Viele zelluläre Funktionen werden nicht durch einzelne Proteine, sondern vielmehr durch Proteinkomplexe ausgeführt. Die Identifikation von Protein-Protein-Interaktionen ist deshalb in der post-genomischen Ära von entscheidender Bedeutung geworden, um die Bestandteile von Multiproteinkomplexen zu identifizieren.

Unter Verwendung der TAP-Methode sollten C/EBPβ-assoziierte Proteinkomplexe isoliert und durch massenspektrometrische Untersuchungen identifiziert werden. Da die verschiedenen Isoformen von C/EBPβ unterschiedlich lange Bereiche des N-Terminus enthalten, sollte überprüft werden, ob die verschiedenen Isoformen unterschiedliche Proteinkomplexe binden. Dies würde Rückschlüsse auf eine spezifische biologische Funktion der verschiedenen Isoformen ermöglichen.

Die kodierenden Bereiche für die LAP*, LAP und LIP Isoformen und die CR8-9 des human C/EBPβ Gens wurden mittels PCR amplifiziert und in den pZome-Vektor zur Generierung von C-terminalen TAP-Fusionsproteinen kloniert. Neben zwei endständigen IgG-Bindungsdomänen von Protein A aus Staphylococcus a u reus (ProtA) besteht das TAP-tag aus einem calmodulin-binding peptide (CBP). ProtA und CBP sind durch eine spezifische Spaltstelle für die TEV Protease getrennt. Diese erlaubt die Abspaltung des ProtA-Anteils unter nativen Bedingungen.

Für die Herstellung von Zellinien, die stabil C/EBPβ-TAP Fusionsproteine exprimieren, wurden diese mit virushaltigem Zellkulturüberstand infiziert und anschließend selektioniert. Die pZome-Vektoren wurden in GP2-293 Zellen transfiziert, die virushaltigen Zellüberstände nach 48 h geerntet und damit unterschiedliche Zellinien infiziert. Aufgrund des Puromycin-Resistenzgens konnten die Zielzellen mit Puromycin selektioniert werden. Dadurch wurden verschiedene stabil exprimierende Zellinien generiert (C33a, HEK-293, K562, C/EBPβ^-/- MEF). Exemplarisch ist in Abb. 3.1 die Expression der TAP-Fusionsproteine in K562-Zellen gezeigt. Das TAP-tag erhöht das Molekulargewicht der Proteine um 20 kD.

Abb. 3.1: Expression der C/EBP β -TAP Konstrukte in K562-Zellen. K562-Zellen wurden mit LAP*-, LAP-, LIP- und CR89-TAP Konstrukten infiziert und mit Puromycin für 10 Tage selektioniert. Von jeder Zellinie wurden 1x10⁵ Zellen lysiert, die Lysate mit SDS-PAGE aufgetrennt und die Fusionsproteine mittels Immunoblot (anti-ProtA Antikörper) detektiert.

Abb. 3.2 zeigt beispielhaft die Aufreinigung von LIP-TAP aus K562-Zellen mittels „tandem affinity purification“. Die Zellen wurden mit Lysepuffer und nativen Bedingungen aufgeschlossen und in Cytoplasma und Nukleoplasma fraktioniert (siehe Kap. 2.2.3.18). Das Nukleoplasma enthielt den Hauptanteil von TAP-Fusionsprotein, im Cytoplasma konnte dieses nicht detektiert werden. Die Nukleoplasma-Fraktion wurde mit IgG-Agarose inkubiert und an die Affinitätssäule gebunden (Abb. 3.2 A). Durch Inkubation mit TEV Protease wurde LIP-CBP effizient von der Säule geschnitten (Abb. 3.2 B). Das Eluat von der IgG-Säule konnte in einem zweiten Affinitätsschritt an Calmodulin-Sepharose gebunden werden (Abb. 3.2 C). Nach der Elution mit EGTA-haltigem Puffer konnte LIP-CBP durch SDS-PAGE und nachfolgende Silberfärbung detektiert werden. Zusätzlich wurden spezifische Interaktionspartner auf dem Gel sichtbar (Abb. 3.2 D). Die Identifikation dieser assoziierten Proteine mit massenspektrometrischen Untersuchungen wurde in Kollaboration mit E. Müller und A. Otto (MDC, Berlin) durchgeführt. Es konnten jedoch keine spezifisch mit C/EBPβ assoziierten Proteine gefunden werden. Nach mehreren Versuchen stellte sich heraus, dass die Menge an Ausgangsmaterial dafür noch immer zu gering war. Es konnte zum Teil noch nicht einmal die Anwesenheit des C/EBPβ-CBP Proteins nach Durchführung der TAP-Affinitätsreinigung nachgewiesen werden. Die Sensitivität des Massenspektrometers war demnach zu gering, da C/EBPβ-CBP Proteine durch Immunoblot und Detektion mit anti-C/EBPβ-spezifischem Antikörper nach dem letzten Elutionsschritt nachgewiesen werden konnten. Eine Erhöhung der Menge an Ausgangsmaterial über 10⁹ Zellen hinaus konnte nicht erreicht werden, da die veränderten Wachstumsbedingungen zur Kultivierung dieser großen Zellmengen zu einem Absterben der Zellen führten. Alles in allem stellte sich heraus, dass die TAP-Methode in Verbindung mit den verwendeten Massenspektrometern zu ineffizient war, um C/EBPβ-assoziierte Proteinkomplexe aufzureinigen.

Abb. 3.2: Reinigung der C/EBP β -TAP Isoform und assoziierter Proteine aus K562-Zellen. (A) Aufschluss und Fraktionierung der Zellen und Bindung an die IgG-Affinitätssäule. Als Ausgangsmaterial dienten 1x10⁹ Zellen. (B) IgG-Affinitätsmatrix vor und nach der proteolytischen Spaltung mit TEV Protease. (C) Elution von der IgG-Affinitätsmatrix und Bindung an die Calmodulin-Säule. (D) Elutionsfraktionen von der Calmodulin-Affinitätsmatrix. Die Fragezeichen (?) markieren putative Interaktionspartner.

Zur Generierung einer Proteinsonde wurden die pGEX-2TK-Vektoren in E. coli BL21 transformiert und Einzelkolonien über Nacht bei 37°C in LB mit Ampicillin inkubiert. Die ersten vier Spuren des in Abb. 3.6 A dargestellten Coomassie-Gels zeigen die Expression des GST-PKA-C/EBPβ CR1-4 Fusionsproteins nach Induktion mit 1 mM IPTG nach zwei-, drei- und vierstündiger Inkubation. Bereits zwei Stunden nach IPTG-Induktion ist eine deutliche Expression des GST-Fusionsproteins zu erkennen. Abb. 3.6 B zeigt GST-PKA-C/EBPβ CR1-4 nach Thrombin-Verdau unter verschiedenen Bedingungen. Dabei wird deutlich, dass eine Spaltung des Fusionsproteins über Nacht bei RT nur die zwei erwarteten Spaltprodukte liefert und kein unspezifischer Verdau durch die Thrombin-Protease erfolgt. Unter diesen Bedingungen ist der Verdau nahezu vollständig, es liegt kein GST-Fusionsprotein mehr vor. Als Kontrolle wurde GST-PKA als Größenreferenz geladen (Abb. 3.6 B, Spur 1). Bei der Expression von GST-PKA-C/EBPβ CR1-4 ist auch etwas GST-PKA entstanden, vermutlich durch einen Abbruch der Translation.

Abb. 3.6: Expression und enzymatische Spaltung des GST-PKA-C/EBP β CR1-4 Fus i onsproteins mittels Thrombin. (A) Für die Expressionskontrolle wurden Bakterien nach 2 h, 3 h und 4 h geerntet und wie in Kap. 2.2.3.6 beschrieben lysiert. 5 μl des Lysats wurden auf einem 12% SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt und mit Coomassie-Lösung gefärbt. (B) Für die enzymatische Spaltung wurden jeweils 5 μg GST-PKA-C/EBPβ CR1-4 mit 1/20 U Thrombin Protease bei 4°C oder bei RT inkubiert. Nach Inkubation für eine oder zwei Stunden bzw. über Nacht wurde ein Teil des Reaktionsansatzes entnommen, mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese aufgetrennt und mit Coomassie-Lösung gefärbt.

Für die Präparation der Proteinsonde in größerem Maßstab wurden 100 µg GST-PKA-C/EBPβ CR1-4 Fusionsprotein und GST-PKA als Kontrolle unter den optimalen Reaktionsbedingungen mit Thrombin-Protease verdaut (Abb. 3.7). Nach der proteolytischen Spaltung wurde das Thrombin mit Benzamidin-Sepharose aus dem Reaktionsansatz entfernt. Die Entfernung von abgespaltenen GST-Molekülen erfolgte durch Glutathion-Sepharose-Affinitätschromatographie. Die Elutionsfraktionen des letzten Chromatographieschrittes wurden mit SDS-PAGE analysiert und sind in Abb. 3.7 A dargestellt. Das eluierte PKA-C/EBPβ CR1-4 Fusionsprotein liegt in relativ reiner Form vor und kann im nachfolgenden Schritt mit PKA in vitro phosphoryliert und somit radioaktiv markiert werden. Die Abtrennung der GST-Moleküle war nicht vollständig, deshalb ist verbliebenes GST in der vierten Spur von Abb. 3.7 A zu erkennen. Es wurde jedoch nicht in vitro phosphoryliert und beeinträchtigt deshalb nicht die Qualität der Proteinsonde.

In der in vitro Phosphorylierungsreaktion wurden 5 µg PKA-C/EBPβCR1-4 und als Kontrolle der abgespaltene GST-Rest mit 50 µCi ³²P γ-ATP und Proteinkinase A inkubiert. Nicht eingebaute Nukleotide wurden nach der Reaktion abgetrennt. Die spezifische Phosphorylierung der Sonde wurde durch SDS-PAGE und nachfolgender Autoradiographie überprüft. PKA-C/EBPβ CR1-4 konnte spezifisch phosphoryliert werden stand nun für den Einsatz als Sonde auf dem Protein-Macroarray zur Verfügung.

Abb. 3.7: Thrombin-Spaltung, Affinitätsaufreinigung und in vitro Phosphorylierung des GST-PKA-C/EBP β CR1-4 Fusionsproteins. (A) Neben dem GST-PKA-C/EBPβ Fusionsprotein wurde GST-PKA als Referenz gespalten. Die Thrombinspaltung erfolgte über Nacht bei RT. Thrombin-Protease wurde durch Benzamidin-Sepharose Affinitätschromatographie aus dem Ansatz entfernt. Abgespaltene GST-Reste wurden durch Glutathion-Sepharose Affinitätschromatographie zum Teil aus der Lösung entfernt. Die Proteine wurden auf einem 12% SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt und mittels Coomassie-Färbelösung sichtbar gemacht. In der vierten Spur ist neben dem abgespaltenen GST-Anteil das PKA-C/EBPβ CR1-4 Fusionsprotein zu sehen. (B) In vitro Phosphorylierung des PKA-C/EBPβ CR1-4 Fusionsproteins mit PKA. 5 μg abgespaltenes GST bzw. PKA-Fusionsprotein wurden in die Phosphorylierungsreaktion eingesetzt. 1/50 des Reaktionsansatzes wurde auf einem 12% SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt. Das Gel wurde getrocknet und radioaktiv markiertes Protein mittels Autoradiographie nachgewiesen.

