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2.  Material und Methoden

2.1.  Material

2.1.1. Reagenzien


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Tabelle 2.1: Reagenzienname, Hersteller und Bestellnummer der verwendeten Chemikalien

Produkt

Bestellnr.

Firma

Acetonitril p.a.

1.00003

Merck (Darmstadt, Deutschland)

Acrylamid 99,9%

161-0103

Bio-Rad Laboratories
(Hercules, USA)

Agarose L

17-0424-02

Amersham Biosciences
(Little Chalfont Buckinghamshire, UK)

Ammoniaklösung 25% p.a.

1.05432

Merck (Darmstadt, Deutschland)

Ammoniumbicarbonat

150107

ICN Biomedicals GmbH (Eschwege, Deutschland)

Ampholine (pH 3,5-10)

80-1125-87

Amersham Biosciences (Little Chalfont Buckinghamshire, UK)

(pH 4.0-6.5)

80-1127-17

 

APS (Ammoniumpersulfat)

161-0700

Bio-Rad Laboratories (Hercules, USA)

Bis (n,n´-methylene-bis-acrylamide)

161-0201

Bio-Rad Laboratories (Hercules, USA)

Bromphenol blau

18030

Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Deutschland)

1-Butanol p.a.

1.01990

Merck (Darmstadt, Deutschland)

CHAPS (3-[(3-cholamidopropyl)-dimethyalmino] -propansulfate)

C-2023

Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Deutschland)

Citronensäure-monohydrat p.a.

1.00244

Merck (Darmstadt, Deutschland)

Coomassie brillant blue R-250

161-0400

Bio-Rad Laboratories (Hercules, USA)

DTT (DL-Dithiothreitol)

D-0632

Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Deutschland)

Essigsäure 100% p.a.

1.00063

Merck (Darmstadt, Deutschland)

Ethanol denaturiert

200-578-5

Herbeta-Arzneimittel (Berlin, Deutschland)

Formaldehyd 37% p.a.

1.04002

Merck (Darmstadt, Deutschland)

Glutardialdehyd p.a.

 

Merck (Darmstadt, Deutschland)

Glycerin p.a.

1.04092

Merck (Darmstadt, Deutschland)

Glycin p.a.

1.04201

Merck (Darmstadt, Deutschland)

Harnstoff

51459

Fluka Chemie AG (Buchs, Schweiz)

Kaliumacetat reinst

1.04821

Merck (Darmstadt, Deutschland)

Kaliumcarbonat reinst

1.04924

Merck (Darmstadt, Deutschland)

Kaliumferricyanid p.a.

13746-66-2

Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Deutschland)

Kaliumtetrathionat p.a.

60593

Fluka Chemie AG (Buchs, Schweiz)

Lyphochek assayed chemistry control level1

C-310-5

Bio-Rad Laboratories (Hercules, USA)

Lyphochek assayed chemistry control level2

C-315-5

Bio-Rad Laboratories (Hercules, USA)

Methanol p.a.

1.06009

Merck (Darmstadt, Deutschland)

Naphthalin-1,5-disulfonsäure Tetrahydrat 97%

27-637-5

Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Deutschland)

Natriumacetat wasserfrei

71180

Fluka Chemie AG (Buchs, Schweiz)

Natriumchlorid p.a.

1.06404

Merck (Darmstadt, Deutschland)

Natriumhydrogencarbonat p.a.

1.06329

Merck (Darmstadt, Deutschland)

Natriumhydroxid Plätzchen p.a.

1.06495

Merck (Darmstadt, Deutschland)

Natriumthiosulfat-pentahydrat p.a.

1.06516

Merck (Darmstadt, Deutschland)

Pharmalyte (pH 2.5-5)
(pH 5-6)
(pH 5-8)
(pH 8-10.5)

17-0451-01
17-0564-01
17-0453-01
17-0455-01

Amersham Biosciences (Little Chalfont Buckinghamshire, UK)

ortho-Phosphorsäure 85% p.a.

1.00573

Merck (Darmstadt, Deutschland)

PDA (piperazine diacrylamide)

161-0202

Bio-Rad Laboratories (Hercules, USA)

Salzsäure rauchend (37%) p.a.

1.13386

Merck (Darmstadt, Deutschland)

SDS (sodium dodecyl sulfate)

161-0301

Bio-Rad Laboratories (Hercules, USA)

Servalyt (ph 5-7)

42905

Serva Electrophoresis GmbH (Heidelberg, Deutschland)

Silbernitrat p.a.

1.01512

Merck (Darmstadt, Deutschland)

Spermine (n,n´-bis[3-aminopropyl]-1,4-butanediamine)

S-3256

Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Deutschland)

Temed (n,n,n`,n`-tetra-methyl-ethylendiamine)

161-0800

Bio-Rad Laboratories (Hercules, USA)

Thioharnstoff p.a.

1.07979

Merck (Darmstadt, Deutschland)

Tris (tris(hydroxymethyl)-aminomethan) p.a.

1.08382

Merck (Darmstadt, Deutschland)

Triton X-100

807423

ICN Biomedicals GmbH (Eschwege, Deutschland)

2.1.2. Geräte

Tabelle 2.2: Verwendete Geräte

 

Gerätetyp

Firma

Zentrifugenarbeiten

Centrifuge 5402

Eppendorf (Köln, Deutschland)

Proteinkonzentrationsbestimmung

Tecan Spectra Reader classic

Tecan Deutschland GmbH (Crailsheim, Deutschland)

Erhitzung von Lösungen

Hi-Speed Cooker

Brother International GmbH(Bad Vilbel, Deutschland)

pH-Messung

763 Multi-Calimatic pH-Meter

Knick Elektronische Meßgeräte GmbH & Co. (Berlin, Deutschland)

Mischung von Lösungen

MS1 Minishaker

IKA Labortechnik(Staufen, Deutschland)

Entgasung

Membran-Vakuumpumpe

Vakuubrand GmbH

Weitere Demineralisierung von Aqua dem.

