Vermutung nahe, dass die Ankyrin repeats diese Bindung vermitteln. Zudem konnte die Interaktionsdomäne in C/EBPβ auf CR4 eingegrenzt werden (Abb. 3.11).

Lysin-methyliertes C/EBPβ konnte mit einem anti-pan-methyl-Lysin Antikörper nachgewiesen werden (dieser erkennt mono-, di- und trimethylierte Lysine) und der Anteil an methyliertem C/EBPβ-Protein konnte in Zellen durch Kotransfektion von G9a erhöht werden (Abb. 3.12). Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass rekombinantes C/EBPβ Protein (sowohl GST-CR1-7 als auch GST-LIP) ein Substrat für die in vitro-Methylierung durch G9a ist (Abb. 3.13 und 3.14). In Reportergenstudien konnte gezeigt werden, dass eine Koexpression von G9a die transkriptionelle Aktivität von C/EBPβ herrunterreguliert (Kap. 3.4.3). Eine inaktive Form von G9a mit einer Deletion der katalytischen SET-Domäne konnte diese Verminderung der transkriptionellen Aktivität nicht bewirken. Die Mutation von Lys-39 und Lys-168 in Alanin führten zu einer Steigerung der Aktivität des Proteins und zu einem Verlust der Reprimierbarkeit durch G9a (Abb. 3.15). Lysin-Methylierung von C/EBPβ durch G9a führt also zur Repression des Transkriptionsfaktors bzw. zu dessen Inaktivierung. Zwischen Inaktivierung des Proteins durch Methylierung und der Repression durch einen Kofaktor kann hierbei aufgrund fehlender Testsysteme nicht unterschieden werden.

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Bislang konnte durch massenspektrometrische Analysen nur eine Monomethylierung von Lysinen in C/EBPβ gezeigt werden. Ob auch di- oder trimethylierte Formen von C/EBPβ existieren, und welche Enzyme diese Schritte katalysieren, ist bislang noch nicht bekannt. Besonders interessant ist die Beobachtung, dass Lys-39 auch in acetylierter Form vorliegen kann (Cesena et al., 2007). Acetylierung und Methylierung konnte durch Arbeiten in unserer Gruppe auch an Lys-168 durch massenspektrometrische Untersuchungen nachgewiesen werden. Die Acetylierung führt hier ebenfalls zu einer Änderung der Aktivität des Transkriptionsfaktors. Methylierung und
Acetylierung an dieser Position könnten sich wechselseitig ausschließen und spezifische Effekte nach sich ziehen. Die Signalwege, die zur Methylierung von C/EBPβ führen, sind nicht verstanden.

Die Position in C/EBPβ, an der die Lysin-Methylierung durch G9a katalysiert wird, konnte bislang noch nicht identifiziert werden. In Histon H3 ist die minimale Sequenz, welche noch durch G9a methyliert werden kann, als das Heptapeptid TARKSTG bestimmt worden (Chin et al., 2005). Im C-terminalen Bereich von C/EBPβ ist ein RKS-haltiges Motiv vorhanden (Lys-270), welches eine Akzeptorsequenz für die Methylierung durch G9a enthalten könnte. Durch in vitro Methylierung konnte jedoch kein unterschied in der Markierbarkeit des Substrates (GST-LIP im Vergleich zu GST-LIP K270A) festgestellt werden. Die Lys-39 und Lys-168 werden z. Z. auf Methylierbarkeit durch G9a getestet.

MRG-binding protein:

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Histon-Acetyltransferasen sind Schlüsselenzyme für die Regulation von Genexpression. Das MRG-binding protein ist eine Komponente des NuA4 Histon-Acetyltransferase Komplexes, welcher die Aktivierung bestimmter Gene durch Acetylierung der Histonproteine H4 und H2A bewirkt und somit einen Einfluß auf verschiedene zelluläre Funktionen hat (Doyon und Cote, 2004). Diese posttranslationale Modifikation neutralisiert positive Ladungen an Lysin-Gruppen und verändert damit die Interaktionen zwischen Nukleosomen und DNA, zwischen Nukleosomen und assoziierten Proteinen und zwischen verschiedenen Nukleosomen. Acetylierung beeinflusst deshalb die Ausbildung von Chromatinstrukturen aber auch die Interaktion von spezifischen Proteinen mit Chromatin. Durch die Veränderung der Interaktionsfläche können Proteine gebunden werden, welche die Transkription verstärken. Der NuA4-Komplex könnte für die Aktivierung von transkriptionellen Programmen verantwortlich sein, welche mit Onkogen bzw. Proto-Onkogen vermittelter Wachstumsinduktion, Tumor-Suppressor vermitteltem Wachstumsarrest und replikativer Seneszenz,
Apoptose und DNA Reparatur verbunden sind. Der NuA4 Histon Acetyltransferase-Komplex enthält als katalytische Untereinheit Tip60.

Die Acetylierung von C/EBPβ an unterschiedlichen Lysinresten durch p300/CBP wurde kürzlich beschrieben (Cesena et al., 2007). Es besteht daher auch die Möglichkeit, dass eine Acetylierung von C/EBPβ neben p300/CBP auch durch den NuA4 Histon-Acetyltransferase Komplex katalysiert werden kann.