Für die Hybridisierung wurde eine „RZPD Human Colon Protein Expression Library (no 829)“ verwendet. Auf dieser PVDF-Membran wurden 18432 mit einem N-terminalen His-Epitop versehene Fusionsproteine gespottet. Für die Hybridisierung wurden 5 μg der radioaktiv markierten Proteinsonde PKA-C/EBPβ CR 1-4 benutzt. Es wurden 223 Signale erkannt, die jeweils einem der acht aufgebrachten Muster entsprachen. Abb. 3.8 zeigt schematisch einen Ausschnitt aus dem Protein-Macroarray und die Zuordnung zweier Hybridisierungssignale zu den jeweiligen Spotting-Mustern. 168 der 223 Signale konnten durch Sequenzvergleiche direkt einem Eintrag in der UniGene Datenbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/) zugeordnet werden. Viele der identifizierten Klone waren mehrfach auf der PVDF-Membran vertreten. Insgesamt konnten 122 nicht-redundante Interaktionspartner detektiert werden, welche in Tab. 3.1 im Anhang aufgeführt sind. Die Stärke der Hybridisierungssignale unterschied sich zum Teil recht deutlich für die einzelnen Kolonien. Auf eine Korrelation zwischen der Stabilität der Protein-Interaktion und der biologischen Relevanz kann jedoch nicht geschlossen werden (Mahlknecht et al., 2001). Die gefundenen Interaktionspartner wurden im Folgenden weiter untersucht.

Abb. 3.8: Identifikation von Interaktionspartnern auf dem Protein-Macroarray. Die Klone auf der PVDF-Membran sind nach einem der acht Muster in Doppelwerten aufgetragen worden. Bei einer positiven Interaktion werden deshalb beide Klone sichtbar. Abgebildet sind beispielhaft zwei Interaktionspartner, die nach dem Muster 2 bzw. 5 aufgespottet wurden. Der schwarze Punkt in der Mitte der 5x5-Quadrate dient als Referenzmarke zur Orientierung.

Von den in Tab. 3.1 (Anhang) aufgeführten potentiellen Interaktionspartnern der Transaktivierungsregion von C/EBPβ wurde eine Auswahl von Proteinen getroffen, die für die biologische Funktionalität von C/EBPβ eine wichtige Rolle spielen könnten. Diese Proteine können einer der folgenden Klassen zugeteilt werden: Mitglieder der Polycomb-Familie, transkriptionelle Regulatoren, posttranslational modifizierende Enzyme und Moleküle in Signaltransduktionskaskaden. Tab. 3.2 zeigt eine Zusammenstellung dieser Proteine und die dazugehörige Proteinfamilie.

Tab. 3.2: Auswahl der Interaktionspartner der C/EBP β   TAD. Insgesamt wurden 19 Interaktionspartner ausgewählt, welche bestimmten Proteinfamilien zugeordnet wurden (Polycomb Proteine, Posttranslationale Modifikatoren, Moleküle in Signaltransduktionswegen und Transkriptionelle Kofaktoren).

Im Fokus der nachfolgenden Experimente standen dabei die Korepressoren N-CoR und N-CoR2, die Histone-lysine N-methyltransferase, H3 lysine-9 specific 3 (im Folgenden wird der Name G9a verwendet) und die Notch1 intrazelluläre Domäne (NICD).

Für das Repressormolekül N-CoR2 konnte bereits eine direkte Interaktion mit der C/EBPβ TAD gezeigt werden (Ki et al., 2005). Die Überprüfung dieser Interaktion diente als positive Kontrolle für verwendete Methode zur Identifikation von Interaktionspartnern. Parallel dazu wurde das dem N-CoR2 verwandte Molekül N-CoR auf eine Interaktion mit C/EBPβ CR1-4 getestet.

Als Interaktionspartner der transaktivierenden Region von C/EBPβ wurde außerdem die Lysin-Methyltransferase G9a identifiziert (Tabelleneintrag Nr. 60). Das Protein gehört zur Suvar3-9 Familie und methyliert präferenziell Lysin-9 in Histon H3 in vitro (Tachibana et al., 2001). In Säugerzellen scheint G9a die vorherrschende euchromatische H3K9-Methyltransferase zu sein, denn eine Deletion des Gens verringert den H3K9-Methylierungsstatus in euchromatischen chromosomalen Bereichen (Tachibana et al., 2002). Die katalytische Aktivität von G9a ist in der SET-Domäne enthalten. In vitro können N-terminal gelegene Peptide des Histons H3 durch G9a mono-, di- und trimethyliert werden, wobei die Katalyse durch eine Deletion der SET-Domäne verhindert wird (Patnaik et al., 2004; Collins et al., 2005). Neben der SET-Domäne besitzt G9a sieben Ankyrin repeats, welche Wechselwirkungen mit anderen Proteinen vermitteln können.

Die direkte Bindung zwischen dem epigenetischen Regulator G9a und C/EBPβ könnte Hinweise auf eine bislang unbekannte Chromatin-assoziierte Funktion von C/EBPβ geben. Darüber hinaus wurden durch massenspektrometrische Untersuchungen Monomethylierungen von C/EBPβ an Lys-39 und Lys-168 nachgewiesen (Knoblich, Vermeulen, Mann und Leutz, unpubliziert). Die nachfolgenden Untersuchungen sollten deshalb außerdem klären, ob G9a für die Methylierung von C/EBPβ verantwortlich ist und ob es als Folge davon zu Veränderungen der Aktivität des Transkriptionsfaktors kommt.

Eintrag 79 der Tab. 3.1 zeigt als Interaktionspartner Notch1. Der Notch-Signalweg besitzt einen sehr einfachen Aufbau und liegt in allen Metazoa konserviert vor (Ehebauer et al., 2006). Er wirkt über direkte Zell-Zell-Kontakte auf Entscheidungen in Entwicklungsprozessen und beeinflusst dabei Differenzierung, Proliferation und Apoptose in verschiedenen Geweben und Organen. Notch-Rezeptoren sind einzelpass Membranrezeptoren und empfangen Signale von Liganden der DSL-Familie (Delta (Drosophila)/Serrate (Drosophila)/LAG-2 (C. elegans)), welche größtenteils ebenfalls Transmembran-Proteine sind. Die Bindung von Liganden an Notch-Rezeptoren induziert Proteolyse durch den γ-Sekretase-Enzymkomplex an der inneren Zellmembran und ein intrazelluläres Notch-Fragment („Notch intracellular domain“, NICD) entsteht, welches in den Zellkern gelangen kann. Transkriptionsfaktoren der CSL-Familie (CBF (Säuger)/Suppressor of Hairless (Drosoph i la)/LAG-1 (C. elegans)) sind die Hauptmoleküle zur Vermittlung von Notch-Signalen (Lai, 2002). Ohne Notch-Signale sind CSL-Proteine mit Korepressor-Komplexen assoziiert und die CSL-abhängige Genexpression reprimiert. Die Komposition der Korepressor-Komplexe ist für verschiedene Spezies recht unterschiedlich. Gemeinsames Merkmal ist jedoch die Anwesenheit von Histon-Deacetylasen (HDACs) (Kao et al., 1998; Chen et al., 1999). Durch die Bindung von Notch an CSL kommt es zur Verdrängung von Korepressoren und zu einer Rekrutierung von Koaktivator-Komplexen, welche Mastermind/LAG-3/SEL-8 und Histon-Acetyltransferasen enthalten (Doyle et al., 2000; Petcherski und Kimble, 2000; Wu et al., 2000; Kitagawa et al., 2001). CSL kann nun Zielgene aktivieren. Notch-Signale führen also zur Umschaltung von transkriptioneller Repression zu transkriptioneller Aktivierung CSL-abhängiger Zielgene. Es wird vermutet, dass CSL eine Reihe von unterschiedlichen Genen kontrolliert, da viele biologische Prozesse über Notch gesteuert werden. Die am besten charakterisierten Zielgene von CSL in Säugern und Drosophila sind „basic helix-loop-helix“ Proteine der Hairy/E(spl) (HES) Familie (Bailey und Posakony, 1995; Iso et al., 2003). Diese scheinen ihrerseits als transkriptionelle Repressoren zu wirken. Die Fähigkeit von Notch, diese Repressoren positiv zu verstärken, könnte die Funktion von Notch als „Anti-Differentiationssignal“ erklären.

NICD besteht aus mehreren Domänen, die zwischen Mitgliedern der Notch-Familie konserviert sind. Die Bindung zwischen NICD und CSL erfolgt über die N-terminal gelegene RAM-Domäne in der NICD (Tamura et al., 1995). Im zentralen Bereich des Proteins befinden sich Ankyrinmotive, welche Protein-Protein-Interaktionen vermitteln. Im C-Terminus befindet sich die PEST-Sequenz, über welche die Proteinstabilität reguliert wird. Zwischen Ankyrinmotiven und PEST-Sequenz ist die Aminosäuresequenz zwischen den einzelnen Familienmitgliedern weniger stark konserviert. Für Notch1 und 2 wurde in dieser Region eine transaktivierende Funktion postuliert, da Gal4-Fusionen zu einer Erhöhung der Aktivität in Reportergenstudien führen können (Kurooka et al., 1998). Darüber hinaus kann diese Region mit Histon-Acetyltransferasen interagieren (Kurooka und Honjo, 2000).

Die direkte Interaktion zwischen Notch1 und C/EBPβ könnte auf eine Verbindung des Notch-Signalwegs mit dem transkriptionellen Effektor C/EBPβ hindeuten. Das würde bedeuten, dass Notch-Signale auch über andere Transkriptionsfaktoren als CSL vermittelt werden und die Transkription CSL-unabhängiger Zielgene steuern können, wie bereits vorgeschlagen wurde (Martinez Arias et al., 2002).

Die auf dem Protein-Macroarray gefundene Interaktion wurde mit GST-Bindungsstudien verifiziert. Dafür wurde G9a wurde in vitro translatiert und durch den Einbau von ³⁵S-haltigem Methionin radioaktiv markiert. Das Protein wurde anschließend mit Matrix-gebundenem GST bzw. GST-C/EBPβ CR1-4 inkubiert und ungebundenes Protein durch wiederholtes Waschen entfernt. Die Proteinkomplexe wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und markiertes Protein wurde durch Autoradiographie nachgewiesen. G9a zeigte eine Bindung an das GST-PKA-C/EBPβ-Fusionsprotein, nicht aber an GST-Protein (Abb. 3.10 A). Demnach konnte eine direkte Bindung von G9a an die transaktivierende Region von C/EBPβ in vitro bestätigt werden.

