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3.  Ergebnisse

3.1.  Entwicklung einer mit MALDI-Massenspektrometrie kompatiblen Silberfärbung

Die Prozedur der neu entwickelten Silberfärbung ist unter 2.2.1.8. beschrieben. Diese eignet sich insbesondere für die Färbung großer Gele (25cm x 20cm), wie sie beim ISO-DALT System von Hoefer verwendet werden. Der Färbevorgang erfolgt in einem speziell dafür konstruierten Apparat, der den Kontakt mit den Gelen auf ein Minimum reduziert. Abbildung 3.1. zeigt den Aufbau dieser Färbekammer: die Gele werden auf Plexiglas-Gittern platziert [b)], welche wie Schubladen in Führungsschienen des Innengestells [a)] eingesetzt werden. Plexiglas-Klemmen an beiden Seiten verhindern, dass die Gele während der Färbung herausrutschen. Das Innengestell wird in eine äußere Kammer eingesetzt, die mit einem Auslass (Passage von ca. 8 Litern pro Minute) zum Ablassen der Lösungen versehen ist. In der Färbekammer können 10 Gele simultan gefärbt werden. Die Färbekammer wird mit einem elektrisch betriebenen Schüttelmechanismus verbunden [c)], dessen Drehgeschwindigkeit variabel ist, um ausreichende Fixierung bzw. Austausch von Substanzen von der Lösung in die Gelphase zu gewährleisten.

Abbildung 3.1:
Aufbau der Färbekammer (Fotografien);

a) Plexiglas-Innengestell mit eingesetzten Gittern
b) Beispiel eines Plexiglas-Gitters
c) Gesamtansicht des Färbeapparats mit Außen- und Innenkammer links und elektrischem Schüttelapparat rechts

Ein Gel, dessen Proteinmuster unter Zuhilfenahme dieses Apparates mit der Spezial-Silberfärbung sichtbar gemacht wurde, ist in Abbildung 3.2. dargestellt. Hierbei handelt es sich um eine 2-D Analyse der Proteinfraktion der Magenkarzinomlinie EPG85-257-P-TR. Die aufgetragene Menge betrug 100µg, die erste Dimension wurde in 23cm langen Rundgelen (Konzept A) durchgeführt. Vier zufällig ausgewählte Proteinspots wurden aus dem [Seite 34↓]Gel ausgestanzt und nach Entfärbung (siehe 2.2.1.8.) in Trypsin verdaut. Mit Hilfe der anschließend durchgeführte Maldi-TOF-Massenspektrometrie konnten daraus FK506 binding protein 4 (FKBP4), Cytokeratin 19, Prohibitin und eine Isoform des Heat shock protein 27 identifiziert werden. Die Sequenz-Übereinstimmung der verschiedenen Proteine variierte zwischen 12% für FKBP4 und 41% für Cytokeratin 19. In jedem Fall konnten die Proteine eindeutig identifiziert werden. Zur Bestätigung wurden dieselben Proteinspots aus Coomassie-gefärbten Gelen mit höherer Proteinbeladung (1mg) ausgeschnitten und der Massenspektrometrie zugeführt. Die Fingerabdrücke der Peptidmassen zeigten sich identisch mit den Resultaten aus der Silberfärbung. Die beschriebene Silberfärbung, der Färbeapparat und die damit gewonnenen Ergebnisse sind bei Sinha et al. (Sinha et al., 2001) beschrieben.

Abbildung 3.2:
Spotmuster eines mit der Spezial-Silberfärbung angefärbten Gels (EPG85-257-P-TR, 100mg Gesamtprotein) und vier mit Maldi-TOF identifizierte Proteine

(grün markiert: HSP27, schwarz markiert: Prohibitin, rot markiert: Cytokeratin 19, blau markiert: FK506 binding protein 4)


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3.2.  Proteom-Analyse der chemo- und thermoresistenten Magen- und Pankreaskarzinomzellinien

