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1.  Einleitung

1.1.  Einführung

Die Komplexität von malignen Erkrankungen erfordert einen interdisziplinären Ansatz bei Diagnostik und Therapie. Unter Beteiligung multipler medizinischer Fachrichtungen hat sich im Laufe der Jahre ein multimodales Behandlungskonzept etabliert, das neben den klassischen Verfahren Chirurgie, Chemotherapie und Radiatio neuere konservative Methoden wie Hyperthermie und Immuntherapie integriert. Eine Kombination verschiedener Verfahren ermöglicht eine Steigerung der Effektivität auch bei fortgeschrittenen Tumorstadien.

1.2.  Rolle der Chemotherapie in der modernen Onkologie

In der gängigen klinischen Praxis ist die zytostatische Chemotherapie unter drei verschiedenen Gesichtspunkten indiziert: für einige wenige maligne Erkrankungen unter kurativem Aspekt, als Palliativtherapie bei fortgeschrittenen Krankheitsstadien verschiedenster Tumoren und als adjuvante bzw. neoadjuvante Behandlung vor, während oder nach lokaler chirurgischer Therapie und/oder Radiatio.

Gründe für den Einsatz von zytostatisch und zytotoxisch wirksamen Chemotherapeutika bei weit fortgeschrittenen Stadien maligner Erkrankungen oder primär generalisierten Neoplasien ergeben sich allein aus der Tatsache heraus, dass multiple Metastasen oder disseminierte maligne Neoplasien wie Leukämien durch Operation oder Bestrahlung nicht bzw. schlecht erreichbar sind. Letztere können teilweise durch eine Polychemotherapie dauerhaft geheilt werden, wie am Beispiel der akuten myeloischen Leukämie gezeigt werden konnte; durch intensive Chemotherapie mit nachfolgender allogener Knochenmarktransplantation kann bei 50% der Patienten in der 1.Remission eine dauerhafte Rezidivfreiheit erreicht werden (Appelbaum et al., 1988).

Unbefriedigend ist aber der Erfolg der zytostatischen Therapie bei soliden Tumoren. Zwar sind einige Tumorentitäten wie Seminone, Osteosarkome und Neuroblastome potentiell durch Chemotherapie heilbar, fortgeschrittene maligne Neoplasien des Gastrointestinaltraktes und der Nieren, maligne Melanome sowie Mammakarzinome lassen sich jedoch höchstens temporär in ihrer Tumormasse reduzieren. Ein Grund, der die Wirksamkeit einer Chemotherapie limitiert, ist das Vorhandensein einer primären intrinsischen oder das Auftreten einer sekundären erworbenen Chemoresistenz, die sich oftmals als simultane Resistenz gegen unterschiedliche Wirkstoffgruppen äußert. Dieses Phänomen der Zy[Seite 2↓]tostatikakreuzresistenz bzw. pleiotropen Chemoresistenz prägte den Begriff multidrug resistance (MDR). Andere Faktoren, welche die Ansprechrate einer Chemotherapie beeinflussen, sind das Proliferationsstadium der Zellen und Eigenschaften des den Tumor umgebenden Milieus, wie limitierte Vaskularisation und Penetration der Zytostatika ins Gewebe.

Die Selektion oder Induktion einer resistenten Subpopulation der Tumorzellen ist wahrscheinlich der hauptsächlich die Effektivität einer Chemotherapie limitierende Faktor.

1.2.1. Mechanismen für Zytostatikaresistenz

Das Phänomen der Chemoresistenz kann sowohl primär ohne vorherigen Kontakt zu Zytostatika auftreten, als auch sekundär im Laufe mehrer Therapiezyklen durch Selektion von Zellen, in denen Resistenzfaktoren gesteigert exprimiert werden.

Eine beträchtliche Anzahl von metabolischen oder strukturellen Eigenschaften von Zellen kann zu einer Zytostatikaresistenz führen. Als Übersicht zusammengefasst sind folgende Mechanismen daran beteiligt (Tannock und Goldenberg, 1998):

1.2.2. Klassische und atypische multidrug resistance (MDR)

Verschiedene molekulare Ursachen und Mechanismen der multidrug resistance konnten in den letzten Jahren identifiziert und genetisch, biochemisch und pathophysiologisch charakterisiert werden.


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Viele Zytostatika sind Substrate für membranständige Proteine, die als auswärtsgerichtete Pumpe das Medikament aus der Zelle transportieren. Davon am längsten bekannt und am besten charakterisiert ist das durch das mdr1-Gen kodierte P-170-Glykoprotein, dessen Überexpression bei chemoresistenten malignen Tumoren mittlerweile als klassische MDR bezeichnet wird (Gottesman et al., 2002;Nooter und Stoter, 1996).