Die Interaktion von G9a und C/EBPβ wurde darüber hinaus in Koimmunopräzipitationsexperimenten überprüft (Abb. 3.10 B). Expressionsplasmide, welche für C/EBPβ und G9a bzw. G9a mit einer fehlenden SET-Domäne kodieren (G9a ΔSET), wurden in HEK-293 Zellen transfiziert. Die Zellen wurden nach 48 h geerntet, lysiert und C/EBPβ-FLAG zusammen mit assoziierten Proteinen an eine FLAG-Affinitätsmatrix gebunden. Die Identifikation von C/EBPβ und assoziierten Proteinen erfolgte mittels SDS-PAGE und Immunoblot. G9a bindet auch in diesem Experiment C/EBPβ. Die Interaktion ist unabhängig von der katalytischen SET-Domäne in G9a, die Bindungsstärke nimmt jedoch bei einem Fehlen der SET-Domäne ab.

Abb. 3.10: Die Lysin-Methyltransferase G9a bindet C/EBP β. (A) GST-Bindungsstudie zwischen G9a und der transaktivierenden Region von C/EBPβ. 3 μg GST bzw. GST-PKA-C/EBPβ CR1-4 wurden an Glutathion-Sepharose Affinitätsmatrix gebunden. G9a wurde von dem Plasmid pcDNA3-hG9a in vitro translatiert und für 1 h mit den gebundenen GST-Proteinen inkubiert. Matrix-gebundene Proteine wurden auf einem 8% SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt und radioaktiv markiertes Protein mittels Autoradiographie sichtbar gemacht. Nach der Exposition wurde das Gel rehydriert und Proteine mit Coomassie-Lösung angefärbt. (B) Koimmunopräzipitationsstudie zwischen C/EBPβ LAP*-FLAG und GFP-G9a bzw. GFP-G9a ΔSET. pCMV-GFP, pCMV-GFP-G9a bzw. pCMV-GFP-G9a ΔSET wurden zusammen mit pcDNA3-C/EBPβ LAP*-FLAG wurden transient in HEK-293 Zellen transfiziert. Nach 48 h wurden die Zellen lysiert und mittels „Anti-FLAG M2 Affinity Gel“ immunopräzipitiert (IP). Die Proteine wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und durch Immunoblot (IB) mit anti-GFP bzw. anti-FLAG Antikörpern detektiert.

Zur Eingrenzung der Interaktionsdomäne in C/EBPβ wurden weitere Koimmunopräzipitationsstudien durchgeführt. Dazu wurden C/EBPβ-Konstrukte verwendet, welches nur über die konservierte Region 4 und die bZIP-Region (CR489) verfügten bzw. über eine Deletion der konservierten Region 4 (C/EBPβ ΔCR4). Diese wurden alleine oder in Kombination mit GFP-G9a in HEK-293 Zellen transfiziert und interagierende Proteine mit anti-C/EBPβ Antikörper immunopräzipitiert. Das Ergebnis ist in Abb. 3.11 dargestellt. Durch Immunopräzipitation von C/EBPβ CR489 konnte GFP-G9a kopräzipitiert werden. Die Verwendung der ΔCR4-Mutante führte hingegen zu einem Verlust der Bindung an G9a. Durch die Experimente in Abb. 3.10 und 3.11 konnte damit die direkte Interaktion zwischen C/EBPβ und G9a gezeigt werden. Dabei ist die CR4 in C/EBPβ die minimale Interaktionsdomäne zwischen den beiden Proteinen.

Abb. 3.11: G9a interagiert mit CR4 in C/EBP β. Koimmunopräzipitationsstudie zwischen C/EBPβ CR489 und GFP-G9a und verschiedenen C/EBPβ-Mutanten. pCMV-G9a wurde zusammen mit pcDM8-C/EBPβ LAP*, CR489 oder ΔCR4 transient in HEK-293 Zellen transfiziert. Nach 48 h wurden die Zellen lysiert und mittels anti-C/EBPβ immunopräzipitiert (IP). Die Proteine wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und durch Immunoblot (IB) mit anti-GFP bzw. anti-C/EBPβ Antikörpern detektiert (n.s.: nicht spezifisch).

Durch massenspektrometrische Untersuchungen von aufgereinigtem C/EBPβ konnten methylierte Lysine an Position Lys-39 und Lys-168 in C/EBPβ identifiziert werden (Knoblich, Vermeulen, Mann und Leutz, unpubliziert). Um zu untersuchen, ob G9a den Anteil von methyliertem C/EBPβ erhöhen kann, wurde C/EBPβ-FLAG alleine oder zusammen mit G9a in HEK-293 Zellen exprimiert, immunopräzipitiert und der Anteil an methylierten Lysinen im Präzipitat bestimmt. Hierzu wurde ein anti-pan-methyl-Lysin Antikörper benutzt, welcher gegen jegliche Form methylierter Lysine gerichtet ist (mono- als auch di- und trimethyliert). Abb. 3.12 A zeigt im unteren Teil das immunopräzipitierte C/EBPβ und den Lysin-methylierten Anteil an C/EBPβ im oberen Immunoblot. Abb. 3.12 B zeigt die Quantifizierung der Immunoblots aus Abb. 3.12 A durch Bestimmung der relativen Signalstärken unter zu Hilfenahme eines Li-Cor Odyssey Scanners. Während der Anteil an gesamt-C/EBPβ in beiden Spuren ungefähr gleich ist, steigt der Anteil an Lysin-methyliertem C/EBPβ durch Koexpression von G9a um den Faktor 1,4. Die Lysin-Methyltransferase G9a erhöht demnach den Anteil von Lysin-methyliertem C/EBPβ am gesamten C/EBPβ-Protein der Zelle.

Abb. 3.12: G9a verstärkt die Lysin-Methylierung von C/EBP β. (A) pcDNA-C/EBPβ-FLAG wurde alleine oder in Kombination mit pCMV-GFP-G9a transient in HEK-293 Zellen transfiziert. Nach 48 h wurden die Zellen lysiert und mittels anti-FLAG Affinitätsmatrix immunopräzipitiert (IP). Die Proteine wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und durch Immunoblot (IB) mit anti-pan-methyl-Lysin bzw. anti-FLAG Antikörpern detektiert. (B) Quantifizierung der Signale. C/EBPβ-FLAG wurde mit einem anti-Maus Alexa 680 Antikörper (rot) detektiert. Lysin-methyliertes C/EBPβ wurde mit einem anti-Kaninchen Alexa 800 Antikörper (grün) detektiert. Die fluoreszierenden Signale wurden auf einem Odyssey Imager detektiert und quantifiziert. Gezeigt sind die Quotienten der Intensitäten (grünes Signal / rotes Signal). Die Standardabweichung ergibt sich aus zwei individuellen Experimenten.

Um zu testen, ob G9a für die direkte Methylierung von C/EBPβ verantwortlich ist, wurden darüber hinaus in vitro Methyltransferase-Assay durchgeführt. Als Substrat für die Reaktion wurde sowohl C/EBPβ CR1-7 (Abb. 3.13) als auch GST-LIP (Abb. 3.14) verwendet. Das vollständige C/EBPβ konnte als GST-Fusionsprotein nicht exprimiert werden und deshalb wurden zwei Proteine auf ihre Methylierbarkeit getestet, welche in ihrer Sequenz jedoch das gesamte Protein abdecken. Die Substrate werden dann mit dem ³H-markiertem Methyl-Donor S-Adenosyl-Methionin inkubiert. Katalysiert wird die Reaktion mit der zu untersuchenden Methyltransferase. In diesem Fall wurde G9a oder eine katalytisch inaktive Mutante mit einer Deletion der SET-Domäne in HEK-293 Zellen exprimiert und immunopräzipitiert. Die Präzipitate könnten dann direkt in die Reaktion eingesetzt werden.

Abb. 3.13 und 3.14 zeigen die Ergebnisse der Untersuchungen. Dabei wird deutlich, dass G9a in der Lage ist, GST-CR1-7 und GST-LIP in vitro zu methylieren. Die Markierung von GST ist dabei nicht möglich und dient als Negativkontrolle. Histon H3 dient als positive Kontrolle für die Aktivität des Enzyms. G9a zeigt darüber hinaus die Fähigkeit zur Automethylierung. Durch eine Deletion der katalytischen SET-Domäne geht die Fähigkeit zur Automethylierung verloren und auch GST-CR1-7 bzw. GST-LIP können nicht methyliert werden. G9a ist somit in der Lage, spezifisch C/EBPβ zu methylieren.

Abb. 3.13: Die Histon-Lysin N-Methyltransferase G9a methyliert GST-C/EBP β CR1-7 in vitro . (A) Die in vitro Methylierung von rekombinantem GST-C/EBPβ (CR1-7) bzw. GST erfolgte durch Konjugation ³H-markierter CH₃-Gruppen. S-Adenosyl-Methionin diente dabei als Methyl-Donor. G9a bzw. G9a ΔSET wurden als GFP-Fusionsproteine in HEK-293-Zellen exprimiert, daraus immunopräzipitiert und direkt in die Reaktion eingesetzt. Die Reaktion wurde für 4 h bei 30°C durchgeführt. Anschließend wurden die Proben durch SDS-PAGE aufgetrennt, das SDS-Polyacrylamidgel getrocknet und radioaktiv markiertes Protein mittels Autoradiographie sichtbar gemacht. (B) 5 μg GST bzw. GST-C/EBPβ CR1-7 wurden in die Reaktion eingesetzt. Nach erfolgter Exposition wurde das Gel aus (A) rehydriert und mit Coomassie-Lösung angefärbt. (C) pCMV-GFP-G9a bzw. pCMV-GFP-G9a ΔSET wurden in HEK-293-Zellen exprimiert. Nach 48 h wurden die Zellen lysiert, GFP-G9a bzw. GFP-G9a ΔSET immunopräzipitiert und mittels Immunoblot mit anti-GFP-Antikörpern detektiert.