Pim-3:

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Bei der Serin/Threonin-Proteinkinase Pim-3 handelt es sich um ein Proto-Onkogen, welches eine wichtige Rolle bei der Zellzykluskontrolle und bei anti-apoptotischen Prozessen spielt. Sie scheint eine wichtige Rolle bei der Proliferation von humanen Hepatom-Zellinien zu spielen (Fujii et al., 2005). Pim-3 könnte die Phosphorylierung von C/EBPβ katalysieren.

4.3.3 Moleküle in Signaltransduktionskaskaden

Eine relativ kleine Anzahl von konservierten Signalwegen wird in unterschiedlichen Entwicklungsstadien der Organismen benutzt, um verschiedene biologische Prozessen zu steuern. Diese Signalwege treffen sich an Kreuzungspunkten und können so die gleichen Zellen oder die gleichen Prozesse beeinflussen. Eine wichtige Frage ist, wie unterschiedliche Signale integriert werden. Dies geschieht oft auf der Ebene der Transkriptionsfaktoren. C/EBPβ ist das Ziel von Signaltransduktionskaskaden. Das Protein wird über die MAPK-Enzymkaskade phosphoryliert und dabei in seiner Aktivität verändert (Nakajima et al., 1993; Trautwein et al., 1993; Kowenz-Leutz et al., 1994). In der vorliegenden Arbeit wurden Moleküle aus anderen Signaltransduktionskaskaden identifiziert, die mit C/EBPβ interagieren. Dies lässt die Vermutung zu, dass C/EBPβ durch weitere Signalwege in seiner Aktivität moduliert wird.

Tab. 4.3: Interaktionspartner der C/EBP β TAD - Moleküle in Signaltransdukt i onskaskaden. Die Tabelle zeigt drei Interaktionspartner, die den Signaltransduktoren zugeordnet werden können.

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Axin-1:

Axin-1 ist ein Inhibitor des Wnt-Signalweges. Das Molekül β-Catenin wird durch Axin-1 in seiner Aktivität gehemmt. Vermutlich wird durch Axin-1 die Phosphorylierung von β-Catenin und APC durch GSK3β erleichtert. Wahrscheinlich wirkt es daher als Tumor-Suppressor-Molekül. Die Interaktion zwischen Axin-1 und β-Catenin wird durch die Armadillo-Repeats in β-Catenin vermittelt. Zusätzlich kann Axin-1 mit Plakoglobin (γ-Catenin), APC, Dvl und PP2A interagieren.

Notch1 und Notch3:

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Der Notch-Signalweg wurde bereits an anderer Stelle beschrieben (siehe Kap. 3.2.3). Im Folgenden werden die physiologischen Funktionen von Notch skizziert.

Mäuse, in denen Notch1 konstitutiv ausgeschaltet ist, zeigen vielfältige Defekte. Neben abnormaler Genese der Somiten kommt es zu einer gestörten Entwicklung der Blutgefäße und die Tiere sind embryonal lethal vor E11.5 (Swiatek et al., 1994; Conlon et al., 1995). Notch-Signalwege beeinflussen die Implementierung des embryonalen hämatopoietischen Systems. Durch den Rezeptor entwickeln sich hämatopoietische Stammzellen („hematopoietic stem cells“, HSC) aus Hämangioblasten. Notch-Rezeptoren sind auch später in vielen hämatopoietischen Zellen exprimiert. Eine konditionale Inaktivierung der Notch-Allele verhindert das frühe Absterben der Tiere und erlaubt die Charakterisierung von Notch-Effekten in verschiedenen Organsystemen (Radtke et al., 1999). Dabei wurde die Rolle von Notch bei der T-/B-Zell-Entscheidung in der lymphatischen Entwicklung deutlich; andere Aspekte der Hämatopoiese blieben von Notch unbeeinflusst. Ähnliche Ergebnisse wurden nach einer konditionalen Inaktivierung von CSL gewonnen (Han et al., 2002). Im Thymus sind Notch-Signale notwendig für die Differenzierung von verschiedenen Vorläuferzellen in T-Zellen, ein Fehlen des Rezeptors führt zur verstärkten Reifung von B-Zellen (Radtke et al., 2004). In der DN1-Entwicklungsstufe von Thymus-Vorläuferzellen sind die myeloiden Transkriptionsfaktoren C/EBPα, C/EBPβ und PU.1 exprimiert und funktionell. Im Verlauf der T-Zell-Reifung kommt es durch Notch-Signale zu einer verminderten Expression dieser Transkriptionsfaktoren. Retrovirale Transduktion von C/EBPs oder PU.1 in DN1 Thymozyten führt zudem zu einer Konversion dieser Vorläuferzellen in Makrophagen und Dendritischen Zellen und verhindert die T-Zell-Differenzierung (Laiosa et al., 2006).

Neueren Erkenntnissen zufolge ist Notch1 entscheidend für die Genese von hämatopoietischen Stammzellen, wird jedoch nicht gebraucht, wenn der Pool an Stammzellen schon angelegt wurde. Dies ist auch für andere Gene bekannt, die eine Rolle bei der frühen hämatopoietischen Entwicklung und der Gefäßentwicklung spielen. Eine Deletion des SCL/tal-1 Gens führt beispielsweise zum Verlust von primitiver und definitiver Hämatopoiese und führt zu Defekten in der Angiogenese (Orkin und Zon, 2002). Eine konditionale Inaktivierung führt auch hier zu keiner Veränderung der HSC-Funktion zu späteren Entwicklungszeitpunkten (Mikkola et al., 2003).

