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4.  Diskussion

4.1.  Proteom-Analyse

4.1.1. Stellung in der biomedizinischen Forschung

Durch intensive Forschung in den letzten Jahren sind inzwischen etwa 80 Genome vollständig entschlüsselt, einschließlich des menschlichen Genoms.

Nach Abschluss dieses Genomprojekts ist es daher sinnvoll, die Proteine einer Zelle als dynamische Marker der Genexpression in ihrer Gesamtheit zu analysieren.

Proteomics als Untersuchungsmethode für quantitative Veränderungen des Expressionsniveaus von Proteinen hat sich in den letzten Jahren einen festen Platz in der biomedizinischen Forschung erobert. Durch rapide Weiterentwicklung der verwendeten Technologien konnten die ursprünglich komplizierten und von individuellen Faktoren abhängigen Methoden einer breiten Anwenderschaft zugänglich gemacht werden.

4.1.2. Möglichkeiten und Grenzen der zweidimensionalen Elektrophorese

Im Zentrum der Proteom-Analyse stehen die hochauflösende 2D-Elektrophorese mit ihrer Fähigkeit, komplexe Proteingemische aufzutrennen sowie die Massenspektrometrie zur Identifizierung und Strukturanalyse von einzelnen relevanten Proteinen.

Die 2D-Elektrophorese bietet gegenüber anderen Analyseverfahren einige entscheidende Vorteile (Westermeier, 2000):

Idealerweise sollten alle von der Zelle exprimierten Proteine im 2D-Gel enthalten und sichtbar gemacht sein. Diesem Anliegen werden aber Grenzen gesetzt durch Verlust von Proteinen bei Probenvorbereitung und 2-D-Prozedur. Zusätzlich sind sehr basische Proteine trotz verbesserter Methodik immer noch schwer durch 2D-Elektrophorese darstellbar, einige hydrophobe und hochmolekulare Proteine werden im Gel nicht aufgenommen, und manche Proteine, meist regulatorische, sind in derart geringen Zahlen exprimiert, dass die [Seite 55↓]Sensitivität der Detektionsmethoden nicht ausreicht (Westermeier, 2000). Die genaue Anzahl der in 2-D-Gelen darstellbaren Proteine einer Zelle ist nicht bekannt. Entsprechend bestehen die Herausforderungen an die 2D-Technik in einer Erweiterung des pH-Gradienten in den basischen Bereich, in Erhöhung des Detektionslimit für Proteine mit niedrigen Kopiezahlen und in Verbesserung der Darstellung von hydrophoben und hochmolekularen Proteinen.

4.1.3. Diskussion von Elektrophoreseverfahren und Probenaufarbeitung

Für diese Arbeit wurde die 2D-Elektrophorese auf der Basis von konventioneller isoelektrischer Fokussierung in Kombination mit einer hochsensitiven Silberfärbung für analytische sowie einer Spezial-Silberfärbung bzw. Coomassie-Färbung für präparative Zwecke als Methode gewählt.

Die klassische IEF unter Verwendung des ISO-DALT-Systems ist relativ einfach handhabbar und jede Versuchsreihe in vergleichsweise kurzer Zeit durchführbar, da man bis zu 20 Gele simultan laufen lassen kann und das Gießen der Gele für die erste Dimension am gleichen Tag erfolgt wie der Start der Fokussierung. Die Qualität der Gele im mittleren pH-Bereich ist reproduzierbar gut unter Verwendung der käuflich erhältlichen Ampholyte. Untersuchungen bezüglich Auflösung und Reproduzierbarkeit von traditionellen 2D-Verfahren mit guten Resultaten auch im Hinblick auf unterschiedliche Chargen von Carrier-Ampholyten sind in der Literatur beschrieben (Lopez und Patton, 1997).

Unabhängig von der Wahl der 2D-Methode spielt die Probenbehandlung eine Schlüsselrolle, um gute Ergebnisse zu erzielen. Denaturierende Bedingungen bei der Probenvorbereitung mit Hilfe von hochmolarem Harnstoff (gewöhnlich 9 mol/l) bringen auch wasserunlösliche Proteine in Lösung. Außerdem sind hohe Harnstoffkonzentrationen in der Lage, Sekundär- und Tertiärstrukturen aufzubrechen und Protein-Proteininteraktionen zu vermeiden.

Die Solubilisierung der Zellpellets erfolgte unter Verwendung von 2M Thioharnstoff zur weiteren Verbesserung der Lösung von hydrophoben Proteinen (Rabilloud, 1998). Das im Lysepuffer enthaltene zwitterionische Detergenz CHAPS (3-[(3-cholamidopropyl)-dimethyalmino] -propansulfate) ist mit der Massenspektrometrie kompatibel und ist für die Lösung von hydrophoben Bindungen erforderlich. Aufgrund seines höheren Reinheitsgrades ist es nichtionischen Polyolgemischen wie Triton X-100 oder Nonidet NP-40 vorzuziehen. DTT als reduzierende Verbindung verhindert verschiedene Oxidationsschritte bei den Proteinen und ist an der Spaltung der Quartärstruktur von Proteinen beteiligt.


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4.1.4.  Diskussion von Färbemethoden, einschließlich der neu entwickelten Silberfärbung

Als Proteinnachweisverfahren für anschließende Bildanalyse wurde eine Silberfärbung nach Hochstrasser et al. (http://www.expasy.ch/ch2d/protocols/protocols.fm4.html) verwendet. Diese ist unter die ammoniakalischen Färbungen einzuordnen, die als besonders sensitive Silberfärbungen gelten, aber nicht in Kombination mit massenspektrometrischen Analysen verwendet werden können.

Die Silberfärbung ist eine extrem empfindliche Methode zur Detektion von Proteinspots in Polyacrylamidgelen. Die Sensitivität ist 100-fach höher als die der Coomassiefärbung, übersteigt auch die Sensitivität von Fluoreszenzmethoden und reicht an die Autoradiographie heran. Nachteile der Silberfärbung, wie kleine Abweichungen in der Reproduzierbarkeit durch Schwankungen in der Färbeintensität von nicht simultan gefärbten Gelen lassen sich in der Regel mit der Analysesoftware überwinden. Ein sensibles Densitometer bietet einen breiten Toleranzbereich für die Färbeintensität, und Hintergrundsubtraktion bei der Erstellung von Gel-Abbildern und entsprechende Normalisierungsschritte während der Matchvorgänge bringen die Spotintensitäten auf ein einheitliches, vergleichbares Niveau.

Die Notwendigkeit für rapide Protein-Identifizierung nach 2-D-Elektrophorese bringt die Entwicklung von neuen Färbemethoden und Verbesserung der massenspektrometrischen Methoden mit sich. Ein Durchbruch für Proteinidentifizierung mit hohem Durchsatz gelang Shevchenko et al. mit der Einführung eines Silberfärbeprotokolls, das mit MALDI-TOF Analyse kompatibel ist (Shevchenko et al., 1996). Darüber hinaus sind kürzlich zwei Techniken vorgestellt worden, die eine akkurate Identifizierung von qualitativen und quantitativen Unterschieden der Proteinexpression ermöglichen können, nämlich „Multiphoton Detection“ von Proteinen, die mit 125I und 131I markiert werden und „2-D-Fluorescence Difference Gel Electrophoresis“ (2D-DIGE). In beiden Fällen werden individuelle Proben mit einem Isotop oder einem fluoreszierenden CyTM-Farbstoff (Cy2, Cy3 oder Cy5) markiert, zusammengemischt und mittels Co-Elektrophorese in einem einzigen Gel aufgetrennt. Durch Einlesen der Gele werden Proteine mit nur einer Markierung sichtbar gemacht. Nachteil beider Methoden ist die Notwendigkeit spezieller Hardware und Software zur Auswertung (Sinha et al., 2001).

Um auch kleineren Laboren, die mit Proteomics arbeiten, eine schnelle, einfach durchführbare und für kleine Proteinmengen geeignete Färbung zu ermöglichen, die eine nachfolgende Identifizierung von Proteinspots erlaubt, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine spezielle Oberflächen-Silberfärbung entwickelt. Damit kann der massive Zeit- und [Seite 57↓]Materialaufwand, der sich aus der zweifach notwendigen Elektrophorese-Prozedur bei einem analytischen und einem präparativen Lauf ergibt, auf die Hälfte reduziert werden, da sowohl Auswertung des Spotmusters und Exzision von Proteinspots aus demselben Gel erfolgt.

Um den Färbevorgang zu automatisieren, die Reproduzierbarkeit zu steigern und den Kontakt mit den Gelen auf ein Minimum zu reduzieren, wurde eine elektrisch betriebene Färbe-Apparatur für 10 Gele konstruiert. Da die neu entwickelte Färbung wie alle Silberfärbungen problematischer in Zusammenhang mit der MALDI-Massenspektrometrie ist, weil bereits geringe Keratin-Verunreinigungen die relevanten Peptid-Peaks überdecken können (und diese wegen der geringen Proteinmenge sehr viel schwächer sind), ist der Färbeapparat eine sinnvolle Ergänzung. Im Vergleich zu präparativen Coomassie-Färbungen weist die Silberfärbung entscheidende Vorteile auf:

Die relativ geringe Sensitivität der Coomassie-Färbung bei hohen zu applizierenden Proteinmengen ist zusammen mit dem von silbergefärbten Gelen abweichenden Proteinmuster ein Hauptproblem der präparativen 2D-Elektrophorese. Dadurch kann die Menge an Information, die durch den hohen Standard bei analytischer Silberfärbung und computergesteuerter Bildanalyse gewonnen wird, praktisch nicht genutzt werden, da viele differentiell exprimierte Proteine aus den genannten Gründen nicht isolierbar und damit identifizierbar sind. Unsere Silberfärbung überwindet einen Teil dieser Probleme, und wurde für die Identifizierung einiger Proteine mit Erfolg angewendet.

Beide Färbungen wurden ergänzend angewendet, um mit möglichst wenig Aufwand die größtmögliche Anzahl an Proteinen zu identifizieren.