Abb. 3.14: Die Histon-Lysin N-Methyltransferase G9a methyliert die LIP Isoform von C/EBP β in vitro . (A) Die in vitro Methylierung von rekombinantem GST-C/EBPβ (LIP Isoform) bzw. GST erfolgte durch Konjugation ³H-markierter CH₃-Gruppen. S-Adenosyl-Methionin diente dabei als Methyl-Donor. G9a bzw. G9a ΔSET wurden als GFP-Fusionsproteine in HEK-293-Zellen exprimiert, daraus immunopräzipitiert und direkt in die Reaktion eingesetzt. Die Reaktion wurde für 4 h bei 30°C durchgeführt. Anschließend wurden die Proben durch SDS-PAGE aufgetrennt, das SDS-Polyacrylamidgel getrocknet und radioaktiv markiertes Protein mittels Autoradiographie sichtbar gemacht. (B) 5 μg GST bzw. GST-C/EBPβ LIP wurden in die Reaktion eingesetzt. Nach erfolgter Exposition wurde das Gel aus (A) rehydriert und mit Coomassie-Lösung angefärbt. (C) pCMV-GFP-G9a bzw. pCMV-GFP-G9a ΔSET wurden in HEK-293-Zellen exprimiert. Nach 48 h wurden die Zellen lysiert, GFP-G9a bzw. GFP-G9a ΔSET immunopräzipitiert und mittels Immunoblot mit anti-GFP-Antikörpern detektiert.

Um den Einfluss von G9a auf die transkriptionellen Eigenschaften von C/EBPβ zu bestimmen, wurden Reportergenstudien durchgeführt. Hierfür wurde das C/EBPβ-abhängige Reporterkonstrukt pM82 verwendet (Sterneck et al., 1992a; Sterneck et al., 1992b). Es verfügt über zwei C/EBPβ-Bindungsstellen in der Promotorregion (Abb. 3.15 A). G9a, nicht aber G9a ΔSET, ist in der Lage, die transkriptionelle Aktivität von C/EBPβ konzentrationsabhängig zu reprimieren (Abb. 3.15 B). Durch Kotransfektion von G9a kann eine bis zu fünffache Reduktion der Reportergenexpression im Vergleich zum Ansatz ohne G9a gemessen werden. Bei Kotransfektion von G9a ΔSET ändert sich die Expression des Reportergens nicht. Die Anwesenheit der SET-Domäne ist demnach eine notwendige Voraussetzung für die Repression von C/EBPβ durch die Lysin-Methyltransferase G9a. Desweiteren wurde der Einfluß von G9a auf die monomethylierten Lysinreste untersucht. Dabei zeigte sich, dass sowohl die K39A- als auch die K168A-Mutante etwas aktiver als das unveränderte Protein war. Die Doppelmutante K39/168A war etwa zwei- bis dreifach aktiver als das C/EBPβ Protein. Im Vergleich zum unveränderten C/EBPβ Protein waren darüber hinaus die Einzelmutanten weniger stark durch G9a reprimierbar (Abb. 3.15 C). Die Doppelmutante ist kaum mehr durch G9a reprimierbar. Auch in diesem Experiment konnten die transkriptionellen Eigenschaften von C/EBPβ nicht durch G9a ΔSET beeinflusst werden.

Abb. 3.15: Die G9a SET-Domäne und die monomethylierten Lysine K39 und K168 in C/EBP β sind entscheidend für die Repression der C/EBP β LAP*-abhängigen Transkription. (A) Schematische Darstellung des pM82 Reportergenkonstrukts. Die C/EBPβ-Bindungsstellen sind grau schattiert dargestellt. (B) pCMV-GFP-G9a bzw. pCMV-GFP-G9a ΔSET und pcDM8-C/EBPβ LAP* wurden zusammen mit dem Luciferase-Reportergenkonstrukt pM82 in HEK-293 Zellen transfiziert, nach 48 h lysiert und die relativen Lichteinheiten gemessen. Die Expression der verschiedenen G9a- bzw. C/EBPβ-Konstrukte wurde durch Immunoblot mit anti-GFP bzw. anti-C/EBPβ Antikörpern nachgewiesen. Die Zahlen unter der Graphik geben die Menge an transfiziertem pCMV-GFP-G9a bzw. -G9a ΔSET-Plasmid an (in ng). (C) pCMV-GFP-G9a bzw. pCMV-GFP-G9a ΔSET und pcDM8-C/EBPβ LAP*, LAP* K39A, LAP* K168A und LAP* K39/168A wurden zusammen mit dem Luciferase-Reportergenkonstrukt pM82 in HEK-293 Zellen transfiziert, nach 48 h lysiert und die relativen Lichteinheiten gemessen. RLU: Relative light units.

In einem weiterführenden Experiment wurde der Einfluß von G9a auf die TAD von C/EBPβ unter zu Hilfenahme von Fusionskonstrukten untersucht, bei denen unterschiedliche Abschnitte der C/EBPβ TAD an die Gal4-DNA-Bindungsdomäne fusioniert wurden. Es wurde ein Gal4-abhängiger Reporter verwendet (Abb. 3.16 A) und zum anderen die Konstrukte CR1-4-Gal4 DBD, CR4-Gal4 DBD und CR1-3-Gal4 DBD. In den Versuchen zeigte sich, dass G9a in der Lage war, die Aktivität der CR1-4 um den Faktor zwei zu senken (Abb. 3.16 B). Die G9a ΔSET Deletionsmutante war dazu nicht in der Lage. Die Konstrukte CR4-Gal4 DBD oder CR1-3-Gal4 DBD wurden in ihrer Aktivität durch G9a oder G9a ΔSET nicht beeinflusst (Abb. 3.16 C-D). Diese Versuche zeigen, dass die Bindung von G9a an CR4 keine hinreichende Bedingung, jedoch eine Voraussetzung für die Repression des Transkriptionsfaktors ist. Das Vorhandensein der gesamten TAD, welche K39, nicht jedoch K168 beinhaltet, scheint für einen Teil der Repression durch G9a wichtig zu sein.

Abb. 3.16: CR1-4-Gal4 DBD, jedoch nicht CR1-3-Gal4 DBD oder CR4-Gal4 DBD werden durch die SET-Domäne von G9a transkriptionell reprimiert. (A) Schematische Darstellung des pM82 Reportergenkonstrukts, bei dem die zwei C/EBPβ-Bindungsstellen durch vier Gal4-Bindungsstellen ausgetauscht wurden. (B-D) pCMV-GFP-G9a bzw. pCMV-GFP-G9a ΔSET Konstrukte wurden zusammen mit pcDM8-C/EBPβ CR1-4-Gal4 DBD (B), pcDM8-C/EBPβ CR4-Gal4 DBD (C) oder pcDM8-C/EBPβ CR1-3-Gal4 DBD (D) und dem unter (A) beschriebenen Gal4-abhängigen Reporterkonstrukt transient in HEK-293 Zellen transfiziert. Für die Normalisierung der Lichteinheiten gegen die Transfektionseffizient wurden gleiche Mengen pCMV-β-Galactosidase kotransfiziert. 48 h nach der Transfektion wurden die Zellen lysiert und die Lichteinheiten wie unter „Material und Methoden“ beschrieben gemessen. Eine schematische Darstellung der C/EBPβ TAD-Gal4 DBD Konstrukte ist über der jeweiligen Abbildung gezeigt. RLU: Relative light units.

Um zu bestimmen, ob die Methylierung und damit einhergehende Repression von C/EBPβ durch G9a durch eine Umverteilung von C/EBPβ im Zellkern erreicht wird, wurden Immunofluoreszenzstudien durchgeführt. Dazu wurden Cos-7 Zellen mit C/EBPβ und G9a Expressionsvektoren transfiziert. Nach 48 h wurden die Zellen fixiert, C/EBPβ Protein mit einem anti-C/EBPβ Antikörper angefärbt. Abbildung 3.17 zeigt das Ergebnis der Kolokalisationsstudie. GFP-G9a und C/EBPβ zeigen eine
Überlagerung der Fluoreszenzsignale zusammen mit DAPI und damit eine Kolokalisation im Zellkern. Es konnte jedoch keine Veränderung der Lokalisation von C/EBPβ bei einer Kotransfektion von G9a beobachtet werden (Daten nicht gezeigt).

Abb. 3.17: C/EBP β und G9a zeigen eine Kolokalisation im Zellkern. Immunofluoreszenzmikroskopie von Cos7-Zellen nach Transfektion mit C/EBPβ oder GFP-G9a. Die Zellen wurden nach 48 h mit 4% PFA-Lösung (Histofix) fixiert, permeabilisiert und C/EBPβ mit einem anti-C/EBPβ Antiserum und einem Alexa Fluor 555 gekoppelten anti-Kaninchen IgG angefärbt (rot). Die GFP-G9a Fusionsproteine konnten direkt sichtbar gemacht werden (grün). Kern-DNA wurde mittels DAPI angefärbt und mit UV-Licht sichtbar gemacht (blau). Bereiche, die Kolokalisieren zeigen durch die Überlagerung eine gelbliche Färbung.

Der auf dem Protein-Macroarray gefundene Klon an Position 239/163 (Duplikat 236/164) enthielt die intrazelluläre Domäne von Notch1. C/EBPβ könnte demnach ein direktes Zielmolekül für Notch1-Signaltransduktionskaskaden sein. Diese Interaktion wurde in nachfolgenden Experimenten einer weiteren Analyse unterzogen. Dazu wurden zunächst GST-Bindungsstudien durchgeführt. NICD bzw. NICD mit einer Deletion der RAM-Domäne (ΔRAM) wurden in vitro trankribiert und in Anwesenheit von ³⁵S-Methionin translatiert. Die radioaktiv markierten Proteine wurden mit GST bzw. mit GST-C/EBPβ CR1-4 Fusionsproteinen inkubiert und direkte Interaktionen mittels Autoradiographie sichtbar gemacht. Die in Abb. 3.18 A dargestellten Ergebnisse bestätigen, dass C/EBPβ CR1-4 und NICD direkt interagieren können. Darüber hinaus kann auch die NICD-Mutante, die keine N-terminale RAM-Domäne besitzt, mit C/EBPβ CR1-4 interagieren. Das RAM-Interaktionsmodul ist also nicht notwendig für die Bindung an C/EBPβ.

Die Interaktion zwischen C/EBPβ und Notch1 auf dem Protein-Macroarray wurde darüber hinaus durch Koimmunopräzipitationsexperimente bestätigt. Expressionsplasmide, welche für C/EBPβ und Notch1 IC bzw. Notch1 IC mit einer fehlenden N-terminalen RAM-Domäne kodieren, wurden in HEK-293 Zellen transfiziert und diese nach 48 h geerntet. Das Ergebnis in Abb. 3.18 B zeigt eine Bindung von Notch1 IC als auch von Notch1 IC ΔRAM an C/EBPβ. Demnach binden C/EBPβ und Notch1 IC auch in Zellen unabhängig von der RAM-Domäne aneinander.