Millipore-Anlage

Millipore GmbH (Eschborn, Deutschland)

Wägearbeiten

Präzisionswaage

Sartorius AG (Göttingen, Deutschland)

Stromversorgungsgeräte

Hoefer EPS 2A200

 

Electrophoresis Power Supply EPS 3500 XL

Isoelektrische Fokussierung (1.Dimension)

Elektrophoresekammer Typ ID 125 Tube Gel Unit

Gel-Tubes 28cm, 1,5mm ID

SDS-PAGE (2. Dimension)

Hoefer DALT Multiple Gel Caster

Amersham Biosciences (Little Chalfont Buckinghamshire, UK)

Electrophoresis System DALT Multiple Slab Gel Unit

Hoefer DALT Gel Cassettes 20 x 25cm, 1,5mm Spacer

Separator Sheets

Filler Block Set

Färbung

Laborshake

Gerhardt (Bonn, Deutschland)

Spot-Detektion

Densitometer GS 710

Bio-Rad Laboratories (Hercules, USA)

Bildanalyse

PDQuest-Software 6.1


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2.1.3.  Zellproben

Folgende Zellinien wurden als Ausgangsmaterial verwendet:

Tabelle 2.3: Bezeichnung und Charakteristika der in dieser Arbeit untersuchten Zellinien

Ausgangstumor

Zellinie

Chemo-Selektion

Kultivierungs-temperatur

Magenkarzinom

EPG85-257-P

-

37°C

EPG85-257-P-TR

-

39,4°C

EPG85-257-RNOV

Mitoxantron

37°C

EPG85-257-RNOV-TR

Mitoxantron

39,4°C

EPG85-257-RDB

Daunorubicin

37°C

EPG85-257-RDB-TR

Daunorubicin

39,4°C

Pankreaskarzinom

EPP85-181-P

-

37°C

EPP85-181-P-TR

-

39,4°C

EPP85-181-RNOV

Mitoxantron

37°C

EPP85-181-RNOV-TR

Mitoxantron

39,4°C

EPP85-181-RDB

Daunorubicin

37°C

EPP85-181-RDB-TR

Daunorubicin

39,4°C

2.1.3.1. Zellkultur und Zellernte

Die zwölf Zellinien wurden mir freundlicherweise vom Institut für Pathologie der Charité Berlin (Arbeitsgruppe PD Dr. Hermann Lage) in Form von Zellpellets zur Verfügung gestellt. Für jede Zellinie wurden drei Zellpellets aus jeweils unabhängigen, unter gleichen Bedingungen gewachsenen Kulturen als Ausgangspunkt der Experimente genommen. Für Einzelheiten bezüglich Etablierung und Kultivierung der Ausgangslinien EPG85-257-P und EPP85-181-P siehe (Dietel et al., 1990) bzw. (Lage und Dietel, 2002).

Die Selektionierung gegen die Zytostatika erfolgte schrittweise über max. 120 Tage, beginnend mit 0,001 µg/ml mit Daunorubicin bis 2,4 µg/ml und für Mitoxantron bis 0,2 µg/ml, ausgenommen für EPP85-181RNOV bis 0,02 µg/ml.

Die Thermoselektionierung vollzog sich unter kontinuierlicher Temperaturerhöhung von 37°C angefangen über 37,8°C und 38,4°C bis 39,4°C (Lage et al., 2000;Stein et al., 2002).


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2.2.  Methodik

2.2.1. 2D-Elektrophorese mit Carrier-Ampholyten in der 1. Dimension

2.2.1.1. Proteinisolierung

Zur Aufspaltung der Zellen wird ein Lysepuffer nach Rabilloud (Rabilloud, 1998) verwendet, der aus 7M Harnstoff, 2M Thioharnstoff, 4% CHAPS, 20mM Spermin und 40mM DTT besteht. Davon werden je nach Zellquantität auf das entsprechende Zellpellet zwischen 80 und 300µl pipettiert. Nach 60 Minuten Äquilibrierung bei Raumtemperatur mit zwischenzeitlichem Vortexen wird die Zellsuspension in ein Zentrifugenröhrchen überführt. Anschließend wird die Lösung bei 14000 rpm und 4°C eine Stunde lang zentrifugiert, danach der Überstand ohne die ausgefällte DNA in ein neues Eppendorf-Hütchen abpipettiert.

