Aus dem Institut für Laboratoriumsmedizin und Pathobiochemie
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

Dissertation

Proteom-Analyse von chemo- und thermoresistenten Magen- und Pankreaskarzinomzellinien zur Untersuchung von thermoresistenzassoziierten Phänomenen und Interaktionen mit Chemoresistenz

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Julia Poland
aus Berlin

Dekan: Prof. Dr. med. Joachim W. Dudenhausen

Gutachter:
1. Prof. Dr. med. Dr. rer. nat. P. Sinha
2. Prof. Dr. rer. nat. P.-M. Kloetzel
3. Prof. Dr. rer. nat. I. Lefkovits

Datum der Promotion:20.02.2003

Liste an Veröffentlichungen, die aus dieser Arbeit hervorgegangen sind:

1. Sinha P, Poland J, Schnölzer M, Celis JE, Lage H (2001a) Characterization of the differential protein expression associated with thermoresistance in human gastric carcinoma cell lines. Electrophoresis 22(14):2990-3000.
2. Sinha P, Poland J, Schnölzer M, Rabilloud T (2001b) A new silver staining apparatus and procedure for matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight analysis of proteins after two-dimensional electrophoresis. Proteomics 1(7):835-840.
3. Poland J, Schadendorf D, Lage H, Schnölzer M, Celis JE, Sinha P (2002) Study of therapy resistance in cancer cells with functional proteome analysis. Clin Chem Lab Med 40(3):221-234.

Diese Arbeit wurde unterstützt von der Deutschen Krebshilfe (grant 10-1628-La4).

Zusammenfassung

Palliative Therapie inklusive Chemotherapie und andere Behandlungsmethoden wie Hyperthermie ist oftmals die einzig verbleibende Option bei der Behandlung von bestimmten soliden Tumoren wie Magen- und Pankreaskarzinom. Leider ist die kurative Behandlung limitiert durch geringes Ansprechen der Tumore auf die Behandlung und die Entwicklung einer Therapieresistenz.
In dieser Arbeit wurde die globale Proteinexpression von chemo- und thermoresistenten Varianten der Magenkarzinomzellinie EPG85-257 und der Pankreaskarzinomzellinie EPP85-181 mit Hilfe von Proteomics (Kombination aus zweidimensionaler Elektrophorese, computergestützter Gel-Analyse und Massenspektrometrie) in vitro untersucht, um Kandidatenproteine zu finden, die potentiell mit Thermoresistenz bzw. Chemoresistenz assoziiert sind. In diesem Zusammenhang wurde eine mit Maldi-TOF-Massenspektrometrie kompatible Silberfärbung neu entwickelt.
Es zeigte sich eine differentielle Expression einer Vielzahl von Proteinen in den thermoresistenten Zellen, darunter eine Hochregulation von Proteinen mit Chaperonaktivität aus nahezu allen subzellulären Kompartimenten sowie eine Überexpression von Enzymen des Arzneimittelmetabolismus in Zellen mit sowohl chemo- als auch thermoresistentem Phänotyp. Darüber hinaus wurden weitere Proteine identifiziert, welche hinsichtlich ihrer Beteiligung an Resistenzphänomenen im Vorfeld noch gar nicht charakterisiert worden sind (u.a. Aldehyd-Dehydrogenase 1, Transgelin, Phosphoglyceromutase).

Eigene Schlagworte: Krebs, Chemoresistenz, Thermoresistenz, Proteomics, Proteom-Analyse, zweidimensionale Elektrophorese

Abstract

Palliative treatment including chemotherapy and other modes of treatment, e.g. hyperthermia, is often the only remaining option in the management of certain solid tumours including gastric and pancreatic carcinoma. Unfortunately, its efficacy is poor due to low tumour sensitivity and the development of therapy resistance.
The aim was to study in vitro global protein expression of chemo- and thermoresistant variants of the stomach cancer cell line EPG85-257 and the pancreatic cancer cell line EPP85-181 using proteomics (two-dimensional electrophoresis in combination with computer-assisted image analysis and mass spectrometry) to identify candidate proteins potentially associated with thermoresistance alone or in combination with chemoresistance. In this context, a silver stain compatible with Maldi-TOF mass spectrometry was developed.
A large number of proteins was found to be differentially expressed in thermoresistant cells, e.g. overexpression of molecular chaperones at practically every sub-cellular level as well as over-expression of enzymes involved in drug metabolism in both chemo- and thermoresistant cells. Furthermore, other proteins that have not yet been linked to resistance phenomena (e.g. aldehyde dehydrogenase 1, transgelin, phosphoglycerate mutase) have been shown to be differentially expressed.

