Liste an Veröffentlichungen, die aus dieser Arbeit hervorgegangen sind:
Sinha P, Poland J, Schnölzer M, Celis JE, Lage H (2001a) Characterization of the differential protein expression associated with thermoresistance in human gastric carcinoma cell lines. Electrophoresis 22(14):2990-3000.
Sinha P, Poland J, Schnölzer M, Rabilloud T (2001b) A new silver staining apparatus and procedure for matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight analysis of proteins after two-dimensional electrophoresis. Proteomics 1(7):835-840.
Poland J, Schadendorf D, Lage H, Schnölzer M, Celis JE, Sinha P (2002) Study of therapy resistance in cancer cells with functional proteome analysis. Clin Chem Lab Med 40(3):221-234.
Diese Arbeit wurde unterstützt von der Deutschen Krebshilfe (grant 10-1628-La4).
Palliative Therapie inklusive Chemotherapie und andere Behandlungsmethoden wie Hyperthermie ist oftmals die einzig verbleibende Option bei der Behandlung von bestimmten soliden Tumoren wie Magen- und Pankreaskarzinom. Leider ist die kurative Behandlung limitiert durch geringes Ansprechen der Tumore auf die Behandlung und die Entwicklung einer Therapieresistenz.
In dieser Arbeit wurde die globale Proteinexpression von chemo- und thermoresistenten Varianten der Magenkarzinomzellinie EPG85-257 und der Pankreaskarzinomzellinie EPP85-181 mit Hilfe von Proteomics (Kombination aus zweidimensionaler Elektrophorese, computergestützter Gel-Analyse und Massenspektrometrie) in vitro untersucht, um Kandidatenproteine zu finden, die potentiell mit Thermoresistenz bzw. Chemoresistenz assoziiert sind. In diesem Zusammenhang wurde eine mit Maldi-TOF-Massenspektrometrie kompatible Silberfärbung neu entwickelt.
Es zeigte sich eine differentielle Expression einer Vielzahl von Proteinen in den thermoresistenten Zellen, darunter eine Hochregulation von Proteinen mit Chaperonaktivität aus nahezu allen subzellulären Kompartimenten sowie eine Überexpression von Enzymen des Arzneimittelmetabolismus in Zellen mit sowohl chemo- als auch thermoresistentem Phänotyp. Darüber hinaus wurden weitere Proteine identifiziert, welche hinsichtlich ihrer Beteiligung an Resistenzphänomenen im Vorfeld noch gar nicht charakterisiert worden sind (u.a. Aldehyd-Dehydrogenase 1, Transgelin, Phosphoglyceromutase).
Palliative treatment including chemotherapy and other modes of treatment, e.g. hyperthermia, is often the only remaining option in the management of certain solid tumours including gastric and pancreatic carcinoma. Unfortunately, its efficacy is poor due to low tumour sensitivity and the development of therapy resistance.
The aim was to study in vitro global protein expression of chemo- and thermoresistant variants of the stomach cancer cell line EPG85-257 and the pancreatic cancer cell line EPP85-181 using proteomics (two-dimensional electrophoresis in combination with computer-assisted image analysis and mass spectrometry) to identify candidate proteins potentially associated with thermoresistance alone or in combination with chemoresistance. In this context, a silver stain compatible with Maldi-TOF mass spectrometry was developed.
A large number of proteins was found to be differentially expressed in thermoresistant cells, e.g. overexpression of molecular chaperones at practically every sub-cellular level as well as over-expression of enzymes involved in drug metabolism in both chemo- and thermoresistant cells. Furthermore, other proteins that have not yet been linked to resistance phenomena (e.g. aldehyde dehydrogenase 1, transgelin, phosphoglycerate mutase) have been shown to be differentially expressed.
Die Komplexität von malignen Erkrankungen erfordert einen interdisziplinären Ansatz bei Diagnostik und Therapie. Unter Beteiligung multipler medizinischer Fachrichtungen hat sich im Laufe der Jahre ein multimodales Behandlungskonzept etabliert, das neben den klassischen Verfahren Chirurgie, Chemotherapie und Radiatio neuere konservative Methoden wie Hyperthermie und Immuntherapie integriert. Eine Kombination verschiedener Verfahren ermöglicht eine Steigerung der Effektivität auch bei fortgeschrittenen Tumorstadien.
In der gängigen klinischen Praxis ist die zytostatische Chemotherapie unter drei verschiedenen Gesichtspunkten indiziert: für einige wenige maligne Erkrankungen unter kurativem Aspekt, als Palliativtherapie bei fortgeschrittenen Krankheitsstadien verschiedenster Tumoren und als adjuvante bzw. neoadjuvante Behandlung vor, während oder nach lokaler chirurgischer Therapie und/oder Radiatio.
Gründe für den Einsatz von zytostatisch und zytotoxisch wirksamen Chemotherapeutika bei weit fortgeschrittenen Stadien maligner Erkrankungen oder primär generalisierten Neoplasien ergeben sich allein aus der Tatsache heraus, dass multiple Metastasen oder disseminierte maligne Neoplasien wie Leukämien durch Operation oder Bestrahlung nicht bzw. schlecht erreichbar sind. Letztere können teilweise durch eine Polychemotherapie dauerhaft geheilt werden, wie am Beispiel der akuten myeloischen Leukämie gezeigt werden konnte; durch intensive Chemotherapie mit nachfolgender allogener Knochenmarktransplantation kann bei 50% der Patienten in der 1.Remission eine dauerhafte Rezidivfreiheit erreicht werden (Appelbaum et al., 1988).
Unbefriedigend ist aber der Erfolg der zytostatischen Therapie bei soliden Tumoren. Zwar sind einige Tumorentitäten wie Seminone, Osteosarkome und Neuroblastome potentiell durch Chemotherapie heilbar, fortgeschrittene maligne Neoplasien des Gastrointestinaltraktes und der Nieren, maligne Melanome sowie Mammakarzinome lassen sich jedoch höchstens temporär in ihrer Tumormasse reduzieren. Ein Grund, der die Wirksamkeit einer Chemotherapie limitiert, ist das Vorhandensein einer primären intrinsischen oder das Auftreten einer sekundären erworbenen Chemoresistenz, die sich oftmals als simultane Resistenz gegen unterschiedliche Wirkstoffgruppen äußert. Dieses Phänomen der Zy
Die Selektion oder Induktion einer resistenten Subpopulation der Tumorzellen ist wahrscheinlich der hauptsächlich die Effektivität einer Chemotherapie limitierende Faktor.
Das Phänomen der Chemoresistenz kann sowohl primär ohne vorherigen Kontakt zu Zytostatika auftreten, als auch sekundär im Laufe mehrer Therapiezyklen durch Selektion von Zellen, in denen Resistenzfaktoren gesteigert exprimiert werden.
Eine beträchtliche Anzahl von metabolischen oder strukturellen Eigenschaften von Zellen kann zu einer Zytostatikaresistenz führen. Als Übersicht zusammengefasst sind folgende Mechanismen daran beteiligt (Tannock und Goldenberg, 1998):
Geminderte/fehlende Substanzakkumulation des Zytostatikums, bedingt durch verminderte Aufnahme bzw. gesteigerten Efflux
Verminderte Aktivierung des Zytostatikums
Steigerung oder Minderung des Levels an Zielenzymen oder Veränderungen an Zielenzymen
Detoxifikation durch Sulfhydryl-Verbindungen wie Glutathion über Glutathion-S-Transferasen
Protektion durch Induktion von humanen Metallothioneinen, vermutlich durch Neutralisation von externen apoptotischen Signalen
Gesteigerte DNA-Reparatur über Poly(Adenosin diphosphate (ADP)-Ribose)-Polymerase (PARP)-Aktivierung, Proteinkinase C (PKC)
Multiple Veränderungen der Zellzyklus-Regulationsgene mit konsekutivem Apoptoseausfall (z.B. über p16, p53, Bcl-2, BAX)
Weitere
Verschiedene molekulare Ursachen und Mechanismen der multidrug resistance konnten in den letzten Jahren identifiziert und genetisch, biochemisch und pathophysiologisch charakterisiert werden.
Das 170 kDa große P-Glykoprotein (Pgp) gehört zu einer Familie von Molekülen, die als ATP-binding cassette (ABC)-Transporter bezeichnet werden (Childs und Ling, 1994). Dieses Protein mit seiner exkretorischen Funktion ist eine Komponente des Membrantransportsystems gesunder Zellen und findet sich physiologisch in Organen mit Stoffwechselfunktionen wie Leber, Pankreas und Darmmukosa in hohen Expressionsniveaus (Fojo et al., 1987;Thiebaut et al., 1987) und ist in diesen Zellen an der Exkretion von Xenobiotika beteiligt.
Die P-Glykoprotein-Produktion bei Überexpression des mdr1-Gens, am häufigsten als Folge einer Amplifikation oder einer gesteigerten Transkription, ist Ursache für eine klassische Zytostatikaresistenz. Aus einer Erhöhung seiner Expression in neoplastisch transformierten Zellen resultiert ein gesteigerter Zytostatikaefflux und damit eine Senkung der intrazellulären Zytostatikakonzentration.
Eine Vielzahl von Stoffen sind bekannte Inhibitoren von P-Glykoprotein und können die Sensitivität von chemoresistenten Zellen steigern (Bradley et al., 1988;Shustik et al., 1995); dazu gehören z.B. Kalziumkanalblocker (Verapamil). Einige davon sind selbst Substrate des Pgp und hemmen kompetitiv den Zytostatikaefflux, aber auch nicht kompetitive Mechanismen sind an der Inhibition beteiligt. Leider zeigte der Einsatz derartiger Substanzen zur Überwindung von Chemoresistenz in klinischen Studien nicht den erhofften Erfolg, teils wegen der Beteiligung von vielen anderen Mechanismen an der Resistenz, teils durch inadäquate Konzentrationen der Hemmsubstanz im Gewebe bzw. einer verminderten Aktivität in der hohen Zellkonzentration solider Tumoren. Neuere Agenzien mit höherer Affinität und größerer Spezifität werden zurzeit klinisch erprobt.
Alle Formen der MDR, die nicht mit der Überexpression von P-Glykoprotein einhergehen, werden unter dem Begriff atypische MDR zusammengefasst.
An diesen Formen mitbeteiligt sind andere Mitglieder der ABC-Transporter-Superfamilie, zu denen das multidrug resistance protein (MRP) (Cole et al., 1992) und das breast cancer
Ein weiteres Molekül, bekannt als lung-resistance protein (LRP), ist ebenfalls mit pleiotroper Zytostatikaresistenz assoziiert, wahrscheinlich über eine Sequestrierung der Substanzen in intrazellulären Organellen und damit über Regulierung des nucleozytoplasmatischen Transports von Zytostatika (Izquierdo et al., 1996).
Die klinische Applikation der Hyperthermie ist inzwischen in die multimodalen Anti-Tumor-Strategien integriert worden (Falk und Issels, 2001). Denn die Hyperthermie ist durch ihre breite Palette von lokalen und systemischen Auswirkungsmechanismen in der Tumorbekämpfung äußerst effektiv (Pontiggia et al., 1996). Durch Kombination von Chemotherapie und/oder Radiatio mit Hyperthermie lassen sich bei verschiedenen soliden chemotherapieresistenten Tumoren deutlich bessere Behandlungsergebnisse erzielen als durch klassische Methoden allein (Engin, 1994). Ebenso können als nicht mehr resektabel eingeschätzte Tumoren in ein operationsfähiges Stadium gelangen.
Ein weiterer nicht unbedeutender Punkt für den klinischen Einsatz ergibt sich aus der Tatsache heraus, dass die Hyperthermie eine im Allgemeinen verträgliche Therapie darstellt, von der keine schwerwiegenderen Nebenwirkungen bekannt sind.
Hyperthermie wird als Ganzkörperhyperthermie oder lokal als regionale Hyperthermie angewandt. Die klinische Applikation von Wärme kann durch elektromagnetische Strahlen, Ultraschall oder Perfusionsmethoden erfolgen. Letztere Form ist essentiell für die Herangehensweise der Ganzkörperhyperthermie unter Verwendung von extrakorporaler Zirkulation, während regionale Hyperthermie gewöhnlich über extra- oder intrakorporale Mikrowellenapplikatoren vor sich geht.
Die Hyperthermie verfügt über eine breite Palette von tumordevitalisierenden Effekten. Ergebnisse thermobiologischer Studien haben gezeigt, dass in Abhängigkeit von Tempe
In der frühen Phase der Hyperthermie wird die Durchblutung im tumorösen Gewebe stimuliert und dadurch u.a. die Zytostatikazufuhr erleichtert. Bei extremer Hyperthermie über 43°C kommt es zu ausgeprägter Zellschädigung im Tumorparenchym mit Nekrose. Durch Störung von DNA- und RNA-Synthese sowie Steigerung der Plasma- und Lysosomenmembranpermeabilität können andererseits auch Apoptosemechanismen induziert werden, wenn eine Reparatur hyperthermiegeschädigter Zellstrukturen nicht ausreichend möglich ist (Bogovic et al., 1999).
Sekundäre extreme Schäden der vaskulären Komponenten des Tumorstromas mit Blockierung der Mikrozirkulation lösen Hypoxie, Wärmestau im Tumor, lactatbedingte pH-Senkung und Schädigung von Membranstrukturen und Nucleinsäuresynthese aus. Extreme Temperaturen verursachen Konformations-Deformation von Makromolekülen, Denaturierung von Membranen und zytoplasmatischen Proteinen.
Zellen in einem so gearteten Mikromilieu sind höchst sensitiv gegenüber weiterer Hyperthermie und können durch eine Hitzebehandlung in ihrer Zahl reduziert werden (Wilmanns et al., 1999), die keine signifikant negativen Auswirkungen auf normales Gewebe hat. Dies ist auf eine verminderte Thermoregulation in Tumorgeweben zurückzuführen. So können normale Gewebe ihre Durchblutung bei Überwärmung bis auf das Zehnfache steigern, während bei der Perfusion von Tumorgewebe maximal eine Verdopplung möglich ist (Hill, 1992), was eine verbesserte Wärmeabgabe im Normalgewebe nach sich zieht.
Darüber hinaus reduzieren diese die Ansprechrate von Hyperthermie erhöhenden Umgebungsbedingungen die Erfolgsrate von Strahlentherapie, so dass der additive Effekt von Hyperthermie für diese Tumorareale genutzt werden kann.
Hyperthermie kann auf unterschiedliche Weise die Erfolgsrate einer Chemotherapie erhöhen. So wird, wie schon oben erwähnt, durch Steigerung der Perfusion in Tumorgeweben die Zytostatikazufuhr erhöht. Desweiteren wird die Membranfluidität und -permeabilität erhöht, was die Zytostatikapenetration in die Zelle verbessert.
Die Steigerung der Effektivität einer Chemotherapie durch Kombination mit Hyperthermie (Thermochemotherapie) hängt ab von dem verwendeten Zytostatikum (Hahn und Li, 1982). Sensibilisierende Effekte zeigen sich bei alkylierenden Substanzen, Nitroseharnstoffen, Cisplatin, Carboplatin, Anthrazyklinen, Bleomycin, ferner Interferon-gamma
Tabelle 1.1 zeigt die Interaktion von Hyperthermie mit verschiedenen Zytostatika (Issels, 1999)
Zellkulturen, die Temperaturen ausgesetzt sind, welche über normalen Wachstumsbedingungen liegen, reagieren mit reproduktivem Zelltod. Dieser Prozess lässt sich in Überlebenskurven quantifizieren, in denen die Fraktion der überlebenden Zellen semilogarithmisch gegen die gesamte Expositionszeit bei einer bestimmten Temperatur graphisch aufgetragen wird. Die Zahl der überlebenden Zellen hängt von beiden Parametern, der Temperatur sowie der Expositionsdauer, ab. Die so erhaltenen Kurven weisen eine initiale Schulter auf mit anschließendem exponentiellen Abfall, ähnlich den Kurven, die sich nach Exposition gegenüber ionisierender Strahlung darstellen (Laszlo und Venetianer, 1998).
Mitte der 70 Jahre entdeckten zwei unabhängige Forschungsgruppen, dass Zellkulturen, die in gesplitteten Dosen Hyperthermie ausgesetzt wurden, eine größere Überlebensfraktion aufwiesen als solche, die einer Einzeldosis von äquivalenter Dauer ausgesetzt waren (Gerner und Schneider, 1975;Henle und Leeper, 1976). Infolgedessen führte kurzzeitige Exposition von erhöhten Temperaturen mit 20-50% Zellreduktion gefolgt von einer mehrstündigen Erholungsphase bei 37°C zur Entwicklung einer Fähigkeit der Zellen, einen weiteren akuten und sonst lethalen Hitzeschock zu überleben. Diese transiente Resistenz mit definierten Kinetiken von Entwicklung und Rückgang nannte man Thermotoleranz.
Dagegen ist Thermoresistenz eine permanente Eigenschaft, die z.B. durch erhöhte Expression eines Heat Shock Proteins (HSPs), z.B. HSP70 (Laszlo und Venetianer, 1998) oder durch Gentransfer erworben wird.
Laszlo und Li wiesen nach, dass Aminosäureanaloga die Entwicklung von Thermotoleranz bei HA1-Fibroblasten des chinesischen Hamsters inhibieren, während bereits thermotolerante Zellen keinen thermosensitivierenden Effekt durch Aminosäureanaloga zeigen (Laszlo und Li, 1993). Diese Daten unterstützen die Theorie, dass HSPs eine wichtige Rolle bei dem Phänomen Thermotoleranz spielen.