3.2.1. Übersicht

Die Gel-Abbilder der Magenkarzinomlinie EPG85-257 und der Pankreaskarzinomlinie EPP85-181 enthielten nach automatischer Spot-Detektion und manueller Nachbearbeitung jeweils ca. 1500 Spots. Unter Zuhilfenahme der im Internet verfügbaren Datenbank http://proteomics.cancer.dk bzw. durch Ausschneiden von Gelspots und Proteinidentifizierung mittels Maldi-TOF und Microsequenzierung war es möglich, 140 Spots ihren zugehörigen Proteinen zuzuordnen. In den meisten Fällen entspricht ein Gelspot einem einzelnen Protein, in einigen wenigen Fällen (ca. 5%) befindet sich im Bereich eines Spots ein Gemisch aus zwei oder mehr Proteinen, die sich in dem untersuchten relativ weiten pH-Gradienten an einer Stelle konzentrieren.

Abbildung 3.3. zeigt ein repräsentatives Elektropherogramm, in dem alle bisher identifizierten Proteine markiert sind. Es handelt sich dabei um ein Übersichtsbild, dem ein eingescanntes Gel der Parentallinie EPG85-257-P zugrundeliegt. Dieses ist ein Produkt aus einem 12,5 cm IEF-Gel in der ersten Dimension, das unter vergleichbaren Bedingungen wie die Gele der oben genannten Keratinozyten-Datenbank nach Konzept B hergestellt wurde und somit bestmöglichen Datenbankvergleich erlaubte.

Mit schwarzen Pfeilen markierte Spots sind identifiziert, aber nicht verändert in den chemo- bzw. thermoresistenten Varianten, während rote Pfeile auf differentiell exprimierte Proteine hinweisen, die in den thermoresistenten Varianten signifikant herauf- oder herunterreguliert wurden. Als signifikante Veränderung wurde eine Erhöhung bzw. Erniedrigung der optischen Dichte um das Vierfache definiert. In diesen Bereich fallen nicht relevante Veränderungen, die auf Färbeunterschieden der einzelnen Gele beruhen, mit hoher Wahrscheinlichkeit nicht (Sinha, persönliche Mitteilung). Die Relevanz dieser Fehlerquelle wird durch den oben beschriebenen Vorgang der Normalisierung bei der rechnerisch gestützten Auswertung zusätzlich vermindert.

Die entsprechenden Namen der Proteine sind in Tabelle 3.1. alphabetisch aufgelistet, auch hier sind die veränderten Spots farblich und kursiv hervorgehoben.


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Abbildung 3.3:
Zweidimensionales Muster der parentalen Magenkarzinomzellinie EPG85-257-P (Bild eines Gelscans) als repräsentatives Elektropherogramm

die bis jetzt identifizierten Proteine sind mit nummerierten Pfeilen versehen, von denen die schwarzen nicht veränderte Proteine anzeigen, die roten dagegen die in den Magenkarzinomlinien differentiell exprimierten Proteine


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Tabelle 3.1: Liste der identifizierten Proteine in der Magenkarzinomlinie EPG85-257-P und ihren fünf Varianten

 

Legende: rot und kursiv-unterstrichen sind die differentiell exprimierten Proteine in diesen Linien (Spotlokalisation kann in der Abbildung 3.2.1. eingesehen werden)

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Für jede der drei Ausgangslinien, d.h. die Parentallinien EPG85-257-P bzw. EPP85-181-P und deren gegen Mitoxantron und Daunorubicin chemoresistente Varianten, wurde ein Matchset kreiert, in dem der Ausgangslinie ihre thermoresistente Variante gegenübergestellt wurde.

Um Variationen innerhalb der einzelnen Zellinien erkennen und aussortieren zu können, wurden jeweils drei Gele aus drei verschiedenen Proben der gleichen Linie, deren Zellen unter identischen Bedingungen in unterschiedlichen Zellkulturen gewachsen waren, zu einem untergeordneten Matchset zusammengefasst. Das jeweilige Standardgel dieser sechs untergeordneten Matchsets vereinigte dann die Informationen aller drei Gele in sich, so dass sich eine vergleichbare Grundlage für die Gegenüberstellung von verschiedenen Zellinien ergab.