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4.2.  Diskussion der differentiell exprimierten Proteine

4.2.1. Zuordnung in verschiedene funktionelle Gruppen

Die Untersuchung der globalen Proteinexpression von chemo- und thermoresistenten Karzinomzelllinien erfolgte in erster Linie mit der Absicht herauszufinden, ob Mechanismen, die Chemoresistenz verursachen, simultan die Entwicklung von Thermoresistenz beeinflussen und vice versa. Interaktionen dieser Art sind in der Literatur wenig beschrieben.

Die Proteom-Analyse ergab für beide untersuchten Karzinomtypen eine Fülle von differentiell exprimierten Proteinen. Viele davon lassen sich unter funktionellen Gesichtspunkten verschiedenen Gruppen zuordnen, die sich z.T. überschneiden und von denen einzelne Mitglieder bereits bei Chemo- und/oder Thermoresistenzphänomenen beschrieben wurden. Dies gilt insbesondere für Mitglieder der Heat Shock Protein-Familie, die zu der großen übergeordneten Gruppe der molekularen Chaperone gehören (Sarto et al., 2000), in die auch die Ca2+-abhängigen Proteine Calnexin und Calreticulin (High et al., 2000), das Nucleophosmin (Okuwaki et al., 2001) sowie das Prohibitin (Nijtmans et al., 2000) und inzwischen auch Annexin I (Rhee et al., 2000) und die 14-3-3-Proteine (Vincenz und Dixit, 1996) einzuordnen sind. Wenn man die Gruppe der Calcium-bindenden Proteine betrachtet, wären dort neben Calnexin und Calreticulin das BIP und das Reticulocalbin als zugehörig zu nennen (Hebert et al., 1995;Ozawa und Muramatsu, 1993).

Andere für Chemoresistenz als relevant beschriebene funktionelle Proteingruppen betreffen den Arzneimittelmetabolismus (Glutathione Transferase M3 (Berhane et al., 1993;Egyhazi et al., 1997;Hao et al., 1994), Glyoxalase I (Di Ilio et al., 1995;Sakamoto et al., 2000), Thioredoxin Peroxidase (Chung et al., 2001), die Modulation von PKC-Aktivität (14-3-3 Familie (Fu et al., 2000), Annexin I (Dubois et al., 1996)) und das Cytoskelett (z.B. verschiedene Cytokeratine (Bichat et al., 1997), Vimentin (Hendrix et al., 1992) und das Actin-bindende Protein T-Plastin (Hisano et al., 1996)). Den Proliferationsmarkern zuzurechnen sind die G-Protein-Komponenten G-β1 und G-β2, der Rho-GDP dissociation Inhibitor und der Initiationsfaktor 5A. Eine weitere Gruppe betrifft Proteine, die als Modulatoren der Genexpression agieren; darunter fällt HSP90, das mit FKBP4, einem Immunophilin, im Komplex vorliegt und mit Steroidrezeptoren interagiert (Peattie et al., 1992;Pirkl und Buchner, 2001;Pratt und Toft, 1997).

Einzelne Proteine wie Cancer Oncogene, Aldehyde dehydrogenase 1, Creatinkinase und das G1 Cyclin D2 sind bisher nicht unter Betrachtung von Assoziation zu Chemo- oder Thermoresistenz bekannt; die Funktion des mitochondrialen Proteins Mitofilin ist noch nicht geklärt.


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4.2.2.  Gruppe der molekularen Chaperone

4.2.2.1. Heat Shock Proteine

Ein großer Teil der differentiell exprimierten Proteine gehört der Familie der Hitzeschockproteine (Heat Shock Proteine, HSPs) an.

Die Synthese bzw. Steigerung der Expression von Heat Shock Proteinen wird sowohl bei prokaryoten als auch eukaryoten Zellen durch verschiedene stressinduzierende Faktoren wie sublethalen Hitzeschock, chemische Substanzen oder physikalische Reize ausgelöst (s.u.), die Zustände induzieren, bei denen die Zahl nicht oder fehlerhaft gefalteter Proteine in der Zelle zunimmt. Aufgrund ihrer Funktion, die Erreichung des nativen, korrekt gefalteten Zustandes von Proteinen zu beschleunigen und damit zur Aggregation führende Wechselwirkungen zwischen Proteinen zu verhindern, werden die HSPs als molekulare Chaperone (engl. Chaperone: Anstandsdame) bezeichnet (Löffler, 1998).

Eine Steigerung der Synthese von Heat shock Proteinen kann z.B. durch Aminosäure- oder Glucoseanaloga, PKC-Stimulatoren, Schwermetalle, Ischämie, Natriumarsenit, mikrobiologische Infektionen, Stickoxide, Hormone, Antibiotika, Zytostatika und Malignome hervorgerufen werden.

Die durch Hitzeschock induzierbare Reaktion involviert einen Signaltransduktionsweg, der zu der Aktivierung von Transkriptionsfaktoren führt. Der vorrangige Mechanismus besteht in der Aktivierung von Heat Shock Faktoren (HSFs), die an Heat Shock Elemente (HSEs) binden, welche stromaufwärts von allen Hitzeschockgenen gelegen sind, um die Transkription zu initiieren (Fernandes et al., 1994). Von den zwei humanen HSFs wird HSF1 unter Stressbedingungen, HSF2 dagegen bei der embryonalen Entwicklung und Zelldifferenzierung aktiviert (Morimoto et al., 1994;Wu et al., 1994).

Molekulare Chaperone haben wichtige Funktionen bei der zellulären Antwort auf Stress und bei der Aufrechterhaltung des zellulären Homöostasegleichgewichts. Im Einzelnen handelt es sich um folgende verschiedenen Funktionen und Eigenschaften (Löffler, 1998):

HSPs lassen sich nach ihren elektrophoretischen Charakteristika in drei Gruppen einteilen, wobei die erste Gruppe die großen Proteine HSP60, 70, 90, 110 (alle auch ohne Hitzeschockbedingungen exprimiert), die zweite Gruppe die Glucose-regulierten Proteine GRP34, 47, 56, 76, 78, 94, 174 (induziert unter Glucose-Deprivation) und die dritte Gruppe die kleinen Heat Shock Proteine HSP27, Ubiquitin und α-Crystallin beinhaltet (Sarto et al., 2000). Eine andere Klassifikation bezieht sich auf verschiedene Chaperon-Familien (die drei Hauptfamilien): die HSP90-Familie, die HSP70-Familie, die Familie der kleinen Chaperone sowie einzelne, keiner größeren Gruppe zugeordnete Proteine, z.B. HSP60 oder HSP40.

Die meisten Mitglieder sind universell konservierte Proteine, repräsentiert durch ein Spektrum von funktionellen Homologen in allen zellulären Kompartimenten. Einige HSPs werden konstitutiv in der Zelle unter Normalbedingungen synthetisiert, andere hauptsächlich durch Stressereignisse hochreguliert.

Die Expression von induzierbaren HSPs korreliert mit einer erhöhten Resistenz gegen Apoptose, ausgelöst durch diverse zytotoxische Substanzen oder hyperthermische Behandlung, wobei eine Beteiligung an Chemoresistenzmechanismen beschrieben ist (Creagh und Cotter, 1999;Samali und Cotter, 1996). Stressproteine spielen außerdem eine Rolle bei der Karzinogenese und bei der Entwicklung von Thermotoleranz. Für den durch HSPs vermittelten Schutz vor Apoptose existieren mehrere Hypothesen, die genauen Mechanismen sind aber weiterhin klärungsbedürftig. Erleuchtung solcher Mechanismen könnte neue Ziele eröffnen, um onkologische Therapiestrategien zu verbessern.

In dieser Arbeit fanden sich Mitglieder aus allen großen HSP-Gruppen verändert: beim Magenkarzinom waren dies das HSP90, eine HSX70-Variante, die in die HSP70-Familie gehört, das BIP, ebenfalls dieser Familie zuzuordnen, und aus der Gruppe der kleinen Heat Shock Proteine das HSP27 und eine Variante davon. Die Pankreaskarzinomlinien zeigten veränderte Expression von HSP90, HSP110 samt Variante, einer HSX70-Variante, den beiden HSP27 Isoformen und einem dem HSP70 verwandten Protein. HSP90, HSP70 und HSP27 als am bisher besten untersuchte Proteine werden im Folgenden bezüglich ihrer Funktion erörtert, an Chemo- und Thermoresistenzmechanismen beteiligt zu sein.


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HSP27

Beschrieben ist eine Beteiligung an Stressresistenz, inklusive Chemoresistenz und Thermotoleranz, eine Rolle bei Wachstum, Differenzierung und Mikrofilament-Organisation und eine entscheidende Modulatorfunktion beim Schutz der Zelle vor Apoptose (Ciocca et al., 1993;Garrido et al., 1999;Guenal et al., 1997;Mehlen et al., 1996).

Eine Schlüsseleigenschaft von HSP27 ist seine schnelle Phosphorylierungsfähigkeit, die während verschiedener zellulärer Bedingungen -physiologisch bei Differenzierungsvorgängen, pathologisch bei Stressexposition- zum Tragen kommt (Sarto et al., 2000).

HSP27 scheint auf verschiedenen Wegen in die Regulation von Apoptose einzugreifen, beschrieben ist eine Inhibition des programmierten Zelltods an mehreren rezeptorvermittelten Pfaden. Dazu gehört die Induktion über den Fas-Rezeptor (CD95, APO-1), über den PKC-Inhibitor Staurosporin, über Monozyten, H2O2 und verschiedene Chemotherapeutika (Garrido et al., 1997;Jaattela und Wissing, 1993;Mehlen et al., 1996;Richards et al., 1996;Samali und Cotter, 1996). Dagegen erfolgt keine Apoptosehemmung durch HSP27, wenn die Einleitung der Apoptose durch p53, UV und Lymphokin-aktivierte Killerzellen (LAK) vermittelt wird (Guenal et al., 1997;Richards et al., 1996;Trautinger et al., 1997). Man vermutet, dass diese Regulatorrolle von HSP27 bei Apoptose über Aufrechterhaltung des Redox-Equilibriums der Zelle vonstatten geht unter essentieller Beteiligung des Antioxidants Glutathion (Arrigo, 1998). HSP27 soll die GSH-Konzentration intrazellulär erhöhen; intrazellulärer oxidativer Stress, hervorgerufen entweder durch gesteigerte Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) oder die Depletion von Antioxidantien (GSH, Catalase, Superoxiddismutase (SOD)) vermag die apoptotische Kaskade auf verschiedenen Wegen zu triggern. ROS ist ein Kollektivbegriff, der freie Radikale wie Superoxid-Anionen und Hydroxylradikale und non-Radikal-Derivate wie H2O2 einschließt. Eine erhöhte Produktion von ROS kann z.B. durch ionisierende Strahlung, Schwermetalle, Anoxie, Hyperoxie, TNFα und verschiedene Pharmaka wie Zytostatika hervorgerufen werden (Becker et al., 1991;Carney et al., 1991;Floyd, 1991;Troll, 1991). Einige Agenzien, die selbst nicht als Oxidantien wirken, generieren ROS während ihrer Apoptoseinduktion.