2.2.1.2. Proteinkonzentrationsbestimmung

Es folgt eine photometrische TCA-Proteinkonzentrationsbestimmung (Cheung et al., 1987) mit 1:5 und 1:10 verdünnten Aliquots der Probe. Als Proteinstandards werden Lyphochek I (Gesamtproteinkonzentration 67,0 mg/ml (chargenabhängig)) und Lyphochek II (Konzentration 45,0 mg/ml) verwendet. Für die Eichkurve wird eine Standardreihe mit folgenden Konzentrationen hergestellt:

a)

5mg/ml:

100µl Lyphochek I + 1240µl Lysepuffer

b)

2mg/ml:

200µl aus 5mg/ml + 300µl Lysepuffer

c)

1mg/ml:

100µl aus 5mg/ml + 400µl Lysepuffer

d)

0,2mg/ml:

20µl aus 5mg/ml + 480µl Lysepuffer

Die Kontrollreihe sieht folgendermaßen aus:

a)

4,5mg/ml:

20µl Lyphochek II + 180µl Lysepuffer

b)

3,5mg/ml:

20µl Lyphochek II + 238µl Lysepuffer

c)

2,5mg/ml:

20µl Lyphochek II + 340µl Lysepuffer

d)

1,5mg/ml:

20µl Lyphochek II + 580µl Lysepuffer

Es werden nacheinander je zweimal 35µl Standard, Kontrolle und Probe auf eine Rundboden-Mikrotiterplatte aufgetragen (Doppelbestimmung), anschließend wird mit je 100µl 0,1N HCL, dann mit 25µl 20% TCA überschichtet. Dann werden die Konzentrationen am Tecan Spectra Reader bestimmt.


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Aliquots der Proteinlösungen der Zellinien, die miteinander verglichen werden sollen, werden durch Verdünnung mit Lysepuffer auf einheitliche Konzentrationen (im Bereich 1-4mg/ml) gebracht und ebenso wie die restlichen Proben bei -80°C eingefroren.

2.2.1.3. Gießen der Gele für die 1. Dimension

Für die isoelektrische Fokussierung (IEF) in der 1. Dimension wird das von Anderson entwickelte ISO-DALT System (Modell ID 125) verwendet (Anderson und Anderson, 1982).

Zum Gießen der Gele und für die eigentliche Fokussierung dient ein und dasselbe System, bestehend aus einer großen unteren Pufferkammer und einer darin einzuhängenden oberen, in der die 20 Glasröhrchen (28cm bzw. 16cm Länge, 1,5mm ID) befestigt werden. Für den Gießvorgang wird an deren unterem Ende ein Reservoir für die Gellösung montiert; es werden 20 Gele simultan gegossen.

Für die Durchführung der ersten Dimension wurden zwei verschiedene, in Bezug auf die Länge der Gele, ihre Zusammensetzung und einige weitere Details variierende Konzepte angewandt; erstens ein 28cm-Gelsystem nach den Empfehlungen des ISO-DALT-Herstellers zur Darstellung der größtmöglichen Anzahl von Proteinspots (Konzept A) und zweitens ein nach J.E. Celis modifiziertes 16cm-Gelsystem (http://proteomics.cancer.dk) mit deutlich verbessert aufgelöstem sauren Bereich und Möglichkeit der Identifizierung von Proteinen durch mit Hilfe dieses Systems generierten 2D-Gel-Datenbanken (Konzept B). Der bei beiden Methoden erreichte pH-Gradient liegt im mittleren Bereich etwa zwischen 4 und 8.

Konzept A: Die Herstellung der 23cm langen vertikalen Rundgele erfolgt auf der Basis der konventionellen Gellösung von O´Farrell (O'Farrell, 1975) nach einem vom Hersteller empfohlenen Rezept (Zusammensetzung des selbst hergestellten Carrier-Ampholyt-Gemisches, aufbewahrt in 0.8ml-Aliquots: 20% pH 2.5-5.0, 30% pH 4.0-6.5, 10% pH 5.0-6.0, 20% pH 5.0-8.0, 20% pH 8.0-10.5):

Tabelle 2.4: Protokoll für die Gellösung der 1. Dimension (23cm-Gele)

Reagenz

Masse (g)

Volumen (ml)

Harnstoff

8,74

 

30% Acrylamid mit 1,8% Bis

 

2

Aqua dem.

 

5,17

Carrier-Ampholyt-Gemisch

 

0,8

Triton X 100 (20%)

 

1,62

nach Entgasen (ca. 5 min.):

  

10% Ammoniumpersulfat

 

100µl

10% TEMED

 

100µl


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Das Endvolumen der Lösung beträgt 16ml und wird nach vorsichtigem Entgasen mit Hilfe einer Vakuumpumpe mit nacheinander je 100µl 10% TEMED und 10% APS zur Beschleunigung der Polymerisation versetzt. Anschließend wird die Lösung in das vorgesehene Reservoir eingefüllt und der gesamte Einsatz in die bis zur „Cast Fill“-Markierung mit Wasser gefüllte untere Pufferkammer langsam eingehängt, wobei die Gellösung durch den hydrostatischen Druck des Wassers in die Röhrchen gedrängt wird. Durch zügiges Nachgießen von Wasser wird die gewünschte Gellänge von 23cm erreicht.

Die Gele werden für mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur auspolymerisiert.

Konzept B: Hierbei werden 12,5cm lange Gele in 16cm-Glasröhrchen nach dem untenstehenden Protokoll (Celis et al., 1994) gegossen, wobei der Hauptunterschied zu Konzept A in der Carrier-Ampholyt-Zusammensetzung besteht.

Tabelle 2.5: Protokoll für die Gellösung der 1. Dimension (12.5cm-Gele)

Reagenz

Masse (g)

Volumen (ml)

Harnstoff

8,24

 

28,38% Acrylamid mit 1,92% Bis

 

1,95

Aqua dem.

 

3

Carrier-Ampholyte 5-7

 

0,6

Carrier-Ampholyte 3,5-10

 

0,2

Triton X 100 (10%)

 

3

nach Entgasen (ca. 5 min.):

  

TEMED

 

0,02

10% Ammoniumpersulfat

 

0,03

Der Gießvorgang erfolgt analog zur obenstehenden Beschreibung, nur dass die Gellänge hier 12,5cm erreicht.