Die genauen Mechanismen des hitzeinduzierten Zelltods bzw. der Physiologie von Thermotoleranz bedürfen weiterhin der Klärung. Man postulierte als Hauptziel des Zelltods unter hyperthermen Bedingungen sowohl Plasmamembran als auch Nucleus. Da Zelltod definitionsgemäß den Verlust reproduktiver Integrität des Nucleus involviert, muss dieser in jedem Fall ultimativ mitbeteiligt sein, auch wenn das Hauptziel woanders liegt. Hyperthermie scheint bei epithelialen und mesenchymalen Zellen eine Art Interphase-Zelltod herbeizuführen, während in Zellen der hämatopoietischen Reihe Apoptose induziert wird.
Die Mechanismen der Physiologie von Thermotoleranz basieren auf zwei Grundkonzepten: erstens verbesserte Schutzmöglichkeiten der Zelle vor thermoinduzierter Schädigung und zweitens effizientere Reparaturfähigkeit in diesen Zellen.
Gastrointestinale Karzinome, einschließlich Magen- und Pankreaskarzinom, weisen eine natürliche Resistenz gegenüber vielen zytostatischen Substanzen auf (Dietel, 1996). Zusätzlich können sie eine sekundäre Resistenz entwickeln, welche das klassische multidrug
In vitro Modellsysteme von Tumorzellinien eignen sich als Untersuchungsmittel von chemoresistentem Verhalten. Über den Einsatz zweier zytostatisch wirksamer Substanzen Daunorubicin und Mitoxantron, denen divergente Resistenzmechanismen zugeschrieben werden, sind aus den parentalen Zellinien EPG85-257 und EPP85-181 resistente Varianten selektioniert worden. Durch Exposition der Zellen gegenüber Daunorubicin wird ein klassischer, also P-Glykoprotein-positiver MDR-Phänotyp induziert, während Mitoxantron eine atypische multidrug-Resistenz vermittelt ohne Überexpression von P-Glykoprotein (Kellner et al., 1997).
Um die Empfänglichkeit von Tumorzellen mit verschiedenen MDR-Phänotypen gegenüber einer Hitzebehandlung zu untersuchen, wurden analog der Etablierung von chemoresistenten Zellen thermoresistente Varianten generiert. Dazu wurden die sensible und die chemoresistenten Linien jedes Karzinomtyps einer gleichförmigen, sich schrittweise erhöhenden Temperatursteigerung ausgesetzt. Mittels dieser Vorgehensweise ist es gelungen, aus allen Ausgangslinien thermoresistente Varianten zu etablieren, die stabil bei einer um 2,4°C erhöhten Umgebungstemperatur bei gleicher Teilungsaktivität im Vergleich zur Referenztemperatur von 37°C kultiviert werden können. Im Klonogenitätsassay zeigten diese Zellen eine um 1-2 Dekaden (bei 45°C) erhöhte Überlebensrate im Vergleich zu den thermosensiblen Ausgangszellen (Lage, persönliche Mitteilung).
Die humane Magenkarzinomlinie EPG85-257 und ihre klassisch und atypisch chemoresistenten Varianten EPG85-257-RDB bzw. EPG85-257-RNOV wurden von Lage et al. hinsichtlich ihrer durch chronische Thermoexposition induzierten Eigenschaften charakterisiert. Verschiedene Schlussfolgerungenkonnten aus den Untersuchungen gezogen werden (Lage, persönliche Mitteilung):
Unter erhöhten Temperaturen kultivierte Zellen zeigten Nekrose
Die Populationsverdopplungszeit der chemoresistenten Linien wurde für die mitoxantronresistente Variante 2-fach, für die daunorubicinresistente 1.4-fach gesteigert
Alle drei Zellinien erreichten chronisch induzierte stabile Thermoresistenz
Resistenz gegenüber akuter Hyperthermie fand sich in der chemosensitiven Parentallinie und der mitoxantronresistenten Sublinie, nicht jedoch in der daunorubicinresistenten Linie
Die erzielte Thermoresistenz war stabil auch nach Gefrieren und Wiederauftauen
Daunorubicin ist ein Anthracyclin-Glycosid-Antibiotikum mit der Summenformel C27H29NO10 · HCl, und folgender Strukturformel:
Strukturformel von Daunorubicin
Es wird hauptsächlich in Kombinations-Therapieschemata zur Behandlung von akuter myeloischer Leukämie verwendet. In modernen Therapieregimes zur Behandlung von Magen- und Pankreaskarzinom wird Daunorubicin nicht verwendet, aber es eignet sich für Modellsysteme von gastrointestinalen Tumoren, da es eine klassische MDR (s.o.) hervorruft.
Mitoxantron ist ein synthetisches Antracendion aus der Gruppe der Anthracyclin-Antibiotika mit der Summenformel C22H28N4O6 · 2HCl und folgender Strukturformel:
Strukturformel von Mitoxantron
Mitoxantron wird aufgrund seiner antineoplastischen Eigenschaften bei Mammakarzinom (auch fortgeschrittene Stadien), Ovarialkarzinom, hepatozellulärem Karzinom, Non-Hodgkin-Lymphom und akuten Leukämien als Zytostatikum eingesetzt. In Kombination mit Cytosin-Arabinosid wirkt es remissionsauslösend bei akuter non-lymphoblastischer Leukämie. Mitoxantron, das eine atypische MDR (s.o.) hervorruft, kann für Modellsysteme genutzt werden, wird jedoch für die Behandlung von Magen- und Pankreaskarzinom nicht eingesetzt.
Für Anthracycline sind eine Vielzahl von wichtigen biochemischen Effekten beschrieben worden, die an den therapeutischen und toxischen Wirkungen dieser Medikamente einzeln oder additiv beteiligt sein können. Indem Daunorubicin in die Basenpaare der DNA-Helix interkaliert und dadurch deren Entwindung induziert, beeinträchtigt es viele Funktionen der DNA, einschließlich DNA- Synthese und DNA- abhängige RNA-Synthese (Aubel-Sadron und Londos-Gagliardi, 1984). Es kommt zu Einzel- und Doppelstrangbrüchen sowie zum Austausch von Schwesterchromatiden. Desweiteren inhibiert Daunorubicin die Aktivität der Topoisomerase II, was zu einer weiteren Induktion von DNA-Strangbrüchen führt (Zunino und Capranico, 1990).
Der genaue Wirkmechanismus von Mitoxantron ist noch nicht vollständig geklärt. Nachgewiesen ist eine Wirkung auf chromosomale Strukturen mit Schädigung der DNA sowie Inhibition der DNA-Topoisomerase II. Eine weitere Eigenschaft des Medikaments ist seine Bindung an Cytokeratin 8, ein Protein des Zytoskeletts, das möglicherweise in die Zellteilung eingreift.
Aufgrund der geschilderten Eigenschaften besitzen Anthracyclin-Pharmaka mutagene und karzinogene Eigenschaften. Wahrscheinlich steht die Spaltung von DNA in Verbindung mit der Erzeugung von freien Radikalen. Die zellschädigende Wirkung kann durch Superoxiddismutase, Katalase und exogene Antioxidantien (z.B. Tocopherol) vermindert werden.
Ferner können Anthracycline mit Zellmembranen interagieren und deren Funktionen verändern. So weisen insbesondere Doxorubicin und Daunorubicin eine spezielle Affinität zu Phospholipiden auf (Aubel-Sadron und Londos-Gagliardi, 1984). Es gibt Anhaltspunkte,
„Proteomics“ oder „Proteom-Technologie“ leiten sich ab von dem Wort Proteom, ein Begriff, der 1995 geprägt wurde (Wasinger et al., 1995). Er bezeichnet die Gesamtheit aller zu einem definierten Zeitpunkt in der Zelle vorhandenen Proteine.
Proteom-Forschung ist ein neueres Gebiet, das das weite Feld der Genomforschung komplementiert. Um komplexe physiologische Vorgänge im Organismus zu verstehen, reicht es nicht aus, das Genom zu entschlüsseln. Es ist notwendig, die Proteine in ihrer Gesamtheit zu erfassen.
Die Biosynthese von Proteinen ist gewebs - bzw. zellspezifisch. Nach der Translation können die Proteine durch verschiedene posttranslationale Modifikationen wie z.B. Phosphorylierung, Glykosylierung oder Acetylierung weiter verändert werden. Aus diesem Grund ist die ein-Gen-ein-Protein-Hypothese nicht mehr haltbar. Das Proteom ist ein dynamisches, sich ständig änderndes Gebilde. Zum einen ist die Proteinbiosynthese zell- oder gewebsspezifisch, zum anderen sind äußere Bedingungen (Temperatur, Stress, Interaktionen mit anderen Zellen, Medikamente) dafür ausschlaggebend, welche Proteine und in welcher Menge diese synthetisiert werden.
Proteomics ist die Analyse der gesamten Proteinmenge, die von einem Genom unter bestimmten Bedingungen exprimiert wird. Es ist der direkte Weg, um Proteine in Zellen, Geweben und Organismen zu identifizieren und quantifizieren bzw. um zu untersuchen, welche posttranslationalen Modifikationen vorgenommen wurden.
Eine weit verbreitete Methode, die es ermöglicht, Proteine aus dem Proteom voneinander zu trennen, ist die 2D-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2D- PAGE). Sie ist geeignet, um viele Tausend Proteinkomponenten in multiplen Proben voneinander zu trennen, darzustellen und zu quantifizieren. Daher ist diese Herangehensweise gegenwärtig ohne Konkurrenz für die Analyse und Darstellung von Proteinexpressionsprofilen, welchen eine Schlüsselrolle im rapide expandierenden Gebiet von Proteomics zukommt.
Die einzelnen Schritte der Proteom-Analyse lassen sich folgendermaßen zusammenfassen (Westermeier, 2000):
Zweidimensionale Elektrophorese
Spot-Detektion
Bildanalyse mit Hilfe geeigneter Software
Exzision der veränderten Proteinspots
Enzymatischer Verdau der Proteine in den Gelstücken
Identifizierung und Charakterisierung der Proteine mittels Massenspektrometrie
Bioinformatik für Proteinidentifizierung und Datenbanksuche
Die Separation von Proteinen in zwei Dimensionen ist über 40 Jahre alt. Smithies und Poulik trennten 1956 als erste Serumproteine mit einer Kombination von Papier- und Stärkegelelektrophorese. Innovationen bei den Elektrophoreseprozeduren und Entwicklung von diskontinuierlichen Puffersystemen verbesserten die 2D-Formen rapide. Gradient-Polyacrylamidgele verfeinerten die Schärfe der Proteinbanden (Margolis und Kenrick, 1967), was, eingesetzt in 2D-Separationen, den Weg ebnete für die Integrierung von isoelektrischen Fokussierungstechniken (IEF) in 2D-Prozeduren mit entweder einfachen (Dale und Latner, 1969;Macko und Stegemann, 1969) oder Gradient- Polyacrylamidgelen (Emes et al., 1975). Die eigentliche 2D-Revolution fand ihren Anfang 1975 mit der Veröffentlichung von drei Beschreibungen über 2D-PAGE unter denaturierender isoelektrischer Fokussierung (Klose, 1975;O'Farrell, 1975;Scheele, 1975) in einer Form, die den meisten heutigen Anwendern vertraut sein dürfte.
Zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese ist das Kernstück der Proteom-Technologie. Dabei handelt es sich um eine Kombination aus isoelektrischer Fokussierung (1.Dimension) und SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (2.Dimension).
Beide Trennungsverfahren beruhen auf unterschiedlichen, voneinander unabhängigen Eigenschaften von Proteinen, einem chemischen Parameter- isoelektrischer Punkt- in der ersten Dimension und einem physikalischen Parameter- Molekulargewicht- in der zweiten. Während der isoelektrischen Fokussierung werden die Proteine in einem pH-Gradienten separiert, bis sie eine stationäre Position erreichen, wo ihre Nettoladung Null ist, also der isoelektrische Punkt (pI) des jeweiligen Proteins erreicht ist.
In der zweiten Dimension erfolgt die Auftrennung orthogonal durch Elektrophorese in Anwesenheit von Natriumdodecylsulfat (SDS). SDS ist ein Detergenz, das an Proteine bindet
Die erste Dimension brachte zu Beginn der 2D-Epoche einige Schwierigkeiten und Rückschläge mit sich; die bei der traditionellen Methode verwendeten Carrier-Ampholyte, die nach Anlegen der Spannung den pH-Gradienten generieren und aufrechterhalten, gefährdeten die Reproduzierbarkeit innerhalb eines Labors durch Unterschiede zwischen den Chargen. Außerdem war es bei dieser Methode nicht möglich, die für präparative Läufe zur Proteinidentifizierung nötigen Probenmengen auf ein einzelnes IEF-Gel aufzutragen. Diese Probleme wurden durch die Einführung von immobilisierten pH-Gradienten gelöst, eine Methode, bei der die pH-Gradienten in der Gelmatrix in Form von Acrylamidoverbindungen, den Immobilinen, kopolymerisiert werden (Bjellqvist et al., 1982;Gorg et al., 1988;Righetti et al., 1990) Allerdings sind auch diese Verfahren nicht ohne Nachteile, so ist z.B. die Reproduzierbarkeit der Spotpositionen in sehr basischen pH-Bereichen noch nicht ausreichend gewährleistet, und die an sich hohe Beladungskapazität der IPG-Gele durch Proteinpräzipitation an der Applikationsstelle limitiert (Lopez und Patton, 1997).
Parallel zu diesem grundsätzlich anderen Prinzip der isoelektrischen Fokussierung wurde die klassische Methode mit Trägerampholyten weiterentwickelt und der Routine-Analytik zugeführt. Einen wesentlichen Beitrag lieferte Anderson mit der Entwicklung des ISO-DALT-Systems (Anderson und Anderson, 1982). Diese Methode basiert auf dem von O`Farrell veröffentlichten Prinzip (O'Farrell, 1975), das als Auftragsseite für die Proben die kathodische Seite des Gels (CIF) vorsieht. Bei dem unabhängig davon zur gleichen Zeit von Klose entwickelte System wird das Proteingemisch dagegen auf die anodische Seite des IEF-Gels (AIF) aufgeladen und die Fokussierung gestoppt, bevor die basischen Proteine das kathodische Ende des Gels erreichen (Klose, 1975). Eine revidierte Form seines ursprünglichen Protokolls veröffentlichte Klose 1995 unter exakter Beschreibung des Verfahrens mit Beweisen für eine gute Reproduzierbarkeit und hochwertige Qualität seiner 2D-Gele (Klose und Kobalz, 1995). Um das bei der AIF bestehende Problem der basischen Proteine, die z.T. nicht in das Gel migrieren, zu lösen, entwickelte O`Farrell das Prinzip der Nonequilibrium pH-Gradient-Elektrophorese. Dabei werden die Proteine wie bei dem Klose-System auf das anodische Ende des Gels appliziert, dann allerdings in einem basischen pH-Gradienten separiert.
Viele Kontroversen haben sich im Laufe der Jahre mit den Vorteilen von IPG versus traditionelle IEF bzw. mit den Vor- und Nachteilen der klassischen IEF-Verfahren untereinander befasst. Zusammenfassend kann man sagen, dass die Resultate bezüglich Auflösung und Reproduzierbarkeit bei allen Methoden nicht signifikant differieren (Lopez und Patton, 1997). Auch bei Verwendung von unterschiedlichen Chargen von Carrier-Ampholyten kann hohe Reproduzierbarkeit bei der klassischen IEF erreicht werden, wie Lopez und Patton mit Hilfe statistischer Analysen in zwei verschiedenen Laboren testeten. Auch der zweite große Nachteil der klassischen Verfahren, die große Proteinmenge für präparative Läufe, ist heute durch Weiterentwicklung der Identifizierungsmethoden überwunden worden, da inzwischen auch Mengen von einigen hundert Mikrogramm zur Spotidentifizierung ausreichen.
Durch diese rasante Entwicklung der hochauflösenden 2D-Elektrophorese in den letzten Jahren mit Erschaffung neuer Proteindatenbanken und Erweiterung schon bestehender ist der Meilenstein für die breite Nutzung und Anwendung der Informationen gelegt. Als eine der wichtigsten auf der Basis von IPG generierten Datenbanken im Internet wäre die SWISS-2DPAGE (Appel et al., 1996;Sanchez et al., 1995) zu nennen. Eine mit Hilfe von traditioneller IEF in Kombination mit Autoradiographie erschaffene Datenbank mit über 800 Proteinspots kann unter der Internetadresse http://proteomics.cancer.dk eingesehen werden.
Der Erfolg einer kombinierten Tumortherapie unter Einbeziehung von Chemotherapie und Hyperthermie wird durch Ausbildung von chemoresistenten und thermoresistenten Tumorzellen deutlich limitiert.
Ein nützliches Instrument zur Untersuchung von Resistenzphänomenen ist die Kultivierung von Zellinien, während klinische Studien an Patienten kaum realisierbar sind. Kombinationen von chemoresistenten mit thermoresistenten Eigenschaften bei humanen Tumorzellen sind bisher in der Literatur nicht befriedigend beschrieben. Vor allem exakte molekulare Mechanismen, die einer Thermoresistenz zugrunde liegen, insbesondere im Hinblick auf eine Korrelation zu Chemoresistenzmechanismen, bleiben ein weitgehend unerforschtes Feld.