Eine Depletion von GSH, z.B. durch Buthionin Sulfoximin (BSO), verringert das Reduktionspotential der Zelle erheblich und verursacht dadurch intrazellulären oxidativen Stress ohne Steigerung des ROS-Level (Creagh et al., 2000).

Fas-induzierte Apoptose funktioniert unabhängig von einer Erhöhung der ROS, senkt aber die GSH-Konzentration durch nach außen gerichteten Transport als Teil des apoptotischen Mechanismus (van den Dobbelsteen et al., 1996). Daraus hat man gefolgert, dass [Seite 62↓]der durch HSP27 gesteigerte GSH-Level verantwortlich sein kann für den Schutz der Zelle vor Fas-induzierter Apoptose (Creagh et al., 2000).

Kürzlich wurde noch ein weiteres Einflussgebiet von HSP27 bei der Inhibition von Apoptose, in diesen Fall durch Etoposid induziert, demonstriert, nämlich die Inhibition der Caspasen-Kaskade auf der Ebene von Caspase 9 stromabwärts von der Cytochrom c-Freisetzung (Garrido et al., 1999).

Eine schematische Zusammenfassung der beschriebenen und vermuteten Eingriffsmöglichkeiten von HSP27 in die stressinduzierte apoptotische Kaskade zeigt Abbildung 4.1. (Arrigo, 1998).

Abbildung 4.1:
Mögliche Modulatorfunktion des kleinen Heat Shock Proteins HSP27 bei Apoptosevorgängen, schematische Darstellung (modifiziert nach Arrigo, 1998)

Bei den chemo- und thermoresistenten Magenkarzinomzellinien fand sich ein interessantes Expressionsmuster für zwei Isoformen von HSP27 (siehe Ergebnisteil 3.2.4.). Die mehr im basischen Bereich gelegene Form ist nicht phosphoryliert, während die Variante mit niedrigerem pI nach den Informationen der Keratinozyten-Datenbank eine phosphorylierte Isoform des Heat shock Proteins darstellt. Beide Formen verhalten sich in den sechs Linien ähnlich hinsichtlich ihrer Expression: bei einem geringen basalen Level der beiden Proteine in der Parentallinie kommt es zu einer starken Überexpression in der thermoresistenten Linie, während beide Isoformen in der mitoxantronresistenten Linie und ihrer thermoresistenten Variante bis auf eine sehr geringe Expression bei RNOV-TR nicht [Seite 63↓]nachweisbar sind. Die klassische, daunorubicinresistente MDR-Linie zeigt dann wieder eine deutliche Expression von beiden HSP27-Formen, und dieser Level wird in ihrer thermoresistenten Variante noch leicht gesteigert beibehalten.

In den Pankreaskarzinomzellinien weichen die Expressionsmuster von HSP27 insofern ab, als dass hier in der thermoresistenten daunorubicinresistenten Linie eine deutliche Überexpression auftritt, während beiden Isoformen in der Parentallinie und ihrer thermoresistenten Variante ähnlich exprimiert sind. In den beiden mitoxantronresistenten Linien ist der Level von HSP27 auch hier im kaum messbaren Bereich.

Die Ergebnisse deuten auf eine mögliche Beteiligung von HSP27 an der Entwicklung von dauerhaft thermoresistenten Varianten hin, zumindest bei der parentalen Zellinie der Magenkarzinomlinie und der daunorubicinresistenten Linie beim Pankreaskarzinom. Andererseits scheint das kleine Hitzeschockprotein bei der Magenkarzinomlinie bei der Entwicklung von MDR gegenüber Daunorubicin involviert zu sein. Der Zusammenhang dazu ist durchaus einleuchtend, da Daunorubicin als Topoisomerase II-Inhibitor in der Zelle unter Produktion von ROS wirkt, was wahrscheinlich eine Hauptrolle bei der Induktion von Apoptose durch diese Pharmaka spielt. Die Pankreaslinie verhält sich dagegen deutlich anders, was sich auch im Gesamtbild der veränderten Proteine zeigt. Bei allen untersuchten mitoxantronresistenten Zellinie stehen offensichtlich, obwohl es sich auch hier um ein Topo II-Zielmedikament handelt, andere Mechanismen für Chemo- und Thermoresistenz im Vordergrund.

HSP70

Auch Mitglieder der HSP70-Familie sind vermutlich an einer gesteigerten Resistenz gegenüber durch oxidativen Stress vermittelte Apoptose beteiligt. So gibt es Berichte darüber, dass HSP70 Apoptose inhibiert, wenn diese durch Ethanol, H2O2, TNF, UV und verschiedene Chemotherapeutika ausgelöst wird. Weiterhin zeigte sich, dass in Leukämiezellen, die unter dem Einfluss der ROS produzierenden zytotoxischen Substanzen Camptothecin und Actinomycin-D standen, die Behandlung mit Antioxidantien gleichermaßen zur Apoptoseinhibition führte wie eine Überexpression von HSP70 (Creagh und Cotter, 1999). Dagegen hat HSP70 keinen inhibitorischen Effekt auf die Fas-vermittelte Apoptose, die unabhängig von ROS abläuft.

Eine weitere Eigenschaft von induzierbarem HSP70 ist seine Fähigkeit, die Aktivierung von p38 Mitogen-aktivierter Kinase (MAPK), die Apoptose induziert, zu hemmen (Gabai et al., 1997). Darüber hinaus kann HSP70 mit p53 und c-Myc interagieren (Hainaut und Milner, 1992;Koskinen et al., 1991). Durch Bindung an mutiertes p53 stabilisiert das [Seite 64↓]Hitzeschockprotein die Konformation des Proteins, und beugt der proapoptotischen Funktion des Wildtyp-p53 vor. Es wurde eine Kolokalisation von HSP70 mit c-Myc in nukleären Strukturen nachgewiesen und die Fähigkeit von HSP70 beschrieben, die freien Level von c-Myc in der Zelle zu reduzieren (Jaattela et al., 1992;Koskinen et al., 1991).

Eine weitere Möglichkeit von HSP70, in Apoptosewege einzugreifen, liegt auf der Ebene der Mitochondrien. Die antiapoptotischen Mitglieder der Bcl-2-Familie hemmen Apoptose wahrscheinlich durch Blockierung der Freisetzung von Cytochrom C (Zamzami et al., 1996). Das Bcl-2-bindende Protein BAG-1 assoziiert u.a. mit der induzierbaren und der konstitutiven Form von HSP70 (Takayama et al., 1997) und verkörpert somit vielleicht ein Intermediärprotein in der Assoziation von Bcl-2 und HSP70.

Einige dieser Modulatoreigenschaften von HSP70 sind in der unten stehenden Abbildung schematisch aufgezeichnet (Creagh et al., 2000).

Abbildung 4.2:
Mögliche Modulatorfunktion von HSP70 bei Apoptosevorgängen, schematische Darstellung (modifiziert nach Creagh et al., 2000)

Ein Mitglied der großen HSP70-Familie, eine HSX70-Variante, zeigte sich in der thermoresistenten Linie und der thermoresistenten daunorubicinresistenten Variante der Linie EPG85-257 überexprimiert, während das ebenfalls in diese Gruppe zuzuordnende Protein BIP (GRP78) in der thermoresistenten Linie hochreguliert und in der thermoresistenten mitoxantronresistenten Variante herunterreguliert war, letzteres bezogen auf den Level von BIP in der atypisch chemoresistenten Linie.


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Auch in den thermoresistenten Pankreaszellen fanden sich Änderungen von HSP70-assoziierten Proteinen: in den Linien EPP85-181-P-TR und EPP85-181-RNOV-TR waren dies ein HSP70-verwandtes Protein, das Heat shock related Protein, KDA Protein 4, und in EPP85-181-RNOV-TR zusätzlich noch ein Valosin containing protein NP009057. Dieses ist ein ubiquitäres Clathrin-bindendes Protein, das zu einer Familie von ATP-bindenden Proteinen gehört, die in Vesikeltransport und Fusionsvorgänge involviert sind und mit HSC70 und Clathrin komplexbildend sind. In der LinieEPP85-181-RDB-TR wurde die oben erwähnte HSX70-Variante überexprimiert.

HSP90

HSP90 ist eine obligate Komponente von fundamentalen zellulären Prozessen, wie Hormon-Signaltransduktion und Zellzykluskontrolle. Es spielt eine Rolle bei der Organisation des Zytoplasmas zum Schutz von Filamentstrukturen bei Stress.

Wahrscheinlich bildet HSP90 stabile Komplexe mit Aktinfilamenten, wenn der zelluläre ATP-Level fällt (Scheibel et al., 1997). Zusätzlich schützt das Protein Mikrotubuli durch Bindung an Tubulin.

