Identifikation und Charakterisierung von Protein-Interaktionspartnern des Transkriptionsfaktors CCAAT/Enhancer Binding Protein β

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie

eingereicht an der

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von


Dipl.-Biol. Ole Pleß

geboren am 15.12.1976 in Hamburg

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin

Prof. Dr. Dr. h.c. Christoph Markschies

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Christian Limberg

Gutachter:
1. Prof. Dr. Achim Leutz
2. Prof. Dr. Klaus Scheidereit
3. Prof. Dr. Thomas Sommer

Tag der mündlichen Prüfung: 15.11.2007

Zusammenfassung

Der Transkriptionsfaktor CCAAT/Enhancer Binding Protein β (C/EBPβ) reguliert die Genexpression, Proliferation und Differenzierung in verschiedenen Zelltypen. Die Funktion von C/EBPβ wird durch Interaktionen mit einer Reihe von Kofaktoren moduliert, die Bestandteile von Chromatin-verändernden oder Transkriptions-regulierenden makromolekularen Maschinen sind. Die Identifikation und funktionelle Charakterisierung dieser Kofaktoren trägt maßgeblich zum Verständnis der Biologie von C/EBPβ bei.

C/EBPβ wird zudem in vielfältiger Weise posttranslational reguliert. Beispielsweise kann C/EBPβ phosphoryliert, SUMOyliert, acetyliert und an mehreren Positionen an Arginin- und Lysinresten methyliert werden. Die SUMOylierung von C/EBPβ gilt als Schlüsselmodifikation, die nachfolgende Modifikationen steuert und zu einer Veränderung der genregulatorischen Eigenschaften von C/EBPβ führt. C/EBPβ bindet an zwei Enzyme der SUMOylierungsmaschinerie, Ubc9 und PIAS3. Es konnte gezeigt werden, dass PIAS3 nicht nur als E3-Ligase bei der SUMOylierungsreaktion dient, sondern auch mit SUMO-modifiziertem C/EBPβ interagieren und als transkriptioneller Repressor wirken kann.

Um weitere Interaktionspartner von C/EBPβ zu identifizieren wurde ein System zur Proteom-weiten Identifikation von Bindungspartnern etabliert. Dazu wurden radioaktiv markierbare Proteinsonden hergestellt, welche die Identifikation von Bindungspartnern auf Protein-Macroarrays ermöglichten. Neben der transaktivierenden Domäne (TAD) wurde die regulatorische Region in ihrer SUMOylierten und nicht-modifizierten Form in Screening-Experimenten eingesetzt. Eine Vielzahl von neuen C/EBPβ-Bindungspartnern konnte identifiziert werden, wobei die konstitutive SUMOylierung C/EBPβ-Interaktionen verändern kann. Bei den identifizierten Proteinen handelt es sich um Mitglieder der Polycomb Gruppe, Chromatin-modifizierende Enzyme, Signaltransduktionsmoleküle und transkriptionelle Koregulatoren.

Wissenschaftlich besonders interessant war die Identifikation der Lysin-Methyltransferase H3-K9-HMTase 3 (G9a) als Bindungspartner der transaktivierenden Region von C/EBPβ. Diese Interaktion wurde durch GST-Bindungs- und Koimmunopräzipitationsstudien bestätigt. Durch massenspektrometrische Analysen konnte Monomethylierung der Aminosäuren K39 und K168 in C/EBPβ nachgewiesen werden. Dadurch ergab sich die Vermutung, dass G9a nicht nur die Methylierung von Histon H3 katalysiert, sondern auch für die Methylierung und Regulation von C/EBPβ verantwortlich ist. Rekombinantes C/EBPβkonnte durch G9a in vitro methyliert werden. Koexpression von C/EBPβ und G9a führte zu einer Reduktion der transaktivierenden Eigenschaften von C/EBPβ in Abhängigkeit von der katalytischen SET-Domäne von G9a. Dieser Reduktion konnte durch Mutation der Aminosäuren K39 und K168 in Alanin entgegengewirkt werden.

Als Bindungspartner der C/EBPβ TAD konnte außerdem die intrazelluläre Domäne von Notch1 (NICD) identifiziert werden. Der Notch-Signalweg ist ein evolutionär konservierter Genschalter, der an vielen Entscheidungen in der Entwicklung sowie bei physiologischen und pathophysiologischen Prozessen im adulten Organismus, wie
z. B. akuter lymphatischer T-Zell Leukämie (T-ALL), beteiligt ist. Die Interaktion zwischen Notch1 IC und C/EBPβ konnte in GST-Bindungsexperimenten und Koimmunopräzipitationsstudien verifiziert werden. In Reportergenstudien wurde eine Stimulation der C/EBPβ-abhängigen Transkription durch NICD beobachtet. C/EBPβ ist demnach ein Zielmolekül des Notch1-Signalweges.