1.2.2.1. Klassische MDR

Das 170 kDa große P-Glykoprotein (Pgp) gehört zu einer Familie von Molekülen, die als ATP-binding cassette (ABC)-Transporter bezeichnet werden (Childs und Ling, 1994). Dieses Protein mit seiner exkretorischen Funktion ist eine Komponente des Membrantransportsystems gesunder Zellen und findet sich physiologisch in Organen mit Stoffwechselfunktionen wie Leber, Pankreas und Darmmukosa in hohen Expressionsniveaus (Fojo et al., 1987;Thiebaut et al., 1987) und ist in diesen Zellen an der Exkretion von Xenobiotika beteiligt.

Die P-Glykoprotein-Produktion bei Überexpression des mdr1-Gens, am häufigsten als Folge einer Amplifikation oder einer gesteigerten Transkription, ist Ursache für eine klassische Zytostatikaresistenz. Aus einer Erhöhung seiner Expression in neoplastisch transformierten Zellen resultiert ein gesteigerter Zytostatikaefflux und damit eine Senkung der intrazellulären Zytostatikakonzentration.

Eine Vielzahl von Stoffen sind bekannte Inhibitoren von P-Glykoprotein und können die Sensitivität von chemoresistenten Zellen steigern (Bradley et al., 1988;Shustik et al., 1995); dazu gehören z.B. Kalziumkanalblocker (Verapamil). Einige davon sind selbst Substrate des Pgp und hemmen kompetitiv den Zytostatikaefflux, aber auch nicht kompetitive Mechanismen sind an der Inhibition beteiligt. Leider zeigte der Einsatz derartiger Substanzen zur Überwindung von Chemoresistenz in klinischen Studien nicht den erhofften Erfolg, teils wegen der Beteiligung von vielen anderen Mechanismen an der Resistenz, teils durch inadäquate Konzentrationen der Hemmsubstanz im Gewebe bzw. einer verminderten Aktivität in der hohen Zellkonzentration solider Tumoren. Neuere Agenzien mit höherer Affinität und größerer Spezifität werden zurzeit klinisch erprobt.

1.2.2.2. Atypische MDR

Alle Formen der MDR, die nicht mit der Überexpression von P-Glykoprotein einhergehen, werden unter dem Begriff atypische MDR zusammengefasst.

An diesen Formen mitbeteiligt sind andere Mitglieder der ABC-Transporter-Superfamilie, zu denen das multidrug resistance protein (MRP) (Cole et al., 1992) und das breast cancer [Seite 4↓] resistance protein (BCRP) (Doyle et al., 1998) gehören. Beide sind wie das P-Glykoprotein bei Chemoresistenz gegen bestimmte Zytostatika überexprimiert. BCRP vermittelt apikal gerichteten Substanztransport und scheint die Bioverfügbarkeit von Medikamenten zu vermindern (Lage und Dietel, 2000), MRP führt ebenfalls zu verminderter Substanzakkumulation und veränderter intrazellulärer Lokalisation (Cole et al., 1992). MRP teilt nur 15% Sequenzidentität mit Pgp, und der Membrantransport von einigen Substraten ist gebunden an die Anwesenheit von reduziertem Glutathion (Loe et al., 1996;Zaman et al., 1995).

Ein weiteres Molekül, bekannt als lung-resistance protein (LRP), ist ebenfalls mit pleiotroper Zytostatikaresistenz assoziiert, wahrscheinlich über eine Sequestrierung der Substanzen in intrazellulären Organellen und damit über Regulierung des nucleozytoplasmatischen Transports von Zytostatika (Izquierdo et al., 1996).

1.3.  Rolle der Hyperthermie in der modernen Onkologie

Die klinische Applikation der Hyperthermie ist inzwischen in die multimodalen Anti-Tumor-Strategien integriert worden (Falk und Issels, 2001). Denn die Hyperthermie ist durch ihre breite Palette von lokalen und systemischen Auswirkungsmechanismen in der Tumorbekämpfung äußerst effektiv (Pontiggia et al., 1996). Durch Kombination von Chemotherapie und/oder Radiatio mit Hyperthermie lassen sich bei verschiedenen soliden chemotherapieresistenten Tumoren deutlich bessere Behandlungsergebnisse erzielen als durch klassische Methoden allein (Engin, 1994). Ebenso können als nicht mehr resektabel eingeschätzte Tumoren in ein operationsfähiges Stadium gelangen.