HSP90 und HSP90-Chaperonkomplexe sind auf dynamische Weise involviert in Transportvorgänge im Zytoplasma und in der Promotion von Partikelmigration (Pratt, 1992). Nukleärer Transport von HSP90 wird möglicherweise durch andere Komponenten des HSP90-Komplexes, wie Proteinkinasen oder Steroidrezeptoren vermittelt. Auch eine Beteiligung an RNA-Synthese und Prozessierung ist für HSP90 denkbar, wie aus der Bindungsfähigkeit des Chaperons an sowohl DNA als auch RNA mit relativ geringer Affinität und der Assoziation mit nukleären Strukturproteinen geschlossen wurde (Sarto et al., 2000). Mitglieder der HSP90-Familie sind auch involviert in Proteasom-Wirkungsmechanismen, zusammen mit Actin und Tubulin (Mathew und Morimoto, 1998). Das Proteasom ist ein Komplex aus verschiedenen Untereinheiten mit mutipler proteolytischer Aktivität. Die Herstellung von Peptiden aus zytosolischen Proteinen für den Transport in das endoplasmatische Retikulum, wo sie mit MHC-Klasse I Molekülen assoziieren, wird als eine Funktion des Proteasom vermutet. HSP90 kann mit Actin und Tubulin an der strukturellen Organisation dieses multikatalytischen Komplexes partizipieren.

Ein interessanter Befund ist die Hochregulation von proteasomalen Komponenten in den beiden chemo- und thermoresistenten Pankreaszellinien; in der Linie EPP85-181-RNOV-TR wurden zwei überexprimierte Spots als Proteasome subunit, beta type, 7 und Proteasome 26S subunit, non-ATPase, 10 identifiziert, während in EPP85-181-RDB-TR ein nicht näher identifiziertes proteasomales Protein per Datenbankvergleich bestimmt wurde. In [Seite 66↓]der erstgenannten Linie ist gleichzeitig auch HSP90 überexprimiert, so dass eine Interaktion der Proteine denkbar wäre. Spataro et al. erforschten mit einem Hefe-Modell neue Modalitäten für Chemoresistenz und entdeckten dabei, dass Überexpression von pad1 (ein Homologes zu einer Komponente des menschlichen 26 S Proteasom) der Zelle pleiotrope Zytostatikaresistenz verlieh über einen Weg, der einen über pap1(+) kodierten AP-1 Transkriptionsfaktor involviert (Spataro et al., 1997). Andere wiesen nach, dass Proteasom-Inhibitoren, die eine neue potentielle Antitumortherapie repräsentieren, die Proliferation in verschiedenen Zellinien hemmten und Apoptose induzierten; diese Hemmstoffe waren in der Lage, Signalvorgänge über Mitogen-aktivierte Proteinkinasezu inhibieren, Apoptose zu induzieren ungeachtet von p21 und p27 in sowohl Wildtyp-p53- als auch p53-mutierten multiplen Myelomzellen und schließlich Chemoresistenz zu überwinden (Hideshima et al., 2001).

Mehrfach berichtet wurde die Expression von HSP90 auf der Oberfläche von ruhenden und gestressten Zellen. Eine Funktion dieser Oberflächenmoleküle kann in der Präsentation von Antigenen zu den MHC-I-Molekülen liegen, in Zusammenhang mit der Assoziation zu dem Proteasom (Srivastava et al., 1994).

HSP90 kann auch mit anderen Chaperonen assoziieren, z.B. dem FK506-binding Protein FKBP52, das auch als HSP56 bezeichnet wird, allerdings nur, wenn dieses nicht durch die Casein Kinase II (CK2) phosphoryliert ist (Miyata et al., 1997). Diese Eigenschaften lassen auf eine Rolle in immunologischen Prozessen schließen, die auch für die HSP70-Familie beschrieben wurde.

4.2.2.2. Calcium-bindende Chaperone

Calnexin, Calreticulin, BIP und Reticulocalbin gehören zu einer großen Familie von Calcium-bindenden Proteinen in der Membran des endoplasmatischen Reticulum. Man kann diese Proteine in drei verschiedene Klassen einteilen: die erste beinhaltet Proteine mit hoher Ca2+-Bindungskapazität (z.B. BIP, Endoplasmin, PDI, Calreticulin, Calsequestrin), die zweite Ca2+-bindende Proteine mit hoher Affinität (Calreticulin, Calmegin, Calnexin) und die dritte EF-hand-Proteine (Reticulocalbin, ERC-55, Calumenin) (Michalak et al., 1998). Sie sind in ihrer Funktionsausübung als molekulare Chaperone vermutlich vielfach miteinander assoziiert und wirken bei der Aufrechterhaltung der Calcium-Homöostase mit. Ihre Interaktionen untereinander werden wahrscheinlich durch Änderungen der Ca2+-Konzentration im ER-Lumen reguliert.


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Calcium-Signale regulieren unzählige Zellfunktionen, einschließlich Zellmotilität, Sekretion, Kontraktion und Erschlaffung, Proliferation, Zellüberleben, einige Formen von Apoptose und Genexpression (Corbett und Michalak, 2000). Die Regulation der Aufnahme, Speicherung und Abgabe von Ca2+ wird über ER-Proteine vermittelt.

Calnexin

Calnexin ist ein Membranprotein, das transient mit verschiedenen Proteinen assoziiert, wie dem T-Zell Rezeptor, MHC-Klasse I und II Molekülen, viralen Proteinen und Integrinen (Chevet et al., 1999;Hebert et al., 1995;High et al., 2000). Mit Hilfe von Glykosylierungs-Inhibitoren konnte demonstriert werden, dass Glykoproteine selektiv mit Calnexin assoziieren (Ou et al., 1993).

Calreticulin

Calreticulin ist, wie Calnexin, ein Lectin-ähnliches molekulares Chaperon, und teilt mit diesem signifikante Aminosäuren-Sequenzidentität. Es ist involviert in die Biosynthese von einer breiten Vielfalt von Molekülen, darunter Ionenkanäle, Zelloberflächenrezeptoren, Integrine und Transporter (Coppolino und Dedhar, 1998;Hebert et al., 1995;Michalak et al., 1999;Michalak et al., 1998). Eine wichtige Funktion von Calreticulin ist die Regulation der intrazellulären Calciumkonzentration. Dies geschieht durch Steigerung der Ca2+-Speicherkapazität des ER (ein Resultat der Überexpression von Calreticulin) und Modulation der Funktion der Ca2+-ATPase im ER. Außerhalb des ER ist Calreticulin möglicherweise ein Modulator für Zelladhäsion, wie in Calreticulin-defizienten Zellen überprüft wurde, und beteiligt an Integrin-abhängiger Calcium-Signaltransduktion sowie an Steroid-vermittelter Genexpression.

BIP

BIP (GRP78) gehört, wie oben erwähnt, zur HSP70-Familie, und ist ein im ER lokalisiertes Mitglied dieser Familie (Gething, 1999;Haas, 1994). HSP70-Proteine führen ihre Chaperonfunktion in Kombination mit HSP40-Proteinen aus, die J-Domänen enthalten. BIP bzw. sein Homologes bei Saccharomyces cerevisiae, Kar2p, interagiert mit drei HSP40-Mitgliedern im ER, nämlich Sec63p, Scj1p und Jem1p. Es bindet im ER neusynthetisierte Proteine vorrübergehend, während missgefaltete, ungruppierte oder unterglykosylierte Proteine, deren Transport vom ER blockiert ist, permanent gebunden werden. Kar2p zeigte sich essentiell für die Proteintranslokation neusynthetisierter Sektretionsvorläufer entlang der ER-Membran und für den Rücktransport von aberranten Polypeptiden, be[Seite 68↓]stimmt für Degradierung durch das Proteasom. Hebert et al konnten nachweisen, dass in Kar2- Mutanten Faltung und Transport sowie Ausschleusung von bestimmten Proteinen wie Carboxypeptidase Y inhibiert wurde, wogegen Abgang von H+-ATPase auf dem normalen Sekretionsweg nicht betroffen war (Hebert et al., 1995).

Reticulocalbin

Das vierte Protein in dieser Gruppe, Reticulocalbin, enthält eine Sequenz HDEL aus vier Aminosäuren, und scheint als ER-Wiederherstellungssignal zu arbeiten. Reticulocalbin ist ein Mitglied einer Familie von Calcium-bindenden Proteinen mit geringer Affinität und multiplen EF-Händen, die als CREC-Familie bezeichnet wird (Cab45, Reticulocalbin, ERC-45, Calumenin). Diese Proteine sind wahrscheinlich an Sekretionswegen beteiligt, wobei die zelluläre Lokalisation wechseln kann. So sind Reticulocalbin und sein Ratten-Homologes ERC-55 strikt an das ER gekoppelt, Cab45 befindet sich im Golgi-Komplex und Calumenin verteilt sich entlang des Sekretionsweges (Honore und Vorum, 2000;Tachikui et al., 1997;Weis et al., 1994). Durch ihre Zielproteine wie HPV E6 Oncoproteine, Vitamin D-Rezeptor, Schlangentoxin und Topoisomerasen besitzt diese Familie weite funktionelle Signifikanz. Reticulocalbin, das Überexpression in invasiven Mammakarzinomlinien zeigte, könnte in Kombination mit Calnexin, Calreticulin und BIP in Thermoresistenzphänomene involviert sein, mutmaßlich durch seine Funktion als Chaperon im endoplasmatischen Retikulum.

Calreticulin war bei den thermoresistenten Parentallinien von Magen- und Pankreaskarzinom und bei der mitoxantronresistenten thermoresistenten Magenkarzinomlinie überexprimiert; letztere zeigte zusätzlich Überexpression von Calnexin. Das Expressionsverhalten von BIP und Reticulocalbin war dagegen uneinheitlich: BIP war in EPG85-257-P-TR überexprimiert, dagegen in EPG85-257-RNOV-TR unterexprimiert; Reticulocalbin wurde aus zwei im Molekulargewicht stark abweichenden Spots identifiziert -möglicherweise handelt es sich bei dem niedermolekularen um ein Fragment; die hochmolekulare Form war bei EPG85-257-P-TR überexprimiert, während in der gleichen Linie die niedermolekulare herunterreguliert war. Eine Überexpression der niedermolekularen Form fand sich bei EPP85-181-P-TR. In der gegebenen Situation lässt sich dieses komplexe Verhalten der Ca2+-abhängigen Chaperone ohne weitere Charakterisierung der Reticulocalbin-Formen und funktionelle Analysen wie Untersuchung eines möglichen Abbauweges nicht deuten. Die große Vielfalt an Funktionen dieser Proteine macht aber eine möglicherweise direkte Beteiligung zusammen mit den Hitzeschockproteinen an der Entwicklung von Thermoresistenz, eventuell kombiniert mit Chemoresistenz nicht unwahrscheinlich.