↓131

Mitglieder der Notch-Familie, vor allem Notch1 und Notch3, spielen eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung von Lymphozyten. Eine konstitutive Aktivierung von Notch in hämatopoietischen Knochenmarkzellen oder T-Vorläuferzellen blockiert deren Differenzierung (Pear und Aster, 2004). Aktivierende Mutationen im humanen Notch1-Gen führen zur Entstehung von akuter lymphatischer Leukämie der T-Zellen (T-ALL, Lymphoblastenleukämie) (Ellisen et al., 1991; Weng et al., 2004) und aktivierte Notch-Moleküle verstärken T-Zell-Tumore in der Maus (Pear et al., 1996; Bellavia et al., 2000). Notch kann jedoch nicht nur als Onkogen, sondern auch als Tumorsuppressor wirken. In der Epidermis verhindert Notch1 die Zellproliferation und fördert die Differenzierung von Keratinozyten, während konditionelle Notch1-„knock-out“ Mäuse Basalzellkarzinome entwicklen (Rangarajan et al., 2001; Nicolas et al., 2003; Okuyama et al., 2004). Wie bei der Entwicklung von C. elegans und D. mel a nogaster scheinen die spezifischen Folgen von Notch-Signalen auch bei der Krebsentstehung stark abhängig vom jeweiligen Kontext zu sein.

In welchem Maße die unterschiedlichen Notch-Moleküle redundante Aufgaben übernehmen oder spezifische Funktionen in der Zelle ausüben ist nicht genau verstanden. Die Beobachtung, dass Notch1 bzw. Notch3 als Bindungspartner von C/EBPβ identifiziert wurden (siehe Tab. 3.1 (Anhang)), könnte darauf hindeuten, dass C/EBPβ das Ziel unterschiedlicher Notch-Signalwege ist.

In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die intrazelluläre Domäne von Notch1 IC auf Protein-Macroarrays (Kap. 3.2.2), in GST-Bindungsstudien und Koimmunopräzipitationsexperimenten mit der TAD von C/EBPβ interagieren kann (Abb. 3.18). Die Anwesenheit der RAM-Domäne in Notch1 IC ist keine Voraussetzung für die Assoziation der Moleküle. In C/EBPβ ist die konservierte Region 4 (CR4) die Hauptinteraktionsdomäne. Auch hier scheint die Bindung über die Ankyrin repeats vermittelt zu werden, analog zur Interaktion von C/EBPβ mit G9a (siehe auch Kap. 4.3.2). In Jurkat-Zellen, welche über erhöhte Mengen von Notch1 IC verfügen, konnte eine Assoziation zwischen C/EBPβ und Notch1 IC auf endogenem Proteinexpressionsniveau bestätigt werden (Kap. 3.5.2). Notch1 IC beziehungsweise Notch1 IC ΔRAM sind in der Lage, die C/EBPβ-abhängige Transkription zu verstärken (Kap. 3.5.4). Dies konnte sowohl in C/EBPβ-abhängigen Reportergenstudien als auch in Reportergenstudien mit C/EBPβ-gal4 DBD Fusionskonstrukten gezeigt werden. Eine Verstärkung der C/EBPβ-abhängigen Transkription durch Koexpression von Notch1 IC wurde bereits für das PSG-Gen rnCGM3 (PSG: Pregnancy-specific glycoprotein) gezeigt (Chen et al., 2000). Ferner war Notch1 IC in der Lage, im Chromatin eingebettete reprimierte myeloide Gene zusammen mit C/EBPβ und c-Myb zu aktivieren (Abb. 3.23). Zusammengefasst legen diese Daten die Vermutung nahe, dass C/EBPβ ein Effektormolekül des Notch-Signalweges ist.

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C/EBPα und β spielen ebenso wie Notch-Transmembranrezeptoren eine wichtige Rolle bei der adipozytären Differenzierung. C/EBPβ wird früh während der Adipogenese induziert und führt zur Induktion von C/EBPα und peroxisome proliferator-activating receptor γ (PPARγ) während der späten Phase der Differenzierung. Diese Transkriptionsfaktoren sind direkt für die Aktivierung einer Reihe von Adipozyten-spezifischen Genen verantwortlich.

Notch-Signale sind eine notwendige Voraussetzung für die Bildung von Fettzellen aus 3T3-L1 Präadipozyten (Garces et al., 1997). Andere Studien hingegen haben gezeigt, dass Notch-Signale die Differenzierung von 3T3-L1 Präadipozyten blockieren (Ross et al., 2004) und das eine konstitutive Expression von Hes-1, einem Zielmolekül des Notch-Signalweges, zum gleichen Effekt führt (Ross et al., 2006).

Die Beobachtung, dass C/EBPβ der Aktivierbarkeit der RBP-Jκ-/CSL-abhängigen Transkription durch Notch entgegenwirkt (Kap. 3.5.5), könnte auf einen wichtigen Schritt bei der Induktion der Adipogenese hindeuten. Eine direkte Interaktion zwischen Notch1 IC und C/EBPβ könnte deshalb von entscheidender Bedeutung während der frühen Phase der Adipogenese sein.