Ein weiterer nicht unbedeutender Punkt für den klinischen Einsatz ergibt sich aus der Tatsache heraus, dass die Hyperthermie eine im Allgemeinen verträgliche Therapie darstellt, von der keine schwerwiegenderen Nebenwirkungen bekannt sind.

Hyperthermie wird als Ganzkörperhyperthermie oder lokal als regionale Hyperthermie angewandt. Die klinische Applikation von Wärme kann durch elektromagnetische Strahlen, Ultraschall oder Perfusionsmethoden erfolgen. Letztere Form ist essentiell für die Herangehensweise der Ganzkörperhyperthermie unter Verwendung von extrakorporaler Zirkulation, während regionale Hyperthermie gewöhnlich über extra- oder intrakorporale Mikrowellenapplikatoren vor sich geht.

1.3.1. Biologische Grundlagen

Die Hyperthermie verfügt über eine breite Palette von tumordevitalisierenden Effekten. Ergebnisse thermobiologischer Studien haben gezeigt, dass in Abhängigkeit von Tempe[Seite 5↓]ratur und Expositionszeit (°C x min.) eine Erhöhung der Temperatur von 37°C in den Bereich von 42,5 bis 45°C zytotoxische Effekte nach sich zieht (Westra und Dewey, 1971).

In der frühen Phase der Hyperthermie wird die Durchblutung im tumorösen Gewebe stimuliert und dadurch u.a. die Zytostatikazufuhr erleichtert. Bei extremer Hyperthermie über 43°C kommt es zu ausgeprägter Zellschädigung im Tumorparenchym mit Nekrose. Durch Störung von DNA- und RNA-Synthese sowie Steigerung der Plasma- und Lysosomenmembranpermeabilität können andererseits auch Apoptosemechanismen induziert werden, wenn eine Reparatur hyperthermiegeschädigter Zellstrukturen nicht ausreichend möglich ist (Bogovic et al., 1999).

Sekundäre extreme Schäden der vaskulären Komponenten des Tumorstromas mit Blockierung der Mikrozirkulation lösen Hypoxie, Wärmestau im Tumor, lactatbedingte pH-Senkung und Schädigung von Membranstrukturen und Nucleinsäuresynthese aus. Extreme Temperaturen verursachen Konformations-Deformation von Makromolekülen, Denaturierung von Membranen und zytoplasmatischen Proteinen.

Zellen in einem so gearteten Mikromilieu sind höchst sensitiv gegenüber weiterer Hyperthermie und können durch eine Hitzebehandlung in ihrer Zahl reduziert werden (Wilmanns et al., 1999), die keine signifikant negativen Auswirkungen auf normales Gewebe hat. Dies ist auf eine verminderte Thermoregulation in Tumorgeweben zurückzuführen. So können normale Gewebe ihre Durchblutung bei Überwärmung bis auf das Zehnfache steigern, während bei der Perfusion von Tumorgewebe maximal eine Verdopplung möglich ist (Hill, 1992), was eine verbesserte Wärmeabgabe im Normalgewebe nach sich zieht.

Darüber hinaus reduzieren diese die Ansprechrate von Hyperthermie erhöhenden Umgebungsbedingungen die Erfolgsrate von Strahlentherapie, so dass der additive Effekt von Hyperthermie für diese Tumorareale genutzt werden kann.

1.3.2. Interaktion mit Chemotherapie

Hyperthermie kann auf unterschiedliche Weise die Erfolgsrate einer Chemotherapie erhöhen. So wird, wie schon oben erwähnt, durch Steigerung der Perfusion in Tumorgeweben die Zytostatikazufuhr erhöht. Desweiteren wird die Membranfluidität und -permeabilität erhöht, was die Zytostatikapenetration in die Zelle verbessert.

Die Steigerung der Effektivität einer Chemotherapie durch Kombination mit Hyperthermie (Thermochemotherapie) hängt ab von dem verwendeten Zytostatikum (Hahn und Li, 1982). Sensibilisierende Effekte zeigen sich bei alkylierenden Substanzen, Nitroseharnstoffen, Cisplatin, Carboplatin, Anthrazyklinen, Bleomycin, ferner Interferon-gamma [Seite 6↓]und Tumornekrose Faktor. Insbesondere alkylierende Substanzen und Zytostatika, die direkt mit der DNA der Tumorzelle reagieren (z.B. Cisplatin, Carboplatin etc.) erweisen sich als geeignet.