Inhaltsverzeichnis

• Vorwort
• 1 Einleitung
  • 1.1 Struktur und Funktion der CCAAT/Enhancer Binding Proteine
    • 1.1.1 Die C/EBPβ „basic leucine zipper“ Domäne
    • 1.1.2 Die C/EBPβ transaktivierende Domäne
    • 1.1.3 Die C/EBPβ regulatorische Domäne
  • 1.2 Modifikation durch „Small Ubiquitin-like Modifiers“
  • 1.3 Funktionelle Änderungen von Transkriptionsfaktoren durch SUMOylierung
    • 1.3.1 Repression durch SUMO-Konjugation
    • 1.3.2 Aktivierung durch SUMO-Konjugation
    • 1.3.3 Änderung der subnukleären Lokalisation durch SUMO
    • 1.3.4 Änderung der Proteinstabilität durch SUMO
    • 1.3.5 Änderung der Proteinkonformation durch SUMO
  • 1.4 SUMOylierung führt zur Modulation von Protein-Protein-Interaktionen
  • 1.5 SUMOylierung ist essentiell für die Organisation und Funktion des Zellkerns
  • 1.6 „Protein inhibitor of activated STAT“
  • 1.7 Posttranslationale Modifikationen von C/EBPβ
  • 1.8 Ziele der Arbeit
• 2 Material und Methoden
  • 2.1 Material
    • 2.1.1 Chemikalien
    • 2.1.2 „Kits“
    • 2.1.3 Enzyme
    • 2.1.4 Proteine
    • 2.1.5 Antikörper
    • 2.1.6 Chromatographie
    • 2.1.7 Bakterien
    • 2.1.8 Zellkultur
    • 2.1.9 Zellinien
    • 2.1.10 Laborgeräte
    • 2.1.11 Oligonukleotidsequenzen und Vektoren
  • 2.2 Methoden
    • 2.2.1 DNA Methoden
      • 2.2.1.1 Amplifikation von Plasmid-DNA
      • 2.2.1.2 Transformation von E. coli
      • 2.2.1.3 Präparation von Plasmid-DNA
      • 2.2.1.4 Molekulare Klonierungen
      • 2.2.1.5 PCR
      • 2.2.1.6 Mutagenese
      • 2.2.1.7 DNA Sequenzierung
    • 2.2.2 RNA Methoden
      • 2.2.2.1 Isolation von RNA aus eukaryotischen Zellen
      • 2.2.2.2 polyA-Selektion von mRNA
      • 2.2.2.3 Elektrophorese von RNA und Northern-Hybridisierung
    • 2.2.3 Biochemische Methoden
      • 2.2.3.1 Eindimensionale SDS-Gelelektrophorese von Proteinen
      • 2.2.3.2 Coomassie-Färbungen von SDS-Proteingelen
      • 2.2.3.3 Silberfärbungen von SDS-Proteingelen (für die Massenspektrometrie)
      • 2.2.3.4 Immunoblot und Immunodetektion
      • 2.2.3.5 Koimmunopräzipitation
      • 2.2.3.6 Expression von Proteinen in E. coli
      • 2.2.3.7 Expression SUMOylierter Proteine in E. coli
      • 2.2.3.8 Affinitätsreinigung von Glutathion-S-Transferase Fusionsproteinen
      • 2.2.3.9 Enzymatische Spaltung von Glutathion-S-Transferase Fusionsproteinen mittels Thrombin Protease
      • 2.2.3.10 Affinitätsreinigung von His-Fusionsproteinen
      • 2.2.3.11 Dialyse von Proteinlösungen
      • 2.2.3.12 Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford (Mikrotiterplattenformat)
      • 2.2.3.13 Expression von Proteinen im zellfreien System (Reticulozyten)
      • 2.2.3.14 GST-Bindungsstudien
      • 2.2.3.15  In vitro Phosphorylierung mit Erk1 Kinase
      • 2.2.3.16  In vitro Methylierung mit immunopräzipitiertem G9a
      • 2.2.3.17  In vitro SUMOylierung
      • 2.2.3.18 Tandem affinity purification
    • 2.2.4 Identifikation von Interaktionspartnern auf RZPD Protein-Macroarrays
      • 2.2.4.1 Herstellung einer radioaktiv markierten Proteinsonde
      • 2.2.4.2 Hybridisierung der RZPD Protein-Macroarray PVDF-Membran
      • 2.2.4.3 Detektion gebundener Proteine
      • 2.2.4.4 Identifikation von Interaktionspartnern
    • 2.2.5 Reportergenstudien
    • 2.2.6 Zellkultur
      • 2.2.6.1 Zellinien
      • 2.2.6.2 Transiente Transfektion
      • 2.2.6.3 Virale Infektionen
    • 2.2.7 Immunofluoreszenz
• 3 Ergebnisse
  • 3.1 „Tandem affinity purification“ (TAP) zur Identifikation C/EBPβ-assoziierter Proteinkomplexe
    • 3.1.1 Generierung von stabil exprimierenden C/EBPβ-TAP Zellinien
    • 3.1.2 Reinigung von C/EBPβ-TAP Komplexen
  • 3.2 Hybridisierung von Protein-Macroarrays zur Identifikation von Bindungspartnern
    • 3.2.1 Generierung einer Proteinsonde aus der transaktivierenden Domäne (CR1-4) von C/EBPβ
    • 3.2.2 Identifikation von Interaktionspartnern
    • 3.2.3 Auswahl von C/EBPβ Interaktionspartnern
  • 3.3 N-CoR und das verwandte N-CoR2 binden an die C/EBPβ TAD
  • 3.4 Lysin-Methylierung von C/EBPβ durch G9a führt zu transkriptioneller Repression
    • 3.4.1 G9a interagiert mit C/EBPβ in GST-Bindungsstudien und Koimmunopräzipitationsexperimenten
    • 3.4.2 C/EBPβ ist an Lysinresten methyliert und die Methylierung kann durch G9a verstärkt werden
    • 3.4.3 Die G9a SET-Domäne ist verantwortlich für die transkriptionelle Repression von C/EBPβ
    • 3.4.4 C/EBPβ und G9a kolokalisieren im Zellkern
  • 3.5 Die Notch1 IC Domäne ist ein Koaktivator für die C/EBPβ-abhängige Transkription
    • 3.5.1 NICD bindet C/EBPβ in GST-Bindungs- und Koimmunopräzipitationsexperimenten
    • 3.5.2 Endogene Notch1 IC- und C/EBPβ-Proteine interagieren miteinander
    • 3.5.3 CR4 in C/EBPβ vermittelt die Bindung an Notch1 IC
    • 3.5.4 Notch1 IC wirkt als Koaktivator für C/EBPβ
      • 3.5.4.1 Notch1 IC erhöht die C/EBPβ-abhängige Transkription in Reportergenstudien
      • 3.5.4.2 Notch1 IC erhöht die transkriptionelle Aktivität von C/EBPβ bei der Aktivierung differenzierungs-spezifischer Gene im Chromatin
    • 3.5.5 C/EBPβ wirkt der Aktivierung von CSL/RBP-Jκ durch Notch1 IC entgegen
  • 3.6 Untersuchungen zur SUMOylierung von C/EBPβ
    • 3.6.1 PIAS3 und Ubc9 binden die regulatorische Region von C/EBPβ im Hefe-Zwei-Hybrid-System
    • 3.6.2 PIAS-Proteine verstärken die SUMOylierung von C/EBPβ in vitro
    • 3.6.3 C/EBPβ-SUMO-1 interagiert mit der SP-RING Domäne von PIAS3
    • 3.6.4 C/EBPβ CR6-SUMO-1 ist die minimale Interaktionsdomäne für die Interaktion mit PIAS3
    • 3.6.5 C/EBPβ interagiert nicht mit PIASy
    • 3.6.6 PIAS3 ist ein SUMO-abhängiger C/EBPβ Repressor
    • 3.6.7 PIAS-Proteine rekrutieren Arginin-Methyltransferasen
    • 3.6.8 SUMOylierung und Phosphorylierung von C/EBPβ CR567 sind in vitro unabhängig voneinander
  • 3.7 Detektion von Interaktionspartnern auf Protein-Macroarrays mit radioaktiv markierten Proteinsonden der C/EBPβ RD in SUMO-1-modifizierter und unmodifizierter Form
    • 3.7.1 Generierung einer SUMO-1-modifizierten Proteinsonde aus der RD (CR567) von C/EBPβ
    • 3.7.2 Identifikation von SUMO-1-abhängigen Interaktionspartnern der regulatorischen Domäne von C/EBPβ
    • 3.7.3 Auswahl von Interaktionspartnern der C/EBPβ RD
• 4 Diskussion
  • 4.1 Tandem affinity purification führte nicht zur Identifikation von neuen Interaktionspartnern
  • 4.2 Identifikation von neuen Interaktionspartnern auf Protein-Macroarrays
  • 4.3 Neue Interaktionspartner der C/EBPβ TAD
    • 4.3.1 Mitglieder der Polycomb-Familie
    • 4.3.2 Interaktionspartner die auf neue posttranslationale Modifikationen von C/EBPβ hinweisen
    • 4.3.3 Moleküle in Signaltransduktionskaskaden
    • 4.3.4 Transkriptionsfaktoren und Koregulatoren
  • 4.4 Interaktion und Repression von SUMO-modifiziertem C/EBPβ durch PIAS3
  • 4.5 Neue Interaktionspartner der C/EBPβ regulatorischen Domäne
    • 4.5.1 Bindungspartner der RD in ihrer nicht-SUMOylierten Form
    • 4.5.2 Bindungspartner der RD in ihrer SUMOylierten und nicht-SUMOylierten Form
    • 4.5.3 Bindungspartner der RD in ihrer SUMOylierten Form
  • 4.6 Abschließende Bemerkungen
• Abkürzungsverzeichnis
• Anhang
• Danksagung
• Erklärung
• Lebenslauf Ole Pleß
• Veröffentlichungen
• Quellenverzeichnis