4.3.4 Transkriptionsfaktoren und Koregulatoren

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Im folgenden Abschnitt sind Transkriptionsfaktoren und transkriptionelle Koregulatoren zusammengefasst.

Tab. 4.4: Interaktionspartner der C/EBP β TAD - Transkriptionsfaktoren und Koregulatoren. Die Tabelle zeigt sieben Interaktionspartner, die den Transkriptionsfaktoren oder transkriptionellen Aktivatoren/Repressoren zugeordnet werden können.

CDX1:

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CDX1 gehört zur Familie der „Caudal-type homeobox proteins“ mit einer DNA-bindenden Homöobox-Domäne. Das Protein spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung des Darms und kontrolliert die Proliferation und Differentiation von intestinalen Mucosazellen (Guo et al., 2004). Eine fehlerhafte Expression der Gene dieser Familie korreliert mit der Karzinogenese des gastrointestinalen Traktes. Eine funktionelle Abhängigkeit zwischen CDX und C/EBP-Proteinen wurde bereits beschrieben (Staloch et al., 2005). Diese Interaktionen könnten zur differentiellen transkriptionellen Regulation in verschiedenen Kompartimenten des Darms dienen.

Hox-A11:

Das Homöobox-Protein Hox-A11 ist ein Sequenz-spezifischer Transkriptionsfaktor und Teil eines regulatorischen Systems, welches Zellen ihre relative Position entlang der anterior-posterior-Achse von Organismen vermittelt. Es gehört zur Abd-B Homöobox-Familie und verfügt über eine Homöobox DNA-bindende Domäne. Interessanterweise ist Hox-A11 in allen Entwicklungsstadien von Thymozyten exprimiert (Taghon et al., 2003). Es kann demnach auf eine Rolle von Hox-A11 in Verbindung mit C/EBPβ bei der Hämatopoiese geschlossen werden.

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NFATc3:

Der Transkriptionsfaktor NFATc3 spielt eine Rolle bei der induzierbaren Expression von Cytokin-Genen in T-Zellen, insbesondere bei der Induktion von IL-2. NFATc3 ist eine Komponente des NFATc Transkriptionskomplexes, welcher mindestens aus zwei Komponenten besteht: Einer cytoplasmatischen Komponente NFATc2 und einer induzierbaren nukleären Komponente NFATc1. Weitere Komplexpartner wie NFATc3 oder c4, Mitglieder der AP-1 Familie, GATA4 und Cbp/p300 können ebenfalls Bestandteile des Komplexes sein. NFATc Proteine binden DNA als Monomere. NFATc3 liegt im Cytoplasma hauptsächlich in der phosphorylierten Form vor und wird konstitutiv durch die NFATc-Kinase phosphoryliert. Kommt es zur Calcineurin-abhängigen Dephosphorylierung, liegt NFATc3 hauptsächlich im Nukleus vor. Bei einem Sinken der Ca2+-Konzentration kommt es zu einem schnellen Kernexport des Proteins und einer Rückkehr in den Ruhezustand. Die subzelluläre Lokalisation spielt damit eine wichtige Rolle bei der Regulation der Genaktivierung durch NFATc-Proteine.

N-CoR und N-CoR2:

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N-CoR und das eng verwandte Protein N-CoR2 (SMRT) sind transkriptionelle Repressormoleküle. Beide Proteine gehören zur Familie der Kernrezeptor Korepressoren. Beim Fehlen eines an Thyroidhormon- oder Retinsäurerezeptoren gebundenen Liganden ist der ca. 1,5-2 MDa große Repressorkomplex mit den entsprechenden Rezeptoren assoziiert. N-CoR Proteine sind mit Histon-Deacetylasen wie z. B. SIN3A/B, HDAC1 und HDAC2 assoziiert, welche zur Bildung von kondensiertem Chromatin führen können. Dadurch wird der Zugang der basalen Transkriptionsmaschinerie zur DNA-Matrize erschwert und die Genexpression vermindert.

Die N-CoR2/SMRT-Form interagiert mit der Histon-Deacetylase HDAC10 (Fischer et al., 2002). HDAC10 wurde im Rahmen dieser Arbeit als ein Interaktionspartner von C/EBPβ identifiziert (siehe Tab. 3.1, Eintrag Nr. 58). Eine direkte Assoziation zwischen C/EBPβ und N-CoR2 wurde bereits beschrieben (Ki et al., 2005). Die Interaktion wird durch die transaktivierende Region von C/EBPβ vermittelt. Es besteht demnach die Möglichkeit, dass C/EBPβ mit seiner transaktivierenden Region einen Korepressorkomplex rekrutieren kann, welcher zum einen aus N-CoR/N-CoR2 und zum anderen aus HDAC10 besteht. Die Verifizierung der Bindung von N-CoR2 an C/EBPβ auf dem Protein-Macroarray zeigt, dass die beschriebene Technologie zur Identifikation unbekannter Interaktionspartner verwendet werden kann.

PML:

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PML ist vermutlich ein Transkriptionsfaktor. PML dient als Markerprotein für „nuclear bodies“. Das Protein könnte eine wichtige Rolle bei der Rekrutierung von Faktoren zu Kernkörpern spielen. Eine chromosomale Translokation t(15;17)(q21;q21) fusioniert das PML Protein mit dem Retinsäurerezeptor α. Diese Aberration kann der Auslöser für Akute Promyelocytische Leukämie (APL) sein.