Tabelle 1.1 zeigt die Interaktion von Hyperthermie mit verschiedenen Zytostatika (Issels, 1999)

Tabelle 1.1: Effekte von Temperaturerhöhung auf die Wirkungsweise von speziellen Zytostatika (Issels, 1999)

Keine oder geringe Wirkungssteigerung

Additive Wirkungssteigerung

Exponentielle Wirkungssteigerung

Vincaalkaloide

Doxorubicin

Cisplatin

Methotrexat

Mitoxantron

Carboplatin

5-Fluorouracil

Cyclophosphamid

Mitomycin C

Taxane

Mephalan

Bleomycin

Cytarabin

Ifosfamid

 

Daunorubicin

  

Actinomycin D

  

1.3.3. Thermotoleranz/Thermoresistenz

Zellkulturen, die Temperaturen ausgesetzt sind, welche über normalen Wachstumsbedingungen liegen, reagieren mit reproduktivem Zelltod. Dieser Prozess lässt sich in Überlebenskurven quantifizieren, in denen die Fraktion der überlebenden Zellen semilogarithmisch gegen die gesamte Expositionszeit bei einer bestimmten Temperatur graphisch aufgetragen wird. Die Zahl der überlebenden Zellen hängt von beiden Parametern, der Temperatur sowie der Expositionsdauer, ab. Die so erhaltenen Kurven weisen eine initiale Schulter auf mit anschließendem exponentiellen Abfall, ähnlich den Kurven, die sich nach Exposition gegenüber ionisierender Strahlung darstellen (Laszlo und Venetianer, 1998).

Mitte der 70 Jahre entdeckten zwei unabhängige Forschungsgruppen, dass Zellkulturen, die in gesplitteten Dosen Hyperthermie ausgesetzt wurden, eine größere Überlebensfraktion aufwiesen als solche, die einer Einzeldosis von äquivalenter Dauer ausgesetzt waren (Gerner und Schneider, 1975;Henle und Leeper, 1976). Infolgedessen führte kurzzeitige Exposition von erhöhten Temperaturen mit 20-50% Zellreduktion gefolgt von einer mehrstündigen Erholungsphase bei 37°C zur Entwicklung einer Fähigkeit der Zellen, einen weiteren akuten und sonst lethalen Hitzeschock zu überleben. Diese transiente Resistenz mit definierten Kinetiken von Entwicklung und Rückgang nannte man Thermotoleranz.

Dagegen ist Thermoresistenz eine permanente Eigenschaft, die z.B. durch erhöhte Expression eines Heat Shock Proteins (HSPs), z.B. HSP70 (Laszlo und Venetianer, 1998) oder durch Gentransfer erworben wird.


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Bei der Untersuchung von möglichen Mechanismen für Resistenz gegen erhöhte Temperaturen postulierten drei verschiedene Forschungsteams die Beteiligung der Heat Shock Proteine (Landry et al., 1982;Li und Werb, 1982;Subjeck et al., 1982). Ein wesentlicher Bestandteil zur Stärkung dieser Hypothese war die Demonstration, dass mehrere Reagenzien (z.B. Natriumarsenit), die die Synthese der HSPs steigern, ebenso Thermotoleranz induzieren können. Andererseits konnte gezeigt werden, dass Thermotoleranz unter Bedingungen, die die Synthese von HSPs inhibieren, induziert werden kann. Folglich muss es mindestens zwei Zustände von Thermotoleranz geben, nämlich einen proteinsyntheseabhängigen und einen proteinsyntheseunabhängigen. Letzterer zeigte sich nach Hitzeexposition, nicht aber nach Behandlung mit Natriumarsenit. Interessanterweise fanden sich aber Anhaltspunkte, dass HSPs, die zum Zeitpunkt der Hitzeexposition bereits in der Zelle vorhanden sind, wahrscheinlich eine wichtige Rolle in der proteinsyntheseunabhängigen Form der Thermotoleranz spielen.

Laszlo und Li wiesen nach, dass Aminosäureanaloga die Entwicklung von Thermotoleranz bei HA1-Fibroblasten des chinesischen Hamsters inhibieren, während bereits thermotolerante Zellen keinen thermosensitivierenden Effekt durch Aminosäureanaloga zeigen (Laszlo und Li, 1993). Diese Daten unterstützen die Theorie, dass HSPs eine wichtige Rolle bei dem Phänomen Thermotoleranz spielen.

Die genauen Mechanismen des hitzeinduzierten Zelltods bzw. der Physiologie von Thermotoleranz bedürfen weiterhin der Klärung. Man postulierte als Hauptziel des Zelltods unter hyperthermen Bedingungen sowohl Plasmamembran als auch Nucleus. Da Zelltod definitionsgemäß den Verlust reproduktiver Integrität des Nucleus involviert, muss dieser in jedem Fall ultimativ mitbeteiligt sein, auch wenn das Hauptziel woanders liegt. Hyperthermie scheint bei epithelialen und mesenchymalen Zellen eine Art Interphase-Zelltod herbeizuführen, während in Zellen der hämatopoietischen Reihe Apoptose induziert wird.