Tabellen

• Tab. 2.1: Verwendete Bakterienstämme zur Expression von Fusionsproteinen. Detaillierte Informationen zu verwendeten Bakterienstämmen wurden dem „pET System Manual, 10^th Edition“ (Novagen, 2003) entnommen
• Tab. 2.2: Verwendete Oligonukleotide für Sequenzierungen, Klonierungen und Mutagenesen. Die jeweilige Nukleotidsequenz ist vom 5´-Ende dargestellt.
• Tab. 2.3: Verwendete virale, eukaryotische und prokaryotische Expressionspla s m i de.
• Tab. 2.4: Anleitung zur Bestimmung der absoluten Position eines Klons auf dem RZPD Protein-Macroarray.
• Tab. 2.5: Übersicht über die verwendeten Protein-Macroarrays und die hybrid i sierten Protei n sonden.
• Tab. 3.2: Auswahl der Interaktionspartner der C/EBP β   TAD. Insgesamt wurden 19 Interaktionspartner ausgewählt, welche bestimmten Proteinfamilien zugeordnet wurden (Polycomb Proteine, Posttranslationale Modifikatoren, Moleküle in Signaltransduktionswegen und Transkriptionelle Kofaktoren).
• Tab. 3.6: Ausgewählte Interaktionspartner der PKA-C/EBP β CR567 Proteinso n de in ihrer S U MOylierten oder nicht-SUMOylierten Form. Die Tabelle zeigt die neun wichtigsten Interaktionspartner, welche an die unmodifizierte oder SUMO-modifizierte regulatorische Domäne von C/EBPβ binden.
• Tab. 4.1: Interaktionspartner der C/EBP β TAD - Polycomb-Familie. Die Tabelle zeigt drei Interaktionspartner, die zur Polycomb-Familie gehören oder damit funktionell assoziiert sind.
• Tab. 4.2: Interaktionspartner der C/EBP β TAD - posttranslationale Modifikat o ren. Die Tabelle zeigt sechs Interaktionspartner, die den posttranslationalen Modifikatoren zugeordnet werden können. Sie besitzen entweder enzymatische Funktionen oder sind Bestandteile von Multiproteinkomplexen mit enzymatischen Funktionen.
• Tab. 4.3: Interaktionspartner der C/EBP β TAD - Moleküle in Signaltransdukt i onskaskaden. Die Tabelle zeigt drei Interaktionspartner, die den Signaltransduktoren zugeordnet werden können.
• Tab. 4.4: Interaktionspartner der C/EBP β TAD - Transkriptionsfaktoren und Koregulatoren. Die Tabelle zeigt sieben Interaktionspartner, die den Transkriptionsfaktoren oder transkriptionellen Aktivatoren/Repressoren zugeordnet werden können.
• Tab. 4.5: Interaktionspartner der C/EBP β RD in ihrer nicht-SUMOylierten Form.
• Tab. 4.6: Interaktionspartner der C/EBP β RD in ihrer nicht-SUMOylierten oder S U MOylie r ten Form.
• Tab. 4.7: Interaktionspartner der C/EBP β RD in ihrer SUMO y lierten Form.

