Identifikation und Charakterisierung von Protein-Interaktionspartnern des Transkriptionsfaktors CCAAT/Enhancer Binding Protein β

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie

eingereicht an der

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von


Dipl.-Biol. Ole Pleß

geboren am 15.12.1976 in Hamburg

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin

Prof. Dr. Dr. h.c. Christoph Markschies

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Christian Limberg

Gutachter:
1. Prof. Dr. Achim Leutz
2. Prof. Dr. Klaus Scheidereit
3. Prof. Dr. Thomas Sommer

Tag der mündlichen Prüfung: 15.11.2007

Zusammenfassung

Der Transkriptionsfaktor CCAAT/Enhancer Binding Protein β (C/EBPβ) reguliert die Genexpression, Proliferation und Differenzierung in verschiedenen Zelltypen. Die Funktion von C/EBPβ wird durch Interaktionen mit einer Reihe von Kofaktoren moduliert, die Bestandteile von Chromatin-verändernden oder Transkriptions-regulierenden makromolekularen Maschinen sind. Die Identifikation und funktionelle Charakterisierung dieser Kofaktoren trägt maßgeblich zum Verständnis der Biologie von C/EBPβ bei.

C/EBPβ wird zudem in vielfältiger Weise posttranslational reguliert. Beispielsweise kann C/EBPβ phosphoryliert, SUMOyliert, acetyliert und an mehreren Positionen an Arginin- und Lysinresten methyliert werden. Die SUMOylierung von C/EBPβ gilt als Schlüsselmodifikation, die nachfolgende Modifikationen steuert und zu einer Veränderung der genregulatorischen Eigenschaften von C/EBPβ führt. C/EBPβ bindet an zwei Enzyme der SUMOylierungsmaschinerie, Ubc9 und PIAS3. Es konnte gezeigt werden, dass PIAS3 nicht nur als E3-Ligase bei der SUMOylierungsreaktion dient, sondern auch mit SUMO-modifiziertem C/EBPβ interagieren und als transkriptioneller Repressor wirken kann.

Um weitere Interaktionspartner von C/EBPβ zu identifizieren wurde ein System zur Proteom-weiten Identifikation von Bindungspartnern etabliert. Dazu wurden radioaktiv markierbare Proteinsonden hergestellt, welche die Identifikation von Bindungspartnern auf Protein-Macroarrays ermöglichten. Neben der transaktivierenden Domäne (TAD) wurde die regulatorische Region in ihrer SUMOylierten und nicht-modifizierten Form in Screening-Experimenten eingesetzt. Eine Vielzahl von neuen C/EBPβ-Bindungspartnern konnte identifiziert werden, wobei die konstitutive SUMOylierung C/EBPβ-Interaktionen verändern kann. Bei den identifizierten Proteinen handelt es sich um Mitglieder der Polycomb Gruppe, Chromatin-modifizierende Enzyme, Signaltransduktionsmoleküle und transkriptionelle Koregulatoren.

Wissenschaftlich besonders interessant war die Identifikation der Lysin-Methyltransferase H3-K9-HMTase 3 (G9a) als Bindungspartner der transaktivierenden Region von C/EBPβ. Diese Interaktion wurde durch GST-Bindungs- und Koimmunopräzipitationsstudien bestätigt. Durch massenspektrometrische Analysen konnte Monomethylierung der Aminosäuren K39 und K168 in C/EBPβ nachgewiesen werden. Dadurch ergab sich die Vermutung, dass G9a nicht nur die Methylierung von Histon H3 katalysiert, sondern auch für die Methylierung und Regulation von C/EBPβ verantwortlich ist. Rekombinantes C/EBPβkonnte durch G9a in vitro methyliert werden. Koexpression von C/EBPβ und G9a führte zu einer Reduktion der transaktivierenden Eigenschaften von C/EBPβ in Abhängigkeit von der katalytischen SET-Domäne von G9a. Dieser Reduktion konnte durch Mutation der Aminosäuren K39 und K168 in Alanin entgegengewirkt werden.

Als Bindungspartner der C/EBPβ TAD konnte außerdem die intrazelluläre Domäne von Notch1 (NICD) identifiziert werden. Der Notch-Signalweg ist ein evolutionär konservierter Genschalter, der an vielen Entscheidungen in der Entwicklung sowie bei physiologischen und pathophysiologischen Prozessen im adulten Organismus, wie
z. B. akuter lymphatischer T-Zell Leukämie (T-ALL), beteiligt ist. Die Interaktion zwischen Notch1 IC und C/EBPβ konnte in GST-Bindungsexperimenten und Koimmunopräzipitationsstudien verifiziert werden. In Reportergenstudien wurde eine Stimulation der C/EBPβ-abhängigen Transkription durch NICD beobachtet. C/EBPβ ist demnach ein Zielmolekül des Notch1-Signalweges.

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23.01.2008