Dieses Problem wurde als Ausgangspunkt für diese Arbeit gewählt. Daraus wurden folgende Fragestellungen abgeleitet:
Darstellung des Proteoms von sensiblen sowie chemo- und thermoresistenten Magen- und Pankreaskarzinomzellinien mit Hilfe von zweidimensionaler Elektrophorese
Computergestützte Auswertung der Daten mit Vergleich des Proteinmusters der verschiedenen Tumorzellinien
Feststellung von Proteinen mit unterschiedlicher Expression in den resistenten Linien im Vergleich zur Ausgangslinie und Identifizierung dieser mit Hilfe von Massenspektrometrie und Vergleich mit 2D-Datenbanken
Entwicklung einer mit der Massenspektrometrie kompatiblen Silberfärbung, um eine reduzierte Probenmenge auswerten zu können, durch Wegfall der präparativen Läufe die Prozedur zu verkürzen und Probleme zu umgehen, die sich durch ein variierendes Spotmuster (Silberfärbung für analytische Läufe/Coomassie-Färbung für präparative Läufe) ergeben können
Diskussion einer möglichen Beteiligung der differentiell exprimierten Proteine an Mechanismen, die den Resistenzphänomenen zugrunde liegen unter Zuhilfenahme vorhandener Literatur
Folgende Zellinien wurden als Ausgangsmaterial verwendet:
Die zwölf Zellinien wurden mir freundlicherweise vom Institut für Pathologie der Charité Berlin (Arbeitsgruppe PD Dr. Hermann Lage) in Form von Zellpellets zur Verfügung gestellt. Für jede Zellinie wurden drei Zellpellets aus jeweils unabhängigen, unter gleichen Bedingungen gewachsenen Kulturen als Ausgangspunkt der Experimente genommen. Für Einzelheiten bezüglich Etablierung und Kultivierung der Ausgangslinien EPG85-257-P und EPP85-181-P siehe (Dietel et al., 1990) bzw. (Lage und Dietel, 2002).
Die Selektionierung gegen die Zytostatika erfolgte schrittweise über max. 120 Tage, beginnend mit 0,001 µg/ml mit Daunorubicin bis 2,4 µg/ml und für Mitoxantron bis 0,2 µg/ml, ausgenommen für EPP85-181RNOV bis 0,02 µg/ml.
Die Thermoselektionierung vollzog sich unter kontinuierlicher Temperaturerhöhung von 37°C angefangen über 37,8°C und 38,4°C bis 39,4°C (Lage et al., 2000;Stein et al., 2002).
Zur Aufspaltung der Zellen wird ein Lysepuffer nach Rabilloud (Rabilloud, 1998) verwendet, der aus 7M Harnstoff, 2M Thioharnstoff, 4% CHAPS, 20mM Spermin und 40mM DTT besteht. Davon werden je nach Zellquantität auf das entsprechende Zellpellet zwischen 80 und 300µl pipettiert. Nach 60 Minuten Äquilibrierung bei Raumtemperatur mit zwischenzeitlichem Vortexen wird die Zellsuspension in ein Zentrifugenröhrchen überführt. Anschließend wird die Lösung bei 14000 rpm und 4°C eine Stunde lang zentrifugiert, danach der Überstand ohne die ausgefällte DNA in ein neues Eppendorf-Hütchen abpipettiert.
Es folgt eine photometrische TCA-Proteinkonzentrationsbestimmung (Cheung et al., 1987) mit 1:5 und 1:10 verdünnten Aliquots der Probe. Als Proteinstandards werden Lyphochek I (Gesamtproteinkonzentration 67,0 mg/ml (chargenabhängig)) und Lyphochek II (Konzentration 45,0 mg/ml) verwendet. Für die Eichkurve wird eine Standardreihe mit folgenden Konzentrationen hergestellt:
Die Kontrollreihe sieht folgendermaßen aus:
Es werden nacheinander je zweimal 35µl Standard, Kontrolle und Probe auf eine Rundboden-Mikrotiterplatte aufgetragen (Doppelbestimmung), anschließend wird mit je 100µl 0,1N HCL, dann mit 25µl 20% TCA überschichtet. Dann werden die Konzentrationen am Tecan Spectra Reader bestimmt.
Für die isoelektrische Fokussierung (IEF) in der 1. Dimension wird das von Anderson entwickelte ISO-DALT System (Modell ID 125) verwendet (Anderson und Anderson, 1982).
Zum Gießen der Gele und für die eigentliche Fokussierung dient ein und dasselbe System, bestehend aus einer großen unteren Pufferkammer und einer darin einzuhängenden oberen, in der die 20 Glasröhrchen (28cm bzw. 16cm Länge, 1,5mm ID) befestigt werden. Für den Gießvorgang wird an deren unterem Ende ein Reservoir für die Gellösung montiert; es werden 20 Gele simultan gegossen.
Für die Durchführung der ersten Dimension wurden zwei verschiedene, in Bezug auf die Länge der Gele, ihre Zusammensetzung und einige weitere Details variierende Konzepte angewandt; erstens ein 28cm-Gelsystem nach den Empfehlungen des ISO-DALT-Herstellers zur Darstellung der größtmöglichen Anzahl von Proteinspots (Konzept A) und zweitens ein nach J.E. Celis modifiziertes 16cm-Gelsystem (
Konzept A: Die Herstellung der 23cm langen vertikalen Rundgele erfolgt auf der Basis der konventionellen Gellösung von O´Farrell (O'Farrell, 1975) nach einem vom Hersteller empfohlenen Rezept (Zusammensetzung des selbst hergestellten Carrier-Ampholyt-Gemisches, aufbewahrt in 0.8ml-Aliquots: 20% pH 2.5-5.0, 30% pH 4.0-6.5, 10% pH 5.0-6.0, 20% pH 5.0-8.0, 20% pH 8.0-10.5):
Die Gele werden für mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur auspolymerisiert.
Konzept B: Hierbei werden 12,5cm lange Gele in 16cm-Glasröhrchen nach dem untenstehenden Protokoll (Celis et al., 1994) gegossen, wobei der Hauptunterschied zu Konzept A in der Carrier-Ampholyt-Zusammensetzung besteht.
Der Gießvorgang erfolgt analog zur obenstehenden Beschreibung, nur dass die Gellänge hier 12,5cm erreicht.
Überschüssiges Acrylamid am unteren Ende der Gele wird mittels Skalpell entfernt und die untere Pufferkammer mit 3,26 Liter Wasser und 3,26ml 85% ortho-Phosphorsäure als Anoden-Puffer gefüllt. Als Kathoden-Puffer dient eine entgaste Lösung aus 300µl 10N NaOH ad 150ml Wasser.
Vor dem Präfokussierungs-Schritt, der dazu dient, dass sich aus dem einheitlichen Durchschnitts-pH-Wert des Gels ein linearer, monoton steigender pH-Gradient formiert, indem durch Anlegen eines elektrischen Feldes die mobilen Carrier-Ampholyte je nach Ladung in Richtung Kathode oder Anode wandern, trägt man zum Schutz der Geloberfläche 10µl einer Overlay-Lösung pro Gel auf, die aus 20% Glycerol und 2% Carrierampholyten be
Dann wird bei Konzept A 60 min. lang bei 200V präfokussiert; bei Konzept B erfolgt die Präfokussierung nach einem Programm mit fortschreitender Erhöhung der Voltzahl: 15 min. bei 200V, 30 min. bei 300V, 60 min. bei 400V.
Nachdem in jedes Röhrchen über die Geloberfläche 30µg (Konzept A) Proteinlösung appliziert worden ist, erfolgt die isoelektrische Fokussierung bei 1500V (Stromstärke und Leistung bei 1mA bzw. 1W eingestellt) über Nacht für 20 Stunden. Für Konzept B werden 10µg Protein appliziert und für 19 Stunden bei 400V fokussiert.
Alternativ wird für die präparativen Läufe bis 1mg (Coomassie-Gele) bzw. 100-200µg (Spezial-Silberfärbung) Gesamtprotein aufgetragen.
Für den Gießvorgang der linearen 15% Polyacrylamidgele mit 0,5% Vernetzungsgrad kommt eine bis zu 20 Gelcassetten fassende ISO-DALT Gießkammer zur Anwendung.
Die Gellösung (Celis et al., 1994) wird aus verschiedenen Lösungen zusammengesetzt:
Für den Gießvorgang werden außerdem ca. 250ml 50% Glycerol, um die Gele auf die gewünschte Höhe zu bringen, und wassergesättigtes Butanol zum Überschichten benötigt.
Danach schließt sich die Polymerisationsphase für mindestens 60 min. bei Raumtemperatur an.
Die Rundgele der 1. Dimension werden direkt nach Beendigung der IEF auf die Flachgele der 2. Dimension übertragen. Dazu werden sie unter Verwendung einer 1ml-Spritze mit Hilfe von Wasserdruck aus den Glasröhrchen entladen und unter Vermeidung von Dehnung und Luftblasen nahtlos an die Flachgele angelegt. Zur Fixierung dient eine erhitzte Versiegelungslösung, bestehend aus 0,5% Agarose, 0,1% SDS, 0,29% Tris und 1,5% Glycin. Um die Proteinlauffront während der Elektrophorese verfolgen zu können, wird der Versiegelungslösung als Marker etwas Bromphenol blau zugesetzt.
Nach Verfestigung der Lösung werden je 10 Gele in einen ISO-DALT Tank eingesetzt, der mit 20L Lämmli-Puffer (siehe Tabelle) gefüllt ist.
Für die analytische Auswertung der Gele wird eine alkalische Silberfärbung nach Hochstrasser et al. durchgeführt (
Für 10 Gele werden 2 Liter der jeweiligen Lösung bzw. Wasser verwendet, mit Ausnahme der Silberlösung (2250 ml).
Die einzelnen Schritte der Fixierung und Färbung nach Herausnehmen der Gele aus den Gelcassetten:
5 min. waschen in Aqua dem.
2 x 60 min. Fixierung in 40% Ethanol / 10% Essigsäure
2 h bis über Nacht Fixierung in 5% Ethanol / 5% Essigsäure
5 min. waschen in Aqua dem.
30 min. Sensibilisierung in 1% Glutardialdhyd und 0,5 M Natriumacetat
3 x 10 min. waschen in Aqua dem.
2 x 30 min. Sensibilisierung in 0,05% Naphthalin-1,5-disulfonsäure
4 x 15 min. waschen in Aqua dem.
30 min. Imprägnierung in einer frischen Lösung aus 0,8% Silbernitrat / 1,34% Ammoniak / 0,2% 10N NaOH
4 x 4 min. waschen in Aqua dem.
2-5 min. Entwicklung in 0,06% Zitronensäure / 0,268% Formaldehyd
30 min. Stoppen der Reaktion in 5% Tris / 2% Essigsäure
Das Resultat dieser Färbeprozedur kann anschließend der rechnergestützten Auswertung mit Hilfe des PDQuest Systems von BioRad zugeführt werden.
Für präparative Zwecke wurden zwei verschiedene Färbeprozeduren verwendet: die Coomassie-Färbung nach Neuhoff (Neuhoff et al., 1988) als Routinemethode (gut kompatibel mit der Massenspektrometrie) und eine speziell für Maldi-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight) Massenspektrometrie von unserer Arbeitsgruppe ent
Protokoll für die Coomassie-Färbung nach Neuhoff (Neuhoff et al., 1988):
Fixierung über Nacht in 50% Ethanol / 10% Essigsäure
Färbung über Nacht (mindestens 5 h) in 50% Methanol / 10% Essigsäure / 0,5 g/l Coomassie brillant blue R-250
Entfärbung für mindestens 4 h in 5% Methanol / 12,5% Essigsäure (Lösung mehrmals wechseln)
Aufbewahrung in 7% Essigsäure
Protokoll für die Oberflächen-Silberfärbung (Sinha et al., 2001):
60 min. + über Nacht oder 4 x 30 min. Fixierung in 30% Ethanol / 10% Essigsäure
45 min. Sensibilisierung in 0,3% Kaliumtetrathionat / 0,5 M Kaliumacetat / 30% Ethanol
6 x 10 min. waschen in Aqua dem.
60 min. Imprägnierung in 0,2% Silbernitrat
5-15 sec. waschen in Aqua dem.
30 min. Entwicklung in 3% Kaliumcarbonat / 0,03% Formaldehyd / 0,00125% Natriumthiosulfat-Pentahydrat
30 min. Stoppen der Reaktion in 4% Tris / 2% Essigsäure
waschen in Aqua dem.
Nach Ausschneiden von silbergefärbten Spots sollten diese vor der Massenspektrometrie wieder entfärbt werden, da Silberionen einen Störfaktor darstellen. Dazu werden 2 Stammlösungen mit 30 mM Kaliumferricyanid und 100 mM Natriumthiosulfat vorbereitet, von denen eine Arbeitslösung in 1:1 ratio hergestellt wird. Diese ist instabil und sollte daher frisch sein. Jeder Spot wird mit 30-50µl bedeckt und gelegentlich vorgetextet. Nach Verschwinden der bräunlichen Farbe wird einige Male in Wasser gewaschen, um die Reaktion zu stoppen, anschließend werden 30-50µl 200 mM Ammoniumbicarbonat für 20 min. hinzugefügt. Nach dessen Entfernung und Waschen der Gelstückchen in Wasser werden
In Anschluss an die Silberfärbung werden die zweidimensionalen Gele der rechnergestützten Auswertung zugeführt. Dazu werden die Gele mit dem Densitometer GS 710 eingescannt und mit Hilfe der PDQuest-Software von Bio-Rad analysiert. Als Arbeitsplattform dient ein PC (Pentium III) mit Windows 98 Benutzeroberfläche und in der Peripherie das Densitometer GS 710; die einzelnen Arbeitsschritte werden mit der PDQuest Version 6.1 ausgeführt.
Die zur Analyse der 2D-Gele involvierten Schritte in Kurzform:
Scan-Prozeß → Spot Detektion → Matching & Editing → Datenanalyse → Aufbau einer Datenbank
Schritt 1: Auswahl des zu scannenden Materials (Gel) und der verwendeten Färbung (Silber), der benötigte Filter (grün, transmissiv, 530-570nm Wellenlänge) wird dann automatisch gewählt.
Schritt 2: Durchführung einer Vorschau, um die exakte Position des Objekts zu determinieren.
Schritt 3: Wahl des Auflösungsbereichs, der von 42.3 x 21.2 Pixel für kleine Gele bis 169.3 x 63.5 Pixel für Gele mit breiten Banden reicht; für die meisten Gele dient der mittlere Bereich von 84.7 x 84.7 Pixel.
Schritt 4: Kalibrierung: die Scanner-Platte des GS 710 besitzt eine integrierte Kalibrationsregion sowohl für transmissive als auch für reflektierende Medien. Für Gele wird der Transmissionsmodus gewählt, der von 0 bis 3.0 O.D. reicht. O.D. steht für „Optische Dichte“ und stellt die Einheit der Signalintensität dar; sie ist definiert als dekadischer Logarithmus des Quotienten von abgegebener zu aufgenommener Lichtintensität.
Schritt 5: eigentlicher Scan-Vorgang
Vor der Spot-Detektion kann man einen Filter-Prozess anschließen, wodurch kleine multiple Störerscheinungen wie z.B. fleckförmige Artefakte, die heller oder dunkler als der umgebende Hintergrund sind, beseitigt werden. Dafür bietet PDQuest eine umfangreiche Auswahl an Filtertypen an, die je nach Charakter der Artefakte, ihrer Verteilung (Gauß´sches Profil, einheitliches Profil) und Filtergröße (3x3 Pixels bis 9x9 Pixels) unterschiedlich arbeiten.
PDQuest bietet ein Verfahren zur automatischen Erkennung der Proteinspots an; mit Hilfe der Funktion „Spot Detection Wizard“ lassen sich unter Verwendung eines Korrespondenz-Gels benutzerdefinierte Parameter-Sets erstellen, mit denen alle unter gleichen Versuchsbedingungen hergestellten Gele auf einem einheitlichen Level bezüglich des Pre-Processings und der Sensitivität der Spoterkennung bearbeitet werden.
Die Erstellung eines solchen Parameter-Sets läuft nach folgendem Muster ab:
Schritt 1: Manuelle Markierung je eines besonders schwachen, eines kleinen und des größten Spots sowie einer großen Region mit Überwiegen von Hintergrund gegenüber Spots und Streifen.
Schritt 2: Pre-Processing mit Wahl der gewünschten Methode zur Abziehung des Hintergrundes. Bei der von mir gewählten Methode „Floating Ball“ (Standardeinstellung vom Hersteller) wird das Gel in vertikalen Säulen durch eine rotierende Scheibe, deren Radius automatisch auf dem größten Spot basierend kalkuliert wird, abgetastet. Es ergibt sich eine Dichtemessung mit Maximal- und Minimalwerten. Verbindet man die Basis aller Maximalwerte zu einem Graphen, werden alle Werte unterhalb des Graphen als Hintergrund definiert und rechnerisch subtrahiert.
Weitere Aufgaben des Pre-Processing: Optionale Entfernung von Flecken und Streifen.
Schritt 3: „Find Spot Centers“; manuelle Veränderung der Sensitivität möglich. Diese bestimmt die minimale Signalintensität, die als Spot erkannt wird. Je nachdem, ob zu wenige Spots oder zu viele Artefakte detektiert worden sind, wird man die Sensitivität entsprechend erhöhen bzw. reduzieren.
Anschließend folgt die Spoterkennung auf allen Gelen nach den Richtlinien dieses Parameter-Sets; dabei wird erst ein Gel-Abbild aus jedem ursprünglichen Scan kreiert, das dann einem initialen Glättungsvorgang unterzogen wird. Dabei verringert ein Glättungs-Algorithmus Densitometer-Störeffekte. Er folgen die Hintergrundsubtraktion (s.o.) und ein endgültiger Glättungsvorgang.