Die Mechanismen der Physiologie von Thermotoleranz basieren auf zwei Grundkonzepten: erstens verbesserte Schutzmöglichkeiten der Zelle vor thermoinduzierter Schädigung und zweitens effizientere Reparaturfähigkeit in diesen Zellen.

1.4.  Humane Karzinomzellinien EPG85-257 (Magen-CA) und EPP85-181 (Pankreas-CA) und ihre resistenten Varianten

Gastrointestinale Karzinome, einschließlich Magen- und Pankreaskarzinom, weisen eine natürliche Resistenz gegenüber vielen zytostatischen Substanzen auf (Dietel, 1996). Zusätzlich können sie eine sekundäre Resistenz entwickeln, welche das klassische multidrug [Seite 8↓] resistance (MDR) Phänomen, das durch Synthese von P-170-Glykoprotein charakterisiert ist, einschließt. Darüber hinaus kann man atypische MDR-Phänomene beobachten, die über verschiedene, z.T. noch nicht geklärte Mechanismen Chemoresistenz vermitteln.

In vitro Modellsysteme von Tumorzellinien eignen sich als Untersuchungsmittel von chemoresistentem Verhalten. Über den Einsatz zweier zytostatisch wirksamer Substanzen Daunorubicin und Mitoxantron, denen divergente Resistenzmechanismen zugeschrieben werden, sind aus den parentalen Zellinien EPG85-257 und EPP85-181 resistente Varianten selektioniert worden. Durch Exposition der Zellen gegenüber Daunorubicin wird ein klassischer, also P-Glykoprotein-positiver MDR-Phänotyp induziert, während Mitoxantron eine atypische multidrug-Resistenz vermittelt ohne Überexpression von P-Glykoprotein (Kellner et al., 1997).

Um die Empfänglichkeit von Tumorzellen mit verschiedenen MDR-Phänotypen gegenüber einer Hitzebehandlung zu untersuchen, wurden analog der Etablierung von chemoresistenten Zellen thermoresistente Varianten generiert. Dazu wurden die sensible und die chemoresistenten Linien jedes Karzinomtyps einer gleichförmigen, sich schrittweise erhöhenden Temperatursteigerung ausgesetzt. Mittels dieser Vorgehensweise ist es gelungen, aus allen Ausgangslinien thermoresistente Varianten zu etablieren, die stabil bei einer um 2,4°C erhöhten Umgebungstemperatur bei gleicher Teilungsaktivität im Vergleich zur Referenztemperatur von 37°C kultiviert werden können. Im Klonogenitätsassay zeigten diese Zellen eine um 1-2 Dekaden (bei 45°C) erhöhte Überlebensrate im Vergleich zu den thermosensiblen Ausgangszellen (Lage, persönliche Mitteilung).

Die humane Magenkarzinomlinie EPG85-257 und ihre klassisch und atypisch chemoresistenten Varianten EPG85-257-RDB bzw. EPG85-257-RNOV wurden von Lage et al. hinsichtlich ihrer durch chronische Thermoexposition induzierten Eigenschaften charakterisiert. Verschiedene Schlussfolgerungenkonnten aus den Untersuchungen gezogen werden (Lage, persönliche Mitteilung):


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Insgesamt standen für die Analyse von Chemo- und Thermoresistenzmechanismen zwölf Zellinien zur Verfügung. Bei der Magenkarzinomlinie EPG85-257 waren dies die Parentallinie EPG85-257-P, deren gegen Daunorubicin und Mitoxantron resistente Varianten EPG85-257-RDB und EPG85-257-RNOV, und thermoresistente Varianten von allen drei Linien, EPG85-257-P-TR, EPG85-257-RDB-TR und EPG85-257-RNOV-TR. Die äquivalenten Zellreihen der Pankreaskarzinomlinie waren die von der Parentallinie EPP85-181-P abgeleiteten chemoresistenten Sublinien EPP85-181-RDB und EPP85-181-RNOV und die drei thermoresistenten Varianten EPP85-181-P-TR, EPP85-181-RDB-TR und EPP85-181-RNOV-TR.

1.5.  Eigenschaften der verwendeten Zytostatika

1.5.1. Daunorubicin

Daunorubicin ist ein Anthracyclin-Glycosid-Antibiotikum mit der Summenformel C27H29NO10 · HCl, und folgender Strukturformel:

Abbildung 1.1:
Strukturformel von Daunorubicin

Es wird hauptsächlich in Kombinations-Therapieschemata zur Behandlung von akuter myeloischer Leukämie verwendet. In modernen Therapieregimes zur Behandlung von Magen- und Pankreaskarzinom wird Daunorubicin nicht verwendet, aber es eignet sich für Modellsysteme von gastrointestinalen Tumoren, da es eine klassische MDR (s.o.) hervorruft.