Keywords: Cancer, Chemoresistance, Thermoresistance, Proteomics, proteome analysis, two-dimensional electrophoresis

Inhaltsverzeichnis

• 1.  Einleitung
  • 1.1.  Einführung
  • 1.2.  Rolle der Chemotherapie in der modernen Onkologie
    • 1.2.1. Mechanismen für Zytostatikaresistenz
    • 1.2.2. Klassische und atypische multidrug resistance (MDR)
      • 1.2.2.1. Klassische MDR
      • 1.2.2.2. Atypische MDR
  • 1.3.  Rolle der Hyperthermie in der modernen Onkologie
    • 1.3.1. Biologische Grundlagen
    • 1.3.2. Interaktion mit Chemotherapie
    • 1.3.3. Thermotoleranz/Thermoresistenz
  • 1.4.  Humane Karzinomzellinien EPG85-257 (Magen-CA) und EPP85-181 (Pankreas-CA) und ihre resistenten Varianten
  • 1.5.  Eigenschaften der verwendeten Zytostatika
    • 1.5.1. Daunorubicin
    • 1.5.2. Mitoxantron
    • 1.5.3. Wirkungsweise von Anthracyclinen
  • 1.6.  Proteomics
    • 1.6.1. Überblick
    • 1.6.2. Zweidimensionale Elektrophorese
  • 1.7.  Fragestellung
• 2.  Material und Methoden
  • 2.1.  Material
    • 2.1.1. Reagenzien
    • 2.1.2. Geräte
    • 2.1.3.  Zellproben
      • 2.1.3.1. Zellkultur und Zellernte
  • 2.2.  Methodik
    • 2.2.1. 2D-Elektrophorese mit Carrier-Ampholyten in der 1. Dimension
      • 2.2.1.1. Proteinisolierung
      • 2.2.1.2. Proteinkonzentrationsbestimmung
      • 2.2.1.3. Gießen der Gele für die 1. Dimension
      • 2.2.1.4. Vorbereitung für die isoelektrische Fokussierung der 1. Dimension
      • 2.2.1.5. Starten der 1. Dimension
      • 2.2.1.6. Erstellen der Gele für die SDS-PAGE der 2. Dimension
      • 2.2.1.7. Starten der SDS-Polyacrylamid-Elektophorese der 2. Dimension
      • 2.2.1.8. Fixierung und Färbung
    • 2.2.2. Auswertung der Gele mit PDQuest
      • 2.2.2.1. Scan-Prozeß
      • 2.2.2.2.  Spot-Detektion
      • 2.2.2.3. Matching & Editing
      • 2.2.2.4. Datenanalyse
    • 2.2.3. Sequenzierung der differentiell exprimierten Proteine
    • 2.2.4.  Schematische Darstellung der verwendeten Methode
• 3.  Ergebnisse
  • 3.1.  Entwicklung einer mit MALDI-Massenspektrometrie kompatiblen Silberfärbung
  • 3.2.  Proteom-Analyse der chemo- und thermoresistenten Magen- und Pankreaskarzinomzellinien
    • 3.2.1. Übersicht
    • 3.2.2.  Magenkarzinomzellinie EPG85-257
      • 3.2.2.1.  Vergleich der Parentallinie EPG85-257-P versus thermoresistente Variante EPG85-257-P-TR
      • 3.2.2.2.  Vergleich der mitoxantronresistenten Linie EPG85-257-RNOV versus thermoresistente Variante EPG85-257-RNOV-TR
      • 3.2.2.3.  Vergleich der daunorubicinresistenten Linie EPG85-257-RDB versus thermoresistente Variante EPG85-257-RDB-TR
    • 3.2.3.  Pankreaskarzinomzellinie EPP85-181
      • 3.2.3.1.  Vergleich der Parentallinie EPP85-181-P versus thermoresistente Variante EPP85-181-P-TR
      • 3.2.3.2.  Vergleich der mitoxantronresistenten Linie EPP85-181-RNOV versus thermoresistente Variante EPP85-181-RNOV-TR
      • 3.2.3.3.  Vergleich der daunorubicinresistenten Linie EPP85-181-RDB versus thermoresistente Variante EPP85-181-RDB-TR
    • 3.2.4.  Zusammenstellung von mehrfach vorkommenden differentiell exprimierten Proteinen
• 4.  Diskussion
  • 4.1.  Proteom-Analyse
    • 4.1.1. Stellung in der biomedizinischen Forschung
    • 4.1.2. Möglichkeiten und Grenzen der zweidimensionalen Elektrophorese
    • 4.1.3. Diskussion von Elektrophoreseverfahren und Probenaufarbeitung
    • 4.1.4.  Diskussion von Färbemethoden, einschließlich der neu entwickelten Silberfärbung
  • 4.2.  Diskussion der differentiell exprimierten Proteine
    • 4.2.1. Zuordnung in verschiedene funktionelle Gruppen
    • 4.2.2.  Gruppe der molekularen Chaperone
      • 4.2.2.1. Heat Shock Proteine
        • HSP27
        • HSP70
        • HSP90
      • 4.2.2.2. Calcium-bindende Chaperone
        • Calnexin
        • Calreticulin
        • BIP
        • Reticulocalbin
      • 4.2.2.3. Annexin I
      • 4.2.2.4. Nucleophosmin
      • 4.2.2.5. FK506 binding protein 4
      • 4.2.2.6. 14-3-3 Familie
      • 4.2.2.7. Prohibitin
    • 4.2.3. Arzneimittelmetabolismus
      • 4.2.3.1. Glutathionstoffwechsel
      • 4.2.3.2. Thioredoxinstoffwechsel
    • 4.2.4. Komponenten des Cytoskeletts
      • 4.2.4.1. Cytokeratine und Vimentin
      • 4.2.4.2. T-Plastin und Actin-Isoformen
    • 4.2.5.  Weitere differentiell exprimierte Proteine
    • 4.2.6. Überblick der besprochenen Ergebnisse und Ausblick
• 5.  Zusammenfassung
• 6. Literatur
• Anhang
• Abkürzungen
• Danksagung
• Lebenslauf
• Erklärung an Eides Statt