Die beiden letzten Schritte beinhalten die Detektion der Spotzentren und die Quantifizierung der Spots. Die Position jedes einzelnen erkennbaren Spots wird lokalisiert, dazu werden die x- und y-Koordinaten bestimmt und gemäß dem Gauß´schen Normalverteilungsmodell die assoziierten Parameter x- sigma und y- sigma sowie die Höhe bestimmt und als Spotinformation abgespeichert.
Jetzt werden die drei verschiedenen Läufe einer Zellinie in einer Vergleichsreihe, dem sog. Matchset, zusammengefasst. Dabei wird ein virtuelles Standardgel erstellt, das die Informationen aller drei Gele in sich vereinigt.
Zuerst wird von einem der drei Gel-Abbilder eine Kopie erstellt, die im weiteren Verlauf alle Informationen der drei Gele in sich speichern wird. Dabei liegt dieser Standard nicht mehr als Gel-Abbild vor, sondern besteht aus einem sog. Gel-Spot File, was bedeutet, dass jeder als solcher erkannte Spot seiner O.D. entsprechend dargestellt wird. Im Gegensatz dazu sind in einem Gel-Abbild, das ja nur der modifizierte Scan ist, auch nicht markierte Spots sichtbar. Bei den anderen Mitgliedern des Matchsets besteht die Möglichkeit, zwischen Gel Abbild und Gel Spot File hin und her zu springen.
Das neue Matchset in seiner unmodifizierten Form besteht jetzt aus vier Bildern: einem Standard in Gel-Spot-Format, der noch identisch mit einem der Mitglieder des Matchsets ist und den drei Mitgliedern. Jetzt schließt sich der Überarbeitungsschritt an, in dem die bei der automatischen Spot-Detektion entstandenen Fehler manuell korrigiert werden. Dieser Editierungsvorgang ist nur auf Gel-Abbild-Basis möglich. Es empfiehlt sich, besonders beim Mitglied, das als Standard fungierte, Sorgfalt walten zu lassen, da der Standard in späteren Phasen als Referenz dient und dann nicht mehr modifizierbar ist.
Als nächster Schritt folgt nun das eigentliche Abstimmen der Gele: Dazu wählt man besonders charakteristische Spots aus, die man sowohl auf dem Standard als auch den anderen Mitgliedern mit Hilfe eines Symbols markiert. Diese Orientierungspunkte dienen dazu, weitere unmarkierte Spots in der Nähe zur Deckung zu bringen. Ca. drei Orientierungspunkte sollten in allen vier Quadranten des Gels gesetzt werden. Falls man auf einem Gel noch auffällige Spots entdeckt (erkennbar an einer Farbkodierung: grün = automatisch erkannt, rot = nicht erkannt), die trotz Vorhandensein in allen Mitgliedern auf diesem nicht erkannt worden sind, kann man sie manuell anpassen. Spots, die nur in einem oder mehreren Mitgliedern, nicht jedoch im Standard vorhanden sind, werden manuell in diesen projiziert.
Das Resultat dieser Prozedur ist ein untergeordnetes Matchset, dessen Standard die Informationen aller drei Gele enthält. Um jetzt zwei verschiedene Zellinien miteinander vergleichen zu können, müssen die Spot-Quantitäten normalisiert werden und aus den Standards beider Linien ein höherrangiges Matchset erstellt werden. Normalisierung bedeutet, dass die rohe Quantität eines einzelnen Spots durch den totalen Intensitäts-Wert aller in dem Gel enthaltenen Pixels dividiert wird. Dazu wird die folgende Formel angewandt:
Normalisierte Spot-Quantität = rohe Spot-Quantität x Skalierungsfaktor x Kompensationsfaktor des Pipettierfehlers / Normalisierungsfaktor
Der resultierende Wert wird in parts per million (PPM) angegeben.
Das übergeordnete Matchset, das jetzt erstellt werden kann, dient dem Vergleich einer Ausgangszellinie mit ihrer thermoresistenten Variante. Dabei kann es sich bei der Ausgangszellinie um die Parentallinie oder eine chemoresistente Variante davon handeln. Von den zwei Standards des untergeordneten Matchsets wird der Standard der Ausgangszellinie als übergeordneter Standard ausgewählt, und der Anpassungsprozeß der Gele mit Setzen von Orientierungspunkten und automatischem und manuellem Spoterkennen wie oben beschrieben durchgeführt.
Für die Kontrolle der Qualität von 2D-Elektrophorese und dem Match-Vorgang stehen mehrere Hilfsmittel zur Verfügung:
Nach Normalisierung und Match-Vorgang bietet PDQuest die Möglichkeit, die Quantitäten eines Gels (Abszisse) gegen die eines anderen Gels (Ordinate) aufzutragen und den Korrelationskoeffizienten zu berechnen.
Desweiteren existieren mehrere Menüs, die es ermöglichen, nicht markierte oder nur partiell zugeordnete Spots sowie Spots, deren Quantität um einen signifikanten Faktor in einem Mitgliedsgel abweicht, herauszufiltern.
2D-Gele sind nie völlig deckungsgleich. Abweichungen ergeben sich aus Inhomogenitäten während des Gießvorgangs in der ersten oder zweiten Dimension, in unterschiedlicher Länge der ersten Dimension durch Ziehen der Rundgele, minimalen Laufzeitvariationen oder Störungen in der Elektrophorese und schließlich durch divergierende Wahl des Ausschnitts beim Scan-Prozeß. Um beim Spotanpassungs-
vorgang zwischen den Gelen entstandene Fehlzuordnungen aufgrund der individuellen
Offsets als Hilfe zur Erkennung falsch zugeordneter Spots
Die Abweichungsvektoren sind normalerweise immer parallel angeordnet, gleich lang und regional ähnlich zahlreich; wenn sie sich lokal überkreuzen, deutet dies auf einen Fehler in der Spotzuordnung hin, sind sie in einer Region spärlich, zeigt dies eine nicht ausreichend zugeordnete Umgebung an.
PDQuest bietet eine Vielzahl von analytischen Werkzeugen an, mit deren Hilfe man Gruppen von Proteinspots zusammenstellen kann, um dann zu determinieren, welche davon statistisch und wissenschaftlich bedeutungsvoll sein könnten.
Da es praktisch unmöglich ist, die gesamte Datenmenge der Experimente auf einmal zu untersuchen, stellt das Programm Methoden zur Verfügung, um die Informationen auf kleinere, überschaubare Teile zu reduzieren. Das geschieht, indem man sog. Analysis Sets kreiert. Alle Spots in einer solchen Analysenreihe erfüllen qualitative, quantitative oder statistische Kriterien, die man selbst spezifiziert.
Qualitative Analysis Set: Selektive Darstellung von On/Off-Phänomenen; dieses Set enthält Spots, deren Quantität „x-mal“ über dem Minimum-Level der Detektion in einem Gel liegt, aber unter diesem in einem anderen Gel.
Arbitrary Analysis Set: Dieses beginnt als „leeres“ Set; man wählt die gewünschten Proteine selbst aus.
Boolean Analysis Set: Kombination aus zwei vorher definierten Analysis Sets, z.B. können unter 1.) und 2.) erstellte Sets mit diesem Menü verknüpft werden. Dabei kann z.B. die selektive Darstellung der Schnittmenge der beiden Sets, d.h. der Proteine, die in beiden Analysis Sets präsent sind im Vordergrund stehen oder auch die Vereinigung beider Sets.
Statistical Analysis Set: Beinhaltet Spots, die je nach dem ausgewählten statistischen Test als signifikant erkannt worden sind. Bei diesem Set müssen Gruppen von Gelen eingeschlossen werden. Um die Relevanz einer Quantitätsänderung in einer Gruppe beurteilen zu können, stehen Student´s T Test, Log Student´s T Test (benötigen mindestens 2 Gele pro Gruppe) bzw. der Mann-Whitney Test (mindestens vier Gele pro Gruppe) zur Verfügung.
Die aus den präparativen Läufen der zweidimensionalen Elektrophorese gewonnenen Spots wurden mit Trypsin verdaut und anschließend mit massenspektrometrischen Methoden identifiziert. Dies wurde freundlicherweise in der Arbeitsgruppe von Frau Dr. Martina Schnölzer (Zentrale Proteinanalytik, DKFZ, Heidelberg) unter Verwendung von „Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation-Time of Flight“ (MALDI-TOF)-Massenspektrometrie und „Post source decay“ (PSD)-Analyse durchgeführt. Die angewendeten Prozeduren sind bei Sinha et al. beschrieben (Sinha et al., 2001). Für allgemeine Informationen über MALDI-Analyse siehe Hillenkamp und Karas (Hillenkamp und Karas, 1990). Details bzgl. peptide mass fingerprint können bei Jensen et al. bzw. Mortz et al. nachgelesen werden (Jensen et al., 1999;Mortz et al., 1994). Eine Übersicht der PSD-Analyse gibt Spengler et al. (Spengler et al., 1992).
Schema der einzelnen Schritte der in dieser Arbeit angewendeten Methode anhand eines analytischen Laufes:
Die Prozedur der neu entwickelten Silberfärbung ist unter 2.2.1.8. beschrieben. Diese eignet sich insbesondere für die Färbung großer Gele (25cm x 20cm), wie sie beim ISO-DALT System von Hoefer verwendet werden. Der Färbevorgang erfolgt in einem speziell dafür konstruierten Apparat, der den Kontakt mit den Gelen auf ein Minimum reduziert. Abbildung 3.1. zeigt den Aufbau dieser Färbekammer: die Gele werden auf Plexiglas-Gittern platziert [b)], welche wie Schubladen in Führungsschienen des Innengestells [a)] eingesetzt werden. Plexiglas-Klemmen an beiden Seiten verhindern, dass die Gele während der Färbung herausrutschen. Das Innengestell wird in eine äußere Kammer eingesetzt, die mit einem Auslass (Passage von ca. 8 Litern pro Minute) zum Ablassen der Lösungen versehen ist. In der Färbekammer können 10 Gele simultan gefärbt werden. Die Färbekammer wird mit einem elektrisch betriebenen Schüttelmechanismus verbunden [c)], dessen Drehgeschwindigkeit variabel ist, um ausreichende Fixierung bzw. Austausch von Substanzen von der Lösung in die Gelphase zu gewährleisten.
Aufbau der Färbekammer (Fotografien);
Ein Gel, dessen Proteinmuster unter Zuhilfenahme dieses Apparates mit der Spezial-Silberfärbung sichtbar gemacht wurde, ist in Abbildung 3.2. dargestellt. Hierbei handelt es sich um eine 2-D Analyse der Proteinfraktion der Magenkarzinomlinie EPG85-257-P-TR. Die aufgetragene Menge betrug 100µg, die erste Dimension wurde in 23cm langen Rundgelen (Konzept A) durchgeführt. Vier zufällig ausgewählte Proteinspots wurden aus dem
Spotmuster eines mit der Spezial-Silberfärbung angefärbten Gels (EPG85-257-P-TR, 100mg Gesamtprotein) und vier mit Maldi-TOF identifizierte Proteine
Die Gel-Abbilder der Magenkarzinomlinie EPG85-257 und der Pankreaskarzinomlinie EPP85-181 enthielten nach automatischer Spot-Detektion und manueller Nachbearbeitung jeweils ca. 1500 Spots. Unter Zuhilfenahme der im Internet verfügbaren Datenbank http://proteomics.cancer.dk bzw. durch Ausschneiden von Gelspots und Proteinidentifizierung mittels Maldi-TOF und Microsequenzierung war es möglich, 140 Spots ihren zugehörigen Proteinen zuzuordnen. In den meisten Fällen entspricht ein Gelspot einem einzelnen Protein, in einigen wenigen Fällen (ca. 5%) befindet sich im Bereich eines Spots ein Gemisch aus zwei oder mehr Proteinen, die sich in dem untersuchten relativ weiten pH-Gradienten an einer Stelle konzentrieren.
Abbildung 3.3. zeigt ein repräsentatives Elektropherogramm, in dem alle bisher identifizierten Proteine markiert sind. Es handelt sich dabei um ein Übersichtsbild, dem ein eingescanntes Gel der Parentallinie EPG85-257-P zugrundeliegt. Dieses ist ein Produkt aus einem 12,5 cm IEF-Gel in der ersten Dimension, das unter vergleichbaren Bedingungen wie die Gele der oben genannten Keratinozyten-Datenbank nach Konzept B hergestellt wurde und somit bestmöglichen Datenbankvergleich erlaubte.
Mit schwarzen Pfeilen markierte Spots sind identifiziert, aber nicht verändert in den chemo- bzw. thermoresistenten Varianten, während rote Pfeile auf differentiell exprimierte Proteine hinweisen, die in den thermoresistenten Varianten signifikant herauf- oder herunterreguliert wurden. Als signifikante Veränderung wurde eine Erhöhung bzw. Erniedrigung der optischen Dichte um das Vierfache definiert. In diesen Bereich fallen nicht relevante Veränderungen, die auf Färbeunterschieden der einzelnen Gele beruhen, mit hoher Wahrscheinlichkeit nicht (Sinha, persönliche Mitteilung). Die Relevanz dieser Fehlerquelle wird durch den oben beschriebenen Vorgang der Normalisierung bei der rechnerisch gestützten Auswertung zusätzlich vermindert.
Die entsprechenden Namen der Proteine sind in Tabelle 3.1. alphabetisch aufgelistet, auch hier sind die veränderten Spots farblich und kursiv hervorgehoben.
Zweidimensionales Muster der parentalen Magenkarzinomzellinie EPG85-257-P (Bild eines Gelscans) als repräsentatives Elektropherogramm
Für jede der drei Ausgangslinien, d.h. die Parentallinien EPG85-257-P bzw. EPP85-181-P und deren gegen Mitoxantron und Daunorubicin chemoresistente Varianten, wurde ein Matchset kreiert, in dem der Ausgangslinie ihre thermoresistente Variante gegenübergestellt wurde.
Um Variationen innerhalb der einzelnen Zellinien erkennen und aussortieren zu können, wurden jeweils drei Gele aus drei verschiedenen Proben der gleichen Linie, deren Zellen unter identischen Bedingungen in unterschiedlichen Zellkulturen gewachsen waren, zu einem untergeordneten Matchset zusammengefasst. Das jeweilige Standardgel dieser sechs untergeordneten Matchsets vereinigte dann die Informationen aller drei Gele in sich, so dass sich eine vergleichbare Grundlage für die Gegenüberstellung von verschiedenen Zellinien ergab.
Von diesen Standards wurden anschließend Ausgangslinie und thermoresistente Variante zu einem übergeordneten Matchset vereinigt, das in zwei Gel-Bildern die Information von zwei mal drei Zellinien enthielt.
Die Analyse des übergeordneten Matchsets der Parentallinie EPG85-257-P und ihrer thermoresistenten Variante EPG85-257-P-TR ergab nach den oben beschriebenen Kriterien relevante Unterschiede bei 19 identifizierten Proteinen. Davon waren 11 Proteine bei der thermoresistenten Variante EPG85-257-P-TR überexprimiert, nämlich Stratifin (14-3-3 σ), BIP (Grp 78), Calreticulin, Cytokeratin 7, Cytokeratin 8, Cytokeratin 19, Cytokeratin 19 Variante, Heat Shock Protein 27 (HSP27), Heat Shock Protein 27 Variante, HSX70 Variante und Reticulocalbin 1. Das Ausmaß der Überexpression wird anhand von Histogrammen im Anhang I, Abschnitt 1averdeutlicht.
Die restlichen acht Proteine zeigten sich differentiell unterexprimiert, und zwar 14-3-3 η, Aldehyd-Dehydrogenase 1, Annexin 1 und seine Variante, Initiation Factor 5A und eine Variante, Vimentin sowie ein niedermolekulares Reticulocalbin, eventuell ein Fragment des hochmolekularen. Das Ausmaß der Unterexpression wird im Anhang I, Abschnitt 1b anhand von Histogrammen verdeutlicht.
Abbildung 3.4. zeigt ein Übersichtsbild, das Gel-Scans der beiden Linien nebeneinander darstellt mit Ausschnittsvergrößerungen im Gelspot-Format der Regionen, in der die veränderten Proteine liegen.
Vergleich der Spotmuster der parentalen Magenkarzinomlinie EPG85-257-P und ihrer thermoresistenten Variante EPG85-257-P-TR (repräsentative Gelscans wurden als Grundlage der Übersichtsbilder benutzt)
Abbildung 3.5. zeigt die Evaluation der atypisch chemoresistenten Karzinomzellinie EPG85-257-RNOV und ihrer thermoresistenten Variante EPG85-257-RNOV-TR. Neunzehn Proteine waren differentiell exprimiert, davon elf überexprimiert in der thermoresistenten Zellkultur und acht herunterreguliert.
Im Einzelnen handelt es sich bei den hochregulierten Spots um die beiden calciumabhängigen Chaperone Calnexin und Calreticulin, wobei letzteres auch in der thermoresistenten Parentallinie EPG85-257-P-TR überexprimiert ist, um ein Homologes des Cancer Oncogene, um Cyclin D2, Cytokeratin 19 und seine Variante (ebenfalls bei EPG85-257-P-TR überexprimiert), um FK506-binding Protein 4 und seine Variante, Glutathion-Transferase M3, HSP 90 und Nucleophosmin. Das Ausmaß der Überexpression wird in Anhang I, Abschnitt 2a anhand von Histogrammen verdeutlicht.