Abb. 3.18: Notch1 IC bindet C/EBP β unabhängig von der RAM-Domäne. (A) GST-Bindungsstudie zwischen Notch1 IC bzw. Notch1 IC ΔRAM und der transaktivierenden Region von C/EBPβ. 3 μg GST bzw. GST-C/EBPβ CR1-4 wurden an Glutathion-Sepharose Affinitätsmatrix gebunden. Notch1 IC bzw. Notch1 IC ΔRAM wurden von den Plasmiden pcDNA3-FLAG-Notch1 IC bzw. pcDNA3-FLAG-Notch1 IC ΔRAM in vitro translatiert und für
1 h mit den gebundenen GST-Proteinen inkubiert. Radioaktiv markierte Proteine wurden auf einem 8% SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt und mittels Autoradiographie sichtbar gemacht. Nach erfolgter Exposition wurde das Gel rehydriert und Proteine mit Coomassie-Lösung angefärbt (input GST-Proteine). (B) Koimmunopräzipitation zwischen Notch1 IC und C/EBPβ. pcDNA3-FLAG-Notch1 IC, pcDNA3-FLAG-Notch1 IC ΔRAM und pcDM8-C/EBPβ LAP* Konstrukte wurden transient in HEK-293 Zellen transfiziert. Nach 48 h wurden die Zellen lysiert und mittels „Anti-FLAG M2 Affinity Gel“ immunopräzipitiert. Gebundene Proteine wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und interagierende Proteine durch Immunoblot mit anti-C/EBPβ Antikörpern detektiert.

Die Zellinie Jurkat wurde aus peripherem Blut eines Patienten mit akuter lymphoblastischer Leukämie der T-Zellen (T-ALL) gewonnen (Schneider et al., 1977). In der Hälfte aller Fälle von T-ALL liegen Mutationen im Notch1-Gen vor, welche zu einer Aktivierung des Proteins führen können (Weng et al., 2004). Der Notch1-Signalweg ist deshalb in dieser Zellinie in hohem Maße aktiv und es liegen verhältnismäßig große Mengen an Notch1 IC vor. Um zu überprüfen, ob die Interaktion zwischen Notch1 IC und C/EBPβ auch zwischen endogen exprimierten Proteinen vorliegen kann, wurden Koimmunopräzipitationsstudien aus Lysaten von Jurkat-Zellen durchgeführt (Abb. 3.19). Durch Inkubation mit einem NICD-spezifischen Antikörper konnte C/EBPβ koimmunopräzipitiert werden. Im reziproken Ansatz konnte Notch1 nach Inkubation mit einem C/EBPβ-spezifischen Antikörper koimmunopräzipitiert werden.

Abb. 3.19: Endogen exprimiertes C/EBP β und NICD interagiert in Jurkat T-ALL Zellen. Koimmunopräzipitation zwischen Notch1 IC und C/EBPβ. Pro Ansatz wurden 10⁶ Jurkat-Zellen lysiert und mit 2 µg anti-NICD bzw. anti-C/EBPβ Antikörper oder Präimmunserum inkubiert. An Protein A-Sepharose gebundene Antikörper-Antigen-Komplexe wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und interagierende Proteine durch Immunoblot mit anti-C/EBPβ bzw. anti-NICD Antikörper detektiert.

Die nachfolgenden Experimente dienten der weiteren Eingrenzung der Interaktionsdomäne in C/EBPβ. Die Daten der Protein-Macroarray Hybridisierung und der GST-Bindungsstudie legen die Vermutung nahe, dass die Assoziation zwischen NICD und C/EBPβ über die Transaktivierungdomäne vermittelt wird. Deshalb wurden Koimmunopräzipitationsstudien mit verschiedenen Deletionsmutanten dieser Region durchgeführt. Es zeigte sich, dass eine Deletion der CR4 zum Verlust der Bindung an NICD führt (Abb. 3.20 A). Das Konstrukt C/EBPβ CR489, welches nur aus der CR4 der transaktivierenden Region und der bZIP-Region besteht, war jedoch in der Lage, die intrazelluläre Domäne von Notch1 zu binden (Abb. 3.20 B). Die Bindung zwischen den Molekülen wird also über die CR4 der transaktivierenden Region von C/EBPβ vermittelt und ist unabhängig von der RAM-Domäne in Notch1 IC.

Abb. 3.20: Die konservierte Region 4 (CR4) in C/EBP β   vermittelt die Bi n dung an Notch1 IC und Notch1 IC Δ RAM. (A) Die Konstrukte pcDNA3-FLAG-Notch1 IC, pcDNA3-FLAG-Notch1 IC ΔRAM und pcDM8-C/EBPβ LAP* bzw. pcDM8-C/EBPβ ΔCR4 wurden transient in HEK-293 Zellen transfiziert. Nach 48 h wurden die Zellen lysiert und mittels „Anti-FLAG M2 Affinity Gel“ immunopräzipitiert. Gebundene Proteine wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und interagierende Proteine durch Immunoblot mit anti-C/EBPβ Antikörper detektiert. (B) Wie (A), nur hier wurde neben pcDNA3-FLAG-Notch1 IC das Konstrukt pcDM8-C/EBPβ CR489 verwendet.

Um festzustellen, ob C/EBPβ einen Einfluß auf CSL/RBP-Jκ-abhängige Transkriptionsprozesse hat, wurden Reportergenstudien mit einem Hes-1 Luciferase-Reporterkonstrukt durchgeführt. Hes-1 ist ein „klassisches“ Zielgen von RBP-Jκ und die Expression kann durch Notch1 IC verstärkt werden. In Reportergenstudien konnte eine ca. sieben- bis neunfache Aktivierung des Hes-1 Reportergens durch Kotransfektion von Notch1 IC beobachtet werden (Abb. 3.24 A). Eine Zugabe von C/EBPβ LAP*-Expressionsplasmid konnte nun der Aktivierung des Hes-1 Reporters konzentrationsabhängig entgegenwirken. In Abb. 3.24 B wurde dieses Experiment parallel mit C/EBPβ ΔCR4 und LIP durchgeführt. Hier zeigte sich, dass diese beiden Proteine der RBP-Jκ-abhängigen Induktion durch Notch1 IC nicht in demselben Maße entgegenwirken können wie LAP*. Dies ist ein weiterer Hinweis auf die Bildung von Notch1 IC-C/EBPβ-Komplexen, welche bei Anwesenheit der CR4 gebildet werden können. Die Notch1 IC-Moleküle liegen dann vermutlich nicht mehr in Verbindung mit RBP-Jκ vor und können nicht mehr gemeinsam den Hes-1 Promoter binden und dessen Transkription aktivieren.

Abb. 3.24: C/EBP β wirkt der Aktivierung von RBP-J κ /CSL durch Notch1 IC entgegen. (A) Ein RBP-Jκ Expressionsvektor, pcDNA3-NICD-FLAG und verschiedene Hes-1 Reportergenkonstrukte wurden zusammen mit pcDM8-C/EBPβ LAP* transient in QT6 Zellen transfiziert. Für die Normalisierung der Lichteinheiten gegen die Transfektionseffizient wurden gleiche Mengen pCMV-β-Galactosidase kotransfiziert. 48 h nach der Transfektion wurden die Zellen lysiert und die Lichteinheiten wie unter „Material und Methoden“ beschrieben gemessen. (B) Ein RBP-Jκ Expressionsvektor, pcDNA3-NICD-FLAG und verschiedene Hes-1 Reportergenkonstrukte wurden zusammen mit pcDM8-C/EBPβ LAP*, LAP* ΔCR4 oder LIP transient in QT6 Zellen transfiziert. Für die Normalisierung der Lichteinheiten gegen die Transfektionseffizient wurden gleiche Mengen pCMV-β-Galactosidase kotransfiziert. 48 h nach der Transfektion wurden die Zellen lysiert und die Lichteinheiten wie unter „Material und Methoden“ beschrieben gemessen. RLU: Relative light units.

Das Hefe-Zwei-Hybrid-System (Yeast 2-hybrid-System, Y2H) ermöglicht die Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen. Um Interaktionspartner der regulatorischen Region von C/EBPβ zu identifizieren, wurde ein Yeast 2-hybrid-Screen mit den konservierten Regionen CR567 als „bait-Protein“ durchgeführt. Als „prey-Klone“ wurden unter anderem Ubc9 und PIAS3 identifiziert (Joschko und Leutz, unpubliziert). Diese Proteine sind Schlüsselproteine für die SUMO-Katalyse. Da PIAS-Proteine eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Aktivität von Transkriptionsfaktoren spielen (siehe auch Kap. 1.6), wurde nachfolgend die Interaktion zwischen PIAS3 und C/EBPβ detaillierter untersucht.

Um den Einfluß von PIAS-Proteinen auf die SUMOylierung von C/EBPβ zu untersuchen, wurde C/EBPβ in An- bzw. Abwesenheit von PIAS1, PIASy oder PIAS3 in vitro SUMOyliert. Als positive Kontrolle wurde der Einfluß von PIAS1 auf die SUMOylierung von Sp3 untersucht. Dabei zeigte sich, dass das GST-PIAS1 in der Lage war, als E3-Ligase für Sp3 zu wirken und die SUMOylierung zu verstärken (Sapetschnig et al., 2002) (Abb. 3.25 A). In Abb. 3.25 B ist der Einfluß der unterschiedlichen PIAS-Proteine auf die SUMOylierung von C/EBPβ CR1-7 gezeigt. Ohne E3-Ligase verläuft die SUMOylierungsreaktion recht langsam ab. SUMO-modifiziertes Produkt ist erst nach 40 min Reaktionszeit sichtbar. Durch Zugabe von GST-PIAS1 oder GST-PIAS3 kann die SUMOylierungsreaktion stark beschleunigt werden. Erstes SUMOyliertes Produkt wurde schon nach 10 min gebildet. GST-PIASy kann die SUMOylierungsreaktion auch beschleunigen, jedoch nicht in dem Maße wie PIAS1 und PIAS3.

Abb. 3.25: PIAS SUMO-E3-Ligasen verstärken die SUMOylierung von C/EBP β   in vitro . (A) HA-FLAG-Sp3 Protein wurde in Ab- bzw. Anwesenheit von GST-PIAS1 in vitro SUMOyliert und der Reaktionsverlauf über eine Stunde verfolgt. SUMOyliertes und nicht-modifiziertes Protein wurde durch Immunoblot mit anti-HA Antikörpern detektiert. (B) GST-C/EBPβ CR1-7 Protein wurde in Ab- bzw. Anwesenheit von GST-PIAS1, GST-PIASy und GST-PIAS3 in vitro SUMOyliert und der Reaktionsverlauf über eine Stunde verfolgt. SUMOyliertes und nicht-modifiziertes Protein wurde durch Immunoblot mit anti-C/EBPβ Antikörper detektiert.

Um die Interaktion zwischen PIAS3 und C/EBPβ im Hefe-Zwei-Hybrid-System zu bestätigen wurden GST-Bindungsexperimente durchgeführt. PIAS3 und verschiedene Mutanten wurden in den prokaryotischen Expressionsvektor pIX-HA kloniert, um N-terminale HA-Fusionsproteine zu erhalten. Es wurden Mutanten hergestellt, die verschiedene konservierte Domänen enthielten (Abb. 3.26 A). Das Konstrukt PIAS3 1-251 enthält die N-terminal gelegene SAP-Domäne, PIAS3 56-366 enthält den SP-RING, PIAS3 245-619 enthält die C-terminale Sequenz des Proteins (SP-RING, saure Region mit SUMO-1 Bindungsstelle und S/T-reiche Region). PIAS3 360-619 enthält nur die C-terminalen Abschnitte. Die in E. coli exprimierten HA-PIAS3-Fusionsproteine sind in Abb. 3.26 B dargestellt.