1.5.2. Mitoxantron

Mitoxantron ist ein synthetisches Antracendion aus der Gruppe der Anthracyclin-Antibiotika mit der Summenformel C22H28N4O6 · 2HCl und folgender Strukturformel:


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Abbildung 1.2:
Strukturformel von Mitoxantron

Mitoxantron wird aufgrund seiner antineoplastischen Eigenschaften bei Mammakarzinom (auch fortgeschrittene Stadien), Ovarialkarzinom, hepatozellulärem Karzinom, Non-Hodgkin-Lymphom und akuten Leukämien als Zytostatikum eingesetzt. In Kombination mit Cytosin-Arabinosid wirkt es remissionsauslösend bei akuter non-lymphoblastischer Leukämie. Mitoxantron, das eine atypische MDR (s.o.) hervorruft, kann für Modellsysteme genutzt werden, wird jedoch für die Behandlung von Magen- und Pankreaskarzinom nicht eingesetzt.

1.5.3. Wirkungsweise von Anthracyclinen

Für Anthracycline sind eine Vielzahl von wichtigen biochemischen Effekten beschrieben worden, die an den therapeutischen und toxischen Wirkungen dieser Medikamente einzeln oder additiv beteiligt sein können. Indem Daunorubicin in die Basenpaare der DNA-Helix interkaliert und dadurch deren Entwindung induziert, beeinträchtigt es viele Funktionen der DNA, einschließlich DNA- Synthese und DNA- abhängige RNA-Synthese (Aubel-Sadron und Londos-Gagliardi, 1984). Es kommt zu Einzel- und Doppelstrangbrüchen sowie zum Austausch von Schwesterchromatiden. Desweiteren inhibiert Daunorubicin die Aktivität der Topoisomerase II, was zu einer weiteren Induktion von DNA-Strangbrüchen führt (Zunino und Capranico, 1990).

Der genaue Wirkmechanismus von Mitoxantron ist noch nicht vollständig geklärt. Nachgewiesen ist eine Wirkung auf chromosomale Strukturen mit Schädigung der DNA sowie Inhibition der DNA-Topoisomerase II. Eine weitere Eigenschaft des Medikaments ist seine Bindung an Cytokeratin 8, ein Protein des Zytoskeletts, das möglicherweise in die Zellteilung eingreift.

Aufgrund der geschilderten Eigenschaften besitzen Anthracyclin-Pharmaka mutagene und karzinogene Eigenschaften. Wahrscheinlich steht die Spaltung von DNA in Verbindung mit der Erzeugung von freien Radikalen. Die zellschädigende Wirkung kann durch Superoxiddismutase, Katalase und exogene Antioxidantien (z.B. Tocopherol) vermindert werden.

Ferner können Anthracycline mit Zellmembranen interagieren und deren Funktionen verändern. So weisen insbesondere Doxorubicin und Daunorubicin eine spezielle Affinität zu Phospholipiden auf (Aubel-Sadron und Londos-Gagliardi, 1984). Es gibt Anhaltspunkte, [Seite 11↓]dass diese Effekte eine entscheidende Rolle sowohl bei der Antitumoraktivität und der Entwicklung von Resistenzmechanismen als auch bei der Kardiotoxizität spielen können (Tritton et al., 1978).

1.6.  Proteomics

1.6.1. Überblick

„Proteomics“ oder „Proteom-Technologie“ leiten sich ab von dem Wort Proteom, ein Begriff, der 1995 geprägt wurde (Wasinger et al., 1995). Er bezeichnet die Gesamtheit aller zu einem definierten Zeitpunkt in der Zelle vorhandenen Proteine.

Proteom-Forschung ist ein neueres Gebiet, das das weite Feld der Genomforschung komplementiert. Um komplexe physiologische Vorgänge im Organismus zu verstehen, reicht es nicht aus, das Genom zu entschlüsseln. Es ist notwendig, die Proteine in ihrer Gesamtheit zu erfassen.

Die Biosynthese von Proteinen ist gewebs - bzw. zellspezifisch. Nach der Translation können die Proteine durch verschiedene posttranslationale Modifikationen wie z.B. Phosphorylierung, Glykosylierung oder Acetylierung weiter verändert werden. Aus diesem Grund ist die ein-Gen-ein-Protein-Hypothese nicht mehr haltbar. Das Proteom ist ein dynamisches, sich ständig änderndes Gebilde. Zum einen ist die Proteinbiosynthese zell- oder gewebsspezifisch, zum anderen sind äußere Bedingungen (Temperatur, Stress, Interaktionen mit anderen Zellen, Medikamente) dafür ausschlaggebend, welche Proteine und in welcher Menge diese synthetisiert werden.