Dagegen herunterreguliert zeigen sich eine 14-3-3-Form (14-3-3 related), das in der thermoresistenten Parentallinie hochregulierte BIP (grp 78), die G-Protein-Unterformen G-beta 1 und 2 (β1- bzw. β2-subunit of G-proteins), Prohibitin, eine homologe Form des GDP dissociation inhibitor Rho GDI, ein Gemisch aus Transgelin 2 und Neuropolypeptide h3 sowie das Translationally Controlled Human Tumour Protein (TCTP). Für das Ausmaß der Unterexpression siehe Histogramme in Anhang I, Abschnitt 2b.
In Abbildung 3.5. ist das Übersichtsbild mit den Veränderungen der mitoxantronresistenten Zellinie EPG85-257-RNOV und ihrer thermoresistenten Variante EPG85-257-RNOV-TR zu erkennen; Ausschnittsvergrößerungen im Gelspot-Format sind um die vollständigen Scans herumgruppiert.
Vergleich der Spotmuster der mitoxantronresistenten Magenkarzinomlinie EPG85-257-RNOV und ihrer thermoresistenten Variante EPG85-257-RNOV-TR (repräsentative Gelscans wurden als Grundlage der Übersichtsbilder benutzt)
Im Fall der Magenkarzinomlinie, die das typische MDR-Phänomen aufweist, nämlich der Linie EPG85-257-RDB und ihrer thermoresistenten Variante EPG85-257-RDB-TR, fanden sich elf Proteine signifikant verändert. In der Variante, die thermischem Stress ausgesetzt worden war, zeigten sich neun Proteine überexprimiert, aber nur zwei herunterreguliert im Vergleich zu der allein chemoresistenten Ausgangslinie. Von den hochregulierten Spots waren einige auch bei der thermoresistenten atypischen MDR-Linie EPG85-257-RNOV-TR differentiell überexprimiert gefunden worden: ein Homologes des Cancer Oncogene, Cyclin D2, Cytokeratin 19, FK506-binding protein 4, Glutathion-Transferase M3 und das Nucleophosmin. Dazu kamen eine Variante des Cyclin D2, die schon in der thermoresistenten Parentallinie EPG85-257-P -TR aufgefallene Variante von HSX70 und die Thioredoxin Peroxidase. Das Ausmaß der Überexpression kann in Anhang I, Abschnitt 3a anhand von Histogrammen eingesehen werden.
Die beiden unterexprimierten Proteine Prohibitin und eine verwandte Form des 14-3-3-Proteins (14-3-3 related) waren ebenfalls wie bei der thermoresistenten mitoxantronresistenten Linie herunterreguliert. Die Histogramme in Anhang I, Abschnitt 3b zeigen das Ausmaß der Unterexpression.
Abbildung 3.6. stellt die daunorubicinresistente Karzinomlinie EPG85-257-RDB ihrer thermoresistenten Variante EPG85-257-RDB-TR gegenüber, wobei auch hier veränderte Regionen markiert und als Gelspot-Ausschnitte vergrößert und beschriftet sind.
Vergleich der Spotmuster der daunorubicinresistenten Magenkarzinomlinie EPG85-257-RDB und ihrer thermoresistenten Variante EPG85-257-RDB-TR (repräsentative Gelscans wurden als Grundlage der Übersichtsbilder benutzt)
Abbildung 3.7. zeigt die Evaluation der parentalen Karzinomzellinie EPP85-181-P und ihrer thermoresistenten Variante EPP85-181-P-TR. 22 Proteine waren differentiell exprimiert, davon siebzehn signifikant überexprimiert in der thermoresistenten Zellkultur und fünf herunterreguliert.
Die hochregulierten Spots wurden als 14-3-3 h, Aldehyd-Dehydrogenase 1, Annexin 1 und Variante, ein Homologes des Cancer Oncogene, Glutathion-Transferase M3, ein HSP70 related Protein KDA Protein 4, hnRNP K, Nucleophosmin, Phosphoglyceromutase, Thioredoxin Peroxidase, Calreticulin, das niedermolekulare Reticulocalbin, Enoyl Coenzym A-Hydratase (short chain, 1, mitochondrial), zwei gamma-Actin-Formen und Creatinkinase (B Kette) identifiziert. Das Ausmaß der Überexpression wird in Anhang II, Abschnitt 1a anhand von Histogrammen verdeutlicht.
Herunterreguliert zeigten sich 14-3-3 σ (Stratifin) und verschiedene Cytokeratine (CK7, CK8, Ck19 und CK19 Variante). Zum Einschätzen des Ausmaßes der Unterexpression siehe Histogramme in Anhang II, Abschnitt 1b.
Im Übersichtsbild von Abbildung 3.7. sind die Gel-Scans der beiden Linien nebeneinander erkennbar mit Ausschnittsvergrößerungen im Gelspot-Format der Regionen, in der die veränderten Proteine liegen.
Die Analyse des übergeordneten Matchsets der mitoxantronresistenten Linie EPP85-181-RNOV und ihrer thermoresistenten Variante EPP85-181-RNOV-TR ergab nach den oben beschriebenen Kriterien relevante Unterschiede bei 25 identifizierten Proteinen. Davon zeigten sich 19 Proteine überexprimiert bei der thermoresistenten Variante EPP85-181-RNOV-TR: zwei 14-3-3 Proteine (14-3-3 ζ und 14-3-3 h), Annexin 1 und seine Variante, ein Heat shock related Protein KDA Protein 4, drei weitere Hitzeschockproteine (HSP90, HSP110 und eine Variante von HSP110), zwei Enzyme des Glutathion-Stoffwechsels (Glutathion-Transferase M3 und Glyoxalase 1), das niedermolekulare Reticulocalbin, ein Valosin containing protein NP009057, eine Isoform des g-Actin, Creatinkinase (B Kette), Mitofilin, zwei Isoformen des T-Plastin und zwei Proteasom-Unterformen (Proteasome 26S subunit und Proteasome subunit, beta type, 7). Für das Ausmaß der Überexpression siehe Histogramme in Anhang II, Abschnitt 2a.
Die restlichen sechs Proteine zeigten sich differentiell unterexprimiert, und zwar auch hier die Cytokeratine CK7, CK8, CK19 und CK19 Variante sowie HSP27 (auch hier wie in der gleichnamigen Magen-CA-Linie nur ganz wenig exprimiert) und Prohibitin. Das Ausmaß der Unterexpression wird in Anhang II, Abschnitt 2b anhand von Histogrammen verdeutlicht.
Abbildung 3.8. zeigt ein Übersichtsbild, das Gel-Scans der beiden Linien nebeneinander darstellt mit Ausschnittsvergrößerungen im Gelspot-Format der Regionen, in der die veränderten Proteine liegen.
Vergleich der Spotmuster der mitoxantronresistenten Pankreaskarzinomlinie EPP85-181-RNOV und ihrer thermoresistenten Variante EPP85-181-RNOV-TR (repräsentative Gelscans wurden als Grundlage der Übersichtsbilder benutzt)
Im Fall der Pankreaskarzinomlinie mit typischem MDR-Phänomen (EPP85-181-RDB) und ihrer thermoresistenten Variante EPP85-181-RDB-TR fanden sich zahlenmäßig nur wenige Spots signifikant verändert. Im Vergleich zu der allein chemoresistenten Ausgangslinie zeigte sich bei der thermoresistenten Variante eine differentielle Überexpression bei vier Proteinen, davon am deutlichsten bei den beiden Isoformen von HSP27, darüber hinaus auch bei der HSX70 Variante und einem proteasomalen Protein. Das Ausmaß der Überexpression wird in Anhang II, Abschnitt 3a anhand von Histogrammen verdeutlicht.
Herunterreguliert waren lediglich zwei Proteine, eines davon ließ sich ausschneiden und ergab Peroxiredoxin 3, das zweite war bei präparativen Läufen nicht wiederzufinden und konnte daher der Maldi-Analyse nicht zugeführt werden. Das Ausmaß der Unterexpression kann in Anhang II, Abschnitt 3b anhand von Histogrammen abgeschätzt werden.
Abbildung 3.9. stellt die daunorubicinresistente Karzinomlinie EPP85-181-RDB ihrer thermoresistenten Variante EPP85-181-RDB-TR gegenüber, wobei auch hier veränderte Regionen markiert und als Gelspot-Ausschnitte vergrößert und beschriftet sind.
Vergleich der Spotmuster der daunorubicinresistenten Pankreaskarzinomlinie EPP85-181-RDB und ihrer thermoresistenten Variante EPP85-181-RDB-TR (repräsentative Gelscans wurden als Grundlage der Übersichtsbilder benutzt)
Ein Teil der oben beschriebenen Proteine zeigt sich bei beiden Karzinomlinien differentiell exprimiert, wobei sowohl gleichgerichtete Veränderungen als auch Gegensätze in den chemo- und thermoresistenten Varianten auftreten. Andere Proteine fallen dadurch auf, dass sie in mehreren thermoresistenten Varianten bei dem gleichen Tumortyp deutlich hoch- oder herunterreguliert sind. Expressionsmuster von einigen dieser Proteine sollen hier beispielhaft anhand von Diagrammen, die alle sechs Linien eines Karzinomtyps beinhalten, aufgezeigt werden.
Beispiel für die Überexpression eines Proteins in beiden Karzinomtypen, aber jeweils in verschiedenen thermoresistenten Linien (Nebenbefund: vernachlässigbare Expression in allen mitoxantronresistenten Zellreihen)
Expression von HSP27 und seiner Variante beim Magenkarzinom:
Expression von HSP27 und seiner Variante beim Pankreaskarzinom:
Diese Ergebnisse wurden zusammen mit den Expressionsmustern für die restlichen wichtigen Heat Shock Proteine HSP60, HSP70 und HSP90 im Westernblot bestätigt (Sinha et al., 2001).
Expression von Annexin 1 und seiner Variante beim Magenkarzinom:
Expression von Annexin 1 und seiner Variante beim Pankreaskarzinom:
Beispiele für die Überexpression von Proteinen nur in den gleichzeitig chemo- und thermoresistenten Varianten
Expression von FK506 binding protein 4 beim Magenkarzinom:
Expression von Cancer Oncogene beim Magenkarzinom:
Expression von Cyclin D2 beim Magenkarzinom:
Beispiel für die Überexpression eines Proteins in allen drei thermoresistenten Linien
Expression von Cytokeratin 19 beim Magenkarzinom:
Durch intensive Forschung in den letzten Jahren sind inzwischen etwa 80 Genome vollständig entschlüsselt, einschließlich des menschlichen Genoms.
Nach Abschluss dieses Genomprojekts ist es daher sinnvoll, die Proteine einer Zelle als dynamische Marker der Genexpression in ihrer Gesamtheit zu analysieren.
Proteomics als Untersuchungsmethode für quantitative Veränderungen des Expressionsniveaus von Proteinen hat sich in den letzten Jahren einen festen Platz in der biomedizinischen Forschung erobert. Durch rapide Weiterentwicklung der verwendeten Technologien konnten die ursprünglich komplizierten und von individuellen Faktoren abhängigen Methoden einer breiten Anwenderschaft zugänglich gemacht werden.
Im Zentrum der Proteom-Analyse stehen die hochauflösende 2D-Elektrophorese mit ihrer Fähigkeit, komplexe Proteingemische aufzutrennen sowie die Massenspektrometrie zur Identifizierung und Strukturanalyse von einzelnen relevanten Proteinen.
Die 2D-Elektrophorese bietet gegenüber anderen Analyseverfahren einige entscheidende Vorteile (Westermeier, 2000):
breiter Toleranzbereich der Probenmenge mit der Möglichkeit, wenige Mikrogramm für analytische Läufe bzw. einige Milligramm für präparative Zwecke aufzutragen
keine Notwendigkeit von Reinigungsmaßnahmen der Proben, wie es z.B. die Chromatographie erfordert
extrem hohe Auflösungskapazität
effiziente Fraktions-Sammelfunktion von 2D-Gelen
Schutz der Proteine innerhalb der Gelmatrix
Idealerweise sollten alle von der Zelle exprimierten Proteine im 2D-Gel enthalten und sichtbar gemacht sein. Diesem Anliegen werden aber Grenzen gesetzt durch Verlust von Proteinen bei Probenvorbereitung und 2-D-Prozedur. Zusätzlich sind sehr basische Proteine trotz verbesserter Methodik immer noch schwer durch 2D-Elektrophorese darstellbar, einige hydrophobe und hochmolekulare Proteine werden im Gel nicht aufgenommen, und manche Proteine, meist regulatorische, sind in derart geringen Zahlen exprimiert, dass die
Für diese Arbeit wurde die 2D-Elektrophorese auf der Basis von konventioneller isoelektrischer Fokussierung in Kombination mit einer hochsensitiven Silberfärbung für analytische sowie einer Spezial-Silberfärbung bzw. Coomassie-Färbung für präparative Zwecke als Methode gewählt.
Die klassische IEF unter Verwendung des ISO-DALT-Systems ist relativ einfach handhabbar und jede Versuchsreihe in vergleichsweise kurzer Zeit durchführbar, da man bis zu 20 Gele simultan laufen lassen kann und das Gießen der Gele für die erste Dimension am gleichen Tag erfolgt wie der Start der Fokussierung. Die Qualität der Gele im mittleren pH-Bereich ist reproduzierbar gut unter Verwendung der käuflich erhältlichen Ampholyte. Untersuchungen bezüglich Auflösung und Reproduzierbarkeit von traditionellen 2D-Verfahren mit guten Resultaten auch im Hinblick auf unterschiedliche Chargen von Carrier-Ampholyten sind in der Literatur beschrieben (Lopez und Patton, 1997).
Unabhängig von der Wahl der 2D-Methode spielt die Probenbehandlung eine Schlüsselrolle, um gute Ergebnisse zu erzielen. Denaturierende Bedingungen bei der Probenvorbereitung mit Hilfe von hochmolarem Harnstoff (gewöhnlich 9 mol/l) bringen auch wasserunlösliche Proteine in Lösung. Außerdem sind hohe Harnstoffkonzentrationen in der Lage, Sekundär- und Tertiärstrukturen aufzubrechen und Protein-Proteininteraktionen zu vermeiden.
Die Solubilisierung der Zellpellets erfolgte unter Verwendung von 2M Thioharnstoff zur weiteren Verbesserung der Lösung von hydrophoben Proteinen (Rabilloud, 1998). Das im Lysepuffer enthaltene zwitterionische Detergenz CHAPS (3-[(3-cholamidopropyl)-dimethyalmino] -propansulfate) ist mit der Massenspektrometrie kompatibel und ist für die Lösung von hydrophoben Bindungen erforderlich. Aufgrund seines höheren Reinheitsgrades ist es nichtionischen Polyolgemischen wie Triton X-100 oder Nonidet NP-40 vorzuziehen. DTT als reduzierende Verbindung verhindert verschiedene Oxidationsschritte bei den Proteinen und ist an der Spaltung der Quartärstruktur von Proteinen beteiligt.
Als Proteinnachweisverfahren für anschließende Bildanalyse wurde eine Silberfärbung nach Hochstrasser et al. (
Die Silberfärbung ist eine extrem empfindliche Methode zur Detektion von Proteinspots in Polyacrylamidgelen. Die Sensitivität ist 100-fach höher als die der Coomassiefärbung, übersteigt auch die Sensitivität von Fluoreszenzmethoden und reicht an die Autoradiographie heran. Nachteile der Silberfärbung, wie kleine Abweichungen in der Reproduzierbarkeit durch Schwankungen in der Färbeintensität von nicht simultan gefärbten Gelen lassen sich in der Regel mit der Analysesoftware überwinden. Ein sensibles Densitometer bietet einen breiten Toleranzbereich für die Färbeintensität, und Hintergrundsubtraktion bei der Erstellung von Gel-Abbildern und entsprechende Normalisierungsschritte während der Matchvorgänge bringen die Spotintensitäten auf ein einheitliches, vergleichbares Niveau.
Die Notwendigkeit für rapide Protein-Identifizierung nach 2-D-Elektrophorese bringt die Entwicklung von neuen Färbemethoden und Verbesserung der massenspektrometrischen Methoden mit sich. Ein Durchbruch für Proteinidentifizierung mit hohem Durchsatz gelang Shevchenko et al. mit der Einführung eines Silberfärbeprotokolls, das mit MALDI-TOF Analyse kompatibel ist (Shevchenko et al., 1996). Darüber hinaus sind kürzlich zwei Techniken vorgestellt worden, die eine akkurate Identifizierung von qualitativen und quantitativen Unterschieden der Proteinexpression ermöglichen können, nämlich „Multiphoton Detection“ von Proteinen, die mit 125I und 131I markiert werden und „2-D-Fluorescence Difference Gel Electrophoresis“ (2D-DIGE). In beiden Fällen werden individuelle Proben mit einem Isotop oder einem fluoreszierenden CyTM-Farbstoff (Cy2, Cy3 oder Cy5) markiert, zusammengemischt und mittels Co-Elektrophorese in einem einzigen Gel aufgetrennt. Durch Einlesen der Gele werden Proteine mit nur einer Markierung sichtbar gemacht. Nachteil beider Methoden ist die Notwendigkeit spezieller Hardware und Software zur Auswertung (Sinha et al., 2001).