Bilder

• Abb. 1.1: Schematische Darstellung von C/EBP β des Huhns (modifiziert nach Kowenz-Leutz et al. , 1994). Aminosäurepositionen (AS) sind oben, konservierte Regionen („conserved regions“, CR) sind unterhalb des Proteins dargestellt. Die konservierten Regionen sind in blau (CR1), grün (CR2-4), rot (CR567) und dunkelgrau (CR8-9) dargestellt. Dazwischen liegen hellgraue Bereiche mit einem geringen Grad an Konservierung und einem hohen Anteil an Alanin, Glycin und Prolin. Die konservierten Regionen 2, 3 und 4 sind Bestandteile der transaktivierenden Region. Die rot markierten Bereiche 5, 6 und 7 bilden die regulatorische Region. Dunkelgraue Bereiche zeigen die DNA-Bindungs- und Dimerisierungsregion (CR8-9). CR1, AS 1-13; CR2, AS 18-38; CR3, AS 42-63; CR4, AS 99-113; CR 5, AS 118-131; CR6, AS 145-179; CR7, AS 184-222; CR8-9, AS 243-317.
• Abb. 1.2: Kristallstruktur einer dimerisierten bZIP-Region (CR8-9) von C/EBP β gebunden an DNA. Der zwei bZIP-Proteine sind in blau und türkis dargestellt. Die DNA-Stränge sind in grün und gelb gezeigt. Die .pdb-Datei, welche die Daten der Kristallstruktur enthält, wurde aus Tahirov et al. (2002) entnommen und mit dem Programm 3D-Mol dargestellt.
• Abb. 1.3: Schematische Darstellung des SUMO Reaktionsweges (modif i ziert nach Jaffray und Hay, 2006). Das unprozessierte SUMO-Vorläuferprotein wird durch eine SUMO-spezifische Protease gespalten und es entstehen zwei endständige Glycine am C-Terminus des Proteins. Das prozessierte Protein wird durch das E1-Enzym (Uba2/Aos1) gebunden und mit ATP aktiviert. Durch eine Transesterifizierungsreaktion wird SUMO nachfolgend auf das E2 SUMO-konjugierende Enzym (Ubc9) übertragen. SUMO kann nun an das Substratprotein konjugiert werden. Dieser Schritt wird bei einigen Substratproteinen durch E3-Ligasen (PIAS, RanBP2 oder Pc2) unterstützt. Die SUMOylierung kann durch SUMO-spezifische Proteasen vom Substratprotein entfernt werden.
• Abb. 1.4: Schematische Darstellung der PIAS Proteine. Die obere Abb. zeigt die Domänenstruktur von PIAS3. Sie zeigt die N-terminal gelegene SAP-Domäne, das PINIT Motiv, die für die SUMO-Katalyse relevante SP-RING Domäne, die saure Region („acidic region“, AR) mit dem SUMO-bindenden Motiv und die C-terminal gelegene Serin/Threonin-reiche Region (S/T). Diese Domänenstruktur ist auch bei den hier nicht gezeigten Vertretern der Proteinfamilie (PIAS1, PIASxα und PIASxβ) stark konserviert. Abweichend davon zeigt PIASy eine C-terminale Verkürzung des Proteins und ein Fehlen des SUMO-bindenden Motives.
• Abb. 2.1: Aminosäuresequenz des TAP-tags. Dargestellt ist die Peptidsequenz des TAP-tags vom N-terminalen Bereich aus. CBP- und ProtA-Interaktionsdomänen sind fett dargestellt, die TEV Proteasesequenz ist fett und unterstrichen dargestellt. Das dargestellte Peptid ist für C-terminale Fusionen geeignet.
• Abb. 2.2: Reinigungsschema der TAP-Methode (modifiziert nach Rigaut et al. , 1999). Dargestellt sind die vier Arbeitsschritte der TAP-Methode. 1) Das Zielprotein liegt mit einem C-terminalen TAP-tag in Zellen vor und ist mit anderen Proteinen komplexiert. Das TAP-Epitop besteht aus einem calmodulin binding peptide (CBP), einer Schnittstelle für die TEV Protease und zwei IgG-Bindungsdomänen von ProtA. 2) In einem ersten Affinitätsschritt wird das TAP-Fusionsprotein an eine IgG Affinitätsmatrix gebunden und Verunreinigungen entfernt. Die Elution erfolgt mit TEV-Protease. 3) Im zweiten Affinitätsschritt wird das CBP-Fusionprotein in Abhängigkeit von Ca²⁺ an eine Calmodulin-Matrix gebunden. Die TEV-Protease und Fremdproteine werden ausgewaschen. 4) TAP-Fusionsproteine und assoziierte Komplexpartner können mit EGTA von der Säule eluiert und identifiziert werden.
• Abb. 2.3: Schematische Darstellung der pM82 Reportergenkonstrukte. pM82 besitzt invertierte C/EBPβ-Bindungsstellen aus dem cMGF-Minimalpromotor. Optional wurden diese durch vier Gal4-Bindungsstellen ausgetauscht (modifiziert nach Kowenz-Leutz et al., 1994).
• Abb. 3.1: Expression der C/EBP β -TAP Konstrukte in K562-Zellen. K562-Zellen wurden mit LAP*-, LAP-, LIP- und CR89-TAP Konstrukten infiziert und mit Puromycin für 10 Tage selektioniert. Von jeder Zellinie wurden 1x10⁵ Zellen lysiert, die Lysate mit SDS-PAGE aufgetrennt und die Fusionsproteine mittels Immunoblot (anti-ProtA Antikörper) detektiert.
• Abb. 3.2: Reinigung der C/EBP β -TAP Isoform und assoziierter Proteine aus K562-Zellen. (A) Aufschluss und Fraktionierung der Zellen und Bindung an die IgG-Affinitätssäule. Als Ausgangsmaterial dienten 1x10⁹ Zellen. (B) IgG-Affinitätsmatrix vor und nach der proteolytischen Spaltung mit TEV Protease. (C) Elution von der IgG-Affinitätsmatrix und Bindung an die Calmodulin-Säule. (D) Elutionsfraktionen von der Calmodulin-Affinitätsmatrix. Die Fragezeichen (?) markieren putative Interaktionspartner.
• Abb. 3.3: Schematische Darstellung der „Far-Western“ Methode zur Ide n tifikation i n t e ragierender Proteine (modifziert nach Mahlknecht et al., 2001). Eine Membran mit aufgespotteten Proteinen wurde mit einer radioaktiven Proteinsonde inkubiert. Interagierende Proteine konnten direkt mittels Autoradiographie nachgewiesen werden.
• Abb. 3.4: Schematische Darstellung der GST-PKA-C/EBP β   Fusionsprote i ne. (A) Die N-terminal gelegene Region (orange) zeigt den GST-Anteil des Proteins. Der schwarze Balken enthält die Thrombinschnittstelle und die rote Region enthält die PKA-Phosphoakzeptorsequenz. Die Thrombin Protease hydrolysiert die Bindung zwischen Arginin und Glycin. PKA phosphoryliert spezifisch das Serin in der Phosphoakzeptorsequenz. Blaue, grüne und graue Teile bilden die transaktivierende Region von C/EBPβ (CR 1-4). Durch CR1 kann der SWI/SNF-Komplex zur Remodellierung von Chromatin rekrutiert werden (Kowenz-Leutz und Leutz, 1999). Grüne Bereiche zeigen Abschnitte mit einem hohen Grad an Konservierung zwischen verschiedenen Spezies und anderen Mitgliedern der C/EBPβFamilie. Graue Bereiche sind weniger stark konserviert. (B) Wie (A), nur das graue und gelbe Bereiche die regulatorische Region von C/EBPβ bilden (CR5, 6 und 7). CR6 enthält eine SUMO-Akzeptorsequenz. CR: „conserved region“, konservierte Region.
• Abb. 3.5: Strategie zur Identifikation von Interaktionspartnern.