Zusätzlich wurden GST-C/EBPβ Fusionsproteine in E. coli exprimiert. Neben der Transaktivierungsregion (GST-CR1-4) wurden die regulatorische Region (GST-CR567) und die kurze Isoform LIP (GST-LIP) als GST-Fusionsproteine exprimiert. Darüber hinaus wurde ein System zur in vivo SUMOylierung von Proteinen verwendet (Mencia und de Lorenzo, 2004) (siehe auch Abb. 3.34). Mit diesem können SUMO-modifizierte Proteine im großen Maßstab hergestellt werden, im speziellen SUMO-1-modifiziertes C/EBPβ CR567. Für die nachfolgenden Experimente wurde zudem eine Spezifitätskontrolle benötigt. Sp100 ist ein Bestandteil von PML-Körpern und liegt im Zellkern in SUMOylierter Form vor (Sternsdorf et al., 1997). GST-Sp100 konnte zu einem hohen Maße mit SUMO-1 modifiziert werden. Die GST-Fusionsproteine sind in Abb. 3.26 C dargestellt.

Für die GST-Bindungsexperimente wurden die exprimierten GST-Proteine an Glutathion-Sepharose immobilisiert und mit den verschiedenen HA-PIAS3 Proteinen inkubiert. Nach häufigem Waschen wurden die gebundenen Proteine mittels Immunoblot mit anti-HA-Antikörpern analysiert. Das Ergebnis ist in Abb. 3.26 D zu sehen. Dabei wird deutlich, dass SUMO-modifiziertes C/EBPβ in der Lage war, PIAS3 zu binden. Dies war sowohl für HA-PIAS3 als auch für HA-PIAS3 56-366 und HA-PIAS3 245-619 der Fall. Die Konstrukte HA-PIAS3 1-251 und HA-PIAS3 360-619 konnten nicht von C/EBPβ, weder in der SUMO-modifzierten noch in der unmodifizierten Form, gebunden werden. Die Region 252-359, welche hauptsächlich den SP-RING von PIAS3 enthält, ist also für die Bindung an SUMOyliertes C/EBPβ verantwortlich.

Es scheint so zu sein, dass die weiter C-terminal gelegenen Abschnitte in PIAS3, welche auch das SUMO-bindende Motiv (Aminosäuren 450-460) enthalten, die Bindung an SUMO-modifiziertes C/EBPβ unterstützen und Spezifität vermitteln. Eine Deletion dieser Bereiche führt zu einer schwachen Bindung an unmodifziertes C/EBPβ CR567 und an GST-Sp100-SUMO-1 (Abb. 3.24 D).

Abb. 3.26: Die SUMO-modifizierte Form von C/EBP β interagiert mit der SP-RING D omäne von PIAS3. (A) Schematische Representation der konservierten Domänen von PIAS3 und Expressionskonstrukte, welche für die nachfolgenden Arbeiten verwendet wurden. Die Zahlen geben die Position in der murinen PIAS3-Sequenz an. (B) PIAS3 und die verschiedenen Deletionsmutanten wurden als N-terminale HA-Fusionsproteine vom Vektor pIX-HA in E. coli exprimiert und im Immunoblot (IB) mit anti-HA-Antikörper detektiert (input HA-PIAS3). (C) Input der GST-C/EBPβ-Proteine und der GST-Sp100-SUMO-1-Kontrolle. Für jeden Ansatz wurden 3 µg der GST-C/EBPβ Fusionsproteine an Glutathion-Sepharose gebunden. Die Proteine wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und im Immunoblot mit anti-GST-Antikörper detektiert. (D) GST-Bindungsstudie: Die unter (B) gezeigten HA-Fusionsproteine wurden mit den immobilisierten GST-Proteinen inkubiert und nach wiederholtem Waschen mittels SDS-PAGE aufgetrennt. Interagierende Proteine wurden mittels Immunoblot mit einem anti-HA-Antikörper detektiert.

Um zu untersuchen, ob die SP-RING-Domäne von PIAS3 in der Tat alleine für die Interaktion mit SUMOyliertem C/EBPβ verantwortlich ist, wurde diese mutiert. Die Punktmutation einer Aminosäure von Cystein zu Serin (C343S) in dem SP-RING führt zur Inaktivierung der E3-Ligase-Funktion von PIAS3 (Nakagawa und Yokosawa, 2002). Die Punktmutation wurde mittels „site directed mutagenesis“ eingefügt und durch direkte Sequenzierung nachgewiesen.

Um zu bestimmen, ob sich die subzelluläre Lokalisation der C343S-Mutante im Vergleich zu PIAS3 ändert, wurden Cos7-Zellen mit PIAS3 oder PIAS3 C343S transfiziert mittels Immunofluoreszenzmikroskopie analysiert. Dafür wurde das endogene C/EBPβ-Protein mit einem anti-C/EBPβ Antikörper markiert und PIAS3-Proteine mit anti-HA Antikörper nachgewiesen. Für die Färbung von Kern-DNA wurde DAPI verwendet. Das Ergebnis ist in Abb. 3.27 A gezeigt. C/EBPβ kolokalisiert mit PIAS3 im Kern, beide Proteine befinden sich nicht in den Nukleoli. Die Punktmutation im SP-RING führt nicht zu einer Veränderung der Lokalisation im Nukleoplasma. Parallel dazu wurde das Bindungsverhalten der PIAS3 C343S-Mutante an C/EBPβ getestet (Abb. 3.27 B). PIAS3 C343S wurde als N-terminales Fusionsprotein von dem prokaryotischen Expressionsvektor pIX-HA exprimiert. Für die GST-Bindungsstudie wurden die GST-C/EBPβ Proteine aus dem Versuch zu Abb. 3.26 verwendet. Es zeigte sich, dass die PIAS3 C343S-Mutante in diesem Versuch nicht mehr in der Lage war, C/EBPβ zu binden. Die intakte räumliche Struktur der SP-RING-Domäne ist demnach eine notwendige Voraussetzung für die Interaktion mit SUMO-modifiziertem C/EBPβ.

Abb. 3.27: Eine Punktmutation in der SP-RING Domäne von PIAS3 unte r bricht die Assoziation mit C/EBP β -SUMO-1, aber ändert nicht dessen zellul ä re Lokalisation. (A) Immunofluoreszenzmikroskopie von Cos7-Zellen nach Transfektion mit HA-PIAS3 oder HA-PIAS3 C343S exprimierenden Vektoren. Die Zellen wurden nach 48 h mit 4% PFA-Lösung (Histofix) fixiert, permeabilisiert und endogenes C/EBPβmit einem anti-C/EBPβ Antikörper (C-19) und einem Alexa Fluor 680 gekoppelten anti-Kaninchen IgG angefärbt (grün). Parallel dazu wurden die Zellen mit einem anti-HA Antikörper und einem Alexa Fluor 488 gekoppelten anti-Maus IgG gefärbt, um PIAS3-Fusionsproteine sichtbar zu machen (rot). Kern-DNA wurde mittels DAPI angefärbt und mit UV-Licht sichtbar gemacht (blau). (B) GST-Bindungsstudie zwischen C/EBPβ und PIAS3 C343S und zwischen C/EBPβ und PIAS3 als Positivkontrolle. HA-PIAS3 C343S und HA-PIAS3 wurden in E. coli exprimiert und mit immobilisierten GST-Proteinen inkubiert. Nach wiederholtem Waschen wurden die Proteine durch SDS-PAGE aufgetrennt und interagierende Proteine mittels Immunoblot (IB) mit einem anti-HA-Antikörper detektiert. Die verwendeten GST-Proteine (input) wurden mittels IB mit einem anti-GST-Antikörper nachgewiesen.

Um den individuellen Einfluß der Regionen 5, 6 und 7 von C/EBPβ auf die Bindung von PIAS3 genauer zu verstehen, wurden Teile der regulatorischen Region von C/EBPβ (CR56, CR6 und CR67) als GST-Fusionsproteine exprimiert und im E. coli-System mit SUMO-1 konjugiert (Abb. 3.28 A). In GST-Bindungsstudien wurde anschließend das Bindungsverhalten an PIAS3 untersucht (Abb. 3.28 B). Die Proteine wurden dafür an Glutathion-Sepharose gebunden und mit rekombinantem HA-PIAS3 inkubiert. GST-CR567-SUMO-1 ist in der Lage, PIAS3 zu binden. Die Bindungsstärke nimmt ab, wenn Region 5 oder Region 7 fehlen. Am schwächsten ist die Bindung, wenn nur Region 6 in SUMOylierter Form vorliegt. Darüber hinaus kann eine schwache Interaktion zwischen GST-CR57 und PIAS3 detektiert werden. Zusammenfassen konnte also durch GST-Bindungsstudien gezeigt werden, dass die SP-RING Domäne von PIAS3 mit der SUMOylierten regulatorischen Region von C/EBPβ interagieren kann. Für die Interaktion ist die SUMOylierte Region 6 ausreichend, wobei die angrenzenden Regionen 5 und 7 die Bindung stabilisieren. Am stärksten jedoch bindet die gesamte regulatorische Region in ihrer SUMOylierten Form. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass die C/EBPβ-PIAS3-Interaktion über die CR6-Domäne in ihrer SUMOylierten Form vermittelt wird und das die angrenzenden Bereiche CR5 und CR7 diese Interaktion verstärken können.

Abb. 3.28: Die CR6 von C/EBP β in ihrer SUMOylierten Form ist ausre i chend für die Interaktion mit PIAS3. (A) Expression und Affinitätsaufreinigung von unmodifizierten und SUMO-modifizierten GST-C/EBPβ Fusionsproteinen. pGEX-4T1-C/EBPβ CR56, CR6 bzw. CR67 Expressionskonstrukte wurden alleine oder in Anwesenheit der SUMOylierungsmaschinerie (pRHSUMO, pBADE12) in BL21 (DE3) Zellen exprimiert und mittels Glutathion-Sepharose aufgereinigt. Die SUMOylierten Proteine sind mit einem * markiert. Von dem jeweiligen Eluat wurden 3 μg mit einem SDS-Polyacrylamidgel getrennt und mittels Immunoblot detektiert. (B) GST-Bindungsstudie: HA-PIAS3 wurde mit verschiedenen immobilisierten GST-C/EBPβ Proteinen inkubiert und nach wiederholtem Waschen mittels SDS-PAGE aufgetrennt. Interagierende Proteine wurden mittels Immunoblot (IB) mit einem anti-HA-Antikörper detektiert.