Um auch kleineren Laboren, die mit Proteomics arbeiten, eine schnelle, einfach durchführbare und für kleine Proteinmengen geeignete Färbung zu ermöglichen, die eine nachfolgende Identifizierung von Proteinspots erlaubt, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine spezielle Oberflächen-Silberfärbung entwickelt. Damit kann der massive Zeit- und
Um den Färbevorgang zu automatisieren, die Reproduzierbarkeit zu steigern und den Kontakt mit den Gelen auf ein Minimum zu reduzieren, wurde eine elektrisch betriebene Färbe-Apparatur für 10 Gele konstruiert. Da die neu entwickelte Färbung wie alle Silberfärbungen problematischer in Zusammenhang mit der MALDI-Massenspektrometrie ist, weil bereits geringe Keratin-Verunreinigungen die relevanten Peptid-Peaks überdecken können (und diese wegen der geringen Proteinmenge sehr viel schwächer sind), ist der Färbeapparat eine sinnvolle Ergänzung. Im Vergleich zu präparativen Coomassie-Färbungen weist die Silberfärbung entscheidende Vorteile auf:
weitaus höhere Sensitivität, d.h. 10-fach geringere Probenmenge nötig
besser mit den analytischen Gelen vergleichbares Spotmuster
Anfärbung von Proteinen, die keinen Coomassie-Farbstoff aufnehmen
Die relativ geringe Sensitivität der Coomassie-Färbung bei hohen zu applizierenden Proteinmengen ist zusammen mit dem von silbergefärbten Gelen abweichenden Proteinmuster ein Hauptproblem der präparativen 2D-Elektrophorese. Dadurch kann die Menge an Information, die durch den hohen Standard bei analytischer Silberfärbung und computergesteuerter Bildanalyse gewonnen wird, praktisch nicht genutzt werden, da viele differentiell exprimierte Proteine aus den genannten Gründen nicht isolierbar und damit identifizierbar sind. Unsere Silberfärbung überwindet einen Teil dieser Probleme, und wurde für die Identifizierung einiger Proteine mit Erfolg angewendet.
Beide Färbungen wurden ergänzend angewendet, um mit möglichst wenig Aufwand die größtmögliche Anzahl an Proteinen zu identifizieren.
Die Untersuchung der globalen Proteinexpression von chemo- und thermoresistenten Karzinomzelllinien erfolgte in erster Linie mit der Absicht herauszufinden, ob Mechanismen, die Chemoresistenz verursachen, simultan die Entwicklung von Thermoresistenz beeinflussen und vice versa. Interaktionen dieser Art sind in der Literatur wenig beschrieben.
Die Proteom-Analyse ergab für beide untersuchten Karzinomtypen eine Fülle von differentiell exprimierten Proteinen. Viele davon lassen sich unter funktionellen Gesichtspunkten verschiedenen Gruppen zuordnen, die sich z.T. überschneiden und von denen einzelne Mitglieder bereits bei Chemo- und/oder Thermoresistenzphänomenen beschrieben wurden. Dies gilt insbesondere für Mitglieder der Heat Shock Protein-Familie, die zu der großen übergeordneten Gruppe der molekularen Chaperone gehören (Sarto et al., 2000), in die auch die Ca2+-abhängigen Proteine Calnexin und Calreticulin (High et al., 2000), das Nucleophosmin (Okuwaki et al., 2001) sowie das Prohibitin (Nijtmans et al., 2000) und inzwischen auch Annexin I (Rhee et al., 2000) und die 14-3-3-Proteine (Vincenz und Dixit, 1996) einzuordnen sind. Wenn man die Gruppe der Calcium-bindenden Proteine betrachtet, wären dort neben Calnexin und Calreticulin das BIP und das Reticulocalbin als zugehörig zu nennen (Hebert et al., 1995;Ozawa und Muramatsu, 1993).
Andere für Chemoresistenz als relevant beschriebene funktionelle Proteingruppen betreffen den Arzneimittelmetabolismus (Glutathione Transferase M3 (Berhane et al., 1993;Egyhazi et al., 1997;Hao et al., 1994), Glyoxalase I (Di Ilio et al., 1995;Sakamoto et al., 2000), Thioredoxin Peroxidase (Chung et al., 2001), die Modulation von PKC-Aktivität (14-3-3 Familie (Fu et al., 2000), Annexin I (Dubois et al., 1996)) und das Cytoskelett (z.B. verschiedene Cytokeratine (Bichat et al., 1997), Vimentin (Hendrix et al., 1992) und das Actin-bindende Protein T-Plastin (Hisano et al., 1996)). Den Proliferationsmarkern zuzurechnen sind die G-Protein-Komponenten G-β1 und G-β2, der Rho-GDP dissociation Inhibitor und der Initiationsfaktor 5A. Eine weitere Gruppe betrifft Proteine, die als Modulatoren der Genexpression agieren; darunter fällt HSP90, das mit FKBP4, einem Immunophilin, im Komplex vorliegt und mit Steroidrezeptoren interagiert (Peattie et al., 1992;Pirkl und Buchner, 2001;Pratt und Toft, 1997).
Einzelne Proteine wie Cancer Oncogene, Aldehyde dehydrogenase 1, Creatinkinase und das G1 Cyclin D2 sind bisher nicht unter Betrachtung von Assoziation zu Chemo- oder Thermoresistenz bekannt; die Funktion des mitochondrialen Proteins Mitofilin ist noch nicht geklärt.
Ein großer Teil der differentiell exprimierten Proteine gehört der Familie der Hitzeschockproteine (Heat Shock Proteine, HSPs) an.
Die Synthese bzw. Steigerung der Expression von Heat Shock Proteinen wird sowohl bei prokaryoten als auch eukaryoten Zellen durch verschiedene stressinduzierende Faktoren wie sublethalen Hitzeschock, chemische Substanzen oder physikalische Reize ausgelöst (s.u.), die Zustände induzieren, bei denen die Zahl nicht oder fehlerhaft gefalteter Proteine in der Zelle zunimmt. Aufgrund ihrer Funktion, die Erreichung des nativen, korrekt gefalteten Zustandes von Proteinen zu beschleunigen und damit zur Aggregation führende Wechselwirkungen zwischen Proteinen zu verhindern, werden die HSPs als molekulare Chaperone (engl. Chaperone: Anstandsdame) bezeichnet (Löffler, 1998).
Eine Steigerung der Synthese von Heat shock Proteinen kann z.B. durch Aminosäure- oder Glucoseanaloga, PKC-Stimulatoren, Schwermetalle, Ischämie, Natriumarsenit, mikrobiologische Infektionen, Stickoxide, Hormone, Antibiotika, Zytostatika und Malignome hervorgerufen werden.
Die durch Hitzeschock induzierbare Reaktion involviert einen Signaltransduktionsweg, der zu der Aktivierung von Transkriptionsfaktoren führt. Der vorrangige Mechanismus besteht in der Aktivierung von Heat Shock Faktoren (HSFs), die an Heat Shock Elemente (HSEs) binden, welche stromaufwärts von allen Hitzeschockgenen gelegen sind, um die Transkription zu initiieren (Fernandes et al., 1994). Von den zwei humanen HSFs wird HSF1 unter Stressbedingungen, HSF2 dagegen bei der embryonalen Entwicklung und Zelldifferenzierung aktiviert (Morimoto et al., 1994;Wu et al., 1994).
Molekulare Chaperone haben wichtige Funktionen bei der zellulären Antwort auf Stress und bei der Aufrechterhaltung des zellulären Homöostasegleichgewichts. Im Einzelnen handelt es sich um folgende verschiedenen Funktionen und Eigenschaften (Löffler, 1998):
sie hemmen die Proteinaggregation während der Proteinfaltung und -entfaltung
sie beeinflussen Ausbeute und Kinetik während der Proteinfaltung
sie wirken in nahezu stöchiometrischem Verhältnis zu den Proteinen
sie stabilisieren das Mikrofilamentsystem der Zelle
sie sind beteiligt an der Translokation von zellulären Proteinen zwischen verschiedenen Kompartimenten
sie sind mitbeteiligt am Abbau von Proteinen
HSPs lassen sich nach ihren elektrophoretischen Charakteristika in drei Gruppen einteilen, wobei die erste Gruppe die großen Proteine HSP60, 70, 90, 110 (alle auch ohne Hitzeschockbedingungen exprimiert), die zweite Gruppe die Glucose-regulierten Proteine GRP34, 47, 56, 76, 78, 94, 174 (induziert unter Glucose-Deprivation) und die dritte Gruppe die kleinen Heat Shock Proteine HSP27, Ubiquitin und α-Crystallin beinhaltet (Sarto et al., 2000). Eine andere Klassifikation bezieht sich auf verschiedene Chaperon-Familien (die drei Hauptfamilien): die HSP90-Familie, die HSP70-Familie, die Familie der kleinen Chaperone sowie einzelne, keiner größeren Gruppe zugeordnete Proteine, z.B. HSP60 oder HSP40.
Die meisten Mitglieder sind universell konservierte Proteine, repräsentiert durch ein Spektrum von funktionellen Homologen in allen zellulären Kompartimenten. Einige HSPs werden konstitutiv in der Zelle unter Normalbedingungen synthetisiert, andere hauptsächlich durch Stressereignisse hochreguliert.
Die Expression von induzierbaren HSPs korreliert mit einer erhöhten Resistenz gegen Apoptose, ausgelöst durch diverse zytotoxische Substanzen oder hyperthermische Behandlung, wobei eine Beteiligung an Chemoresistenzmechanismen beschrieben ist (Creagh und Cotter, 1999;Samali und Cotter, 1996). Stressproteine spielen außerdem eine Rolle bei der Karzinogenese und bei der Entwicklung von Thermotoleranz. Für den durch HSPs vermittelten Schutz vor Apoptose existieren mehrere Hypothesen, die genauen Mechanismen sind aber weiterhin klärungsbedürftig. Erleuchtung solcher Mechanismen könnte neue Ziele eröffnen, um onkologische Therapiestrategien zu verbessern.
In dieser Arbeit fanden sich Mitglieder aus allen großen HSP-Gruppen verändert: beim Magenkarzinom waren dies das HSP90, eine HSX70-Variante, die in die HSP70-Familie gehört, das BIP, ebenfalls dieser Familie zuzuordnen, und aus der Gruppe der kleinen Heat Shock Proteine das HSP27 und eine Variante davon. Die Pankreaskarzinomlinien zeigten veränderte Expression von HSP90, HSP110 samt Variante, einer HSX70-Variante, den beiden HSP27 Isoformen und einem dem HSP70 verwandten Protein. HSP90, HSP70 und HSP27 als am bisher besten untersuchte Proteine werden im Folgenden bezüglich ihrer Funktion erörtert, an Chemo- und Thermoresistenzmechanismen beteiligt zu sein.
Beschrieben ist eine Beteiligung an Stressresistenz, inklusive Chemoresistenz und Thermotoleranz, eine Rolle bei Wachstum, Differenzierung und Mikrofilament-Organisation und eine entscheidende Modulatorfunktion beim Schutz der Zelle vor Apoptose (Ciocca et al., 1993;Garrido et al., 1999;Guenal et al., 1997;Mehlen et al., 1996).
Eine Schlüsseleigenschaft von HSP27 ist seine schnelle Phosphorylierungsfähigkeit, die während verschiedener zellulärer Bedingungen -physiologisch bei Differenzierungsvorgängen, pathologisch bei Stressexposition- zum Tragen kommt (Sarto et al., 2000).
HSP27 scheint auf verschiedenen Wegen in die Regulation von Apoptose einzugreifen, beschrieben ist eine Inhibition des programmierten Zelltods an mehreren rezeptorvermittelten Pfaden. Dazu gehört die Induktion über den Fas-Rezeptor (CD95, APO-1), über den PKC-Inhibitor Staurosporin, über Monozyten, H2O2 und verschiedene Chemotherapeutika (Garrido et al., 1997;Jaattela und Wissing, 1993;Mehlen et al., 1996;Richards et al., 1996;Samali und Cotter, 1996). Dagegen erfolgt keine Apoptosehemmung durch HSP27, wenn die Einleitung der Apoptose durch p53, UV und Lymphokin-aktivierte Killerzellen (LAK) vermittelt wird (Guenal et al., 1997;Richards et al., 1996;Trautinger et al., 1997). Man vermutet, dass diese Regulatorrolle von HSP27 bei Apoptose über Aufrechterhaltung des Redox-Equilibriums der Zelle vonstatten geht unter essentieller Beteiligung des Antioxidants Glutathion (Arrigo, 1998). HSP27 soll die GSH-Konzentration intrazellulär erhöhen; intrazellulärer oxidativer Stress, hervorgerufen entweder durch gesteigerte Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) oder die Depletion von Antioxidantien (GSH, Catalase, Superoxiddismutase (SOD)) vermag die apoptotische Kaskade auf verschiedenen Wegen zu triggern. ROS ist ein Kollektivbegriff, der freie Radikale wie Superoxid-Anionen und Hydroxylradikale und non-Radikal-Derivate wie H2O2 einschließt. Eine erhöhte Produktion von ROS kann z.B. durch ionisierende Strahlung, Schwermetalle, Anoxie, Hyperoxie, TNFα und verschiedene Pharmaka wie Zytostatika hervorgerufen werden (Becker et al., 1991;Carney et al., 1991;Floyd, 1991;Troll, 1991). Einige Agenzien, die selbst nicht als Oxidantien wirken, generieren ROS während ihrer Apoptoseinduktion.
Eine Depletion von GSH, z.B. durch Buthionin Sulfoximin (BSO), verringert das Reduktionspotential der Zelle erheblich und verursacht dadurch intrazellulären oxidativen Stress ohne Steigerung des ROS-Level (Creagh et al., 2000).
Fas-induzierte Apoptose funktioniert unabhängig von einer Erhöhung der ROS, senkt aber die GSH-Konzentration durch nach außen gerichteten Transport als Teil des apoptotischen Mechanismus (van den Dobbelsteen et al., 1996). Daraus hat man gefolgert, dass
Kürzlich wurde noch ein weiteres Einflussgebiet von HSP27 bei der Inhibition von Apoptose, in diesen Fall durch Etoposid induziert, demonstriert, nämlich die Inhibition der Caspasen-Kaskade auf der Ebene von Caspase 9 stromabwärts von der Cytochrom c-Freisetzung (Garrido et al., 1999).
Eine schematische Zusammenfassung der beschriebenen und vermuteten Eingriffsmöglichkeiten von HSP27 in die stressinduzierte apoptotische Kaskade zeigt Abbildung 4.1. (Arrigo, 1998).
Mögliche Modulatorfunktion des kleinen Heat Shock Proteins HSP27 bei Apoptosevorgängen, schematische Darstellung (modifiziert nach Arrigo, 1998)
Bei den chemo- und thermoresistenten Magenkarzinomzellinien fand sich ein interessantes Expressionsmuster für zwei Isoformen von HSP27 (siehe Ergebnisteil 3.2.4.). Die mehr im basischen Bereich gelegene Form ist nicht phosphoryliert, während die Variante mit niedrigerem pI nach den Informationen der Keratinozyten-Datenbank eine phosphorylierte Isoform des Heat shock Proteins darstellt. Beide Formen verhalten sich in den sechs Linien ähnlich hinsichtlich ihrer Expression: bei einem geringen basalen Level der beiden Proteine in der Parentallinie kommt es zu einer starken Überexpression in der thermoresistenten Linie, während beide Isoformen in der mitoxantronresistenten Linie und ihrer thermoresistenten Variante bis auf eine sehr geringe Expression bei RNOV-TR nicht
In den Pankreaskarzinomzellinien weichen die Expressionsmuster von HSP27 insofern ab, als dass hier in der thermoresistenten daunorubicinresistenten Linie eine deutliche Überexpression auftritt, während beiden Isoformen in der Parentallinie und ihrer thermoresistenten Variante ähnlich exprimiert sind. In den beiden mitoxantronresistenten Linien ist der Level von HSP27 auch hier im kaum messbaren Bereich.
Die Ergebnisse deuten auf eine mögliche Beteiligung von HSP27 an der Entwicklung von dauerhaft thermoresistenten Varianten hin, zumindest bei der parentalen Zellinie der Magenkarzinomlinie und der daunorubicinresistenten Linie beim Pankreaskarzinom. Andererseits scheint das kleine Hitzeschockprotein bei der Magenkarzinomlinie bei der Entwicklung von MDR gegenüber Daunorubicin involviert zu sein. Der Zusammenhang dazu ist durchaus einleuchtend, da Daunorubicin als Topoisomerase II-Inhibitor in der Zelle unter Produktion von ROS wirkt, was wahrscheinlich eine Hauptrolle bei der Induktion von Apoptose durch diese Pharmaka spielt. Die Pankreaslinie verhält sich dagegen deutlich anders, was sich auch im Gesamtbild der veränderten Proteine zeigt. Bei allen untersuchten mitoxantronresistenten Zellinie stehen offensichtlich, obwohl es sich auch hier um ein Topo II-Zielmedikament handelt, andere Mechanismen für Chemo- und Thermoresistenz im Vordergrund.
Auch Mitglieder der HSP70-Familie sind vermutlich an einer gesteigerten Resistenz gegenüber durch oxidativen Stress vermittelte Apoptose beteiligt. So gibt es Berichte darüber, dass HSP70 Apoptose inhibiert, wenn diese durch Ethanol, H2O2, TNF, UV und verschiedene Chemotherapeutika ausgelöst wird. Weiterhin zeigte sich, dass in Leukämiezellen, die unter dem Einfluss der ROS produzierenden zytotoxischen Substanzen Camptothecin und Actinomycin-D standen, die Behandlung mit Antioxidantien gleichermaßen zur Apoptoseinhibition führte wie eine Überexpression von HSP70 (Creagh und Cotter, 1999). Dagegen hat HSP70 keinen inhibitorischen Effekt auf die Fas-vermittelte Apoptose, die unabhängig von ROS abläuft.