2.2.1.4. Vorbereitung für die isoelektrische Fokussierung der 1. Dimension

Überschüssiges Acrylamid am unteren Ende der Gele wird mittels Skalpell entfernt und die untere Pufferkammer mit 3,26 Liter Wasser und 3,26ml 85% ortho-Phosphorsäure als Anoden-Puffer gefüllt. Als Kathoden-Puffer dient eine entgaste Lösung aus 300µl 10N NaOH ad 150ml Wasser.

Vor dem Präfokussierungs-Schritt, der dazu dient, dass sich aus dem einheitlichen Durchschnitts-pH-Wert des Gels ein linearer, monoton steigender pH-Gradient formiert, indem durch Anlegen eines elektrischen Feldes die mobilen Carrier-Ampholyte je nach Ladung in Richtung Kathode oder Anode wandern, trägt man zum Schutz der Geloberfläche 10µl einer Overlay-Lösung pro Gel auf, die aus 20% Glycerol und 2% Carrierampholyten be[Seite 22↓]steht. Überschüssige Luft wird mit Hilfe einer 25µl-Hamilton-Spritze aus den Röhrchen entfernt, so dass die Geloberseite durch Overlay und obere Pufferlösung mit der Kathode, die Gelunterseite durch die untere Pufferlösung mit der Anode leitend verbunden ist.

Dann wird bei Konzept A 60 min. lang bei 200V präfokussiert; bei Konzept B erfolgt die Präfokussierung nach einem Programm mit fortschreitender Erhöhung der Voltzahl: 15 min. bei 200V, 30 min. bei 300V, 60 min. bei 400V.

2.2.1.5. Starten der 1. Dimension

Nachdem in jedes Röhrchen über die Geloberfläche 30µg (Konzept A) Proteinlösung appliziert worden ist, erfolgt die isoelektrische Fokussierung bei 1500V (Stromstärke und Leistung bei 1mA bzw. 1W eingestellt) über Nacht für 20 Stunden. Für Konzept B werden 10µg Protein appliziert und für 19 Stunden bei 400V fokussiert.

Alternativ wird für die präparativen Läufe bis 1mg (Coomassie-Gele) bzw. 100-200µg (Spezial-Silberfärbung) Gesamtprotein aufgetragen.

2.2.1.6. Erstellen der Gele für die SDS-PAGE der 2. Dimension

Für den Gießvorgang der linearen 15% Polyacrylamidgele mit 0,5% Vernetzungsgrad kommt eine bis zu 20 Gelcassetten fassende ISO-DALT Gießkammer zur Anwendung.

Die Gellösung (Celis et al., 1994) wird aus verschiedenen Lösungen zusammengesetzt:

Tabelle 2.6 und 2.7: Protokolle für Teillösungen der Gießlösung für die 2. Dimension


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Arbeitsprotokoll für zwanzig 20cm x 25cm-Gele (2000 ml Gesamtlösung):

Tabelle 2.8: Protokoll für die fertige Gießlösung der 2. Dimension

Reagenz

Masse (g)

Volumen (ml)

Lösung A

 

1000

Lösung B

 

500

Natriumthiosulfat

0,86

 

Aqua dem.

 

470

nach Entgasen (30min.):

  

SDS (10%)

 

20

TEMED

 

0,4

APS (10%)

 

10

Für den Gießvorgang werden außerdem ca. 250ml 50% Glycerol, um die Gele auf die gewünschte Höhe zu bringen, und wassergesättigtes Butanol zum Überschichten benötigt.

Danach schließt sich die Polymerisationsphase für mindestens 60 min. bei Raumtemperatur an.

2.2.1.7. Starten der SDS-Polyacrylamid-Elektophorese der 2. Dimension

Die Rundgele der 1. Dimension werden direkt nach Beendigung der IEF auf die Flachgele der 2. Dimension übertragen. Dazu werden sie unter Verwendung einer 1ml-Spritze mit Hilfe von Wasserdruck aus den Glasröhrchen entladen und unter Vermeidung von Dehnung und Luftblasen nahtlos an die Flachgele angelegt. Zur Fixierung dient eine erhitzte Versiegelungslösung, bestehend aus 0,5% Agarose, 0,1% SDS, 0,29% Tris und 1,5% Glycin. Um die Proteinlauffront während der Elektrophorese verfolgen zu können, wird der Versiegelungslösung als Marker etwas Bromphenol blau zugesetzt.

Nach Verfestigung der Lösung werden je 10 Gele in einen ISO-DALT Tank eingesetzt, der mit 20L Lämmli-Puffer (siehe Tabelle) gefüllt ist.

Tabelle 2.9: Protokoll für den Laufpuffer der 2. Dimension (nach Laemmli)

Reagenz

Masse (g)

Volumen (ml)

Tris

58

 

Glycin

299

 

SDS (20%)

 

100

Aqua dem.

 

ad 20000


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Die Elektrophorese wird bei 4° C beginnend mit 100 mA pro Kammer gestartet, nach 2 h auf 250 mA hochgestellt und bis zum Erreichen der Proteinfront am gegenüberliegenden Gelende bei konstanter Stromstärke weitergeführt.

2.2.1.8. Fixierung und Färbung

Für die analytische Auswertung der Gele wird eine alkalische Silberfärbung nach Hochstrasser et al. durchgeführt (http://www.expasy.ch/ch2d/protocols/protocols.fm4.html). Die Imprägnierung erfolgt dabei mit einem Silbernitrat-Diamin-Komplex in einem stark alkalischen Milieu (Ammoniak und NaOH).