Tabellen

• Tabelle 1.1: Effekte von Temperaturerhöhung auf die Wirkungsweise von speziellen Zytostatika (Issels, 1999)
• Tabelle 2.1: Reagenzienname, Hersteller und Bestellnummer der verwendeten Chemikalien
• Tabelle 2.2: Verwendete Geräte
• Tabelle 2.3: Bezeichnung und Charakteristika der in dieser Arbeit untersuchten Zellinien
• Tabelle 2.4: Protokoll für die Gellösung der 1. Dimension (23cm-Gele)
• Tabelle 2.5: Protokoll für die Gellösung der 1. Dimension (12.5cm-Gele)
• Tabelle 2.6 und 2.7: Protokolle für Teillösungen der Gießlösung für die 2. Dimension
• Tabelle 2.8: Protokoll für die fertige Gießlösung der 2. Dimension
• Tabelle 2.9: Protokoll für den Laufpuffer der 2. Dimension (nach Laemmli)
• Tabelle 3.1: Liste der identifizierten Proteine in der Magenkarzinomlinie EPG85-257-P und ihren fünf Varianten

Bilder

• Abbildung 1.1: Strukturformel von Daunorubicin
• Abbildung 1.2: Strukturformel von Mitoxantron
• Abbildung 2.1:  Offsets als Hilfe zur Erkennung falsch zugeordneter Spots
• Abbildung 2.2:  Schema der einzelnen Schritte der in dieser Arbeit angewendeten Methode anhand eines analytischen Laufes:
• Abbildung 3.1:  Aufbau der Färbekammer (Fotografien);
• Abbildung 3.2: Spotmuster eines mit der Spezial-Silberfärbung angefärbten Gels (EPG85-257-P-TR, 100mg Gesamtprotein) und vier mit Maldi-TOF identifizierte Proteine
• Abbildung 3.3: Zweidimensionales Muster der parentalen Magenkarzinomzellinie EPG85-257-P (Bild eines Gelscans) als repräsentatives Elektropherogramm
• Abbildung 3.4: Vergleich der Spotmuster der parentalen Magenkarzinomlinie EPG85-257-P und ihrer thermoresistenten Variante EPG85-257-P-TR (repräsentative Gelscans wurden als Grundlage der Übersichtsbilder benutzt)
• Abbildung 3.5: Vergleich der Spotmuster der mitoxantronresistenten Magenkarzinomlinie EPG85-257-RNOV und ihrer thermoresistenten Variante EPG85-257-RNOV-TR (repräsentative Gelscans wurden als Grundlage der Übersichtsbilder benutzt)
• Abbildung 3.6: Vergleich der Spotmuster der daunorubicinresistenten Magenkarzinomlinie EPG85-257-RDB und ihrer thermoresistenten Variante EPG85-257-RDB-TR (repräsentative Gelscans wurden als Grundlage der Übersichtsbilder benutzt)
• Abbildung 3.7: Vergleich der Spotmuster der parentalen Pankreaskarzinomlinie EPP85-181-P und ihrer thermoresistenten Variante EPP85-181-P-TR (repräsentative Gelscans wurden als Grundlage der Übersichtsbilder benutzt)
• Abbildung 3.8: Vergleich der Spotmuster der mitoxantronresistenten Pankreaskarzinomlinie EPP85-181-RNOV und ihrer thermoresistenten Variante EPP85-181-RNOV-TR (repräsentative Gelscans wurden als Grundlage der Übersichtsbilder benutzt)
• Abbildung 3.9: Vergleich der Spotmuster der daunorubicinresistenten Pankreaskarzinomlinie EPP85-181-RDB und ihrer thermoresistenten Variante EPP85-181-RDB-TR (repräsentative Gelscans wurden als Grundlage der Übersichtsbilder benutzt)
• Abbildung 4.1: Mögliche Modulatorfunktion des kleinen Heat Shock Proteins HSP27 bei Apoptosevorgängen, schematische Darstellung (modifiziert nach Arrigo, 1998)
• Abbildung 4.2: Mögliche Modulatorfunktion von HSP70 bei Apoptosevorgängen, schematische Darstellung (modifiziert nach Creagh et al., 2000)