Eine weitere Eigenschaft von induzierbarem HSP70 ist seine Fähigkeit, die Aktivierung von p38 Mitogen-aktivierter Kinase (MAPK), die Apoptose induziert, zu hemmen (Gabai et al., 1997). Darüber hinaus kann HSP70 mit p53 und c-Myc interagieren (Hainaut und Milner, 1992;Koskinen et al., 1991). Durch Bindung an mutiertes p53 stabilisiert das
Eine weitere Möglichkeit von HSP70, in Apoptosewege einzugreifen, liegt auf der Ebene der Mitochondrien. Die antiapoptotischen Mitglieder der Bcl-2-Familie hemmen Apoptose wahrscheinlich durch Blockierung der Freisetzung von Cytochrom C (Zamzami et al., 1996). Das Bcl-2-bindende Protein BAG-1 assoziiert u.a. mit der induzierbaren und der konstitutiven Form von HSP70 (Takayama et al., 1997) und verkörpert somit vielleicht ein Intermediärprotein in der Assoziation von Bcl-2 und HSP70.
Einige dieser Modulatoreigenschaften von HSP70 sind in der unten stehenden Abbildung schematisch aufgezeichnet (Creagh et al., 2000).
Mögliche Modulatorfunktion von HSP70 bei Apoptosevorgängen, schematische Darstellung (modifiziert nach Creagh et al., 2000)
Ein Mitglied der großen HSP70-Familie, eine HSX70-Variante, zeigte sich in der thermoresistenten Linie und der thermoresistenten daunorubicinresistenten Variante der Linie EPG85-257 überexprimiert, während das ebenfalls in diese Gruppe zuzuordnende Protein BIP (GRP78) in der thermoresistenten Linie hochreguliert und in der thermoresistenten mitoxantronresistenten Variante herunterreguliert war, letzteres bezogen auf den Level von BIP in der atypisch chemoresistenten Linie.
HSP90 ist eine obligate Komponente von fundamentalen zellulären Prozessen, wie Hormon-Signaltransduktion und Zellzykluskontrolle. Es spielt eine Rolle bei der Organisation des Zytoplasmas zum Schutz von Filamentstrukturen bei Stress.
Wahrscheinlich bildet HSP90 stabile Komplexe mit Aktinfilamenten, wenn der zelluläre ATP-Level fällt (Scheibel et al., 1997). Zusätzlich schützt das Protein Mikrotubuli durch Bindung an Tubulin.
HSP90 und HSP90-Chaperonkomplexe sind auf dynamische Weise involviert in Transportvorgänge im Zytoplasma und in der Promotion von Partikelmigration (Pratt, 1992). Nukleärer Transport von HSP90 wird möglicherweise durch andere Komponenten des HSP90-Komplexes, wie Proteinkinasen oder Steroidrezeptoren vermittelt. Auch eine Beteiligung an RNA-Synthese und Prozessierung ist für HSP90 denkbar, wie aus der Bindungsfähigkeit des Chaperons an sowohl DNA als auch RNA mit relativ geringer Affinität und der Assoziation mit nukleären Strukturproteinen geschlossen wurde (Sarto et al., 2000). Mitglieder der HSP90-Familie sind auch involviert in Proteasom-Wirkungsmechanismen, zusammen mit Actin und Tubulin (Mathew und Morimoto, 1998). Das Proteasom ist ein Komplex aus verschiedenen Untereinheiten mit mutipler proteolytischer Aktivität. Die Herstellung von Peptiden aus zytosolischen Proteinen für den Transport in das endoplasmatische Retikulum, wo sie mit MHC-Klasse I Molekülen assoziieren, wird als eine Funktion des Proteasom vermutet. HSP90 kann mit Actin und Tubulin an der strukturellen Organisation dieses multikatalytischen Komplexes partizipieren.
Ein interessanter Befund ist die Hochregulation von proteasomalen Komponenten in den beiden chemo- und thermoresistenten Pankreaszellinien; in der Linie EPP85-181-RNOV-TR wurden zwei überexprimierte Spots als Proteasome subunit, beta type, 7 und Proteasome 26S subunit, non-ATPase, 10 identifiziert, während in EPP85-181-RDB-TR ein nicht näher identifiziertes proteasomales Protein per Datenbankvergleich bestimmt wurde. In
Mehrfach berichtet wurde die Expression von HSP90 auf der Oberfläche von ruhenden und gestressten Zellen. Eine Funktion dieser Oberflächenmoleküle kann in der Präsentation von Antigenen zu den MHC-I-Molekülen liegen, in Zusammenhang mit der Assoziation zu dem Proteasom (Srivastava et al., 1994).
HSP90 kann auch mit anderen Chaperonen assoziieren, z.B. dem FK506-binding Protein FKBP52, das auch als HSP56 bezeichnet wird, allerdings nur, wenn dieses nicht durch die Casein Kinase II (CK2) phosphoryliert ist (Miyata et al., 1997). Diese Eigenschaften lassen auf eine Rolle in immunologischen Prozessen schließen, die auch für die HSP70-Familie beschrieben wurde.
Calnexin, Calreticulin, BIP und Reticulocalbin gehören zu einer großen Familie von Calcium-bindenden Proteinen in der Membran des endoplasmatischen Reticulum. Man kann diese Proteine in drei verschiedene Klassen einteilen: die erste beinhaltet Proteine mit hoher Ca2+-Bindungskapazität (z.B. BIP, Endoplasmin, PDI, Calreticulin, Calsequestrin), die zweite Ca2+-bindende Proteine mit hoher Affinität (Calreticulin, Calmegin, Calnexin) und die dritte EF-hand-Proteine (Reticulocalbin, ERC-55, Calumenin) (Michalak et al., 1998). Sie sind in ihrer Funktionsausübung als molekulare Chaperone vermutlich vielfach miteinander assoziiert und wirken bei der Aufrechterhaltung der Calcium-Homöostase mit. Ihre Interaktionen untereinander werden wahrscheinlich durch Änderungen der Ca2+-Konzentration im ER-Lumen reguliert.
Calnexin ist ein Membranprotein, das transient mit verschiedenen Proteinen assoziiert, wie dem T-Zell Rezeptor, MHC-Klasse I und II Molekülen, viralen Proteinen und Integrinen (Chevet et al., 1999;Hebert et al., 1995;High et al., 2000). Mit Hilfe von Glykosylierungs-Inhibitoren konnte demonstriert werden, dass Glykoproteine selektiv mit Calnexin assoziieren (Ou et al., 1993).
Calreticulin ist, wie Calnexin, ein Lectin-ähnliches molekulares Chaperon, und teilt mit diesem signifikante Aminosäuren-Sequenzidentität. Es ist involviert in die Biosynthese von einer breiten Vielfalt von Molekülen, darunter Ionenkanäle, Zelloberflächenrezeptoren, Integrine und Transporter (Coppolino und Dedhar, 1998;Hebert et al., 1995;Michalak et al., 1999;Michalak et al., 1998). Eine wichtige Funktion von Calreticulin ist die Regulation der intrazellulären Calciumkonzentration. Dies geschieht durch Steigerung der Ca2+-Speicherkapazität des ER (ein Resultat der Überexpression von Calreticulin) und Modulation der Funktion der Ca2+-ATPase im ER. Außerhalb des ER ist Calreticulin möglicherweise ein Modulator für Zelladhäsion, wie in Calreticulin-defizienten Zellen überprüft wurde, und beteiligt an Integrin-abhängiger Calcium-Signaltransduktion sowie an Steroid-vermittelter Genexpression.
BIP (GRP78) gehört, wie oben erwähnt, zur HSP70-Familie, und ist ein im ER lokalisiertes Mitglied dieser Familie (Gething, 1999;Haas, 1994). HSP70-Proteine führen ihre Chaperonfunktion in Kombination mit HSP40-Proteinen aus, die J-Domänen enthalten. BIP bzw. sein Homologes bei Saccharomyces cerevisiae, Kar2p, interagiert mit drei HSP40-Mitgliedern im ER, nämlich Sec63p, Scj1p und Jem1p. Es bindet im ER neusynthetisierte Proteine vorrübergehend, während missgefaltete, ungruppierte oder unterglykosylierte Proteine, deren Transport vom ER blockiert ist, permanent gebunden werden. Kar2p zeigte sich essentiell für die Proteintranslokation neusynthetisierter Sektretionsvorläufer entlang der ER-Membran und für den Rücktransport von aberranten Polypeptiden, be
Das vierte Protein in dieser Gruppe, Reticulocalbin, enthält eine Sequenz HDEL aus vier Aminosäuren, und scheint als ER-Wiederherstellungssignal zu arbeiten. Reticulocalbin ist ein Mitglied einer Familie von Calcium-bindenden Proteinen mit geringer Affinität und multiplen EF-Händen, die als CREC-Familie bezeichnet wird (Cab45, Reticulocalbin, ERC-45, Calumenin). Diese Proteine sind wahrscheinlich an Sekretionswegen beteiligt, wobei die zelluläre Lokalisation wechseln kann. So sind Reticulocalbin und sein Ratten-Homologes ERC-55 strikt an das ER gekoppelt, Cab45 befindet sich im Golgi-Komplex und Calumenin verteilt sich entlang des Sekretionsweges (Honore und Vorum, 2000;Tachikui et al., 1997;Weis et al., 1994). Durch ihre Zielproteine wie HPV E6 Oncoproteine, Vitamin D-Rezeptor, Schlangentoxin und Topoisomerasen besitzt diese Familie weite funktionelle Signifikanz. Reticulocalbin, das Überexpression in invasiven Mammakarzinomlinien zeigte, könnte in Kombination mit Calnexin, Calreticulin und BIP in Thermoresistenzphänomene involviert sein, mutmaßlich durch seine Funktion als Chaperon im endoplasmatischen Retikulum.
Calreticulin war bei den thermoresistenten Parentallinien von Magen- und Pankreaskarzinom und bei der mitoxantronresistenten thermoresistenten Magenkarzinomlinie überexprimiert; letztere zeigte zusätzlich Überexpression von Calnexin. Das Expressionsverhalten von BIP und Reticulocalbin war dagegen uneinheitlich: BIP war in EPG85-257-P-TR überexprimiert, dagegen in EPG85-257-RNOV-TR unterexprimiert; Reticulocalbin wurde aus zwei im Molekulargewicht stark abweichenden Spots identifiziert -möglicherweise handelt es sich bei dem niedermolekularen um ein Fragment; die hochmolekulare Form war bei EPG85-257-P-TR überexprimiert, während in der gleichen Linie die niedermolekulare herunterreguliert war. Eine Überexpression der niedermolekularen Form fand sich bei EPP85-181-P-TR. In der gegebenen Situation lässt sich dieses komplexe Verhalten der Ca2+-abhängigen Chaperone ohne weitere Charakterisierung der Reticulocalbin-Formen und funktionelle Analysen wie Untersuchung eines möglichen Abbauweges nicht deuten. Die große Vielfalt an Funktionen dieser Proteine macht aber eine möglicherweise direkte Beteiligung zusammen mit den Hitzeschockproteinen an der Entwicklung von Thermoresistenz, eventuell kombiniert mit Chemoresistenz nicht unwahrscheinlich.
Annexine bilden eine Familie von wasserlöslichen, Ca2+-abhängigen membranbindenden Proteinen. Ihre multifunktionellen Eigenschaften schließen eine Beteiligung an Entzündungsreaktionen, Apoptose, Vesikeltransport, Signaltransduktion, Zellproliferation und -differenzierung und Calcium-Homöostase ein, darüber hinaus wurden Annexine als Inhibitoren von Phospholipase A2 charakterisiert (Ahluwalia et al., 1995;Buhl, 1992;Croxtall et al., 1996).
Untersuchungen lassen vermuten, dass metastatische Zellen mit hohem Annexin I (ANX1)-Level Überlebensvorteile besitzen (Pencil und Toth, 1998). ANX1 ist Substrat für einige wichtige Kinasen, darunter die epidermal growth factor receptor kinase und Serin/Threoninkinasen wie PKC (Dubois et al., 1996).
Kürzlich erhobene Daten liefern Beweise dafür, dass ANX1 entscheidende Kriterien für eine chaperonähnliche Funktion erfüllt und deshalb auch als Heat Shock Protein betrachtet werden könnte: Induktion von ANX1 geschieht in Antwort auf verschiedene externe Stress-Stimuli einschließlich Hitzeschock, H2O2 und Arsenit (Rhee et al., 2000). ANX1 kann Zellen vor oxidativem Stress schützen, wie Untersuchungen an H2O2-gestressten Rattenthymozyten (Sakamoto et al., 1996) und ischämie-ausgesetzten Rattenhirnzellen (Relton et al., 1991) ergaben. Immunfluoreszenz und Western Blot-Analyse offenbarten, dass ANX1 während der Stressexposition in der perinukleären Region lokalisiert wird (Rhee et al., 2000). Das gleiche gilt für die Distribution von einigen HSPs (HSP70, HSP40, sHSP) unter Stress, die anschließend in der Erholungsphase schrittweise ins Zytoplasma zurückkehren (Neri et al., 1995;Ohtsuka et al., 1993;van Bergen en Henegouwen et al., 1987;Welch und Feramisco, 1984). Obwohl die funktionelle Signifikanz dieser Beobachtungen gegenwärtig nicht geklärt ist, mögen essentieller Schutz von Kernkomponenten vor Stressschäden und Erleichterung der Faltung von durch den Stress in einen nicht gefalteten Zustand gebrachten Molekülen eine Rolle spielen. Mögliche Funktionen von Chaperonen bei der Inhibition von Apoptose sind weiter oben diskutiert. Denkbar wäre, dass auch ANX1 bei diesen Vorgängen eine Modulatorrolle einnimmt. Berichte darüber sind spärlich, allerdings ist eine Hochregulation von ANX1 bei TNF-induzierter Apoptose mit konsekutiver Inhibition dieser in humanen Leukämiezellen beschrieben worden (Wu et al., 2000).
Die ANX1-Expression in den chemo- und thermoresistenten Karzinomlinien zeigte starke Variationen in Abhängigkeit vom Ursprung des Tumors: die thermoresistente Magen-CA-Linie ließ eine Herunterregulation von ANX1 erkennen, während die chemoresistenten
Dagegen kam es zu einer erheblichen Überexpression des Proteins sowohl in der thermoresistenten Pankreas-CA-Parentallinie als auch in ihrer thermoresistenten und mitoxantronresistenten Variante, was die postulierte Chaperonfunktion des Moleküls unterstreicht. Als Erklärung für dieses Verhalten wäre denkbar, dass dieses Stressprotein andere HSPs ersetzt, die aus nicht erklärbarem Grund in diesen Zellinien nicht induziert werden, wie z.B. HSP27. Dieser Erklärungsversuch stützt sich auf die Beobachtung, dass ANX1 in keiner thermoresistenten Zellinie zusammen mit HSP27 hochreguliert wird; in der Zellinie EPP85-181-P-TR ist interessanterweise kein großes HSP im engeren Sinne überexprimiert, dagegen zahlreiche andere Chaperone wie Nucleophosmin Reticulocalbin, ein Heat shock related Protein und das besprochene Annexin 1.
Nucleophosmin (Symbol: NPM; Synonym: nuceolar protein B23, Numatrin), überexprimiert in EPG85-257-RNOV-TR, EPG85-257-RDB-TR und EPP85-181-P-TR, ist ein Phosphoprotein, das in Tumorzellen in größerer Menge exprimiert wird als in normalen ruhenden Zellen. Wachstumsstimulation von normalen Zellen z.B. durch mitogen-Aktivierung von B-Lymphozyten wird von einem gesteigerten NPM-Level begleitet. Nucleophosmin dient als ein Shuttle-Protein für den nukleolären Transport von ribosomalen Komponenten und ist womöglich in Zusammenarbeit mit anderen nukleolären Proteinen an der Formierung von Ribosomen beteiligt, da es sich in der granulären Region des Nucleolus konzentriert (Borer et al., 1989). Neben diesen Funktionen konnte eine für NPM postulierte Chaperon-Aktivität bestätigt werden: das Protein ist in der Lage, die temperaturabhängige und -unabhängige Aggregation des HIV-1 Rev Proteins zu inhibieren. Darüber hinaus erstreckte sich seine Schutzfunktion auf die Alkohol-Dehydrogenase der Leber, deren Enzymaktivität unter denaturierenden Bedingungen aufrechterhalten werden konnte und auf die Enzyme Carboxypeptidase A und Citratsynthase (Szebeni und Olson, 1999).
Die FK506-bindenden Proteine sind Immunophiline, treten mit Immunsuppressiva wie FK506, Cyclosporin A und Rapamycin in Wechselwirkung und besitzen cis/trans-Isomerase-Aktivität. Zu den FK506-bindenden Proteinen, die nach ihren Molekulargewich
Große Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerasen (PPIasen) wie Cyp40, FKBP51 und FKBP52 sind wichtige Bestandteile des HSP90-Chaperonkomplexes, weswegen man für diese Proteine auch Chaperonaktivität postulierte. Die trans/cis-Isomerisierung von Prolin-Peptidbindungen stellt oftmals den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt bei der Proteinfaltung dar (Brandts et al., 1975;Kim und Baldwin, 1982;Schmid, 1993). Die Chaperonkomplexe bestehen aus je zwei PPIase-Monomeren, die an ein HSP90-Dimer via TPR-Domänen binden (Radanyi et al., 1994;Scheufler et al., 2000). Von den drei PPIasen bindet FKBP52 mit der höchsten Affinität an HSP90 (Pirkl und Buchner, 2001). In höheren Eukaryoten sind die Chaperonkomplexe mit inaktiven Steroidhormon-Rezeptoren assoziiert (Buchner, 1999;Pratt und Toft, 1997), für deren Aktivierung mehrere HSP90-Komplexe unterschiedlicher Komposition benötigt zu werden scheinen. Während des Chaperonzyklus interagiert der Rezeptor auch mit HSP70.