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4.2.2.3. Annexin I

Annexine bilden eine Familie von wasserlöslichen, Ca2+-abhängigen membranbindenden Proteinen. Ihre multifunktionellen Eigenschaften schließen eine Beteiligung an Entzündungsreaktionen, Apoptose, Vesikeltransport, Signaltransduktion, Zellproliferation und -differenzierung und Calcium-Homöostase ein, darüber hinaus wurden Annexine als Inhibitoren von Phospholipase A2 charakterisiert (Ahluwalia et al., 1995;Buhl, 1992;Croxtall et al., 1996).

Untersuchungen lassen vermuten, dass metastatische Zellen mit hohem Annexin I (ANX1)-Level Überlebensvorteile besitzen (Pencil und Toth, 1998). ANX1 ist Substrat für einige wichtige Kinasen, darunter die epidermal growth factor receptor kinase und Serin/Threoninkinasen wie PKC (Dubois et al., 1996).

Kürzlich erhobene Daten liefern Beweise dafür, dass ANX1 entscheidende Kriterien für eine chaperonähnliche Funktion erfüllt und deshalb auch als Heat Shock Protein betrachtet werden könnte: Induktion von ANX1 geschieht in Antwort auf verschiedene externe Stress-Stimuli einschließlich Hitzeschock, H2O2 und Arsenit (Rhee et al., 2000). ANX1 kann Zellen vor oxidativem Stress schützen, wie Untersuchungen an H2O2-gestressten Rattenthymozyten (Sakamoto et al., 1996) und ischämie-ausgesetzten Rattenhirnzellen (Relton et al., 1991) ergaben. Immunfluoreszenz und Western Blot-Analyse offenbarten, dass ANX1 während der Stressexposition in der perinukleären Region lokalisiert wird (Rhee et al., 2000). Das gleiche gilt für die Distribution von einigen HSPs (HSP70, HSP40, sHSP) unter Stress, die anschließend in der Erholungsphase schrittweise ins Zytoplasma zurückkehren (Neri et al., 1995;Ohtsuka et al., 1993;van Bergen en Henegouwen et al., 1987;Welch und Feramisco, 1984). Obwohl die funktionelle Signifikanz dieser Beobachtungen gegenwärtig nicht geklärt ist, mögen essentieller Schutz von Kernkomponenten vor Stressschäden und Erleichterung der Faltung von durch den Stress in einen nicht gefalteten Zustand gebrachten Molekülen eine Rolle spielen. Mögliche Funktionen von Chaperonen bei der Inhibition von Apoptose sind weiter oben diskutiert. Denkbar wäre, dass auch ANX1 bei diesen Vorgängen eine Modulatorrolle einnimmt. Berichte darüber sind spärlich, allerdings ist eine Hochregulation von ANX1 bei TNF-induzierter Apoptose mit konsekutiver Inhibition dieser in humanen Leukämiezellen beschrieben worden (Wu et al., 2000).

Die ANX1-Expression in den chemo- und thermoresistenten Karzinomlinien zeigte starke Variationen in Abhängigkeit vom Ursprung des Tumors: die thermoresistente Magen-CA-Linie ließ eine Herunterregulation von ANX1 erkennen, während die chemoresistenten [Seite 70↓]Linien und ihre thermoresistenten Varianten ein etwa gleichermaßen hohes Expressionsniveau zeigten.

Dagegen kam es zu einer erheblichen Überexpression des Proteins sowohl in der thermoresistenten Pankreas-CA-Parentallinie als auch in ihrer thermoresistenten und mitoxantronresistenten Variante, was die postulierte Chaperonfunktion des Moleküls unterstreicht. Als Erklärung für dieses Verhalten wäre denkbar, dass dieses Stressprotein andere HSPs ersetzt, die aus nicht erklärbarem Grund in diesen Zellinien nicht induziert werden, wie z.B. HSP27. Dieser Erklärungsversuch stützt sich auf die Beobachtung, dass ANX1 in keiner thermoresistenten Zellinie zusammen mit HSP27 hochreguliert wird; in der Zellinie EPP85-181-P-TR ist interessanterweise kein großes HSP im engeren Sinne überexprimiert, dagegen zahlreiche andere Chaperone wie Nucleophosmin Reticulocalbin, ein Heat shock related Protein und das besprochene Annexin 1.

4.2.2.4. Nucleophosmin

Nucleophosmin (Symbol: NPM; Synonym: nuceolar protein B23, Numatrin), überexprimiert in EPG85-257-RNOV-TR, EPG85-257-RDB-TR und EPP85-181-P-TR, ist ein Phosphoprotein, das in Tumorzellen in größerer Menge exprimiert wird als in normalen ruhenden Zellen. Wachstumsstimulation von normalen Zellen z.B. durch mitogen-Aktivierung von B-Lymphozyten wird von einem gesteigerten NPM-Level begleitet. Nucleophosmin dient als ein Shuttle-Protein für den nukleolären Transport von ribosomalen Komponenten und ist womöglich in Zusammenarbeit mit anderen nukleolären Proteinen an der Formierung von Ribosomen beteiligt, da es sich in der granulären Region des Nucleolus konzentriert (Borer et al., 1989). Neben diesen Funktionen konnte eine für NPM postulierte Chaperon-Aktivität bestätigt werden: das Protein ist in der Lage, die temperaturabhängige und -unabhängige Aggregation des HIV-1 Rev Proteins zu inhibieren. Darüber hinaus erstreckte sich seine Schutzfunktion auf die Alkohol-Dehydrogenase der Leber, deren Enzymaktivität unter denaturierenden Bedingungen aufrechterhalten werden konnte und auf die Enzyme Carboxypeptidase A und Citratsynthase (Szebeni und Olson, 1999).

4.2.2.5. FK506 binding protein 4

Die FK506-bindenden Proteine sind Immunophiline, treten mit Immunsuppressiva wie FK506, Cyclosporin A und Rapamycin in Wechselwirkung und besitzen cis/trans-Isomerase-Aktivität. Zu den FK506-bindenden Proteinen, die nach ihren Molekulargewich[Seite 71↓]ten bezeichnet werden, gehören FKBP12, 13 und 25 sowie die großen Mitglieder FKBP51 und FKBP52 (=FKBP4). Letzteres ist in allen untersuchten Geweben präsent und zeigt im Gegensatz zu den kleinen FKBPs nach Bindung an FK506 keine immunsuppressive Aktivität (Chambraud et al., 1999).

Große Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerasen (PPIasen) wie Cyp40, FKBP51 und FKBP52 sind wichtige Bestandteile des HSP90-Chaperonkomplexes, weswegen man für diese Proteine auch Chaperonaktivität postulierte. Die trans/cis-Isomerisierung von Prolin-Peptidbindungen stellt oftmals den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt bei der Proteinfaltung dar (Brandts et al., 1975;Kim und Baldwin, 1982;Schmid, 1993). Die Chaperonkomplexe bestehen aus je zwei PPIase-Monomeren, die an ein HSP90-Dimer via TPR-Domänen binden (Radanyi et al., 1994;Scheufler et al., 2000). Von den drei PPIasen bindet FKBP52 mit der höchsten Affinität an HSP90 (Pirkl und Buchner, 2001). In höheren Eukaryoten sind die Chaperonkomplexe mit inaktiven Steroidhormon-Rezeptoren assoziiert (Buchner, 1999;Pratt und Toft, 1997), für deren Aktivierung mehrere HSP90-Komplexe unterschiedlicher Komposition benötigt zu werden scheinen. Während des Chaperonzyklus interagiert der Rezeptor auch mit HSP70.

Neben der Co-Chaperon-Funktion weisen die großen PPIasen auch eigenständige Chaperonaktivität auf. Diese wurde in vitro untersucht: FKBP52 des Kaninchens z.B. verhindert thermale Aggregation des Modellsubstrates Citrat-Synthase (Bose et al., 1996), außerdem interagiert FKBP52 direkt mit dem Glukokortikoidrezeptor (Silverstein et al., 1999). Bei humanen Systemen zeigte sich, dass Cyp40 und FKBP51 potentere Chaperone als FKBP52 sind (Pirkl und Buchner, 2001).

In den Magenkarzinomzellinien fand sich FKBP52 bei der thermoresistenten mitoxantronresistenten und der thermoresistenten daunorubicinresistenten Linie überexprimiert und ist daher möglicherweise an der Entwicklung von Thermoresistenz bei bestehender Anthrazyklinresistenz mitbeteiligt.

4.2.2.6. 14-3-3 Familie

Die Mitglieder der 14-3-3 Familie sind weitgehend homologe Proteine, die in eukaryoten Zellen ubiquitär vorhanden sind. In Säugetierorganismen sind sieben Isoformen bekannt, die durch griechische Buchstaben gekennzeichnet sind: 14-3-3 beta (β), gamma (γ), epsilon (ε), zeta (ζ), eta (η), sigma (σ), und tau (τ) (Aitken et al., 1995). Die 14-3-3 Proteine existieren hauptsächlich als Dimere mit einem monomeren Molekulargewicht von ca. 30 kDa und einem isoelektrischen Punkt im sauren Bereich bei 4-5.


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14-3-3 findet sich reichlich in Hirnsubstanz (Boston et al., 1982), ist aber auch in fast allen anderen Geweben präsent; auf subzellulärem Level findet es sich größtenteils im Zytoplasma, daneben in der Plasmamembran, im Nucleus und im Golgi-Apparat (Celis et al., 1990;Fanger et al., 1998;Freed et al., 1994;Garcia-Guzman et al., 1999;Leffers et al., 1993;Tang et al., 1998).