Von diesen Standards wurden anschließend Ausgangslinie und thermoresistente Variante zu einem übergeordneten Matchset vereinigt, das in zwei Gel-Bildern die Information von zwei mal drei Zellinien enthielt.


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3.2.2.  Magenkarzinomzellinie EPG85-257

3.2.2.1.  Vergleich der Parentallinie EPG85-257-P versus thermoresistente Variante EPG85-257-P-TR

Die Analyse des übergeordneten Matchsets der Parentallinie EPG85-257-P und ihrer thermoresistenten Variante EPG85-257-P-TR ergab nach den oben beschriebenen Kriterien relevante Unterschiede bei 19 identifizierten Proteinen. Davon waren 11 Proteine bei der thermoresistenten Variante EPG85-257-P-TR überexprimiert, nämlich Stratifin (14-3-3 σ), BIP (Grp 78), Calreticulin, Cytokeratin 7, Cytokeratin 8, Cytokeratin 19, Cytokeratin 19 Variante, Heat Shock Protein 27 (HSP27), Heat Shock Protein 27 Variante, HSX70 Variante und Reticulocalbin 1. Das Ausmaß der Überexpression wird anhand von Histogrammen im Anhang I, Abschnitt 1averdeutlicht.

Die restlichen acht Proteine zeigten sich differentiell unterexprimiert, und zwar 14-3-3 η, Aldehyd-Dehydrogenase 1, Annexin 1 und seine Variante, Initiation Factor 5A und eine Variante, Vimentin sowie ein niedermolekulares Reticulocalbin, eventuell ein Fragment des hochmolekularen. Das Ausmaß der Unterexpression wird im Anhang I, Abschnitt 1b anhand von Histogrammen verdeutlicht.

Abbildung 3.4. zeigt ein Übersichtsbild, das Gel-Scans der beiden Linien nebeneinander darstellt mit Ausschnittsvergrößerungen im Gelspot-Format der Regionen, in der die veränderten Proteine liegen.


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Abbildung 3.4:
Vergleich der Spotmuster der parentalen Magenkarzinomlinie EPG85-257-P und ihrer thermoresistenten Variante EPG85-257-P-TR (repräsentative Gelscans wurden als Grundlage der Übersichtsbilder benutzt)

Detailansichten der Regionen mit veränderten Proteinen sind im Gelspot-Format (d.h. nach Digitalisierung und Auswertung in Matchsets) rings um die Übersichtsbilder angeordnet; die differentiell exprimierten Proteinspots sind in der Linie, in der sie höher exprimiert sind, markiert und benannt.


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3.2.2.2.  Vergleich der mitoxantronresistenten Linie EPG85-257-RNOV versus thermoresistente Variante EPG85-257-RNOV-TR

Abbildung 3.5. zeigt die Evaluation der atypisch chemoresistenten Karzinomzellinie EPG85-257-RNOV und ihrer thermoresistenten Variante EPG85-257-RNOV-TR. Neunzehn Proteine waren differentiell exprimiert, davon elf überexprimiert in der thermoresistenten Zellkultur und acht herunterreguliert.

Im Einzelnen handelt es sich bei den hochregulierten Spots um die beiden calciumabhängigen Chaperone Calnexin und Calreticulin, wobei letzteres auch in der thermoresistenten Parentallinie EPG85-257-P-TR überexprimiert ist, um ein Homologes des Cancer Oncogene, um Cyclin D2, Cytokeratin 19 und seine Variante (ebenfalls bei EPG85-257-P-TR überexprimiert), um FK506-binding Protein 4 und seine Variante, Glutathion-Transferase M3, HSP 90 und Nucleophosmin. Das Ausmaß der Überexpression wird in Anhang I, Abschnitt 2a anhand von Histogrammen verdeutlicht.