Für 10 Gele werden 2 Liter der jeweiligen Lösung bzw. Wasser verwendet, mit Ausnahme der Silberlösung (2250 ml).

Die einzelnen Schritte der Fixierung und Färbung nach Herausnehmen der Gele aus den Gelcassetten:

  1. 5 min. waschen in Aqua dem.
  2. 2 x 60 min. Fixierung in 40% Ethanol / 10% Essigsäure
  3. 2 h bis über Nacht Fixierung in 5% Ethanol / 5% Essigsäure
  4. 5 min. waschen in Aqua dem.
  5. 30 min. Sensibilisierung in 1% Glutardialdhyd und 0,5 M Natriumacetat
  6. 3 x 10 min. waschen in Aqua dem.
  7. 2 x 30 min. Sensibilisierung in 0,05% Naphthalin-1,5-disulfonsäure
  8. 4 x 15 min. waschen in Aqua dem.
  9. 30 min. Imprägnierung in einer frischen Lösung aus 0,8% Silbernitrat / 1,34% Ammoniak / 0,2% 10N NaOH
  10. 4 x 4 min. waschen in Aqua dem.
  11. 2-5 min. Entwicklung in 0,06% Zitronensäure / 0,268% Formaldehyd
  12. 30 min. Stoppen der Reaktion in 5% Tris / 2% Essigsäure

Das Resultat dieser Färbeprozedur kann anschließend der rechnergestützten Auswertung mit Hilfe des PDQuest Systems von BioRad zugeführt werden.

Für präparative Zwecke wurden zwei verschiedene Färbeprozeduren verwendet: die Coomassie-Färbung nach Neuhoff (Neuhoff et al., 1988) als Routinemethode (gut kompatibel mit der Massenspektrometrie) und eine speziell für Maldi-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight) Massenspektrometrie von unserer Arbeitsgruppe ent[Seite 25↓]wickelte Oberflächen-Silberfärbung (Sinha et al., 2001). Hierbei dient eine schwach acide Lösung von Silbernitrat in Wasser als Imprägnierlösung. Die Silberfärbung wird in einem speziell dafür konstruierten Apparat durchgeführt, der den Kontakt mit den Gelen auf ein Minimum reduziert. Für Einzelheiten zum Aufbau dieser Färbekammer siehe Abschnitt 3.1. mit entsprechenden Abbildungen.

Protokoll für die Coomassie-Färbung nach Neuhoff (Neuhoff et al., 1988):

  1. Fixierung über Nacht in 50% Ethanol / 10% Essigsäure
  2. Färbung über Nacht (mindestens 5 h) in 50% Methanol / 10% Essigsäure / 0,5 g/l Coomassie brillant blue R-250
  3. Entfärbung für mindestens 4 h in 5% Methanol / 12,5% Essigsäure (Lösung mehrmals wechseln)
  4. Aufbewahrung in 7% Essigsäure

Protokoll für die Oberflächen-Silberfärbung (Sinha et al., 2001):

  1. 60 min. + über Nacht oder 4 x 30 min. Fixierung in 30% Ethanol / 10% Essigsäure
  2. 45 min. Sensibilisierung in 0,3% Kaliumtetrathionat / 0,5 M Kaliumacetat / 30% Ethanol
  3. 6 x 10 min. waschen in Aqua dem.
  4. 60 min. Imprägnierung in 0,2% Silbernitrat
  5. 5-15 sec. waschen in Aqua dem.
  6. 30 min. Entwicklung in 3% Kaliumcarbonat / 0,03% Formaldehyd / 0,00125% Natriumthiosulfat-Pentahydrat
  7. 30 min. Stoppen der Reaktion in 4% Tris / 2% Essigsäure
  8. waschen in Aqua dem.

Nach Ausschneiden von silbergefärbten Spots sollten diese vor der Massenspektrometrie wieder entfärbt werden, da Silberionen einen Störfaktor darstellen. Dazu werden 2 Stammlösungen mit 30 mM Kaliumferricyanid und 100 mM Natriumthiosulfat vorbereitet, von denen eine Arbeitslösung in 1:1 ratio hergestellt wird. Diese ist instabil und sollte daher frisch sein. Jeder Spot wird mit 30-50µl bedeckt und gelegentlich vorgetextet. Nach Verschwinden der bräunlichen Farbe wird einige Male in Wasser gewaschen, um die Reaktion zu stoppen, anschließend werden 30-50µl 200 mM Ammoniumbicarbonat für 20 min. hinzugefügt. Nach dessen Entfernung und Waschen der Gelstückchen in Wasser werden [Seite 26↓]diese in mehrfach gewechselter Acetonitril-Lösung dehydriert (Gharahdaghi et al., 1999).

2.2.2. Auswertung der Gele mit PDQuest

In Anschluss an die Silberfärbung werden die zweidimensionalen Gele der rechnergestützten Auswertung zugeführt. Dazu werden die Gele mit dem Densitometer GS 710 eingescannt und mit Hilfe der PDQuest-Software von Bio-Rad analysiert. Als Arbeitsplattform dient ein PC (Pentium III) mit Windows 98 Benutzeroberfläche und in der Peripherie das Densitometer GS 710; die einzelnen Arbeitsschritte werden mit der PDQuest Version 6.1 ausgeführt.