Eine Eigenschaft der 14-3-3 Proteine ist ihre Fähigkeit, funktionell unterschiedliche Signalproteine zu binden, wie Kinasen, Phosphatasen und Transmembranrezeptoren. Dadurch greifen sie in eine Vielzahl von zellulären Prozessen ein wie mitogene Signaltransduktion, Apoptose, neuronale Entwicklung und Zellzykluskontrolle.

Neben vielen anderen Funktionen wirken 14-3-3 Proteine als sterische Regulatoren, welche die Interaktion ihrer Liganden mit anderen Zellkomponenten verhindern und somit zu einer veränderten intrazellulären Lokalisation oder komplexer Formation führen. Als Beispiel wäre die Unterbrechung der Bad/Bcl-XL-Interaktion zu nennen (möglicherweise ein Mechanismus für die Entwicklung von Resistenzeigenschaften): Unphosphoryliertes Bad bindet Bcl-XL/Bcl-2 im Mitochondrium und wirkt dadurch proapoptotisch. Überlebende Signale stimulieren Kinasen wie Akt/Proteinkinase B (PKB), die Bad phosphorylieren. Phosphoryliertes Bad wird im Cytosol an 14-3-3 gebunden und ist dadurch nicht in der Lage, programmierten Zelltod zu induzieren. Mit Hilfe von Phosphatasen wie Calcineurin kann dieser Prozess umgekehrt werden.

Darüber hinaus wurde schon seit einiger Zeit eine Chaperonfunktion für 14-3-3 Proteine postuliert. Kürzlich konnte dann erstmals experimentell bewiesen werden, dass 14-3-3 η molekulare Chaperonaktivität ausüben kann, indem es den Übergang des Zink-Finger-Proteins A20, einem Inhibitor von TNF-induzierter Apoptose, von unlöslichen punktuellen zytoplasmatischen Strukturen in das lösliche zytoplasmatische Kompartiment fördert (Vincenz und Dixit, 1996).

In den thermoresistenten Magen- und Pankreaskarzinomlinien wurden verschiedene 14-3-3 Formen -14-3-3 σ, 14-3-3 ζ, 14-3-3 η und 14-3-3-verwandte Isoformen- differentiell exprimiert. Bei den Magen-CA-Linien wurde nur Stratifin überexprimiert in der thermoresistenten Parentallinie, während in der gleichen Linie 14-3-3 η herunterreguliert wird. Ebenfalls herunterreguliert wird eine 14-3-3-verwandte Isoform, und zwar besonders stark in der thermoresistenten mitoxantronresistenten Linie (nachdem dieses Protein in der allein mitoxantronresistenten Ausgangslinie stark hochreguliert wurde) und etwas weniger deutlich in der thermoresistenten daunorubicinresistenten Variante.

Beim Pankreas-CA wird genau umgekehrt Stratifin herunterreguliert (thermoresistente Variante der Parentallinie) und 14-3-3 ηin zwei thermoresistenten Linien (EPP85-181-P-TR [Seite 73↓]und RNOV-TR) hochreguliert. Zusätzlich fand sich in der thermoresistenten mitoxantronresistenten Linie 14-3-3 ζ überexprimiert. Bei dieser stark variierende Expression der 14-3-3 Proteine in den verschiedenen Zellinien stellt sich die Frage, ob das Phänomen tatsächlich resistenzvermittelt auftritt oder ein unspezifisches Begleitphänomen ist, das durch unbekannte Variablen wie z.B. Zellkulturbedingungen hervorgerufen wird. Durch die in der Literatur beschriebenen Schutzfunktionen wäre eine Beteiligung an den Resistenzphänomenen zwar nicht ausgeschlossen, dies muss aber mit Hilfe weiterer Experimente untersucht werden.

4.2.2.7. Prohibitin

In beiden chemoresistenten Varianten der Magenkarzinomlinie EPG85-257 fand sich ein Protein deutlich höher exprimiert als in ihren thermoresistenten Sublinien. Es wurde in der Maldi-Massenspektrometrie als Prohibitin identifiziert. Auch in der mitoxantronresistenten thermoresistenten Pankreaskarzinomlinie EPP85-181-RNOV-TR fand sich dieses Protein herunterreguliert.

Prohibitin ist ein ubiquitär reichlich vorkommendes, evolutionär konserviertes Protein, das in wichtige intrazelluläre Prozesse eingreift wie normale Zellzyklusregulation, replikative Seneszenz, zelluläre Immortalisation und Entwicklung von sporadischen Mammakarzinomen (McClung et al., 1995). Es besitzt antiproliferative Aktivität und bildet zusammen mit Bap37 einen großen Komplex in der inneren mitochondrialen Membran (Nijtmans et al., 2000).Das Hefe-Homologe von diesem Komplex, der Phb1/2 Komplex, kann neu synthetisierte mitochondriale Translationsprodukte stabilisieren, wahrscheinlich durch eine direkte Interaktion mit dem Komplex. Die Tatsache, dass Phb1/2 ein mutimerischer Komplex ist, der native Polypeptide vor Proteolyse schützt, legt eine funktionelle Homologie zu den Chaperonen nahe, unter Berücksichtigung ihrer Fähigkeit, einer falschen Faltung neu synthetisierter Proteine vorzubeugen (Nijtmans et al., 2000).

Denkbar wäre, dass Prohibitin eine Chaperonfunktion in anthrazyklinresistenten Tumorzellinien ausübt, mit Schutzfunktionen gegenüber mitochondrialen Proteinen. Unter Thermoresistenz treten dann andere Chaperone in den Vordergrund, so dass die Expression von Prohibitin zurückgeht.

4.2.3. Arzneimittelmetabolismus

Innerhalb der Zelle sorgen Antioxidantien für die Aufrechterhaltung des Redox-Gleichgewichts. Das Glutathion-System, das Glutaredoxin und das Thioredoxin-System stellen die Hauptvertreter der reduzierenden Agenzien intrazellulär. Durch ihre Funktion in [Seite 74↓]der Wechselwirkung mit xenobiotischen Komponenten wie z.B. Chemotherapeutika und der Neutralisierung solcher potentiell für die Zelle schädlichen Substanzen stellen diese zellulären Schutzvorrichtungen ein wirksames Ziel für die Resistenz gegenüber Xenobiotika dar. Der Glutathion-vermittelte Detoxifikationsweg ist ein vielfach zitierter Mechanismus bei der Entwicklung von MDR (Harris und Hochhauser, 1992;Tannock und Goldenberg, 1998). Auch Veränderungen im Thioredoxin-System sind mit Chemoresistenzmechanismen in Verbindung gebracht worden, und die Beteiligung dieser beiden Stoffwechselwege an zellulären Resistenzmechanismen gegenüber Zytostatika einerseits und thermischem Stress andererseits wird im Folgenden diskutiert.

4.2.3.1. Glutathionstoffwechsel

Glutathion (GSH)-vermittelte Detoxifikationswege spielen eine zentrale Rolle bei der Inaktivierung und Eliminierung von antineoplastischen Therapeutika und chemischen Karzinogenen. Viele dieser Stoffe verursachen zelluläre Schäden durch Produktion von reaktiven Intermediärprodukten. Ein Mechanismus, durch den Zellen sich selbst vor solchen Schädigungen schützen können, ist die Synthese einer großen Menge von Sufhydrylkomponenten, besonders des Thiols Glutathion, das mit Radikalen reagieren kann, so dass sie in nontoxische Verbindungen übergehen. Reduziertes Glutathion kann Peroxide und freie Radikale inaktivieren, die z.B. unter Anthrazyklinwirkung produziert werden können, ebenso kann es an positiv geladene elektrophile Moleküle binden, wie die aktiven Gruppen von Alkylanzien. Diese Reaktionen werden durch Glutathion-Peroxidasen und Glutathione-S-Transferasen katalysiert. GSH und die assoziierten Enzyme Glutathione S-Transferasen, Peroxidasen, und Reduktase werden häufig in Chemoresistenzmechanismen impliziert (Krishna und Mayer, 2000;Nielsen et al., 1996;Stavrovskaya, 2000;van der Kolk et al., 1999).

Mit GSH konjugierte Pharmaka müssen durch Export-Carrier, bekannt als GSX-Pumpe, oder den Leukotrien C4-Transporter, aus der Zelle geschleust werden. Teilweise geschieht dieser Export durch das MRP, so dass Chemoresistenz mit gesteigerter MRP-Expression wahrscheinlich von GSH-vermittelter Konjugation der Zytostatika abhängt (Loe et al., 1996).

Durch die Konjugation von GSH zu verschiedenen Pharmaka scheinen Glutathione-S-Transferasen eine Rolle zu spielen bei der Entwicklung von Chemoresistenz (Waxman et al., 1992). Fünf unterschiedliche GST-Klassen oder Genfamilien sind identifiziert. Die cytosolischen GST´s werden nach ihren isoelektrischen Punkten klassifiziert in basisch (α-Form), neutral (μ-Form/GST-M3) und sauer (π-Form), die beiden anderen Formen sind die [Seite 75↓]mikrosomale Isoform und die θ-Form. Jedes funktionelle GST-Enzym ist ein aus Untereinheiten bestehendes Homo- oder Heterodimer.

In den chemo- und thermoresistenten Magenkarzinomzellinien zeigte sich für das Protein GST-M3 eine deutliche Überexpression im Vergleich zu den allein chemoresistenten Ausgangslinien, während beim Pankreaskarzinom dieselbe Isoform bei der thermoresistenten Variante der Parentallinie und besonders bei der mitoxantronresistenten thermoresistenten Linie überexprimiert war.

Möglicherweise steht dieses Phänomen in Zusammenhang mit der Überexpression von HSP27 bei der daunorubicinresistenten Variante der Magenzellinie. Wenn man darüber spekuliert, dass das Enzym ein indirekter Marker für eine mit den verwendeten Methoden nicht messbare Erhöhung der Glutathion-Reserven sein könnte, dann könnte GST M3 einen Resistenzfaktor darstellen. Interessanterweise scheinen diese Ergebnisse aber eher auf eine Beteiligung dieser GST M3-Isoform an Thermoresistenzphänomenen hinzuweisen als an Chemoresistenz, da eine Hochregulation in den allein chemoresistenten Varianten fehlt. Da klärende Experimente, die den gesamten Glutathionstoffwechsel einschließen müssten, den Rahmen dieser Arbeit sprengen würden, ist dies bis jetzt nicht weiterverfolgt worden.