• Abb. 3.6: Expression und enzymatische Spaltung des GST-PKA-C/EBP β CR1-4 Fus i onsproteins mittels Thrombin. (A) Für die Expressionskontrolle wurden Bakterien nach 2 h, 3 h und 4 h geerntet und wie in Kap. 2.2.3.6 beschrieben lysiert. 5 μl des Lysats wurden auf einem 12% SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt und mit Coomassie-Lösung gefärbt. (B) Für die enzymatische Spaltung wurden jeweils 5 μg GST-PKA-C/EBPβ CR1-4 mit 1/20 U Thrombin Protease bei 4°C oder bei RT inkubiert. Nach Inkubation für eine oder zwei Stunden bzw. über Nacht wurde ein Teil des Reaktionsansatzes entnommen, mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese aufgetrennt und mit Coomassie-Lösung gefärbt.
• Abb. 3.7: Thrombin-Spaltung, Affinitätsaufreinigung und in vitro Phosphorylierung des GST-PKA-C/EBP β CR1-4 Fusionsproteins. (A) Neben dem GST-PKA-C/EBPβ Fusionsprotein wurde GST-PKA als Referenz gespalten. Die Thrombinspaltung erfolgte über Nacht bei RT. Thrombin-Protease wurde durch Benzamidin-Sepharose Affinitätschromatographie aus dem Ansatz entfernt. Abgespaltene GST-Reste wurden durch Glutathion-Sepharose Affinitätschromatographie zum Teil aus der Lösung entfernt. Die Proteine wurden auf einem 12% SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt und mittels Coomassie-Färbelösung sichtbar gemacht. In der vierten Spur ist neben dem abgespaltenen GST-Anteil das PKA-C/EBPβ CR1-4 Fusionsprotein zu sehen. (B) In vitro Phosphorylierung des PKA-C/EBPβ CR1-4 Fusionsproteins mit PKA. 5 μg abgespaltenes GST bzw. PKA-Fusionsprotein wurden in die Phosphorylierungsreaktion eingesetzt. 1/50 des Reaktionsansatzes wurde auf einem 12% SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt. Das Gel wurde getrocknet und radioaktiv markiertes Protein mittels Autoradiographie nachgewiesen.
• Abb. 3.8: Identifikation von Interaktionspartnern auf dem Protein-Macroarray. Die Klone auf der PVDF-Membran sind nach einem der acht Muster in Doppelwerten aufgetragen worden. Bei einer positiven Interaktion werden deshalb beide Klone sichtbar. Abgebildet sind beispielhaft zwei Interaktionspartner, die nach dem Muster 2 bzw. 5 aufgespottet wurden. Der schwarze Punkt in der Mitte der 5x5-Quadrate dient als Referenzmarke zur Orientierung.
• Abb. 3.9: N-CoR und N-CoR2/SMRT binden die transaktivierende Region von C/EBP β in GST-Bindungsstudien. (A) 3 μg GST bzw. GST-PKA-C/EBPβ CR1-4 wurden an Glutathion-Sepharose gebunden. N-CoR wurde von dem Plasmid pcDNA3-N-CoR mit dem „TnT T7 Coupled Reticulocyte Lysate System“ in vitro translatiert und für 1 h mit den GST-Proteinen inkubiert. Nach häufigem Waschen mit Bindungspuffer wurde die Glutathion-Sepharose auf einem 8% SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt. Anschließend wurde das SDS-Polyacrylamidgel getrocknet und radioaktiv markierte Proteine mittels Autoradiographie sichtbar gemacht. Nach der Exposition wurde das Gel in SDS-PAGE Laufpuffer rehydriert und die GST-Proteine mittels Coomassie-Färbung sichtbar gemacht. (B) Wie (A), nur dass N-CoR2/SMRT von dem Plasmid pcDNA3-N-CoR2 in vitro translatiert wurde.
• Abb. 3.10: Die Lysin-Methyltransferase G9a bindet C/EBP β. (A) GST-Bindungsstudie zwischen G9a und der transaktivierenden Region von C/EBPβ. 3 μg GST bzw. GST-PKA-C/EBPβ CR1-4 wurden an Glutathion-Sepharose Affinitätsmatrix gebunden. G9a wurde von dem Plasmid pcDNA3-hG9a in vitro translatiert und für 1 h mit den gebundenen GST-Proteinen inkubiert. Matrix-gebundene Proteine wurden auf einem 8% SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt und radioaktiv markiertes Protein mittels Autoradiographie sichtbar gemacht. Nach der Exposition wurde das Gel rehydriert und Proteine mit Coomassie-Lösung angefärbt. (B) Koimmunopräzipitationsstudie zwischen C/EBPβ LAP*-FLAG und GFP-G9a bzw. GFP-G9a ΔSET. pCMV-GFP, pCMV-GFP-G9a bzw. pCMV-GFP-G9a ΔSET wurden zusammen mit pcDNA3-C/EBPβ LAP*-FLAG wurden transient in HEK-293 Zellen transfiziert. Nach 48 h wurden die Zellen lysiert und mittels „Anti-FLAG M2 Affinity Gel“ immunopräzipitiert (IP). Die Proteine wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und durch Immunoblot (IB) mit anti-GFP bzw. anti-FLAG Antikörpern detektiert.
• Abb. 3.11: G9a interagiert mit CR4 in C/EBP β. Koimmunopräzipitationsstudie zwischen C/EBPβ CR489 und GFP-G9a und verschiedenen C/EBPβ-Mutanten. pCMV-G9a wurde zusammen mit pcDM8-C/EBPβ LAP*, CR489 oder ΔCR4 transient in HEK-293 Zellen transfiziert. Nach 48 h wurden die Zellen lysiert und mittels anti-C/EBPβ immunopräzipitiert (IP). Die Proteine wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und durch Immunoblot (IB) mit anti-GFP bzw. anti-C/EBPβ Antikörpern detektiert (n.s.: nicht spezifisch).
• Abb. 3.12: G9a verstärkt die Lysin-Methylierung von C/EBP β. (A) pcDNA-C/EBPβ-FLAG wurde alleine oder in Kombination mit pCMV-GFP-G9a transient in HEK-293 Zellen transfiziert. Nach 48 h wurden die Zellen lysiert und mittels anti-FLAG Affinitätsmatrix immunopräzipitiert (IP). Die Proteine wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und durch Immunoblot (IB) mit anti-pan-methyl-Lysin bzw. anti-FLAG Antikörpern detektiert. (B) Quantifizierung der Signale. C/EBPβ-FLAG wurde mit einem anti-Maus Alexa 680 Antikörper (rot) detektiert. Lysin-methyliertes C/EBPβ wurde mit einem anti-Kaninchen Alexa 800 Antikörper (grün) detektiert. Die fluoreszierenden Signale wurden auf einem Odyssey Imager detektiert und quantifiziert. Gezeigt sind die Quotienten der Intensitäten (grünes Signal / rotes Signal). Die Standardabweichung ergibt sich aus zwei individuellen Experimenten.
• Abb. 3.13: Die Histon-Lysin N-Methyltransferase G9a methyliert GST-C/EBP β CR1-7 in vitro . (A) Die in vitro Methylierung von rekombinantem GST-C/EBPβ (CR1-7) bzw. GST erfolgte durch Konjugation ³H-markierter CH₃-Gruppen. S-Adenosyl-Methionin diente dabei als Methyl-Donor. G9a bzw. G9a ΔSET wurden als GFP-Fusionsproteine in HEK-293-Zellen exprimiert, daraus immunopräzipitiert und direkt in die Reaktion eingesetzt. Die Reaktion wurde für 4 h bei 30°C durchgeführt. Anschließend wurden die Proben durch SDS-PAGE aufgetrennt, das SDS-Polyacrylamidgel getrocknet und radioaktiv markiertes Protein mittels Autoradiographie sichtbar gemacht. (B) 5 μg GST bzw. GST-C/EBPβ CR1-7 wurden in die Reaktion eingesetzt. Nach erfolgter Exposition wurde das Gel aus (A) rehydriert und mit Coomassie-Lösung angefärbt. (C) pCMV-GFP-G9a bzw. pCMV-GFP-G9a ΔSET wurden in HEK-293-Zellen exprimiert. Nach 48 h wurden die Zellen lysiert, GFP-G9a bzw. GFP-G9a ΔSET immunopräzipitiert und mittels Immunoblot mit anti-GFP-Antikörpern detektiert.