Proteomics ist die Analyse der gesamten Proteinmenge, die von einem Genom unter bestimmten Bedingungen exprimiert wird. Es ist der direkte Weg, um Proteine in Zellen, Geweben und Organismen zu identifizieren und quantifizieren bzw. um zu untersuchen, welche posttranslationalen Modifikationen vorgenommen wurden.

Eine weit verbreitete Methode, die es ermöglicht, Proteine aus dem Proteom voneinander zu trennen, ist die 2D-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2D- PAGE). Sie ist geeignet, um viele Tausend Proteinkomponenten in multiplen Proben voneinander zu trennen, darzustellen und zu quantifizieren. Daher ist diese Herangehensweise gegenwärtig ohne Konkurrenz für die Analyse und Darstellung von Proteinexpressionsprofilen, welchen eine Schlüsselrolle im rapide expandierenden Gebiet von Proteomics zukommt.

Die einzelnen Schritte der Proteom-Analyse lassen sich folgendermaßen zusammenfassen (Westermeier, 2000):

1.6.2. Zweidimensionale Elektrophorese

Die Separation von Proteinen in zwei Dimensionen ist über 40 Jahre alt. Smithies und Poulik trennten 1956 als erste Serumproteine mit einer Kombination von Papier- und Stärkegelelektrophorese. Innovationen bei den Elektrophoreseprozeduren und Entwicklung von diskontinuierlichen Puffersystemen verbesserten die 2D-Formen rapide. Gradient-Polyacrylamidgele verfeinerten die Schärfe der Proteinbanden (Margolis und Kenrick, 1967), was, eingesetzt in 2D-Separationen, den Weg ebnete für die Integrierung von isoelektrischen Fokussierungstechniken (IEF) in 2D-Prozeduren mit entweder einfachen (Dale und Latner, 1969;Macko und Stegemann, 1969) oder Gradient- Polyacrylamidgelen (Emes et al., 1975). Die eigentliche 2D-Revolution fand ihren Anfang 1975 mit der Veröffentlichung von drei Beschreibungen über 2D-PAGE unter denaturierender isoelektrischer Fokussierung (Klose, 1975;O'Farrell, 1975;Scheele, 1975) in einer Form, die den meisten heutigen Anwendern vertraut sein dürfte.

Zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese ist das Kernstück der Proteom-Technologie. Dabei handelt es sich um eine Kombination aus isoelektrischer Fokussierung (1.Dimension) und SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (2.Dimension).

Beide Trennungsverfahren beruhen auf unterschiedlichen, voneinander unabhängigen Eigenschaften von Proteinen, einem chemischen Parameter- isoelektrischer Punkt- in der ersten Dimension und einem physikalischen Parameter- Molekulargewicht- in der zweiten. Während der isoelektrischen Fokussierung werden die Proteine in einem pH-Gradienten separiert, bis sie eine stationäre Position erreichen, wo ihre Nettoladung Null ist, also der isoelektrische Punkt (pI) des jeweiligen Proteins erreicht ist.

In der zweiten Dimension erfolgt die Auftrennung orthogonal durch Elektrophorese in Anwesenheit von Natriumdodecylsulfat (SDS). SDS ist ein Detergenz, das an Proteine bindet [Seite 13↓]und deren intrinsische Ladung unbeachtet lässt, so dass alle dieselbe Ladungsdichte haben und demzufolge freie elektrophoretische Mobilität garantiert wird.

Die erste Dimension brachte zu Beginn der 2D-Epoche einige Schwierigkeiten und Rückschläge mit sich; die bei der traditionellen Methode verwendeten Carrier-Ampholyte, die nach Anlegen der Spannung den pH-Gradienten generieren und aufrechterhalten, gefährdeten die Reproduzierbarkeit innerhalb eines Labors durch Unterschiede zwischen den Chargen. Außerdem war es bei dieser Methode nicht möglich, die für präparative Läufe zur Proteinidentifizierung nötigen Probenmengen auf ein einzelnes IEF-Gel aufzutragen. Diese Probleme wurden durch die Einführung von immobilisierten pH-Gradienten gelöst, eine Methode, bei der die pH-Gradienten in der Gelmatrix in Form von Acrylamidoverbindungen, den Immobilinen, kopolymerisiert werden (Bjellqvist et al., 1982;Gorg et al., 1988;Righetti et al., 1990) Allerdings sind auch diese Verfahren nicht ohne Nachteile, so ist z.B. die Reproduzierbarkeit der Spotpositionen in sehr basischen pH-Bereichen noch nicht ausreichend gewährleistet, und die an sich hohe Beladungskapazität der IPG-Gele durch Proteinpräzipitation an der Applikationsstelle limitiert (Lopez und Patton, 1997).