In der mitoxantronresistenten thermoresistenten Variante des Pankreaskarzinoms fand sich neben GST-M3 noch ein weiteres Enzym des GSH-Stoffwechsels, die Glyoxalase I (GLO1), überexprimiert. GLO1 katalysiert die Konversion von Methylglyoxal, einem Nebenprodukt der Glykolyse, zu S-D-Lactoylglutathion. Freies Methylglyoxal reagiert mit biologischen Komponenten der Zelle wie DNA, RNA und Proteinen, wobei es als Konsequenz zur Inhibition ihrer Synthese, zum Abbruch des Zellwachstums und zu Apoptose kommt (Thornalley, 1998). Eine abnorme Expression oder Aktivität der GLO1 konnte u.a. in humanen Karzinomen von Kolon, Niere und Mamma demonstriert werden im Zusammenhang mit gesteigerter Proliferationsaktiviät der Tumoren (Davidson et al., 1999;Di Ilio et al., 1995;Ranganathan und Tew, 1993;Ranganathan et al., 1995;Rulli et al., 2001). Daher wäre auch eine veränderte Proliferation der thermoresistenten Linien eine mögliche Erklärung für die Überexpression. Darüber hinaus fand sich GLO1 in chemoresistenten Leukämie-, Magen- und Kolonzellen überexprimiert (Sakamoto et al., 2000;Sugimoto et al., 1990). Sakamoto et al. untersuchten den Effekt von GLO1 auf Zytostatika-induzierte Apoptose in Leukämiezellen und postulierten, dass GLO1 einen Signaltransduktionsweg an einem Punkt oberhalb der Caspase-Aktivierung blockiert und somit einen apoptoseresistenten Faktor darstellt (Sakamoto et al., 2000). Daraus ließe sich die Hypothese ableiten, dass unter Einbeziehung dieses Enzyms auch Apoptosevorgänge, die durch [Seite 76↓]thermischen Stress in Kombination mit Zytostatikaexposition eingeleitet werden, inhibiert werden können und in einem resistenten Phänotyp solcher GLO1-überexprimierender Zellen resultieren.

4.2.3.2. Thioredoxinstoffwechsel

Das in den Stoffwechsel des Thioredoxins involvierte Enzym Thioredoxin Peroxidase fand sich in zwei thermoresistenten Linien überexprimiert, nämlich in der daunorubicinresistenten Magenkarzinomlinie EPG85-257-RDB-TR und in der Pankreaskarzinomlinie EPP85-181-P-TR. Demgegenüber zeigte sich Peroxiredoxin 3 in EPP85-181-RDB-TR differentiell unterexprimiert. Nicht nur gegenüber seiner thermoresistenten Variante, sondern auch im Vergleich zu der parentalen Pankreaskarzinomlinie war das Protein in der daunorubicinresistenten Sublinie überexprimiert, so dass man unter dieser Betrachtungsweise eher von einer Überexpression in chemoresistenten Zellen sprechen könnte ohne Beteiligung an Thermoresistenz.

Thioredoxin Peroxidase (Symbol: Tpx; Synonym: Peroxiredoxin) ist zusammen mit Thioredoxin (Symbol: Trx;) und Thioredoxin Reduktase (Symbol: TR) in einer zytoplasmatischen Redoxkette verbunden, die Peroxid-Reduktion zu NADPH-Oxidation paart. Eine Form der Thioredoxin Peroxidase, das Peroxiredoxin 2 (Prx II), reduziert Peroxide mit Hilfe von Reduktionsäquivalenten, die durch das Thioredoxin-System bereitgestellt werden. Sie spielt wahrscheinlich eine wichtige Rolle in der Elimination von Peroxiden, die bei Stoffwechselvorgängen generiert werden. Man vermutet, dass dieses Enzym in den Signal-Kaskaden von Wachstumsfaktoren und TNF-α partizipiert, indem es die intrazelluläre Konzentration von H2O2 reguliert. Eine Steigerung der Expression von Prx II inhibierte Cisplatin- und H2O2-induzierte Apoptose; diese Resultate demonstrierten, dass Resistenz gegenüber diesen Agenzien auf eine Inhibition der apoptotischen Maschinerie zurückzuführen ist (Chung et al., 2001).

Die Beteiligung von Mitgliedern des Thioredoxin-Systems an Thermoresistenz-Phänomenen ist bisher in der Literatur nicht beschrieben und bedarf weiterer Klärung. Die Ergebnisse bei den untersuchten thermoresistenten Linien sind bei Magen- und Pankreaskarzinom uneinheitlich und lassen daher in diesem Kontext keine Hypothese zu.

4.2.4. Komponenten des Cytoskeletts

4.2.4.1. Cytokeratine und Vimentin

Das Cytokeratinnetzwerk der Zelle ist ein weiträumiges System, dessen Funktion zu großen Teilen nicht genau bekannt ist. Cytokeratine (CK) repräsentieren eine komplexe [Seite 77↓]Unterklasse der Intermediärfilamente, die auf der Basis von Ladung in zwei Subfamilien unterteilt werden kann: saure oder Typ I Keratine (CK9-20) und basische oder Typ II Keratine (CK1-8). Im Regelfall werden Keratine pärchenweise koordiniert synthetisiert, so dass mindestens ein Mitglied einer Subfamilie in jeder Epithelzelle exprimiert ist. Eine beispielsweise typische Kombination stellt die Koexpression von CK8 und CK18 dar (Southgate et al., 1999). Die auffälligste Ausnahme der Expression in Paaren zeigte sich bei dem kleinsten bekannten Cytokeratin, CK19 (Bader et al., 1986). Expression von CK19 in humanen Keratinocyten, die den retinoic acid receptor (RAR) beta aufweisen, steigert sich unter Vitamin-A-Behandlung (Schon und Rheinwald, 1996).

Diverse Modifikationen des Cytoskeletts sind mit maligner Zelltransformation assoziiert. So wird das Cytokeratinpaar CK8 und CK18 vielfach und persistent in Karzinomzellen exprimiert, was zu der breiten Verwendung von monoklonalen Keratinantikörpern als diagnostische Marker für derartige Tumoren führte. Darüber hinaus lassen neuere Daten vermuten, dass Cytokeratine in MDR-Phänomene involviert sind. Bauman et al. konnten nachweisen, dass Transfektion von Maus L Fibroblasten mit CK 8 und CK18 in Anwesenheit von Chemotherapeutika wie Mitoxantron, Doxorubicin und Vincristin in einem Vielfachresistenz-Phänotyp resultiert (Bauman et al., 1994). Da die intrazelluläre Substanzakkumulation nicht betroffen war, beeinflussen Cytokeratine möglicherweise die intrazelluläre Verteilung von Zytostatika, so dass nukleäre Ziele geschont werden. Keratinabhängige Chemoresistenz kann in verschiedenen Zellinien, aber nicht für alle DNA-schädigenden Substanzen beobachtet werden (Anderson et al., 1996).

Die Expression der Cytokeratine 19, 7 und 8 variierte stark in Abhängigkeit vom Karzinomtyp bei den chemo- und thermoresistenten Zellen. Bei den Magen-CA-Linien fand sich in allen drei thermoresistenten Linien eine deutliche Überexpression von CK19 plus seiner Variante, und zusätzlich eine Hochregulation von CK7 und CK8 in der thermoresistenten nicht chemoresistenten Parentallinie. Genau umgekehrt war eine signifikante Unterexpression all dieser Keratine in der thermoresistenten und mitoxantronresistenten thermoresistenten Variante bei den Pankreaszellen zu verzeichnen. Wie diese gegensätzliche Regulation zustande kommt, lässt sich aus den Ergebnissen und den existierenden Veröffentlichungen über Cytokeratinfunktionen und -regulation nicht ableiten. Möglicherweise handelt es sich hier um eine unspezifische Begleitreaktion.

Auch Vimentin ist eine Komponente der Intermediärfilamente, die zusammen mit den aktinhaltigen Mikrofilamenten und den Mikrotubuli die Elemente des Cytoskeletts bilden. Es findet sich wie einige Cytokeratine ebenfalls in chemoresistenten Karzinomzellen verän[Seite 78↓]dert exprimiert; in der vielfachresistenten Sublinie MCF7R der humanen Mammakarzinomlinie MCF7S wurde es deutlich hochreguliert (Bichat et al., 1997). In der humanen Melanomzellinie A375P wurde mit Hilfe von Co-Transfektion die Hypothese bestätigt, dass eine Coexpression von Vimentin and Keratinen (CK8 und 18) in gesteigerten cytoskeletalen Interaktionen mit extrazellulärer Matrix, einschließlich Integrin-Signalvorgängen, resultiert, was auf ein verstärktes Migrationsverhalten und damit invasiven Phänotyp schließen lässt (Chu et al., 1996).

Vimentin war sich in der thermoresistenten Magen-CA-Linie EPG85-257-P-TR auf kaum nachweisbare Level herunterreguliert. In der jetzigen deskriptiven Situation kann diese Beobachtung nicht ausreichend gedeutet werden; eine Beteiligung von Cytoskelett-Komponenten an der Entwicklung von Thermoresistenz scheint zwar nicht ausgeschlossen, aber bei der gegensätzlichen Regulation der Cytokeratine eher unwahrscheinlich zu sein.

4.2.4.2. T-Plastin und Actin-Isoformen

In der Pankreaslinie EPP85-181-RNOV-TR fanden sich zwei Isoformen des T-Plastins gegenüber der allein mitoxantronresistenten Ausgangslinie überexprimiert. Plastine bilden eine Familie von Actin-bindenden Proteinen, die in normalen und malignen Zellen differentiell exprimiert werden (Lin et al., 1988). T-Plastin-Überexpression ist auch im Zusammenhang mit Cisplatin-Resistenz bei verschiedenen Karzinomen beschrieben, wobei eine funktionelle Beziehung zwischen Ausmaß von Überexpression und Resistenz besteht. Der zugrundeliegende Mechanismus ist nicht geklärt; Vermutungen reichen von Interaktionen des Plastin-assoziierten Actin mit der intrazellulären Verteilung von Cisplatin bis zur Beeinflussung des für den Cisplatin-Efflux verantwortlichen Transporter (Hisano et al., 1996).