• Abb. 3.14: Die Histon-Lysin N-Methyltransferase G9a methyliert die LIP Isoform von C/EBP β in vitro . (A) Die in vitro Methylierung von rekombinantem GST-C/EBPβ (LIP Isoform) bzw. GST erfolgte durch Konjugation ³H-markierter CH₃-Gruppen. S-Adenosyl-Methionin diente dabei als Methyl-Donor. G9a bzw. G9a ΔSET wurden als GFP-Fusionsproteine in HEK-293-Zellen exprimiert, daraus immunopräzipitiert und direkt in die Reaktion eingesetzt. Die Reaktion wurde für 4 h bei 30°C durchgeführt. Anschließend wurden die Proben durch SDS-PAGE aufgetrennt, das SDS-Polyacrylamidgel getrocknet und radioaktiv markiertes Protein mittels Autoradiographie sichtbar gemacht. (B) 5 μg GST bzw. GST-C/EBPβ LIP wurden in die Reaktion eingesetzt. Nach erfolgter Exposition wurde das Gel aus (A) rehydriert und mit Coomassie-Lösung angefärbt. (C) pCMV-GFP-G9a bzw. pCMV-GFP-G9a ΔSET wurden in HEK-293-Zellen exprimiert. Nach 48 h wurden die Zellen lysiert, GFP-G9a bzw. GFP-G9a ΔSET immunopräzipitiert und mittels Immunoblot mit anti-GFP-Antikörpern detektiert.
• Abb. 3.15: Die G9a SET-Domäne und die monomethylierten Lysine K39 und K168 in C/EBP β sind entscheidend für die Repression der C/EBP β LAP*-abhängigen Transkription. (A) Schematische Darstellung des pM82 Reportergenkonstrukts. Die C/EBPβ-Bindungsstellen sind grau schattiert dargestellt. (B) pCMV-GFP-G9a bzw. pCMV-GFP-G9a ΔSET und pcDM8-C/EBPβ LAP* wurden zusammen mit dem Luciferase-Reportergenkonstrukt pM82 in HEK-293 Zellen transfiziert, nach 48 h lysiert und die relativen Lichteinheiten gemessen. Die Expression der verschiedenen G9a- bzw. C/EBPβ-Konstrukte wurde durch Immunoblot mit anti-GFP bzw. anti-C/EBPβ Antikörpern nachgewiesen. Die Zahlen unter der Graphik geben die Menge an transfiziertem pCMV-GFP-G9a bzw. -G9a ΔSET-Plasmid an (in ng). (C) pCMV-GFP-G9a bzw. pCMV-GFP-G9a ΔSET und pcDM8-C/EBPβ LAP*, LAP* K39A, LAP* K168A und LAP* K39/168A wurden zusammen mit dem Luciferase-Reportergenkonstrukt pM82 in HEK-293 Zellen transfiziert, nach 48 h lysiert und die relativen Lichteinheiten gemessen. RLU: Relative light units.
• Abb. 3.16: CR1-4-Gal4 DBD, jedoch nicht CR1-3-Gal4 DBD oder CR4-Gal4 DBD werden durch die SET-Domäne von G9a transkriptionell reprimiert. (A) Schematische Darstellung des pM82 Reportergenkonstrukts, bei dem die zwei C/EBPβ-Bindungsstellen durch vier Gal4-Bindungsstellen ausgetauscht wurden. (B-D) pCMV-GFP-G9a bzw. pCMV-GFP-G9a ΔSET Konstrukte wurden zusammen mit pcDM8-C/EBPβ CR1-4-Gal4 DBD (B), pcDM8-C/EBPβ CR4-Gal4 DBD (C) oder pcDM8-C/EBPβ CR1-3-Gal4 DBD (D) und dem unter (A) beschriebenen Gal4-abhängigen Reporterkonstrukt transient in HEK-293 Zellen transfiziert. Für die Normalisierung der Lichteinheiten gegen die Transfektionseffizient wurden gleiche Mengen pCMV-β-Galactosidase kotransfiziert. 48 h nach der Transfektion wurden die Zellen lysiert und die Lichteinheiten wie unter „Material und Methoden“ beschrieben gemessen. Eine schematische Darstellung der C/EBPβ TAD-Gal4 DBD Konstrukte ist über der jeweiligen Abbildung gezeigt. RLU: Relative light units.
• Abb. 3.17: C/EBP β und G9a zeigen eine Kolokalisation im Zellkern. Immunofluoreszenzmikroskopie von Cos7-Zellen nach Transfektion mit C/EBPβ oder GFP-G9a. Die Zellen wurden nach 48 h mit 4% PFA-Lösung (Histofix) fixiert, permeabilisiert und C/EBPβ mit einem anti-C/EBPβ Antiserum und einem Alexa Fluor 555 gekoppelten anti-Kaninchen IgG angefärbt (rot). Die GFP-G9a Fusionsproteine konnten direkt sichtbar gemacht werden (grün). Kern-DNA wurde mittels DAPI angefärbt und mit UV-Licht sichtbar gemacht (blau). Bereiche, die Kolokalisieren zeigen durch die Überlagerung eine gelbliche Färbung.
• Abb. 3.18: Notch1 IC bindet C/EBP β unabhängig von der RAM-Domäne. (A) GST-Bindungsstudie zwischen Notch1 IC bzw. Notch1 IC ΔRAM und der transaktivierenden Region von C/EBPβ. 3 μg GST bzw. GST-C/EBPβ CR1-4 wurden an Glutathion-Sepharose Affinitätsmatrix gebunden. Notch1 IC bzw. Notch1 IC ΔRAM wurden von den Plasmiden pcDNA3-FLAG-Notch1 IC bzw. pcDNA3-FLAG-Notch1 IC ΔRAM in vitro translatiert und für  1 h mit den gebundenen GST-Proteinen inkubiert. Radioaktiv markierte Proteine wurden auf einem 8% SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt und mittels Autoradiographie sichtbar gemacht. Nach erfolgter Exposition wurde das Gel rehydriert und Proteine mit Coomassie-Lösung angefärbt (input GST-Proteine). (B) Koimmunopräzipitation zwischen Notch1 IC und C/EBPβ. pcDNA3-FLAG-Notch1 IC, pcDNA3-FLAG-Notch1 IC ΔRAM und pcDM8-C/EBPβ LAP* Konstrukte wurden transient in HEK-293 Zellen transfiziert. Nach 48 h wurden die Zellen lysiert und mittels „Anti-FLAG M2 Affinity Gel“ immunopräzipitiert. Gebundene Proteine wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und interagierende Proteine durch Immunoblot mit anti-C/EBPβ Antikörpern detektiert.
• Abb. 3.19: Endogen exprimiertes C/EBP β und NICD interagiert in Jurkat T-ALL Zellen. Koimmunopräzipitation zwischen Notch1 IC und C/EBPβ. Pro Ansatz wurden 10⁶ Jurkat-Zellen lysiert und mit 2 µg anti-NICD bzw. anti-C/EBPβ Antikörper oder Präimmunserum inkubiert. An Protein A-Sepharose gebundene Antikörper-Antigen-Komplexe wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und interagierende Proteine durch Immunoblot mit anti-C/EBPβ bzw. anti-NICD Antikörper detektiert.
• Abb. 3.20: Die konservierte Region 4 (CR4) in C/EBP β   vermittelt die Bi n dung an Notch1 IC und Notch1 IC Δ RAM. (A) Die Konstrukte pcDNA3-FLAG-Notch1 IC, pcDNA3-FLAG-Notch1 IC ΔRAM und pcDM8-C/EBPβ LAP* bzw. pcDM8-C/EBPβ ΔCR4 wurden transient in HEK-293 Zellen transfiziert. Nach 48 h wurden die Zellen lysiert und mittels „Anti-FLAG M2 Affinity Gel“ immunopräzipitiert. Gebundene Proteine wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und interagierende Proteine durch Immunoblot mit anti-C/EBPβ Antikörper detektiert. (B) Wie (A), nur hier wurde neben pcDNA3-FLAG-Notch1 IC das Konstrukt pcDM8-C/EBPβ CR489 verwendet.
• Abb. 3.21: Notch1 IC ist ein Koaktivator für die C/EBP β -abhängige Transkription. (A) pcDNA3-NICD-FLAG oder pcDNA3-NICD ΔRAM-FLAG wurden in Kombination mit pcDM8-C/EBPβ LAP* und dem Luciferase-Reportergenkonstrukt pM82 in HEK-293 Zellen transfiziert. Für die Normalisierung der Lichteinheiten gegen die Transfektionseffizient wurden gleiche Mengen pCMV-β-Galactosidase kotransfiziert. 48 h nach der Transfektion wurden die Zellen lysiert und die Lichteinheiten wie unter „Material und Methoden“ beschrieben gemessen. Die Expression der verschiedenen C/EBPβ-Isoformen und der verschiedenen Notch1-Konstrukte wurde durch Immunoblot (IB) mit anti-C/EBPβ- bzw. anti-FLAG Antikörpern nachgewiesen. (B) Wie (A), nur das pcDM8-C/EBPβ LAP und pcDM8-C/EBPβ LIP verwendet wurden. (C) Wie (A), nur das zusätzlich pcDM8-C/EBPβ LAP* ΔCR4 verwendet wurde. (D) Wie (A), nur das pcDNA3-Gankyrin-HA Expressionskonstrukte wurden zusammen mit pcDM8-C/EBPβ LAP* verwendet wurden. Die Expression von C/EBPβ und Gankyrin wurde durch Immunoblot mit anti-C/EBPβ bzw. anti-HA Antikörpern nachgewiesen. RLU: Relative light units.