Tif1 β :

Tif1β kann als transkriptioneller Repressor oder Aktivator wirken. Das Protein ist mit KRAB-Domänen haltigen Transkriptionsfaktoren assoziiert und erhöht die Effizienz KRAB-vermittelter Repression. Transkriptionelle Repression wird vermutlich durch eine Interaktion zwischen Tif1β und verschiedenen Formen von HP1 vermittelt. Eine direkte Assoziation zwischen C/EBPβ und Tif1β wurde bereits in verschiedenen Publikationen gezeigt (Chang et al., 1998; Rooney und Calame, 2001). Da ein Teil der Daten von Rooney et al. gefälscht wurden, ist die Datenlage zur funktionellen Verbindung von C/EBPβ und Tif1β jedoch unklar. Als gesichert kann gelten, dass Tif1β als Aktivator für die C/EBPβ-abhängige Transkription wirken kann. Weder in GST-Bindungsexperimenten mit in vitro translatiertem Tif1β noch in Koimmunopräzipitationsstudien konnte in dieser Arbeit eine direkte Assoziation zwischen Tif1β und C/EBPβ festgestellt werden (Daten nicht gezeigt), obwohl eine Interaktion auf dem Protein-Macroarray detektiert werden konnte (siehe Tab. 3.2, Eintrag Nr. 114).

4.4 Interaktion und Repression von SUMO-modifiziertem C/EBPβ durch PIAS3

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Alle Mitglieder der PIAS-Familie können mit SUMO-1 und Ubc9 interagieren und die SUMOylierung von Substratproteinen verstärken. Sie wirken folglich analog zur Ubiquitinierung als E3-Ligase bei der SUMO-Katalyse (Kotaja et al., 2002). Beide Eigenschaften sind abhängig von der zentral gelegenen SP-RING Domäne, welche zwischen PIAS1, PIAS3, PIASx und PIASy konserviert ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zunächst die Fähigkeit der verschiedenen PIAS-Proteine untersucht, als E3-Ligase für die Konjugation von SUMO-1 an C/EBPβ zu wirken. Dabei zeigte sich, dass PIAS1 und PIAS3 die SUMOylierung von C/EBPβ verstärken konnten, PIASy hingegen nur in geringerem Maße dazu in der Lage war (Kap. 3.6.2). PIAS1 und 3 können also als wirksamere E3-Ligasen im Vergleich zu PIASy betrachtet werden. In Interaktionsstudien wurde darüber hinaus deutlich, dass nur SUMO-modifiziertes C/EBPβ in der Lage war, PIAS3 zu binden und dass diese Bindung bei unmodifiziertem Protein nicht ausgebildet werden kann (Kap. 3.6.3). PIASy hingegen konnte nicht mit C/EBPβ, weder in seiner modifizierten noch in seiner unmodifizierten Form, interagieren (Kap. 3.6.5). Entscheidend für die Interaktion zwischen C/EBPβ und PIAS3 war eine intakte Struktur des SP-RINGs. Durch Einfügen einer substituierenden Aminosäure wurde die räumliche Struktur des SP-RINGs zerstört und die Interaktion mit SUMOyliertem C/EBPβ ging verloren (Abb. 3.27). In Reportergenstudien konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass die SUMOylierung von C/EBPβ eine notwendige Voraussetzung für die Repression durch PIAS3 ist und das der repressive Effekt von PIASy unabhängig von der SUMOylierbarkeit des Proteins ist (Abb. 3.6.6). Schließlich wurde deutlich, dass PIAS1, PIAS3 und PIASx in der Lage sind, die Arginin-Methyltransferasen PRMT 3 und 6 zu rekrutieren, während PIASy dazu nicht in der Lage war (Kap. 3.6.7). Da PRMTs in der Lage sind, C/EBPβ an Argininresten zu methylieren und dadurch das Protein zu reprimieren (Kowenz-Leutz und Leutz, unpubliziert), könnte dies den repressiven Effekt von PIAS3 erklären.

PIAS Proteine unterschieden sich vor allem in ihren C-terminalen Bereichen. PIASy ist im Gegensatz zu PIAS1, PIAS3 und PIASx C-terminal verkürzt. Daraus erklären sich spezifische Funktionen von PIASy, wie beispielsweise die Fähigkeit, bei Überexpression zelluläre Seneszenz zu induzieren (Bischof et al., 2006). Dies könnte auch die starke Repression von C/EBPβ-abhängiger Transkription durch PIASy erklären, die unabhängig von der SUMOylierbarkeit des Transkriptionsfaktors zu beobachten ist.

Abb. 4.1 fasst die repressive Wirkung von PIAS3 im Vergleich zu PIASy in einem Modell zusammen.

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Abb. 4.1: Modell für die Repression durch PIAS3. 1) C/EBPβ liegt in nichtmodifizierter Form vor. 2) Ubc9/PIAS/SUMO-1-Komplexe erkennen das SUMOylierungsmotiv in C/EBPβ und die SUMOylierung findet statt. 3) PIAS3 bleibt an SUMOyliertem C/EBPβ gebunden, PIASy bindet nicht. 4) PRMT3 und PRMT6 können C/EBPβ methylieren und so zur Repression des Transkriptionsfaktors führen.