Neben den genannten Actin-bindenden Proteinen zeigten sich Proteinspots in den thermoresistenten Pankreaslinien EPP85-181-P-TR und EPP85-181-RNOV-TR überexprimiert, die sich massenspektrometrisch als Formen des γ-Actins herausstellten, obwohl der isoelektrische Punkt dieser Spots deutlich basischer ist als der des an bekannter Stelle fokussierenden Actins. Die Bedeutung dieser Isoformen ist weiterhin klärungsbedürftig; möglicherweise handelt es sich auch um gemischte Spots aus Actin und einem wegen geringen Mengen nicht zu identifizierenden Actin-bindenden Protein oder um durch Stoffwechselvorgänge verändertes Actin.


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4.2.5.  Weitere differentiell exprimierte Proteine

Die übrigen Proteine, die in den chemo- und thermoresistenten Magen- und Pankreas-Karzinomlinien differentielle Expression aufwiesen, sind bisher nicht im Zusammenhang mit Resistenzmechanismen von Tumorzellen beschrieben worden.

Einige der Proteine repräsentieren bekannte Enzyme regulärer Stoffwechselwege der Zelle, wie Phosphoglyceromutase (hochreguliert in EPP85-181-P-TR), Aldehyd-Dehydrogenase 1 (Unterexpression in EPG85-257-P und Überexpression in EPP85-181-P-TR), Kreatinkinase (B chain hochreguliert in EPP85-181-P-TR und EPP85-181-RNOV-TR) und Enoyl CoA Hydratase (Überexpression in EPP85-181-P-TR).

Transgelin (hochreguliert in der atypisch chemoresistenten Linie EPG85-257-RNOV und herunterreguliert in ihrer thermoresistenten Variante) ist ein Actin-assoziiertes Polypeptid (Shapland et al., 1993), das in glatten Muskelzellen und anderen mesenchymalen Zellen vorkommt; Daten bezüglich seiner Funktion sind spärlich. Mitofilin ist ein erst kürzlich charakterisiertes, ursprünglich auch als heart muscle protein bezeichnetes Protein; es ist ein transmembranäres Protein der inneren mitochondrialen Membran, dessen Funktion bisher nicht bekannt ist (Gieffers et al., 1997). Es wird vermutet, dass es als ATP-gesteuertes Motor-Protein mit Zytoskelett-Komponenten interagiert (Icho et al., 1994).

Das Protein „Cancer Oncogene“ (identifiziert per Datenbankanalyse), das in beiden chemo-thermoresistenten Magenkarzinomlinien und der thermoresistenten chemosensiblen Pankreaskarzinomlinie überexprimiert war, ließ sich aufgrund seiner vagen Bezeichnung nicht weiter spezifizieren und damit keinem speziellen Onkogen zuordnen, was eine Hinterfragung seiner Rolle bei der Thermoresistenz praktisch unmöglich macht, obwohl es zumindest in den Magen-CA-Linien durch sein Expressionsmuster ein Kandidatenprotein für die Untersuchung von Interaktionen zwischen Chemo- und Thermoresistenz wäre.

Eine vergleichbare Proteinexpression in den untersuchten Magenkarzinomlinien wie Cancer Oncogene zeigte das G1 Cyclin D2. Dieses ist neben anderen Cyclinen vielfach als überexprimiert in Tumorzellen beschrieben. Darüber hinaus wurden Hypothesen aufgestellt, dass es in die Pathogenese von chronischen B-Zell-Leukämien eingreift, eventuell indem es die Zellen vor programmiertem Zelltod schützt, während die Cyclin D2-Überexpression mit keinerlei Modifikationen des Zellzyklus in diesen Zellen einherging. Aus den mittels Proteom-Analyse gewonnenen Daten lässt sich keine Aussage darüber machen, ob die Überexpression von Cyclin D2 durch Zellzyklus-Veränderungen der thermoresistenten Zellinien hervorgerufen wird, oder an der Entwicklung der Resistenz direkt beteiligt ist.


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Zwei Formen von G-Proteinen (G-beta 1 und G-beta 2) sowie eine Form des Rho GDP Dissociation Inhibitor (Rho-GDI) waren in der atypisch chemoresistenten Magen-CA-Linie EPG85-257-RNOV erhöht exprimiert und in ihrer thermoresistenten Variante wieder herunterreguliert. Ein weiterer Proliferationsmarker, der Initiation Factor 5A und seine Variante, wurden in der thermoresistenten Parentallinie EPG85-257-P-TR herunterreguliert. Die differentielle Expression dieser Proteine scheint ein Begleitphänomen variierender Zellkulturbedingungen zu sein.

4.2.6. Überblick der besprochenen Ergebnisse und Ausblick

Zusammenfassend können folgende Punkte festgestellt werden:

An der Entwicklung von Chemo- und Thermoresistenz sind offenbar verschiedenste Chaperone aus mehreren subzellulären Kompartimenten (u.a. Cytoplasma, Nucleolus, ER) beteiligt. Davon am besten untersucht sind die Heat Shock Proteine im eigentlichen Sinne. Einige davon, z.B. HSP70 und HSP27, sind, wie vielfach in unterschiedlichen Zellinien beschrieben, an der Entwicklung von Thermotoleranz beteiligt. Um dieses Phänomen zu untersuchen, hat man verschiedene permanent hitzeresistente Linien etabliert, abgeleitet von tierischen und menschlichen Organen. Aus diesen Studien ergaben sich mehrere Konzepte und Schlussfolgerungen, die von Laszlo und Venetianer 1998 zusammengefasst wurden: wenn die Expression eines der großen Hitzeschockproteine HSP90, 70, 60 oder 27 gesteigert wurde unter normalen Wachstumsbedingungen, entwickelten die Zellen Resistenz gegenüber hitzeinduzierter Zytotoxizität (Laszlo und Venetianer, 1998). Daneben kann eine derartige Hitzeresistenz auch in Abwesenheit der Expression von Hitzeschockproteinen entstehen.

Bei der Proteinanalyse der Magenkarzinomlinie EPG85-257, der Pankreaskarzinomlinie EPP85-181 sowie deren resistenten Varianten konnten diese Resultate bestätigt werden. Es zeigte sich, dass in jeder der sechs thermoresistenten Linien mindestens ein Mitglied einer großen Familie der Heat Shock Proteine überexprimiert wird. Diese Ergebnisse lassen sich mit den umfangreichen Erkenntnissen, die es inzwischen über die Stressproteine gibt, in Einklang bringen. Darüber hinaus fand sich neben den Hitzeschockproteinen im engeren Sinne differentielle Expression von anderen Proteinen mit Chaperonaktivität, darunter Annexin 1, FKBP4 und Chaperone des ER (Calnexin, Calreticulin) und Nucleus (Nucleophosmin).

Die Mechanismen der Resistenzphänomene liegen wahrscheinlich auf mehreren Ebenen. Einerseits wirkt die Chaperonfunktion direkt durch Verhinderung oder Reparatur von Pro[Seite 81↓]teindenaturierung dem thermischen oder medikamentösen Stress entgegen und bewahrt die Zelle vor dem Untergang. Andererseits greifen Chaperone an verschiedenen Stellen in die apoptotische Kaskade ein und bewirken ihre Inhibition, teilweise auch ihre Promotion. Die Funktionen und Interaktionen sind vielfältig und komplex, und müssen für jeden Zelltyp gesondert betrachtet werden, wie die z.T. gegenteiligen Daten für das gleiche Phänomen bei verschiedenen Zellarten zeigen.

Zusätzlich zu den Chaperonen ergaben sich bei einigen thermoresistenten Karzinomzellinien signifikante Veränderungen von Proteinen, die in den Arzneimittelstoffwechsel eingreifen, darunter Thioredoxin-Peroxidase, Glyoxalase I und GST M3. Proteine dieser Art spielen bekanntermaßen eine Rolle bei der Entwicklung von Chemoresistenz, ihre Funktion bei Thermoresistenz ist noch nicht geklärt. Auch die Rolle der Cytokeratine und des Vimentin bei hitzeinduzierter Resistenz bleibt zu untersuchen, deren Expression stark zelltypabhängig zu sein scheint, wie die z.T. umgekehrten Ausprägungslevel von CK19, CK7 und CK8 vermuten lassen.

Einige andere Proteine lassen sich hinsichtlich ihrer Funktion auf der aktuellen Basis der Erkenntnisse nicht so recht in Resistenzphänomene einordnen, darunter die metabolischen Enzyme (Aldehyde Dehydrogenase 1, Phosphoglyceromutase).

Um diese durch die Proteinanalyse gewonnenen komplexen Informationen zu betätigen und zu erweitern, sind Untersuchungen auf anderen Ebenen (DNA, mRNA) sinnvoll. Mit Hilfe von Transfektionsexperimenten lässt sich die Beteiligung bestimmter Proteine und Proteingruppen an Chemo- und Thermoresistenzphänomenen nachweisen oder ausschließen, und die Anwendung von Proteinaktivitätstest könnte die Beteiligung weiterer Proteine an diesen Phänomenen erkennen lassen, da die Untersuchung der Proteinexpression mittels 2D-Elektrophorese durch alleinige Darstellung von Spotintensitäten ihre Grenzen hat, und die möglicherweise erhöhte Aktivität bei gleichbleibender Expression von Proteinen außer acht lässt. Unter Umständen wären auch funktionelle Untersuchungen mit Hemmsubstanzen in Zellkulturen angebracht, z.B. mit dem Stoff Quercetin, der die HSP-Synthese inhibiert. Dadurch kann man die Auswirkungen einer solchen Behandlung auf die Zellen und ihre Kompensations- und Ersatzmöglichkeiten bei der Entwicklung von Resistenzen gegen zellschädigende Agenzien wie Zytostatika und Hyperthermie austesten.


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09.02.2007