• Abb. 3.22: CR1-4-Gal4 DBD und CR4-Gal4 DBD, jedoch nicht CR1-3-Gal4 DBD, werden durch Notch1 IC transkriptionell aktiviert. (A-C) pcDNA3-NICD-FLAG bzw. pcDNA3-NICD ΔRAM-FLAG Konstrukte wurden zusammen mit pcDM8-C/EBPβ CR1-4-Gal4 DBD (A), pcDM8-C/EBPβ CR4-Gal4 DBD (B) oder pcDM8-C/EBPβ CR1-3-Gal4 DBD (C) und einem Gal4-abhängigen Reporterkonstrukt transient in HEK-293 Zellen transfiziert. Für die Normalisierung der Lichteinheiten gegen die Transfektionseffizient wurden gleiche Mengen pCMV-β-Galactosidase kotransfiziert. 48 h nach der Transfektion wurden die Zellen lysiert und die Lichteinheiten wie unter „Material und Methoden“ beschrieben gemessen. Die Expression der Gal4-Konstrukte und der verschiedenen Notch1-Konstrukte wurde durch Immunoblot (IB) mit anti-Gal4 bzw. anti-FLAG Antikörpern nachgewiesen. Eine schematische Darstellung der C/EBPβ TAD-Gal4 DBD Konstrukte ist über der jeweiligen Abbildung gezeigt. RLU: Relative light units.
• Abb. 3.23: Notch1 IC kann die C/EBP β -abhängige ige Transkription von myeloiden G e nen in Fibroblasten verstärken. pcDM8-C/EBPβ-, pcDNA1-c-Myb- und pcDNA-FLAG-Notch1 IC-Expressionskonstrukte wurden in QT6-Fibroblasten transfiziert und nach 24 h geerntet. Die zelluläre RNA wurde isoliert und polyA-haltige mRNA-Transkripte angereichert. Die RNA wurde elektrophoretisch aufgetrennt, geblottet und mit einer ³²P-markierten mim-1- (A), #126- (B) oder GAPDH-Sonde hybridisiert. Die Exposition erfolgte über unterschiedlich lange Zeiträume.
• Abb. 3.24: C/EBP β wirkt der Aktivierung von RBP-J κ /CSL durch Notch1 IC entgegen. (A) Ein RBP-Jκ Expressionsvektor, pcDNA3-NICD-FLAG und verschiedene Hes-1 Reportergenkonstrukte wurden zusammen mit pcDM8-C/EBPβ LAP* transient in QT6 Zellen transfiziert. Für die Normalisierung der Lichteinheiten gegen die Transfektionseffizient wurden gleiche Mengen pCMV-β-Galactosidase kotransfiziert. 48 h nach der Transfektion wurden die Zellen lysiert und die Lichteinheiten wie unter „Material und Methoden“ beschrieben gemessen. (B) Ein RBP-Jκ Expressionsvektor, pcDNA3-NICD-FLAG und verschiedene Hes-1 Reportergenkonstrukte wurden zusammen mit pcDM8-C/EBPβ LAP*, LAP* ΔCR4 oder LIP transient in QT6 Zellen transfiziert. Für die Normalisierung der Lichteinheiten gegen die Transfektionseffizient wurden gleiche Mengen pCMV-β-Galactosidase kotransfiziert. 48 h nach der Transfektion wurden die Zellen lysiert und die Lichteinheiten wie unter „Material und Methoden“ beschrieben gemessen. RLU: Relative light units.
• Abb. 3.25: PIAS SUMO-E3-Ligasen verstärken die SUMOylierung von C/EBP β   in vitro . (A) HA-FLAG-Sp3 Protein wurde in Ab- bzw. Anwesenheit von GST-PIAS1 in vitro SUMOyliert und der Reaktionsverlauf über eine Stunde verfolgt. SUMOyliertes und nicht-modifiziertes Protein wurde durch Immunoblot mit anti-HA Antikörpern detektiert. (B) GST-C/EBPβ CR1-7 Protein wurde in Ab- bzw. Anwesenheit von GST-PIAS1, GST-PIASy und GST-PIAS3 in vitro SUMOyliert und der Reaktionsverlauf über eine Stunde verfolgt. SUMOyliertes und nicht-modifiziertes Protein wurde durch Immunoblot mit anti-C/EBPβ Antikörper detektiert.
• Abb. 3.26: Die SUMO-modifizierte Form von C/EBP β interagiert mit der SP-RING D omäne von PIAS3. (A) Schematische Representation der konservierten Domänen von PIAS3 und Expressionskonstrukte, welche für die nachfolgenden Arbeiten verwendet wurden. Die Zahlen geben die Position in der murinen PIAS3-Sequenz an. (B) PIAS3 und die verschiedenen Deletionsmutanten wurden als N-terminale HA-Fusionsproteine vom Vektor pIX-HA in E. coli exprimiert und im Immunoblot (IB) mit anti-HA-Antikörper detektiert (input HA-PIAS3). (C) Input der GST-C/EBPβ-Proteine und der GST-Sp100-SUMO-1-Kontrolle. Für jeden Ansatz wurden 3 µg der GST-C/EBPβ Fusionsproteine an Glutathion-Sepharose gebunden. Die Proteine wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und im Immunoblot mit anti-GST-Antikörper detektiert. (D) GST-Bindungsstudie: Die unter (B) gezeigten HA-Fusionsproteine wurden mit den immobilisierten GST-Proteinen inkubiert und nach wiederholtem Waschen mittels SDS-PAGE aufgetrennt. Interagierende Proteine wurden mittels Immunoblot mit einem anti-HA-Antikörper detektiert.
• Abb. 3.27: Eine Punktmutation in der SP-RING Domäne von PIAS3 unte r bricht die Assoziation mit C/EBP β -SUMO-1, aber ändert nicht dessen zellul ä re Lokalisation. (A) Immunofluoreszenzmikroskopie von Cos7-Zellen nach Transfektion mit HA-PIAS3 oder HA-PIAS3 C343S exprimierenden Vektoren. Die Zellen wurden nach 48 h mit 4% PFA-Lösung (Histofix) fixiert, permeabilisiert und endogenes C/EBPβmit einem anti-C/EBPβ Antikörper (C-19) und einem Alexa Fluor 680 gekoppelten anti-Kaninchen IgG angefärbt (grün). Parallel dazu wurden die Zellen mit einem anti-HA Antikörper und einem Alexa Fluor 488 gekoppelten anti-Maus IgG gefärbt, um PIAS3-Fusionsproteine sichtbar zu machen (rot). Kern-DNA wurde mittels DAPI angefärbt und mit UV-Licht sichtbar gemacht (blau). (B) GST-Bindungsstudie zwischen C/EBPβ und PIAS3 C343S und zwischen C/EBPβ und PIAS3 als Positivkontrolle. HA-PIAS3 C343S und HA-PIAS3 wurden in E. coli exprimiert und mit immobilisierten GST-Proteinen inkubiert. Nach wiederholtem Waschen wurden die Proteine durch SDS-PAGE aufgetrennt und interagierende Proteine mittels Immunoblot (IB) mit einem anti-HA-Antikörper detektiert. Die verwendeten GST-Proteine (input) wurden mittels IB mit einem anti-GST-Antikörper nachgewiesen.
• Abb. 3.28: Die CR6 von C/EBP β in ihrer SUMOylierten Form ist ausre i chend für die Interaktion mit PIAS3. (A) Expression und Affinitätsaufreinigung von unmodifizierten und SUMO-modifizierten GST-C/EBPβ Fusionsproteinen. pGEX-4T1-C/EBPβ CR56, CR6 bzw. CR67 Expressionskonstrukte wurden alleine oder in Anwesenheit der SUMOylierungsmaschinerie (pRHSUMO, pBADE12) in BL21 (DE3) Zellen exprimiert und mittels Glutathion-Sepharose aufgereinigt. Die SUMOylierten Proteine sind mit einem * markiert. Von dem jeweiligen Eluat wurden 3 μg mit einem SDS-Polyacrylamidgel getrennt und mittels Immunoblot detektiert. (B) GST-Bindungsstudie: HA-PIAS3 wurde mit verschiedenen immobilisierten GST-C/EBPβ Proteinen inkubiert und nach wiederholtem Waschen mittels SDS-PAGE aufgetrennt. Interagierende Proteine wurden mittels Immunoblot (IB) mit einem anti-HA-Antikörper detektiert.