Parallel zu diesem grundsätzlich anderen Prinzip der isoelektrischen Fokussierung wurde die klassische Methode mit Trägerampholyten weiterentwickelt und der Routine-Analytik zugeführt. Einen wesentlichen Beitrag lieferte Anderson mit der Entwicklung des ISO-DALT-Systems (Anderson und Anderson, 1982). Diese Methode basiert auf dem von O`Farrell veröffentlichten Prinzip (O'Farrell, 1975), das als Auftragsseite für die Proben die kathodische Seite des Gels (CIF) vorsieht. Bei dem unabhängig davon zur gleichen Zeit von Klose entwickelte System wird das Proteingemisch dagegen auf die anodische Seite des IEF-Gels (AIF) aufgeladen und die Fokussierung gestoppt, bevor die basischen Proteine das kathodische Ende des Gels erreichen (Klose, 1975). Eine revidierte Form seines ursprünglichen Protokolls veröffentlichte Klose 1995 unter exakter Beschreibung des Verfahrens mit Beweisen für eine gute Reproduzierbarkeit und hochwertige Qualität seiner 2D-Gele (Klose und Kobalz, 1995). Um das bei der AIF bestehende Problem der basischen Proteine, die z.T. nicht in das Gel migrieren, zu lösen, entwickelte O`Farrell das Prinzip der Nonequilibrium pH-Gradient-Elektrophorese. Dabei werden die Proteine wie bei dem Klose-System auf das anodische Ende des Gels appliziert, dann allerdings in einem basischen pH-Gradienten separiert.

Viele Kontroversen haben sich im Laufe der Jahre mit den Vorteilen von IPG versus traditionelle IEF bzw. mit den Vor- und Nachteilen der klassischen IEF-Verfahren untereinander befasst. Zusammenfassend kann man sagen, dass die Resultate bezüglich Auflösung und Reproduzierbarkeit bei allen Methoden nicht signifikant differieren (Lopez und Patton, 1997). Auch bei Verwendung von unterschiedlichen Chargen von Carrier-Ampholyten kann hohe Reproduzierbarkeit bei der klassischen IEF erreicht werden, wie Lopez und Patton mit Hilfe statistischer Analysen in zwei verschiedenen Laboren testeten. Auch der zweite große Nachteil der klassischen Verfahren, die große Proteinmenge für präparative Läufe, ist heute durch Weiterentwicklung der Identifizierungsmethoden überwunden worden, da inzwischen auch Mengen von einigen hundert Mikrogramm zur Spotidentifizierung ausreichen.

Durch diese rasante Entwicklung der hochauflösenden 2D-Elektrophorese in den letzten Jahren mit Erschaffung neuer Proteindatenbanken und Erweiterung schon bestehender ist der Meilenstein für die breite Nutzung und Anwendung der Informationen gelegt. Als eine der wichtigsten auf der Basis von IPG generierten Datenbanken im Internet wäre die SWISS-2DPAGE (Appel et al., 1996;Sanchez et al., 1995) zu nennen. Eine mit Hilfe von traditioneller IEF in Kombination mit Autoradiographie erschaffene Datenbank mit über 800 Proteinspots kann unter der Internetadresse http://proteomics.cancer.dk eingesehen werden.


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1.7.  Fragestellung

Der Erfolg einer kombinierten Tumortherapie unter Einbeziehung von Chemotherapie und Hyperthermie wird durch Ausbildung von chemoresistenten und thermoresistenten Tumorzellen deutlich limitiert.

Ein nützliches Instrument zur Untersuchung von Resistenzphänomenen ist die Kultivierung von Zellinien, während klinische Studien an Patienten kaum realisierbar sind. Kombinationen von chemoresistenten mit thermoresistenten Eigenschaften bei humanen Tumorzellen sind bisher in der Literatur nicht befriedigend beschrieben. Vor allem exakte molekulare Mechanismen, die einer Thermoresistenz zugrunde liegen, insbesondere im Hinblick auf eine Korrelation zu Chemoresistenzmechanismen, bleiben ein weitgehend unerforschtes Feld.

Dieses Problem wurde als Ausgangspunkt für diese Arbeit gewählt. Daraus wurden folgende Fragestellungen abgeleitet:


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09.02.2007