Die zur Analyse der 2D-Gele involvierten Schritte in Kurzform:

Scan-Prozeß → Spot Detektion → Matching & Editing → Datenanalyse → Aufbau einer Datenbank

2.2.2.1. Scan-Prozeß

Schritt 1: Auswahl des zu scannenden Materials (Gel) und der verwendeten Färbung (Silber), der benötigte Filter (grün, transmissiv, 530-570nm Wellenlänge) wird dann automatisch gewählt.

Schritt 2: Durchführung einer Vorschau, um die exakte Position des Objekts zu determinieren.

Schritt 3: Wahl des Auflösungsbereichs, der von 42.3 x 21.2 Pixel für kleine Gele bis 169.3 x 63.5 Pixel für Gele mit breiten Banden reicht; für die meisten Gele dient der mittlere Bereich von 84.7 x 84.7 Pixel.

Schritt 4: Kalibrierung: die Scanner-Platte des GS 710 besitzt eine integrierte Kalibrationsregion sowohl für transmissive als auch für reflektierende Medien. Für Gele wird der Transmissionsmodus gewählt, der von 0 bis 3.0 O.D. reicht. O.D. steht für „Optische Dichte“ und stellt die Einheit der Signalintensität dar; sie ist definiert als dekadischer Logarithmus des Quotienten von abgegebener zu aufgenommener Lichtintensität.

Schritt 5: eigentlicher Scan-Vorgang

Vor der Spot-Detektion kann man einen Filter-Prozess anschließen, wodurch kleine multiple Störerscheinungen wie z.B. fleckförmige Artefakte, die heller oder dunkler als der umgebende Hintergrund sind, beseitigt werden. Dafür bietet PDQuest eine umfangreiche Auswahl an Filtertypen an, die je nach Charakter der Artefakte, ihrer Verteilung (Gauß´sches Profil, einheitliches Profil) und Filtergröße (3x3 Pixels bis 9x9 Pixels) unterschiedlich arbeiten.


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2.2.2.2.  Spot-Detektion

PDQuest bietet ein Verfahren zur automatischen Erkennung der Proteinspots an; mit Hilfe der Funktion „Spot Detection Wizard“ lassen sich unter Verwendung eines Korrespondenz-Gels benutzerdefinierte Parameter-Sets erstellen, mit denen alle unter gleichen Versuchsbedingungen hergestellten Gele auf einem einheitlichen Level bezüglich des Pre-Processings und der Sensitivität der Spoterkennung bearbeitet werden.

Die Erstellung eines solchen Parameter-Sets läuft nach folgendem Muster ab:

Schritt 1: Manuelle Markierung je eines besonders schwachen, eines kleinen und des größten Spots sowie einer großen Region mit Überwiegen von Hintergrund gegenüber Spots und Streifen.

Schritt 2: Pre-Processing mit Wahl der gewünschten Methode zur Abziehung des Hintergrundes. Bei der von mir gewählten Methode „Floating Ball“ (Standardeinstellung vom Hersteller) wird das Gel in vertikalen Säulen durch eine rotierende Scheibe, deren Radius automatisch auf dem größten Spot basierend kalkuliert wird, abgetastet. Es ergibt sich eine Dichtemessung mit Maximal- und Minimalwerten. Verbindet man die Basis aller Maximalwerte zu einem Graphen, werden alle Werte unterhalb des Graphen als Hintergrund definiert und rechnerisch subtrahiert.

Weitere Aufgaben des Pre-Processing: Optionale Entfernung von Flecken und Streifen.

Schritt 3: „Find Spot Centers“; manuelle Veränderung der Sensitivität möglich. Diese bestimmt die minimale Signalintensität, die als Spot erkannt wird. Je nachdem, ob zu wenige Spots oder zu viele Artefakte detektiert worden sind, wird man die Sensitivität entsprechend erhöhen bzw. reduzieren.

Anschließend folgt die Spoterkennung auf allen Gelen nach den Richtlinien dieses Parameter-Sets; dabei wird erst ein Gel-Abbild aus jedem ursprünglichen Scan kreiert, das dann einem initialen Glättungsvorgang unterzogen wird. Dabei verringert ein Glättungs-Algorithmus Densitometer-Störeffekte. Er folgen die Hintergrundsubtraktion (s.o.) und ein endgültiger Glättungsvorgang.

Die beiden letzten Schritte beinhalten die Detektion der Spotzentren und die Quantifizierung der Spots. Die Position jedes einzelnen erkennbaren Spots wird lokalisiert, dazu werden die x- und y-Koordinaten bestimmt und gemäß dem Gauß´schen Normalverteilungsmodell die assoziierten Parameter x- sigma und y- sigma sowie die Höhe bestimmt und als Spotinformation abgespeichert.


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Der beschriebene Vorgang vermag einen großen Anteil der Proteinspots automatisch zu erkennen. Trotzdem ist eine manuelle Nacharbeitung obligat. Artefakte auf dem Gel, nicht vollständig entfernte horizontale und vertikale Streifen, sehr dicht beieinander liegende oder sehr große Spots werden häufig nicht richtig eingeordnet bzw. nicht erkannt. Der manuelle Überarbeitungsprozess ist identisch mit dem Punkt „Editing“ des nächsten Abschnitts und folgt zeitlich dem Erstellen eines Matchsets.

2.2.2.3. Matching & Editing

Jetzt werden die drei verschiedenen Läufe einer Zellinie in einer Vergleichsreihe, dem sog. Matchset, zusammengefasst. Dabei wird ein virtuelles Standardgel erstellt, das die Informationen aller drei Gele in sich vereinigt.