Dagegen herunterreguliert zeigen sich eine 14-3-3-Form (14-3-3 related), das in der thermoresistenten Parentallinie hochregulierte BIP (grp 78), die G-Protein-Unterformen G-beta 1 und 2 (β1- bzw. β2-subunit of G-proteins), Prohibitin, eine homologe Form des GDP dissociation inhibitor Rho GDI, ein Gemisch aus Transgelin 2 und Neuropolypeptide h3 sowie das Translationally Controlled Human Tumour Protein (TCTP). Für das Ausmaß der Unterexpression siehe Histogramme in Anhang I, Abschnitt 2b.

In Abbildung 3.5. ist das Übersichtsbild mit den Veränderungen der mitoxantronresistenten Zellinie EPG85-257-RNOV und ihrer thermoresistenten Variante EPG85-257-RNOV-TR zu erkennen; Ausschnittsvergrößerungen im Gelspot-Format sind um die vollständigen Scans herumgruppiert.


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Abbildung 3.5:
Vergleich der Spotmuster der mitoxantronresistenten Magenkarzinomlinie EPG85-257-RNOV und ihrer thermoresistenten Variante EPG85-257-RNOV-TR (repräsentative Gelscans wurden als Grundlage der Übersichtsbilder benutzt)

Detailansichten der Regionen mit veränderten Proteinen sind im Gelspot-Format (d.h. nach Digitalisierung und Auswertung in Matchsets) rings um die Übersichtsbilder angeordnet; die differentiell exprimierten Proteinspots sind in der Linie, in der sie höher exprimiert sind, markiert und benannt.


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3.2.2.3.  Vergleich der daunorubicinresistenten Linie EPG85-257-RDB versus thermoresistente Variante EPG85-257-RDB-TR

Im Fall der Magenkarzinomlinie, die das typische MDR-Phänomen aufweist, nämlich der Linie EPG85-257-RDB und ihrer thermoresistenten Variante EPG85-257-RDB-TR, fanden sich elf Proteine signifikant verändert. In der Variante, die thermischem Stress ausgesetzt worden war, zeigten sich neun Proteine überexprimiert, aber nur zwei herunterreguliert im Vergleich zu der allein chemoresistenten Ausgangslinie. Von den hochregulierten Spots waren einige auch bei der thermoresistenten atypischen MDR-Linie EPG85-257-RNOV-TR differentiell überexprimiert gefunden worden: ein Homologes des Cancer Oncogene, Cyclin D2, Cytokeratin 19, FK506-binding protein 4, Glutathion-Transferase M3 und das Nucleophosmin. Dazu kamen eine Variante des Cyclin D2, die schon in der thermoresistenten Parentallinie EPG85-257-P -TR aufgefallene Variante von HSX70 und die Thioredoxin Peroxidase. Das Ausmaß der Überexpression kann in Anhang I, Abschnitt 3a anhand von Histogrammen eingesehen werden.

Die beiden unterexprimierten Proteine Prohibitin und eine verwandte Form des 14-3-3-Proteins (14-3-3 related) waren ebenfalls wie bei der thermoresistenten mitoxantronresistenten Linie herunterreguliert. Die Histogramme in Anhang I, Abschnitt 3b zeigen das Ausmaß der Unterexpression.

Abbildung 3.6. stellt die daunorubicinresistente Karzinomlinie EPG85-257-RDB ihrer thermoresistenten Variante EPG85-257-RDB-TR gegenüber, wobei auch hier veränderte Regionen markiert und als Gelspot-Ausschnitte vergrößert und beschriftet sind.


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Abbildung 3.6:
Vergleich der Spotmuster der daunorubicinresistenten Magenkarzinomlinie EPG85-257-RDB und ihrer thermoresistenten Variante EPG85-257-RDB-TR (repräsentative Gelscans wurden als Grundlage der Übersichtsbilder benutzt)

Detailansichten der Regionen mit veränderten Proteinen sind im Gelspot-Format (d.h. nach Digitalisierung und Auswertung in Matchsets) rings um die Übersichtsbilder angeordnet; die differentiell exprimierten Proteinspots sind in der Linie, in der sie höher exprimiert sind, markiert und benannt


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3.2.3.  Pankreaskarzinomzellinie EPP85-181

3.2.3.1.  Vergleich der Parentallinie EPP85-181-P versus thermoresistente Variante EPP85-181-P-TR

Abbildung 3.7. zeigt die Evaluation der parentalen Karzinomzellinie EPP85-181-P und ihrer thermoresistenten Variante EPP85-181-P-TR. 22 Proteine waren differentiell exprimiert, davon siebzehn signifikant überexprimiert in der thermoresistenten Zellkultur und fünf herunterreguliert.