Lymphoid enhancer factor 1 (Lef1) ist ein Mitglied der Familie der Transkriptionsfaktoren mit HMG-Domäne. Diese Proteine vermitteln Signale der Wnt-Signaltransduktionskaskade und übersetzen diese in differentielle Genexpression. PIASy ist ein Interaktionspartner von Lef1 und ist in der Lage, die Aktivität von Lef1 zu reprimieren (Sachdev et al., 2001). Um die Spezifität der Interaktion zwischen PIAS3 und C/EBPβ zu zeigen, wurden Bindungsstudien zwischen PIASy und C/EBPβ durchgeführt. HA-PIASy wurde bakteriell exprimiert und mit GST-C/EBPβ bzw. His-Lef1 Proteinen inkubiert. Abb. 3.29 zeigt das Ergebnis dieser Interaktionsstudie. PIASy nicht in der Lage, SUMO-modifiziertes oder unmodifiziertes C/EBPβ zu binden. Unter diesen Bedingungen hingegen geht Lef1 eine Assoziation mit PIASy ein. Die Bindung zwischen PIAS3 und C/EBPβ ist demnach spezifisch.

PIASy besitzt im Vergleich zu PIAS3 kein SUMO-bindendes Motiv und hat einen verkürzten C-Terminus. Diese Regionen in PIAS3 sind vermutlich mit verantwortlich für die Interaktion zwischen C/EBPβ und PIAS3.

Abb. 3.29: PIASy zeigt keine Bindung an C/EBP β. Bindungsstudie zwischen HA-PIASy und GST-C/EBPβ bzw. His-Lef1. 3 μg GST-Fusionsproteine bzw. His-Lef1 wurden an Glutathion-Sepharose (input GST-Proteine) bzw. an Nickel-NTA-Sepharose (input His-Lef1) gebunden. Die Sterne (*) zeigen die relevanten Fusionsproteine. Anschließend wurden die gebundenen Proteine mit Lysaten von bakteriell exprimiertem HA-PIASy inkubiert. Nach häufigem Waschen wurden die Proben auf einem 10% SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt. Gebundene Proteine wurden mittels Immunoblot (IB) mit anti-HA Antikörper detektiert.

Die Interaktion zwischen C/EBPβ und PIAS3 legt eine mögliche Rolle von PIAS3 bei der Regulation der C/EBPβ-Aktivität nahe. Um den Einfluß von PIAS3 auf die C/EBPβ-abhängige Transkription zu untersuchen, wurden Reportergenstudien mit dem bereits im Kap. 3.4.3 eingeführten Luciferase-Reporterkonstrukt pM82 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Abb. 3.30 A-D zusammengefasst. Koexpression von Ubc9 und/oder SUMO-1 hatte keinen Einfluß auf die Aktivität des Transkriptionsfaktors. Weder PIAS3 noch PIAS3 C343S war in der Lage, einen Einfluß auf die transkriptionellen Eigenschaften von C/EBPβ auszuüben. Wurde nun jedoch
SUMO-1 und/oder Ubc9 zusammen mit PIAS3 exprimiert, so konnte eine Repression des Transkriptionsfaktors beobachtet werden. Die Aktivität des Transkriptionsfaktors war dabei etwa um den Faktor vier im Vergleich zur Kontrolle gemindert. Im Gegensatz dazu konnte die katalytisch inaktive Mutante PIAS3 C343S diese Repression bei gleichzeitiger Koexpression der Komponenten der SUMOylierungsmaschinerie nicht bewirken. Im Abbildungsteil B wurde der Einfluß von PIAS3 auf ein nicht-SUMOylierbares C/EBPβ Protein mit einer Mutation an der SUMO-Akzeptorposition (K155A) untersucht. Hierbei zeigte sich, dass ein Verlust der SUMOylierbarkeit von C/EBPβ mit einem Verlust der repressiven Eigenschaft von PIAS3 einhergeht. Abbildungsteil C zeigt, dass der repressive Effekt von PIAS3 durch die Abschaffung der SUMOylierung durch Koexpression der Isopeptidase SuPr-1 zum Teil aufgehoben werden kann. Abbildung D zeigt darüber hinaus, dass die Koexpression von PIASy zu einer starken Repression der transkriptionellen Aktivität von C/EBPβ führt. Dies konnte sowohl für LAP* als auch für die nicht-SUMOylierbare LAP* K155A-Mutante gezeigt werden. Die Repression durch PIASy ist demnach nicht von der SUMOylierbarkeit von C/EBPβ abhängig und scheint nach einem anderen Mechanismus zu funktionieren als die Repression durch PIAS3. Da eine Interaktion von PIASy und C/EBPβ nicht beobachtet werden konnte (siehe Abb. 3.29), könnte die Induktion von Seneszenz durch PIASy eine mögliche Erklärung für die Repression sein (Bischof et al., 2006).

Zusammenfassend lässt sich aus diesen Experimenten schließen, dass die SUMOylierung des Transkriptionsfaktors C/EBPβ eine notwendige Voraussetzung für die Repression durch PIAS3 darstellt.

Abb. 3.30: PIAS3 ist ein SUMOylierungs-abhängiger Repressor von C/EBP β. (A) pcDM8-C/EBPβ LAP*, pcDNA3-HA-PIAS3 bzw. pcDNA3-HA-PIAS3 C343S, pcDNA3-HA-Ubc9 und pcDNA3-HA-SUMO-1 wurden zusammen mit dem Luciferase-Reportergenkonstrukt pM82 transient in HEK-293 Zellen transfiziert. Für die Normalisierung der Lichteinheiten gegen die Transfektionseffizienz wurden gleiche Mengen pCMV-β-Galactosidase kotransfiziert. 48 h nach der Transfektion wurden die Zellen lysiert und die Lichteinheiten wie Kap. 2.2.5 beschrieben gemessen. (B) Wie (A), nur das die nicht-SUMOylierbare Mutante von C/EBPβ transfiziert wurde (pcDM8-C/EBPβ LAP* K155A). (C) Wie (A), nur das die SUMO-spezifische Isopeptidase SuPr-1 (pcDNA3-HA-SuPr-1) kotransfiziert wurde. (D) Wie (A), nur das steigende Mengen an pcDNA3-HA-PIASy kotransfiziert wurden. RLU: Relative light units.

Um die Repression von C/EBPβ durch PIAS3 zu verstehen, wurden Interaktionspartner gesucht, welche diese repressiven Eigenschaften vermitteln können. Proteine, die einen repressiven Effekt auf C/EBPβ haben sind beispielsweise Protein-Arginin-Methyltransferasen (PRMTs) (Kowenz-Leutz und Leutz, unpubliziert). Es wurden Interaktionsstudien durchgeführt, um zu ermitteln, ob und welche PRMTs durch welche PIAS-Proteine gebunden werden können. Die Ergebnisse sind in Abb. 3.31 zusammengefasst. Dabei wurde deutlich, dass PIAS1, PIAS3 und PIASx beta in der Lage sind, mit PRMT3 und 6 zu interagieren. PIASy ist dazu nicht in der Lage. Die PRMTs 1, 4 und 5 zeigen keine Interaktionen mit Mitgliedern der PIAS-Familie.

Abb. 3.31: PIAS-Proteine können Protein-Arginin-Methyltransferasen bi n den. Bindungsstudie zwischen GST-PIAS1, -PIAS3, -PIASx beta und -PIASy und verschiedenen PRMTs. 3 μg GST-Fusionsproteine wurden an Glutathion-Sepharose (input GST-Proteine) gebunden. Anschließend wurden die gebundenen Proteine mit Lysaten von in HEK-293 Zellen exprimierten HA-PRMT Fusionsproteinen inkubiert. Nach häufigem Waschen wurden die Proben auf einem 10% SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt. Gebundene Proteine wurden mittels Immunoblot (IB) mit anti-HA Antikörper detektiert.

SUMOylierung von C/EBPβ wirkt sich repressiv auf das Verhalten des Transkriptionsfaktors aus (siehe Kap. 3.6.6). Phosphorylierung über die MAPK-Signaltransduktionskaskade führt zu einer Aktivierung des Proteins. Aus diesen Gründen könnte eine Abhängigkeit dieser posttranslationalen Modifikationen möglich sein, z. B. eine Abnahme der SUMOylierung nach Phosphorylierung durch Erk1 oder eine Abnahme der Phosphorylierung an T220 bei vorhandener SUMOylierung. Um die Abhängigkeit dieser posttranslationalen Modifikationen auf C/EBPβ zu testen, wurden sequenzielle Phosphorylierungs- und SUMOylierungsreaktionen in vitro durchgeführt. Die Ergebnisse der Studien sind in Abb. 3.32 zusammengefasst. Abb. 3.32 A zeigt, dass C/EBPβ in SUMOylierter oder unmodifizierter Form in gleichem Maße durch Erk1 phosphoryliert werden kann. Wird die Phosphorylierungsreaktion zuerst durchgeführt, wie in Abbildungsteil 3.32 B dargestellt, und erfolgt anschließend die SUMO-1-Konjugation in vitro, so ist auch hier kein Unterschied zwischen den beiden Substraten zu erkennen. Eine Abhängigkeit von SUMOylierung und Phosphorylierung kann nach diesen Experimenten also nicht abgeleitet werden. Einschränkend ist jedoch festzustellen, dass nicht das vollständige Protein eingesetzt wurde, sondern nur die regulatorische Region von C/EBPβ. Es könnten demnach andere Teile des Proteins einen Einfluß auf sequenzielle posttranslationale Modifikationen haben.

Abb. 3.32: Keine Abhängigkeit der SUMOylierung und Phosphorylierung von C/EBP β CR567 in vitro . (A) GST-C/EBPβ CR567 wurde in Bakterien exprimiert und SUMOyliert und über Glutathion-Sepharose gereinigt. Gleiche Mengen modifiziertes und unmodifiziertes Protein wurden in eine in vitro Phosphorylierungsreaktion mit rekombinantem Erk1 und ³²P-γATP eingesetzt. Der untere Teil von Abb. (A) zeigt den Input der Proteine nach SDS-PAGE und Coomassiefärbung, der obere Teil zeigt das Ergebnis nach der Phosphorylierungsreaktion, SDS-PAGE und Autoradiographie für 2 h. (B) In einem zu (A) reziproken Experiment wurde GST-C/EBPβ CR567 einer in vitro Phosphorylierungsreaktion unterworfen und anschließend wurden phosphorylierte und unphosphorylierte Proteine in vitro SUMOyliert. GST-Fusionsproteine wurden durch Immunoblot (IB) mit einem anti-GST Antikörper detektiert.