Zuerst wird von einem der drei Gel-Abbilder eine Kopie erstellt, die im weiteren Verlauf alle Informationen der drei Gele in sich speichern wird. Dabei liegt dieser Standard nicht mehr als Gel-Abbild vor, sondern besteht aus einem sog. Gel-Spot File, was bedeutet, dass jeder als solcher erkannte Spot seiner O.D. entsprechend dargestellt wird. Im Gegensatz dazu sind in einem Gel-Abbild, das ja nur der modifizierte Scan ist, auch nicht markierte Spots sichtbar. Bei den anderen Mitgliedern des Matchsets besteht die Möglichkeit, zwischen Gel Abbild und Gel Spot File hin und her zu springen.

Das neue Matchset in seiner unmodifizierten Form besteht jetzt aus vier Bildern: einem Standard in Gel-Spot-Format, der noch identisch mit einem der Mitglieder des Matchsets ist und den drei Mitgliedern. Jetzt schließt sich der Überarbeitungsschritt an, in dem die bei der automatischen Spot-Detektion entstandenen Fehler manuell korrigiert werden. Dieser Editierungsvorgang ist nur auf Gel-Abbild-Basis möglich. Es empfiehlt sich, besonders beim Mitglied, das als Standard fungierte, Sorgfalt walten zu lassen, da der Standard in späteren Phasen als Referenz dient und dann nicht mehr modifizierbar ist.

Als nächster Schritt folgt nun das eigentliche Abstimmen der Gele: Dazu wählt man besonders charakteristische Spots aus, die man sowohl auf dem Standard als auch den anderen Mitgliedern mit Hilfe eines Symbols markiert. Diese Orientierungspunkte dienen dazu, weitere unmarkierte Spots in der Nähe zur Deckung zu bringen. Ca. drei Orientierungspunkte sollten in allen vier Quadranten des Gels gesetzt werden. Falls man auf einem Gel noch auffällige Spots entdeckt (erkennbar an einer Farbkodierung: grün = automatisch erkannt, rot = nicht erkannt), die trotz Vorhandensein in allen Mitgliedern auf diesem nicht erkannt worden sind, kann man sie manuell anpassen. Spots, die nur in einem oder mehreren Mitgliedern, nicht jedoch im Standard vorhanden sind, werden manuell in diesen projiziert.


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Den erkannten Spots werden automatisch übereinstimmende Nummern zugewiesen.

Das Resultat dieser Prozedur ist ein untergeordnetes Matchset, dessen Standard die Informationen aller drei Gele enthält. Um jetzt zwei verschiedene Zellinien miteinander vergleichen zu können, müssen die Spot-Quantitäten normalisiert werden und aus den Standards beider Linien ein höherrangiges Matchset erstellt werden. Normalisierung bedeutet, dass die rohe Quantität eines einzelnen Spots durch den totalen Intensitäts-Wert aller in dem Gel enthaltenen Pixels dividiert wird. Dazu wird die folgende Formel angewandt:

Normalisierte Spot-Quantität = rohe Spot-Quantität x Skalierungsfaktor x Kompensationsfaktor des Pipettierfehlers / Normalisierungsfaktor

Der resultierende Wert wird in parts per million (PPM) angegeben.

Das übergeordnete Matchset, das jetzt erstellt werden kann, dient dem Vergleich einer Ausgangszellinie mit ihrer thermoresistenten Variante. Dabei kann es sich bei der Ausgangszellinie um die Parentallinie oder eine chemoresistente Variante davon handeln. Von den zwei Standards des untergeordneten Matchsets wird der Standard der Ausgangszellinie als übergeordneter Standard ausgewählt, und der Anpassungsprozeß der Gele mit Setzen von Orientierungspunkten und automatischem und manuellem Spoterkennen wie oben beschrieben durchgeführt.

Für die Kontrolle der Qualität von 2D-Elektrophorese und dem Match-Vorgang stehen mehrere Hilfsmittel zur Verfügung:

  1. Nach Normalisierung und Match-Vorgang bietet PDQuest die Möglichkeit, die Quantitäten eines Gels (Abszisse) gegen die eines anderen Gels (Ordinate) aufzutragen und den Korrelationskoeffizienten zu berechnen.
  2. Desweiteren existieren mehrere Menüs, die es ermöglichen, nicht markierte oder nur partiell zugeordnete Spots sowie Spots, deren Quantität um einen signifikanten Faktor in einem Mitgliedsgel abweicht, herauszufiltern.
  3. 2D-Gele sind nie völlig deckungsgleich. Abweichungen ergeben sich aus Inhomogenitäten während des Gießvorgangs in der ersten oder zweiten Dimension, in unter­schiedlicher Länge der ersten Dimension durch Ziehen der Rundgele, minimalen Laufzeitvariationen oder Störungen in der Elektrophorese und schließlich durch divergierende Wahl des Ausschnitts beim Scan-Prozeß. Um beim Spotanpassungs-
    vorgang zwischen den Gelen entstandene Fehlzuordnungen aufgrund der individuellen [Seite 30↓]Beschaffenheiten der einzelnen Gele zu erkennen, bietet PDQuest die Darstellung sog. Offsets an (Beispiel in Abbildung 2.1.). Bei diesen Regelabweichungslinien wird Richtung und Größe der Abweichung des Vektors, der vom Spot-Zentrum in einem Mitgliedsgel ausgeht, zu dem äquivalenten Spot-Zentrum im Standard, der als relativer Fixpunkt dient, ins Verhältnis gesetzt.