Die hochregulierten Spots wurden als 14-3-3 h, Aldehyd-Dehydrogenase 1, Annexin 1 und Variante, ein Homologes des Cancer Oncogene, Glutathion-Transferase M3, ein HSP70 related Protein KDA Protein 4, hnRNP K, Nucleophosmin, Phosphoglyceromutase, Thioredoxin Peroxidase, Calreticulin, das niedermolekulare Reticulocalbin, Enoyl Coenzym A-Hydratase (short chain, 1, mitochondrial), zwei gamma-Actin-Formen und Creatinkinase (B Kette) identifiziert. Das Ausmaß der Überexpression wird in Anhang II, Abschnitt 1a anhand von Histogrammen verdeutlicht.

Herunterreguliert zeigten sich 14-3-3 σ (Stratifin) und verschiedene Cytokeratine (CK7, CK8, Ck19 und CK19 Variante). Zum Einschätzen des Ausmaßes der Unterexpression siehe Histogramme in Anhang II, Abschnitt 1b.

Im Übersichtsbild von Abbildung 3.7. sind die Gel-Scans der beiden Linien nebeneinander erkennbar mit Ausschnittsvergrößerungen im Gelspot-Format der Regionen, in der die veränderten Proteine liegen.


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Abbildung 3.7: Vergleich der Spotmuster der parentalen Pankreaskarzinomlinie EPP85-181-P und ihrer thermoresistenten Variante EPP85-181-P-TR (repräsentative Gelscans wurden als Grundlage der Übersichtsbilder benutzt)

Detailansichten der Regionen mit veränderten Proteinen sind im Gelspot-Format (d.h. nach Digitalisierung und Auswertung in Matchsets) rings um die Übersichtsbilder angeordnet; die differentiell exprimierten Proteinspots sind in der Linie, in der sie höher exprimiert sind, markiert und benannt.


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3.2.3.2.  Vergleich der mitoxantronresistenten Linie EPP85-181-RNOV versus thermoresistente Variante EPP85-181-RNOV-TR

Die Analyse des übergeordneten Matchsets der mitoxantronresistenten Linie EPP85-181-RNOV und ihrer thermoresistenten Variante EPP85-181-RNOV-TR ergab nach den oben beschriebenen Kriterien relevante Unterschiede bei 25 identifizierten Proteinen. Davon zeigten sich 19 Proteine überexprimiert bei der thermoresistenten Variante EPP85-181-RNOV-TR: zwei 14-3-3 Proteine (14-3-3 ζ und 14-3-3 h), Annexin 1 und seine Variante, ein Heat shock related Protein KDA Protein 4, drei weitere Hitzeschockproteine (HSP90, HSP110 und eine Variante von HSP110), zwei Enzyme des Glutathion-Stoffwechsels (Glutathion-Transferase M3 und Glyoxalase 1), das niedermolekulare Reticulocalbin, ein Valosin containing protein NP009057, eine Isoform des g-Actin, Creatinkinase (B Kette), Mitofilin, zwei Isoformen des T-Plastin und zwei Proteasom-Unterformen (Proteasome 26S subunit und Proteasome subunit, beta type, 7). Für das Ausmaß der Überexpression siehe Histogramme in Anhang II, Abschnitt 2a.

Die restlichen sechs Proteine zeigten sich differentiell unterexprimiert, und zwar auch hier die Cytokeratine CK7, CK8, CK19 und CK19 Variante sowie HSP27 (auch hier wie in der gleichnamigen Magen-CA-Linie nur ganz wenig exprimiert) und Prohibitin. Das Ausmaß der Unterexpression wird in Anhang II, Abschnitt 2b anhand von Histogrammen verdeutlicht.