• Abb. 3.29: PIASy zeigt keine Bindung an C/EBP β. Bindungsstudie zwischen HA-PIASy und GST-C/EBPβ bzw. His-Lef1. 3 μg GST-Fusionsproteine bzw. His-Lef1 wurden an Glutathion-Sepharose (input GST-Proteine) bzw. an Nickel-NTA-Sepharose (input His-Lef1) gebunden. Die Sterne (*) zeigen die relevanten Fusionsproteine. Anschließend wurden die gebundenen Proteine mit Lysaten von bakteriell exprimiertem HA-PIASy inkubiert. Nach häufigem Waschen wurden die Proben auf einem 10% SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt. Gebundene Proteine wurden mittels Immunoblot (IB) mit anti-HA Antikörper detektiert.
• Abb. 3.30: PIAS3 ist ein SUMOylierungs-abhängiger Repressor von C/EBP β. (A) pcDM8-C/EBPβ LAP*, pcDNA3-HA-PIAS3 bzw. pcDNA3-HA-PIAS3 C343S, pcDNA3-HA-Ubc9 und pcDNA3-HA-SUMO-1 wurden zusammen mit dem Luciferase-Reportergenkonstrukt pM82 transient in HEK-293 Zellen transfiziert. Für die Normalisierung der Lichteinheiten gegen die Transfektionseffizienz wurden gleiche Mengen pCMV-β-Galactosidase kotransfiziert. 48 h nach der Transfektion wurden die Zellen lysiert und die Lichteinheiten wie Kap. 2.2.5 beschrieben gemessen. (B) Wie (A), nur das die nicht-SUMOylierbare Mutante von C/EBPβ transfiziert wurde (pcDM8-C/EBPβ LAP* K155A). (C) Wie (A), nur das die SUMO-spezifische Isopeptidase SuPr-1 (pcDNA3-HA-SuPr-1) kotransfiziert wurde. (D) Wie (A), nur das steigende Mengen an pcDNA3-HA-PIASy kotransfiziert wurden. RLU: Relative light units.
• Abb. 3.31: PIAS-Proteine können Protein-Arginin-Methyltransferasen bi n den. Bindungsstudie zwischen GST-PIAS1, -PIAS3, -PIASx beta und -PIASy und verschiedenen PRMTs. 3 μg GST-Fusionsproteine wurden an Glutathion-Sepharose (input GST-Proteine) gebunden. Anschließend wurden die gebundenen Proteine mit Lysaten von in HEK-293 Zellen exprimierten HA-PRMT Fusionsproteinen inkubiert. Nach häufigem Waschen wurden die Proben auf einem 10% SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt. Gebundene Proteine wurden mittels Immunoblot (IB) mit anti-HA Antikörper detektiert.
• Abb. 3.32: Keine Abhängigkeit der SUMOylierung und Phosphorylierung von C/EBP β CR567 in vitro . (A) GST-C/EBPβ CR567 wurde in Bakterien exprimiert und SUMOyliert und über Glutathion-Sepharose gereinigt. Gleiche Mengen modifiziertes und unmodifiziertes Protein wurden in eine in vitro Phosphorylierungsreaktion mit rekombinantem Erk1 und ³²P-γATP eingesetzt. Der untere Teil von Abb. (A) zeigt den Input der Proteine nach SDS-PAGE und Coomassiefärbung, der obere Teil zeigt das Ergebnis nach der Phosphorylierungsreaktion, SDS-PAGE und Autoradiographie für 2 h. (B) In einem zu (A) reziproken Experiment wurde GST-C/EBPβ CR567 einer in vitro Phosphorylierungsreaktion unterworfen und anschließend wurden phosphorylierte und unphosphorylierte Proteine in vitro SUMOyliert. GST-Fusionsproteine wurden durch Immunoblot (IB) mit einem anti-GST Antikörper detektiert.
• Abb. 3.33: Schematische Darstellung der parallelen Hybridisierung zweier Protein Macroarrays mit der PKA-C/EBP β CR567 Proteinsonde in ihrer S U MOylierten und nicht-SUMOylierten Form. Die N-terminal gelegene Region (orange) zeigt den GST-Anteil des Proteins. Der schwarze Balken enthält die Thrombinschnittstelle und die rote Region enthält die PKA-Phosphoakzeptorsequenz. Die Thrombin Protease hydrolysiert die Bindung zwischen Arginin und Glycin. PKA phosphoryliert spezifisch das Serin in der Phosphoakzeptorsequenz. Graue und gelbe Bereiche bilden die regulatorische Region von C/EBPβ (CR5,6 und 7), wobei graue Bereiche weniger stark konserviert sind und gelbe Bereiche einen hohen Grad an Konservierung zwischen verschiedenen Spezies und anderen Mitgliedern der C/EBPβ-Familie zeigen. CR6 enthält eine SUMO-Akzeptorsequenz. CR: „conserved region“, konservierte Region.
• Abb. 3.34: SUMOylierung von C/EBP β CR567 in E. coli . Expression und Affinitätsaufreinigung von unmodifizierten und His-SUMO-1-modifizierten GST-C/EBPβ CR567 Fusionsproteinen. Spur 1 zeigt das unmodifizierte GST-PKA-C/EBPβ CR567 Fusionsprotein, Spur 2 das His-SUMO-1 modifizierte Protein nach Glutathion-S-Transferase Affinitätschromatographie. Von dem jeweiligen Eluat wurden 3 μg mit einem SDS-Polyacrylamidgel getrennt und mit Coomassie-Färbelösung angefärbt.
• Abb. 3.35: Präparation von unmodifizierten und SUMO-modifizierten PKA-C/EBP β CR567 Fusionsproteinen. Spur 1: Spaltung von GST-PKA mit Thrombin. Spur 2: Spaltung von GST-PKA-C/EBPβ CR567 mit Thrombin. Spur 3 zeigt den Input (In) für die nachfolgende Thrombin-Spaltung und Affinitätsaufreinigung. Auf das SDS-Gel wurde hier eine Mischung aus unmodifiziertem und SUMO-modifizierten C/EBPβ CR567 geladen. Diese wurde mit Thrombin gespalten und mit Nickel-NTA-Sepharose inkubiert. Der Durchlauf (DL) dieses Affinitätsschrittes ist in Spur 4 aufgetragen. E1-E4 zeigt die Elutionsfraktionen nach Ni-NTA-Affinitätschromatographie. Ca. 5 µg der GST-PKA und GST-PKA-CR567 Proteine in SUMOylierter und nicht-SUMOylierter Form wurden in die Thrombin-Spaltungen eingesetzt. Die Detektion der Proteine erfolgte im Immunoblot (IB) mit einem anti-hC/EBPβ-Antikörper.
• Abb. 3.36: In vitro Phosphorylierung des PKA-C/EBP β Fusionsproteins mittels Protei n k i nase A. (A) Gleiche Mengen PKA-CR567 und PKA-CR567-SUMO-1 wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und mit Coomassie-Lösung angefärbt. In beiden Spuren sind Reste von abgespaltenem GST-Protein zu erkennen. (B) Wie unter (A), nur das die Proteine mittels Immunoblot (IB) und anti-hC/EBPβ Antikörper detektiert wurden. Die Proteinbande bei ca. 33 kD scheint ein Degradationsprodukt von C/EBPβ zu sein. Die schwächeren Banden im oberen Bereich des Immunoblots scheinen poly-SUMOylierte C/EBPβ-Substrate zu sein (C) Wie unter (A) und (B). In vitro Phosphorylierung des PKA-C/EBPβ CR567 Fusionsproteine mit PKA. Ca. 5 μg PKA-Fusionsproteine wurden in die Phosphorylierungsreaktion eingesetzt. 1/50 des Reaktionsansatzes wurde auf einem 12% SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt. Das Gel wurde getrocknet und radioaktiv markiertes Protein mittels Autoradiographie nachgewiesen.
• Abb. 3.37: Parallele Hybridisierung zweier Protein-Macroarrays. Die Membranen wurden zeitgleich mit gleichen Mengen PKA-CR567 bzw. PKA-CR567-SUMO-1 hybridisiert und für eine Woche exponiert. Die Auswertung der Filme erfolgte wie bereits beschrieben (siehe Kap. 2.2.4.4).
• Abb. 4.1: Modell für die Repression durch PIAS3. 1) C/EBPβ liegt in nichtmodifizierter Form vor. 2) Ubc9/PIAS/SUMO-1-Komplexe erkennen das SUMOylierungsmotiv in C/EBPβ und die SUMOylierung findet statt. 3) PIAS3 bleibt an SUMOyliertem C/EBPβ gebunden, PIASy bindet nicht. 4) PRMT3 und PRMT6 können C/EBPβ methylieren und so zur Repression des Transkriptionsfaktors führen.