Abbildung 2.1:
Offsets als Hilfe zur Erkennung falsch zugeordneter Spots

Eine Überkreuzung der Abweichungsvektoren, wie hier bei den mit a und e gekennzeichenten Spots, deutet auf eine Fehlzuordnung hin (modifiziert nach PDQuest Users Guide)

Die Abweichungsvektoren sind normalerweise immer parallel angeordnet, gleich lang und regional ähnlich zahlreich; wenn sie sich lokal überkreuzen, deutet dies auf einen Fehler in der Spotzuordnung hin, sind sie in einer Region spärlich, zeigt dies eine nicht ausreichend zugeordnete Umgebung an.

2.2.2.4. Datenanalyse

PDQuest bietet eine Vielzahl von analytischen Werkzeugen an, mit deren Hilfe man Gruppen von Proteinspots zusammenstellen kann, um dann zu determinieren, welche davon statistisch und wissenschaftlich bedeutungsvoll sein könnten.

Da es praktisch unmöglich ist, die gesamte Datenmenge der Experimente auf einmal zu untersuchen, stellt das Programm Methoden zur Verfügung, um die Informationen auf kleinere, überschaubare Teile zu reduzieren. Das geschieht, indem man sog. Analysis Sets kreiert. Alle Spots in einer solchen Analysenreihe erfüllen qualitative, quantitative oder statistische Kriterien, die man selbst spezifiziert.

  1. Qualitative Analysis Set: Selektive Darstellung von On/Off-Phänomenen; dieses Set enthält Spots, deren Quantität „x-mal“ über dem Minimum-Level der Detektion in einem Gel liegt, aber unter diesem in einem anderen Gel.[Seite 31↓]
  2. Quantitative Analysis Set: Schließt Spots ein, deren Quantität in einem Gel(typ) um den Faktor „x“ (benutzerdefinierter Wert) in Relation zu denselben Spots in einem anderen Gel(typ) gestiegen oder gesunken ist (in dieser Arbeit verwendetes Set).
  3. Arbitrary Analysis Set: Dieses beginnt als „leeres“ Set; man wählt die gewünschten Proteine selbst aus.
  4. Boolean Analysis Set: Kombination aus zwei vorher definierten Analysis Sets, z.B. können unter 1.) und 2.) erstellte Sets mit diesem Menü verknüpft werden. Dabei kann z.B. die selektive Darstellung der Schnittmenge der beiden Sets, d.h. der Proteine, die in beiden Analysis Sets präsent sind im Vordergrund stehen oder auch die Vereinigung beider Sets.
  5. Statistical Analysis Set: Beinhaltet Spots, die je nach dem ausgewählten statistischen Test als signifikant erkannt worden sind. Bei diesem Set müssen Gruppen von Gelen eingeschlossen werden. Um die Relevanz einer Quantitätsänderung in einer Gruppe beurteilen zu können, stehen Student´s T Test, Log Student´s T Test (benötigen mindestens 2 Gele pro Gruppe) bzw. der Mann-Whitney Test (mindestens vier Gele pro Gruppe) zur Verfügung.

2.2.3. Sequenzierung der differentiell exprimierten Proteine

Die aus den präparativen Läufen der zweidimensionalen Elektrophorese gewonnenen Spots wurden mit Trypsin verdaut und anschließend mit massenspektrometrischen Methoden identifiziert. Dies wurde freundlicherweise in der Arbeitsgruppe von Frau Dr. Martina Schnölzer (Zentrale Proteinanalytik, DKFZ, Heidelberg) unter Verwendung von „Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation-Time of Flight“ (MALDI-TOF)-Massenspektrometrie und „Post source decay“ (PSD)-Analyse durchgeführt. Die angewendeten Prozeduren sind bei Sinha et al. beschrieben (Sinha et al., 2001). Für allgemeine Informationen über MALDI-Analyse siehe Hillenkamp und Karas (Hillenkamp und Karas, 1990). Details bzgl. peptide mass fingerprint können bei Jensen et al. bzw. Mortz et al. nachgelesen werden (Jensen et al., 1999;Mortz et al., 1994). Eine Übersicht der PSD-Analyse gibt Spengler et al. (Spengler et al., 1992).


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2.2.4.  Schematische Darstellung der verwendeten Methode

Abbildung 2.2:
Schema der einzelnen Schritte der in dieser Arbeit angewendeten Methode anhand eines analytischen Laufes:

A: Rundgel für die 1. Dimension in einer Glaskapillare gegossen
B: Präfokussierung der Gele (bei 200V für 23cm-Gele und schrittweise Erhöhung auf 400V für 12.5cm-Gele) zur Ausrichtung des pH-Gradienten durch die Carrier-Ampholyte im Gel
C: Probenauftragung und 1. Dimension, in der die Proteine nach ihrem isoelektrischen Punkt aufgetrennt werden
D: Übertragung der Rundgele auf die Flachgele der 2. Dimension und SDS-Elektrophorese der 2. Dimension, in der die Proteine nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt werden
E: Silberfärbung und damit Detektion der Proteinspots in den Gelen
F: Einscannen und elektronische Auswertung der Gele unter Verwendung der PDQuest-Software von Bio-Rad
Davon abweichend ist beim präparativen Lauf (nicht dargestellt) die aufzutragende Probenmenge, die Färbung (mit Maldi-TOF kompatible Silberfärbung oder Coomassiefärbung) und die statt der Auswertung erfolgende Exzision von Gelspots und nachfolgende massenspektrometrische Identifizierung der enthaltenen Proteine


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09.02.2007