Abbildung 3.8. zeigt ein Übersichtsbild, das Gel-Scans der beiden Linien nebeneinander darstellt mit Ausschnittsvergrößerungen im Gelspot-Format der Regionen, in der die veränderten Proteine liegen.


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Abbildung 3.8:
Vergleich der Spotmuster der mitoxantronresistenten Pankreaskarzinomlinie EPP85-181-RNOV und ihrer thermoresistenten Variante EPP85-181-RNOV-TR (repräsentative Gelscans wurden als Grundlage der Übersichtsbilder benutzt)

Detailansichten der Regionen mit veränderten Proteinen sind im Gelspot-Format (d.h. nach Digitalisierung und Auswertung in Matchsets) rings um die Übersichtsbilder angeordnet; die differentiell exprimierten Proteinspots sind in der Linie, in der sie höher exprimiert sind, markiert und benannt.


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3.2.3.3.  Vergleich der daunorubicinresistenten Linie EPP85-181-RDB versus thermoresistente Variante EPP85-181-RDB-TR

Im Fall der Pankreaskarzinomlinie mit typischem MDR-Phänomen (EPP85-181-RDB) und ihrer thermoresistenten Variante EPP85-181-RDB-TR fanden sich zahlenmäßig nur wenige Spots signifikant verändert. Im Vergleich zu der allein chemoresistenten Ausgangslinie zeigte sich bei der thermoresistenten Variante eine differentielle Überexpression bei vier Proteinen, davon am deutlichsten bei den beiden Isoformen von HSP27, darüber hinaus auch bei der HSX70 Variante und einem proteasomalen Protein. Das Ausmaß der Überexpression wird in Anhang II, Abschnitt 3a anhand von Histogrammen verdeutlicht.

Herunterreguliert waren lediglich zwei Proteine, eines davon ließ sich ausschneiden und ergab Peroxiredoxin 3, das zweite war bei präparativen Läufen nicht wiederzufinden und konnte daher der Maldi-Analyse nicht zugeführt werden. Das Ausmaß der Unterexpression kann in Anhang II, Abschnitt 3b anhand von Histogrammen abgeschätzt werden.

Abbildung 3.9. stellt die daunorubicinresistente Karzinomlinie EPP85-181-RDB ihrer thermoresistenten Variante EPP85-181-RDB-TR gegenüber, wobei auch hier veränderte Regionen markiert und als Gelspot-Ausschnitte vergrößert und beschriftet sind.


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Abbildung 3.9:
Vergleich der Spotmuster der daunorubicinresistenten Pankreaskarzinomlinie EPP85-181-RDB und ihrer thermoresistenten Variante EPP85-181-RDB-TR (repräsentative Gelscans wurden als Grundlage der Übersichtsbilder benutzt)

Detailansichten der Regionen mit veränderten Proteinen sind im Gelspot-Format (d.h. nach Digitalisierung und Auswertung in Matchsets) rings um die Übersichtsbilder angeordnet; die differentiell exprimierten Proteinspots sind in der Linie, in der sie höher exprimiert sind, markiert und benannt.


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3.2.4.  Zusammenstellung von mehrfach vorkommenden differentiell exprimierten Proteinen

Ein Teil der oben beschriebenen Proteine zeigt sich bei beiden Karzinomlinien differentiell exprimiert, wobei sowohl gleichgerichtete Veränderungen als auch Gegensätze in den chemo- und thermoresistenten Varianten auftreten. Andere Proteine fallen dadurch auf, dass sie in mehreren thermoresistenten Varianten bei dem gleichen Tumortyp deutlich hoch- oder herunterreguliert sind. Expressionsmuster von einigen dieser Proteine sollen hier beispielhaft anhand von Diagrammen, die alle sechs Linien eines Karzinomtyps beinhalten, aufgezeigt werden.


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09.02.2007