PIAS-Proteine können einen positiven oder negativen Einfluss auf die Genregulation haben. Für die negative Regulation von Transkriptionsfaktoren durch PIAS wurden bislang vier unterschiedliche Mechanismen vorgeschlagen (Shuai und Liu, 2005).

Zum einen kann PIAS die DNA-Bindung von Transkriptionsfaktoren stören. PIAS1 kann beispielsweise die DNA-bindenden Eigenschaften von STAT1 oder NF-κB p65 inhibieren (Liu et al., 1998; Liu et al., 2005). Eine andere Möglichkeit der negativen Regulation ist die Rekrutierung von transkriptionellen Korepressormolekülen wie z. B. Histon-Deacetylasen (HDACs) durch PIAS. HDACs sind Enzyme, die die Abspaltung von Acetyl-Gruppen von Lysinresten in Histon- und nicht-Histon-Proteinen bewirken. Sie spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation der Transkription durch die Modifikation von Chromatin. PIASxβ kann beispielsweise mit HDAC3 interagieren (Tussie-Luna et al., 2002). Weitere Daten, die auf eine PIAS-abhängige Repression durch HDACs hinweisen, stammen von Experimenten mit dem HDAC-Inhibitor Trichostatin A (TSA). Die Repression der STAT4-abhängigen Genaktivierung durch PIASx kann beispielsweise durch TSA aufgehoben werden (Arora et al., 2003). Auch der repressive Effekt von PIASy auf SMAD3 (Long et al., 2003) oder den Androgen-Rezeptor (Gross et al., 2004) kann durch TSA abgeschafft werden.

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Als dritte Möglichkeit können PIAS-Proteine die Aktivität von Transkriptionsfaktoren negativ beeinflussen, indem sie als SUMO-E3-Ligasen wirken und die SUMOylierung von Transkriptionsfaktoren verstärken. Die Einflüsse der SUMOylierung auf Proteine sind bereits beschrieben worden (siehe Kap. 1.3) und können vielfältig sein.

PIAS-Proteine können darüber hinaus Transkriptionsfaktoren reprimieren, indem diese in spezifische subnukleäre Strukturen transportiert werden. Eine Koexpression von PIASy und Lef1 beispielsweise führt zur Lokalisation des Komplexes in „nuclear bodies“ (Sachdev et al., 2001). Andere Publikationen hingegen verweisen auf die gleichförmige Verteilung von PIAS1 und PIASy im Kern (Liu et al., 2001; Liu et al., 2005).

Beispiele für eine positive Regulation durch PIAS-Proteine sind weit seltener. Die Repression des Androgen-Rezeptors durch PIASy wurde bereits oben erwähnt. Die anderen Proteine der PIAS-Familie (PIAS1, PIAS3 und PIASx) scheinen die Aktivität des Androgen-Rezeptors unter den gleichen Bedingungen jedoch zu verstärken. (Gross et al., 2001). Auch bei der Regulation von SMAD3 wurde eine Repression durch PIASy, jedoch eine Aktivierung durch PIAS3 vorgeschlagen (Long et al., 2004). Diese Aktivierung wird vor allem durch Rekrutierung von p300/CBP erreicht.

4.5 Neue Interaktionspartner der C/EBPβ regulatorischen Domäne

4.5.1 Bindungspartner der RD in ihrer nicht-SUMOylierten Form

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Nachfolgend sind in Tab. 4.5 die Proteine aufgeführt, die nur mit der nicht-SUMOylierten Proteinsonde eine Interaktion zeigten.

Tab. 4.5: Interaktionspartner der C/EBP β RD in ihrer nicht-SUMOylierten Form.

UHRF1:

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Bei UHRF1 handelt es sich um eine E3-Ligase, welche den dritten Schritt der Ubiquitin-Konjugation katalysiert. Das Molekül scheint auf unterschiedlichen Ebenen an der transkriptionellen Regulation beteiligt zu sein. Zum einen bindet es die Histon-Moleküle H3, H1 und H2B direkt. Zum anderen scheint es direkt an methylierte CpG-haltige Oligonukleotide binden zu können. Die Bindung erfolgt an invertierte 5´-CCAAT-3´ Sequenzmotive und kann als transkriptioneller Aktivator wirken. Darüber hinaus bindet UHRF1 transkriptionelle Kofaktoren wie beispielsweise HDAC1. Funktionell scheint das Molekül eine wichtige Aufgabe bei der Zellzyklusregulation beim Übergang zwischen G1- und S-Phase zu spielen. Darüber hinaus wurde eine Funktion bei DNA Reparatur und chromosomaler Stabilität postuliert.