Der Prozess der SUMOylierung ist in Zellen einer großen Dynamik unterworfen. In eukaryotischen Zellen liegt nur ein Bruchteil des Gesamtproteins in SUMO-modifizierter Form vor. Beim Aufschluss der Zellen kommt es außerdem zu einem Abspalten der SUMO-Proteine durch Isopeptidasen. Daher ist es sehr schwierig, SUMOyliertes Protein in reiner Form aus eukaryotischen Zellen zu gewinnen.

Eine weitere Möglichkeit der Generierung SUMO-modifizierter Proteine ist die in vitro SUMOylierung. Diese erfordert jedoch die Aufreinigung aktiver Proteine der gesamten Enyzmkaskade (Pichler et al., 2002). Die Ausbeuten an aktiven Enzymen sind dabei häufig sehr gering. Es wurde deshalb ein System zur SUMOylierung von Proteinen in E. coli verwendet (Mencia und de Lorenzo, 2004), welches von M. Knoblich im Labor etabliert wurde. Dieses erlaubt eine Generierung von SUMO-modifizierten GST-Fusionsproteinen in großen Mengen, welche mittels Affinitäts-Chromatographie aus dem E. coli-Extrakt aufgereinigt werden können. Die gereinigten Proteine unterscheiden sich damit von N- bzw. C-terminalen SUMO-Fusionskonstrukten, welche nicht dem physiologisch prozessierten Protein entsprechen.

Ein minimales System zur SUMOylierung besteht aus Plasmiden, welche für His-SUMO-1, Aos1, Uba2, Ubc9 und das Zielprotein kodieren. Koexpression dieser Komponenten führt zur Substrat-spezifischen SUMOylierung des Proteins während der Expression in E. coli.

Abb. 3.34 zeigt die Produkte der bakteriellen SUMOylierung der regulatorischen Region CR567 von humanem C/EBPβ nach Glutathion-S-Transferase Affinitätsaufreinigung. Spur 1 zeigt GST-CR567 ohne Koexpression der SUMOylierungsmaschinerie. Durch Koexpression von Komponenten der SUMO-Enzymkaskade wird GST-CR567 effizient SUMOyliert (siehe Spur 2). Dieses SUMOylierte Substrat kann nun durch nachfolgende Ni-NTA-Affinität unter Verwendung des His-Epitops an SUMO-1 weiter angereichert werden.

Abb. 3.34: SUMOylierung von C/EBP β CR567 in E. coli . Expression und Affinitätsaufreinigung von unmodifizierten und His-SUMO-1-modifizierten GST-C/EBPβ CR567 Fusionsproteinen. Spur 1 zeigt das unmodifizierte GST-PKA-C/EBPβ CR567 Fusionsprotein, Spur 2 das His-SUMO-1 modifizierte Protein nach Glutathion-S-Transferase Affinitätschromatographie. Von dem jeweiligen Eluat wurden 3 μg mit einem SDS-Polyacrylamidgel getrennt und mit Coomassie-Färbelösung angefärbt.

Die Hybridisierung des Protein-Makroarrays erfolgte erneut ohne den GST-Anteil des Fusionsproteins um falsch-positive Interaktionen zu vermeiden. Der GST-Teil wurde dazu proteolytisch mit Thrombin abgespalten und abgetrennt. Darüber hinaus ist es für die nachfolgende vergleichende Hybridisierung der Protein-Macroarrays wichtig, die SUMOylierte Form von der nicht-SUMOylierten Form chromatographisch zu separieren. Abb. 3.35 zeigt die Spaltprodukte der GST-PKA-C/EBPβ CR567 Fusionsproteine nach Thrombin-Hydrolyse und die Abtrennung der SUMO-modifizierten von der nicht-modifizierten Form. In Spur 1 wurde gespaltenes GST-PKA-Protein als Kontrolle geladen, Spur 2 zeigt den abgespaltenen PKA-CR567-Anteil des GST-C/EBPβ Fusionsproteins. Spur 3 (In) zeigt SUMOyliertes GST-PKA-CR567 Fusionsprotein. Von diesem wurde der GST-Anteil abgespalten und Nickel-NTA-Affinitätschromatographie durchgeführt. Durch das His-Epitop an SUMO-1 konnten SUMOylierte Proteine angereichert werden. Spur 4 enthält den Durchlauf (DL), welcher vor allem nicht-SUMOyliertes GST-PKA-CR567 und das PKA-CR567 Spaltprodukt enthält. Nach Elution mit Imidazol-haltigem Puffer wurden die Elutionsfraktionen E1 bis E4 gewonnen und aufgetrennt. Fraktion E4 enthielt einen hohen Anteil von PKA-CR567-SUMO-1-His und wurde für die nachfolgenden Experimente benutzt. Durch eine Kombination von Thrombin-Spaltung und Ni-NTA-Affinität konnten somit PKA-C/EBPβ CR567 und PKA-C/EBPβ CR567-SUMO-1 voneinander getrennt werden.

Abb. 3.35: Präparation von unmodifizierten und SUMO-modifizierten PKA-C/EBP β CR567 Fusionsproteinen. Spur 1: Spaltung von GST-PKA mit Thrombin. Spur 2: Spaltung von GST-PKA-C/EBPβ CR567 mit Thrombin. Spur 3 zeigt den Input (In) für die nachfolgende Thrombin-Spaltung und Affinitätsaufreinigung. Auf das SDS-Gel wurde hier eine Mischung aus unmodifiziertem und SUMO-modifizierten C/EBPβ CR567 geladen. Diese wurde mit Thrombin gespalten und mit Nickel-NTA-Sepharose inkubiert. Der Durchlauf (DL) dieses Affinitätsschrittes ist in Spur 4 aufgetragen. E1-E4 zeigt die Elutionsfraktionen nach Ni-NTA-Affinitätschromatographie. Ca. 5 µg der GST-PKA und GST-PKA-CR567 Proteine in SUMOylierter und nicht-SUMOylierter Form wurden in die Thrombin-Spaltungen eingesetzt. Die Detektion der Proteine erfolgte im Immunoblot (IB) mit einem anti-hC/EBPβ-Antikörper.

Die Proteinsonden wurden nun mit ³²P γ-ATP in vitro phosphoryliert. Dafür wurden gleiche Mengen PKA-CR567 und PKA-CR567-SUMO-1 in die Reaktionen eingesetzt. Abb. 3.36 A-C zeigt das Ergebnis dieses Ansatzes. Sowohl PKA-CR567 als auch PKA-CR567-SUMO-1 wurden spezifisch in vitro phosphoryliert und standen nun für die parallele Hybridisierung der Protein-Macroarrays zur Verfügung.

Abb. 3.36: In vitro Phosphorylierung des PKA-C/EBP β Fusionsproteins mittels Protei n k i nase A. (A) Gleiche Mengen PKA-CR567 und PKA-CR567-SUMO-1 wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und mit Coomassie-Lösung angefärbt. In beiden Spuren sind Reste von abgespaltenem GST-Protein zu erkennen. (B) Wie unter (A), nur das die Proteine mittels Immunoblot (IB) und anti-hC/EBPβ Antikörper detektiert wurden. Die Proteinbande bei ca. 33 kD scheint ein Degradationsprodukt von C/EBPβ zu sein. Die schwächeren Banden im oberen Bereich des Immunoblots scheinen poly-SUMOylierte C/EBPβ-Substrate zu sein (C) Wie unter (A) und (B). In vitro Phosphorylierung des PKA-C/EBPβ CR567 Fusionsproteine mit PKA. Ca. 5 μg PKA-Fusionsproteine wurden in die Phosphorylierungsreaktion eingesetzt. 1/50 des Reaktionsansatzes wurde auf einem 12% SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt. Das Gel wurde getrocknet und radioaktiv markiertes Protein mittels Autoradiographie nachgewiesen.

Für die parallele Hybridisierung wurden zwei Protein-Macroarrays verwendet, die aus einer humanen Lungen cDNA-Bibliothek generiert wurden (RZPD library no 828: Human Lung Protein Expression Library). Auf diesem Filter sind 24576 Proteine aufgebracht worden (also insgesamt 49152 Proteinspots). Die beiden PVDF-Membranen wurden zeitgleich hybridisiert und nach der Detektion der Signale ausgewertet. Bei der Auswertung wurde schnell deutlich, dass Proteine entweder ausschließlich auf einem der beiden Filter oder an der gleichen Position auf beiden Filtern vorhanden waren. Dies legte die Vermutung nahe, dass Bindungspartner der regulatorischen Region von C/EBPβ diese entweder in Abhängigkeit oder unabhängig von der SUMOylierung binden können. Beispielhaft ist dies in Abb. 3.37 gezeigt. Die Membran, die mit PKA-CR567 hybridisiert wurde, zeigt nur die zwei Interaktionen in der oberen rechten Ecke. Die mit PKA-CR567-SUMO-1 hybridisierte Membran zeigt neben den zwei Interaktionen ein weiteres interagierendes Protein im unteren linken Bereich des gezeigten Ausschnitts. Tab. 3.3 (Anhang) zeigt die 53 identifizierten Bindungspartner der PKA-C/EBPβ CR567 Proteinsonde in ihrer nicht-SUMOylierten Form. Tab. 3.4 (Anhang) enthält 40 Interaktionspartner der PKA-C/EBPβ CR567 Proteinsonde in ihrer SUMOylierten und nicht-SUMOylierten Form und Tab. 3.5 führt die 35 Interaktionspartner der PKA-C/EBPβ CR567 Proteinsonde in ihrer SUMOylierten Form auf.

Abb. 3.37: Parallele Hybridisierung zweier Protein-Macroarrays. Die Membranen wurden zeitgleich mit gleichen Mengen PKA-CR567 bzw. PKA-CR567-SUMO-1 hybridisiert und für eine Woche exponiert. Die Auswertung der Filme erfolgte wie bereits beschrieben (siehe Kap. 2.2.4.4).

Es konnten also drei unterschiedliche Gruppen von interagierenden Proteinen identifiziert werden. Zur ersten Gruppe zählen Proteine, die ausschließlich die unmodifizierte RD binden können. In der zweiten Gruppe befinden sich Proteine, die unabhängig von SUMOylierung an der gleichen Position auf den zwei Macroarrays gebunden wurden und die dritte Gruppe enthält ausschließlich CR567-SUMO-1-bindende Interaktionspartner. In Tab. 3.6 wurden die interessantesten Proteine ausgewählt und ihrem jeweiligen Interaktionspartner zugeordnet. Die Funktion der Proteine ist recht unterschiedlich und wird im Diskussionsteil ausführlich erörtert (siehe Kap. 4.6).

Tab. 3.6: Ausgewählte Interaktionspartner der PKA-C/EBP β CR567 Proteinso n de in ihrer S U MOylierten oder nicht-SUMOylierten Form. Die Tabelle zeigt die neun wichtigsten Interaktionspartner, welche an die unmodifizierte oder SUMO-modifizierte regulatorische Domäne von C/EBPβ binden.