MBD1:

MBD1 ist ein Bestandteil des MeCP1-Komplexes und gilt als transkriptioneller Repressor. Die N-terminal gelegene methyl-CpG-binding Domäne (MBD) ist in der Lage methylierte CpG-Oligonukleotide zu binden und dient darüber hinaus als Protein-Interaktionsdomäne. Über sie kann beispielsweise ein Suv39h1-CBX5 Komplex gebunden werden. MBD1 kann darüber hinaus die Histon-Methyltransferase Setdb1 binden und so Zielgene durch Methylierung von Lysin-9 in Histon 3 transkriptionell stilllegen. Eine PIAS3-abhängige Modifikation von MBD1 mit SUMO führt dazu, dass das Protein nicht mehr in Setdb1-haltige Komplexe integriert werden kann und somit die repressiven Eigenschaften verloren gehen (Lyst et al., 2006). Dadurch verliert das Protein seine repressiven Eigenschaften. Einer neueren Studie zufolge kann MBD1 mit Ring1b und hPc2 interagieren, den Hauptkomponenten des Polycomb repressive complex 1 (PRC1) (Sakamoto et al., 2007). Die Komponenten des PRC1-Komplexes, welche C/EBPβ binden können, sind bereits im Kapitel 4.3.1 diskutiert worden. C/EBPβ scheint demnach in der Lage zu sein, unterschiedliche repressive Komplexe über die transaktivierende und regulatorische Domäne zu binden und so die epigenetische Stilllegung bestimmter Bereiche im Chromatin zu bewirken.

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Die Tatsache, dass unmodifiziertes C/EBPβ in der Lage ist, MBD1 zu binden, jedoch die SUMO-modifizierte Form dazu nicht mehr dazu in der Lage ist, lässt auf eine regulative Rolle der SUMOylierung bei der Rekrutierung des Komplexes schließen.
Über die Rolle von MBD6 ist wenig bekannt. Das Protein verfügt jedoch auch über eine methyl-CpG-binding Domäne (MBD) und gehört damit in dieselbe Proteinfamilie wie MBD1.

MLL2:

MLL2 gehört zur Familie der Trithorax-Proteine. Diese wirken der epigenetischen Aktivität von Polycomb-Proteinen entgegen und führen zu einer Aktivierung von entwicklungsbiologisch relevanten Genen. MLL2 enthält eine SET-Domäne und verfügt über Methyltransferase-Aktivität für Histon 3 Lysin-4. Das Protein ist ein Bestandteil des ASC-2/NCOA6 Komplexes (ASCOM), welcher ASC-2/NCOA6, das Rb-bindende Protein RBQ-3/RBBP5, alpha- und beta-Tubulin, die Trithorax-Proteine MLL2 und MLL3 und ASH2/ASCL2 enthält (Goo et al., 2003). Chromosomale Translokationen unterschiedlichster Art zwischen mll2 und anderen Genen werden mit einem Block der hämatopoietischen Differenzierung und aggressiven akuten Leukämien assoziiert (Hess, 2004). Die normale Funktion von MLL2 und Methylierung von Histon H3 Lysin-4 scheinen deshalb wichtig für die Homöostasis der Blutzellproliferation und -differenzierung zu sein. Auf die Lysin-Methylierung von C/EBPβ wurde an anderer Stelle bereits eingegangen (siehe Kap. 3.4.2). MLL2 könnte also auch für die Lysin-Methylierung von C/EBPβ verantwortlich sein.

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c-Myc:

c-Myc ist ein „basic helix-loop-helix“ Transkriptionsfaktor, welcher für die Expression von Wachstums-Genen eine wichtige Rolle spielt. Es bindet DNA als Heterodimer mit Max. Überexpression von Myc spielt eine Rolle bei einer Vielzahl hämatopoietischer Tumore.

4.5.2 Bindungspartner der RD in ihrer SUMOylierten und nicht-SUMOylierten Form

Nachfolgend ist in Tab. 4.6 der Interaktionspartner aufgeführt, der unabhängig von SUMOylierungsstatus der C/EBPβ-Sonde an der gleichen Position auf beiden Protein-Macroarrays gefunden wurde.

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Tab. 4.6: Interaktionspartner der C/EBP β RD in ihrer nicht-SUMOylierten oder S U MOylie r ten Form.

p21:

Das inhibitorische Molekül p21 ist ein wichtiger Regulator des Zellzyklus. Es bindet an „cyclin-dependent kinases“ (CDKs) und inhibiert dadurch deren Aktivität. Somit wird die Phosphorylierung wichtiger CDK-Substrate verhindert und eine Blockierung der Progression durch den Zellzyklus bewirkt. Die Tatsache, dass sowohl SUMOyliertes als auch nicht-SUMOyliertes C/EBPβ p21 binden kann deutet auf eine Unabhängigkeit der Bindung von SUMOylierung hin.

4.5.3 Bindungspartner der RD in ihrer SUMOylierten Form

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Nachfolgend sind die Proteine aufgeführt, die nur mit der SUMOylierten Proteinsonde eine Interaktion zeigten.

Tab. 4.7: Interaktionspartner der C/EBP β RD in ihrer SUMO y lierten Form.

BCR:

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BCR ist ein GTPase-aktivierendes Protein. Es bewirkt den Austausch von RAC- bzw. CDC42-gebundenem GDP durch GTP und führt so zu einer Aktivierung der Proteine. Das Protein besitzt Serin-/Threonin-Kinase Aktivität. Eine chromosomale Aberration von BCR ist eine Ursache für chronische myeloide Leukämie (CML). Die t(9;22)(q34;q11) Translokation mit ABL1 führt zur BCR-ABL Fusionen, welche in akuten myeloiden Leukämien (AML) und akuten lymphoblastischen Leukämien (ALL) gefunden werden.

CITED2:

Das Molekül Cbp/p300-interacting transactivator 2 (CITED2) kompetiert mit den Transkriptionsfaktoren HIF-1α und STAT2 um die Bindung an die transkriptionellen Koaktivatoren p300/CBP. Es bindet direkt an die CH1-Region in p300/CBP. CITED2 scheint auf diese Weise die HIF-1α-abhängige Transkription herunter zu regulieren. Die direkte Interaktion zwischen C/EBPβ und p300 konnte bereits gezeigt werden (Mink et al., 1997). CITED2 könnte analog zu HIF-1α und STAT2 die Interaktion zwischen C/EBPβ und p300/CBP abschaffen.

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SRY:

Bei SRY (sex determining region Y)-box 4 (SOX4) handelt es sich um einen transkriptionellen Aktivator, welcher mit hoher Affinität über seine DNA-bindenden HMG-Box an 5´-AACAAAG-3´ Sequenzmotive bindet. Das Protein spielt eine Rolle bei der normalen Entwicklung der Pankreas.

4.6 Abschließende Bemerkungen

In dieser Arbeit wurde eine Methode zur reproduzierbaren Identifikation von Protein-Protein-Interaktionen auf der Basis einer genom-weiten Expressionsanalyse durchgeführt. Mit ihrer Hilfe konnten neue und bereits bekannte Bindungspartner von verschiedenen Domänen von C/EBPβ identifiziert, in unabhängigen Interaktionsstudien bestätigt und funktionell charakterisiert werden. Diese erweitern das Verständnis der biologischen Funktion des Transkriptionsfaktors C/EBPβ.

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Als Bindungspartner der transaktivierenden Region von C/EBPβ konnten eine Reihe von Proteinen der Polycomb-Familie, posttranslational modifizierende Enzyme, Moleküle in Signaltransduktionskaskaden und Transkriptionsfaktoren bzw. transkriptionelle Koregulatoren identifiziert werden. Die Identifikation von N-CoR2 als bereits bekanntem Interaktionspartner der TAD diente dabei als positive Bestätigung für die Anwendbarkeit der Methode.

Massenspektrometrische Daten zeigen, dass C/EBPβ an mindestens zwei Positionen an Lysinresten monomethyliert vorliegen kann. Die Lysin-Methyltransferase G9a wurde als direkter Bindungspartner von C/EBPβ identifiziert und in unabhängigen Bindungsstudien bestätigt. Aus diesen Einzelbeobachtungen wurde auf einen funktionellen Zusammenhang zwischen den Proteinen geschlossen. Es konnte gezeigt werden, dass der Anteil an methyliertem C/EBPβ durch Koexpression von G9a verstärkt wird. Darüber hinaus waren verschiedene trunkierte Varianten von C/EBPβ ein Substrat für die Methylierung durch G9a in vitro. Koexpression von G9a führte zudem zur Repression C/EBPβ-abhängiger Transkription. Koexpression einer katalytisch inaktiven G9a-Mutante hingegen hatte keinen Einfluß auf die Aktivität von C/EBPβ. Substituierende Mutationen der methylierbaren Aminosäuren führten zu einer Steigerung der Aktivität des Proteins und zu einem Verlust der Reprimierbarkeit durch G9a. Die Lysin-Methylierung durch G9a führt folglich zur transkriptionellen Repression von C/EBPβ oder zu einer Inaktivierung des Proteins.

Als C/EBPβ-interagierendes Protein konnte ausserdem die intrazelluläre Domäne des Notch1-Transmembranrezeptors identifiziert und in einer Reihe von Bindungsstudien bestätigt werden. Der Notch-Signalweg ist an einer Vielzahl entwicklungsbiologischer Prozesse beteiligt und eine Deregulation führt in unterschiedlichen Geweben zu malignen Erkrankungen. Notch1 IC verstärkt die C/EBPβ-abhängige Transkription in Reportergenstudien und bei der Aktivierung endogener myeloider Gene. Auf der anderen Seite scheint C/EBPβ der Aktivierung klassischer Zielgene des Notch-Signalweges, wie beispielsweise Hes-1, entgegenzuwirken.

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Die SUMOylierung von Transkriptionsfaktoren bringt vielfältige funktionelle, Kontext-spezifische Konsequenzen mit sich. C/EBPβwird in seiner zentral gelegenen regulatorischen Region SUMOyliert. Proteine der PIAS-Familie wirken dabei als E3-Ligasen, d. h. sie beschleunigen die SUMO-Konjugation. PIAS3 kann darüber hinaus an die SUMOylierte regulatorische Region von C/EBPβ binden und als transkriptionelles Repressormolekül wirken. Ein Teil des repressiven Effekts ist dabei vermutlich durch Komplexierung von PIAS3 mit Arginin-Methyltransferasen zu erklären.

Die bereits erwähnte Methode zur Identifikation von Interaktionspartnern auf Protein-Macroarrays wurde darüber hinaus auf posttranslational modifizierte Formen eines Proteins ausgeweitet. Es konnten Interaktionspartner der regulatorischen Region von C/EBPβ identifiziert werden, deren Bindung von dem SUMOylierungsstatus des Proteins abhängig ist. Dabei konnten Chromatin-assoziierte Faktoren wie MBD1 oder das Trithorax-Protein mit Lysin-Methyltransferaseaktivität MLL2 als Bindungspartner der regulatorischen Domäne von C/EBPβ isoliert werden.


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23.01.2008