Neben der Co-Chaperon-Funktion weisen die großen PPIasen auch eigenständige Chaperonaktivität auf. Diese wurde in vitro untersucht: FKBP52 des Kaninchens z.B. verhindert thermale Aggregation des Modellsubstrates Citrat-Synthase (Bose et al., 1996), außerdem interagiert FKBP52 direkt mit dem Glukokortikoidrezeptor (Silverstein et al., 1999). Bei humanen Systemen zeigte sich, dass Cyp40 und FKBP51 potentere Chaperone als FKBP52 sind (Pirkl und Buchner, 2001).
In den Magenkarzinomzellinien fand sich FKBP52 bei der thermoresistenten mitoxantronresistenten und der thermoresistenten daunorubicinresistenten Linie überexprimiert und ist daher möglicherweise an der Entwicklung von Thermoresistenz bei bestehender Anthrazyklinresistenz mitbeteiligt.
Die Mitglieder der 14-3-3 Familie sind weitgehend homologe Proteine, die in eukaryoten Zellen ubiquitär vorhanden sind. In Säugetierorganismen sind sieben Isoformen bekannt, die durch griechische Buchstaben gekennzeichnet sind: 14-3-3 beta (β), gamma (γ), epsilon (ε), zeta (ζ), eta (η), sigma (σ), und tau (τ) (Aitken et al., 1995). Die 14-3-3 Proteine existieren hauptsächlich als Dimere mit einem monomeren Molekulargewicht von ca. 30 kDa und einem isoelektrischen Punkt im sauren Bereich bei 4-5.
Eine Eigenschaft der 14-3-3 Proteine ist ihre Fähigkeit, funktionell unterschiedliche Signalproteine zu binden, wie Kinasen, Phosphatasen und Transmembranrezeptoren. Dadurch greifen sie in eine Vielzahl von zellulären Prozessen ein wie mitogene Signaltransduktion, Apoptose, neuronale Entwicklung und Zellzykluskontrolle.
Neben vielen anderen Funktionen wirken 14-3-3 Proteine als sterische Regulatoren, welche die Interaktion ihrer Liganden mit anderen Zellkomponenten verhindern und somit zu einer veränderten intrazellulären Lokalisation oder komplexer Formation führen. Als Beispiel wäre die Unterbrechung der Bad/Bcl-XL-Interaktion zu nennen (möglicherweise ein Mechanismus für die Entwicklung von Resistenzeigenschaften): Unphosphoryliertes Bad bindet Bcl-XL/Bcl-2 im Mitochondrium und wirkt dadurch proapoptotisch. Überlebende Signale stimulieren Kinasen wie Akt/Proteinkinase B (PKB), die Bad phosphorylieren. Phosphoryliertes Bad wird im Cytosol an 14-3-3 gebunden und ist dadurch nicht in der Lage, programmierten Zelltod zu induzieren. Mit Hilfe von Phosphatasen wie Calcineurin kann dieser Prozess umgekehrt werden.
Darüber hinaus wurde schon seit einiger Zeit eine Chaperonfunktion für 14-3-3 Proteine postuliert. Kürzlich konnte dann erstmals experimentell bewiesen werden, dass 14-3-3 η molekulare Chaperonaktivität ausüben kann, indem es den Übergang des Zink-Finger-Proteins A20, einem Inhibitor von TNF-induzierter Apoptose, von unlöslichen punktuellen zytoplasmatischen Strukturen in das lösliche zytoplasmatische Kompartiment fördert (Vincenz und Dixit, 1996).
In den thermoresistenten Magen- und Pankreaskarzinomlinien wurden verschiedene 14-3-3 Formen -14-3-3 σ, 14-3-3 ζ, 14-3-3 η und 14-3-3-verwandte Isoformen- differentiell exprimiert. Bei den Magen-CA-Linien wurde nur Stratifin überexprimiert in der thermoresistenten Parentallinie, während in der gleichen Linie 14-3-3 η herunterreguliert wird. Ebenfalls herunterreguliert wird eine 14-3-3-verwandte Isoform, und zwar besonders stark in der thermoresistenten mitoxantronresistenten Linie (nachdem dieses Protein in der allein mitoxantronresistenten Ausgangslinie stark hochreguliert wurde) und etwas weniger deutlich in der thermoresistenten daunorubicinresistenten Variante.
Beim Pankreas-CA wird genau umgekehrt Stratifin herunterreguliert (thermoresistente Variante der Parentallinie) und 14-3-3 ηin zwei thermoresistenten Linien (EPP85-181-P-TR
In beiden chemoresistenten Varianten der Magenkarzinomlinie EPG85-257 fand sich ein Protein deutlich höher exprimiert als in ihren thermoresistenten Sublinien. Es wurde in der Maldi-Massenspektrometrie als Prohibitin identifiziert. Auch in der mitoxantronresistenten thermoresistenten Pankreaskarzinomlinie EPP85-181-RNOV-TR fand sich dieses Protein herunterreguliert.
Prohibitin ist ein ubiquitär reichlich vorkommendes, evolutionär konserviertes Protein, das in wichtige intrazelluläre Prozesse eingreift wie normale Zellzyklusregulation, replikative Seneszenz, zelluläre Immortalisation und Entwicklung von sporadischen Mammakarzinomen (McClung et al., 1995). Es besitzt antiproliferative Aktivität und bildet zusammen mit Bap37 einen großen Komplex in der inneren mitochondrialen Membran (Nijtmans et al., 2000).Das Hefe-Homologe von diesem Komplex, der Phb1/2 Komplex, kann neu synthetisierte mitochondriale Translationsprodukte stabilisieren, wahrscheinlich durch eine direkte Interaktion mit dem Komplex. Die Tatsache, dass Phb1/2 ein mutimerischer Komplex ist, der native Polypeptide vor Proteolyse schützt, legt eine funktionelle Homologie zu den Chaperonen nahe, unter Berücksichtigung ihrer Fähigkeit, einer falschen Faltung neu synthetisierter Proteine vorzubeugen (Nijtmans et al., 2000).
Denkbar wäre, dass Prohibitin eine Chaperonfunktion in anthrazyklinresistenten Tumorzellinien ausübt, mit Schutzfunktionen gegenüber mitochondrialen Proteinen. Unter Thermoresistenz treten dann andere Chaperone in den Vordergrund, so dass die Expression von Prohibitin zurückgeht.
Innerhalb der Zelle sorgen Antioxidantien für die Aufrechterhaltung des Redox-Gleichgewichts. Das Glutathion-System, das Glutaredoxin und das Thioredoxin-System stellen die Hauptvertreter der reduzierenden Agenzien intrazellulär. Durch ihre Funktion in
Glutathion (GSH)-vermittelte Detoxifikationswege spielen eine zentrale Rolle bei der Inaktivierung und Eliminierung von antineoplastischen Therapeutika und chemischen Karzinogenen. Viele dieser Stoffe verursachen zelluläre Schäden durch Produktion von reaktiven Intermediärprodukten. Ein Mechanismus, durch den Zellen sich selbst vor solchen Schädigungen schützen können, ist die Synthese einer großen Menge von Sufhydrylkomponenten, besonders des Thiols Glutathion, das mit Radikalen reagieren kann, so dass sie in nontoxische Verbindungen übergehen. Reduziertes Glutathion kann Peroxide und freie Radikale inaktivieren, die z.B. unter Anthrazyklinwirkung produziert werden können, ebenso kann es an positiv geladene elektrophile Moleküle binden, wie die aktiven Gruppen von Alkylanzien. Diese Reaktionen werden durch Glutathion-Peroxidasen und Glutathione-S-Transferasen katalysiert. GSH und die assoziierten Enzyme Glutathione S-Transferasen, Peroxidasen, und Reduktase werden häufig in Chemoresistenzmechanismen impliziert (Krishna und Mayer, 2000;Nielsen et al., 1996;Stavrovskaya, 2000;van der Kolk et al., 1999).
Mit GSH konjugierte Pharmaka müssen durch Export-Carrier, bekannt als GSX-Pumpe, oder den Leukotrien C4-Transporter, aus der Zelle geschleust werden. Teilweise geschieht dieser Export durch das MRP, so dass Chemoresistenz mit gesteigerter MRP-Expression wahrscheinlich von GSH-vermittelter Konjugation der Zytostatika abhängt (Loe et al., 1996).
Durch die Konjugation von GSH zu verschiedenen Pharmaka scheinen Glutathione-S-Transferasen eine Rolle zu spielen bei der Entwicklung von Chemoresistenz (Waxman et al., 1992). Fünf unterschiedliche GST-Klassen oder Genfamilien sind identifiziert. Die cytosolischen GST´s werden nach ihren isoelektrischen Punkten klassifiziert in basisch (α-Form), neutral (μ-Form/GST-M3) und sauer (π-Form), die beiden anderen Formen sind die
In den chemo- und thermoresistenten Magenkarzinomzellinien zeigte sich für das Protein GST-M3 eine deutliche Überexpression im Vergleich zu den allein chemoresistenten Ausgangslinien, während beim Pankreaskarzinom dieselbe Isoform bei der thermoresistenten Variante der Parentallinie und besonders bei der mitoxantronresistenten thermoresistenten Linie überexprimiert war.
Möglicherweise steht dieses Phänomen in Zusammenhang mit der Überexpression von HSP27 bei der daunorubicinresistenten Variante der Magenzellinie. Wenn man darüber spekuliert, dass das Enzym ein indirekter Marker für eine mit den verwendeten Methoden nicht messbare Erhöhung der Glutathion-Reserven sein könnte, dann könnte GST M3 einen Resistenzfaktor darstellen. Interessanterweise scheinen diese Ergebnisse aber eher auf eine Beteiligung dieser GST M3-Isoform an Thermoresistenzphänomenen hinzuweisen als an Chemoresistenz, da eine Hochregulation in den allein chemoresistenten Varianten fehlt. Da klärende Experimente, die den gesamten Glutathionstoffwechsel einschließen müssten, den Rahmen dieser Arbeit sprengen würden, ist dies bis jetzt nicht weiterverfolgt worden.
In der mitoxantronresistenten thermoresistenten Variante des Pankreaskarzinoms fand sich neben GST-M3 noch ein weiteres Enzym des GSH-Stoffwechsels, die Glyoxalase I (GLO1), überexprimiert. GLO1 katalysiert die Konversion von Methylglyoxal, einem Nebenprodukt der Glykolyse, zu S-D-Lactoylglutathion. Freies Methylglyoxal reagiert mit biologischen Komponenten der Zelle wie DNA, RNA und Proteinen, wobei es als Konsequenz zur Inhibition ihrer Synthese, zum Abbruch des Zellwachstums und zu Apoptose kommt (Thornalley, 1998). Eine abnorme Expression oder Aktivität der GLO1 konnte u.a. in humanen Karzinomen von Kolon, Niere und Mamma demonstriert werden im Zusammenhang mit gesteigerter Proliferationsaktiviät der Tumoren (Davidson et al., 1999;Di Ilio et al., 1995;Ranganathan und Tew, 1993;Ranganathan et al., 1995;Rulli et al., 2001). Daher wäre auch eine veränderte Proliferation der thermoresistenten Linien eine mögliche Erklärung für die Überexpression. Darüber hinaus fand sich GLO1 in chemoresistenten Leukämie-, Magen- und Kolonzellen überexprimiert (Sakamoto et al., 2000;Sugimoto et al., 1990). Sakamoto et al. untersuchten den Effekt von GLO1 auf Zytostatika-induzierte Apoptose in Leukämiezellen und postulierten, dass GLO1 einen Signaltransduktionsweg an einem Punkt oberhalb der Caspase-Aktivierung blockiert und somit einen apoptoseresistenten Faktor darstellt (Sakamoto et al., 2000). Daraus ließe sich die Hypothese ableiten, dass unter Einbeziehung dieses Enzyms auch Apoptosevorgänge, die durch
Das in den Stoffwechsel des Thioredoxins involvierte Enzym Thioredoxin Peroxidase fand sich in zwei thermoresistenten Linien überexprimiert, nämlich in der daunorubicinresistenten Magenkarzinomlinie EPG85-257-RDB-TR und in der Pankreaskarzinomlinie EPP85-181-P-TR. Demgegenüber zeigte sich Peroxiredoxin 3 in EPP85-181-RDB-TR differentiell unterexprimiert. Nicht nur gegenüber seiner thermoresistenten Variante, sondern auch im Vergleich zu der parentalen Pankreaskarzinomlinie war das Protein in der daunorubicinresistenten Sublinie überexprimiert, so dass man unter dieser Betrachtungsweise eher von einer Überexpression in chemoresistenten Zellen sprechen könnte ohne Beteiligung an Thermoresistenz.
Thioredoxin Peroxidase (Symbol: Tpx; Synonym: Peroxiredoxin) ist zusammen mit Thioredoxin (Symbol: Trx;) und Thioredoxin Reduktase (Symbol: TR) in einer zytoplasmatischen Redoxkette verbunden, die Peroxid-Reduktion zu NADPH-Oxidation paart. Eine Form der Thioredoxin Peroxidase, das Peroxiredoxin 2 (Prx II), reduziert Peroxide mit Hilfe von Reduktionsäquivalenten, die durch das Thioredoxin-System bereitgestellt werden. Sie spielt wahrscheinlich eine wichtige Rolle in der Elimination von Peroxiden, die bei Stoffwechselvorgängen generiert werden. Man vermutet, dass dieses Enzym in den Signal-Kaskaden von Wachstumsfaktoren und TNF-α partizipiert, indem es die intrazelluläre Konzentration von H2O2 reguliert. Eine Steigerung der Expression von Prx II inhibierte Cisplatin- und H2O2-induzierte Apoptose; diese Resultate demonstrierten, dass Resistenz gegenüber diesen Agenzien auf eine Inhibition der apoptotischen Maschinerie zurückzuführen ist (Chung et al., 2001).
Die Beteiligung von Mitgliedern des Thioredoxin-Systems an Thermoresistenz-Phänomenen ist bisher in der Literatur nicht beschrieben und bedarf weiterer Klärung. Die Ergebnisse bei den untersuchten thermoresistenten Linien sind bei Magen- und Pankreaskarzinom uneinheitlich und lassen daher in diesem Kontext keine Hypothese zu.
Das Cytokeratinnetzwerk der Zelle ist ein weiträumiges System, dessen Funktion zu großen Teilen nicht genau bekannt ist. Cytokeratine (CK) repräsentieren eine komplexe
Diverse Modifikationen des Cytoskeletts sind mit maligner Zelltransformation assoziiert. So wird das Cytokeratinpaar CK8 und CK18 vielfach und persistent in Karzinomzellen exprimiert, was zu der breiten Verwendung von monoklonalen Keratinantikörpern als diagnostische Marker für derartige Tumoren führte. Darüber hinaus lassen neuere Daten vermuten, dass Cytokeratine in MDR-Phänomene involviert sind. Bauman et al. konnten nachweisen, dass Transfektion von Maus L Fibroblasten mit CK 8 und CK18 in Anwesenheit von Chemotherapeutika wie Mitoxantron, Doxorubicin und Vincristin in einem Vielfachresistenz-Phänotyp resultiert (Bauman et al., 1994). Da die intrazelluläre Substanzakkumulation nicht betroffen war, beeinflussen Cytokeratine möglicherweise die intrazelluläre Verteilung von Zytostatika, so dass nukleäre Ziele geschont werden. Keratinabhängige Chemoresistenz kann in verschiedenen Zellinien, aber nicht für alle DNA-schädigenden Substanzen beobachtet werden (Anderson et al., 1996).
Die Expression der Cytokeratine 19, 7 und 8 variierte stark in Abhängigkeit vom Karzinomtyp bei den chemo- und thermoresistenten Zellen. Bei den Magen-CA-Linien fand sich in allen drei thermoresistenten Linien eine deutliche Überexpression von CK19 plus seiner Variante, und zusätzlich eine Hochregulation von CK7 und CK8 in der thermoresistenten nicht chemoresistenten Parentallinie. Genau umgekehrt war eine signifikante Unterexpression all dieser Keratine in der thermoresistenten und mitoxantronresistenten thermoresistenten Variante bei den Pankreaszellen zu verzeichnen. Wie diese gegensätzliche Regulation zustande kommt, lässt sich aus den Ergebnissen und den existierenden Veröffentlichungen über Cytokeratinfunktionen und -regulation nicht ableiten. Möglicherweise handelt es sich hier um eine unspezifische Begleitreaktion.
Auch Vimentin ist eine Komponente der Intermediärfilamente, die zusammen mit den aktinhaltigen Mikrofilamenten und den Mikrotubuli die Elemente des Cytoskeletts bilden. Es findet sich wie einige Cytokeratine ebenfalls in chemoresistenten Karzinomzellen verän
Vimentin war sich in der thermoresistenten Magen-CA-Linie EPG85-257-P-TR auf kaum nachweisbare Level herunterreguliert. In der jetzigen deskriptiven Situation kann diese Beobachtung nicht ausreichend gedeutet werden; eine Beteiligung von Cytoskelett-Komponenten an der Entwicklung von Thermoresistenz scheint zwar nicht ausgeschlossen, aber bei der gegensätzlichen Regulation der Cytokeratine eher unwahrscheinlich zu sein.
In der Pankreaslinie EPP85-181-RNOV-TR fanden sich zwei Isoformen des T-Plastins gegenüber der allein mitoxantronresistenten Ausgangslinie überexprimiert. Plastine bilden eine Familie von Actin-bindenden Proteinen, die in normalen und malignen Zellen differentiell exprimiert werden (Lin et al., 1988). T-Plastin-Überexpression ist auch im Zusammenhang mit Cisplatin-Resistenz bei verschiedenen Karzinomen beschrieben, wobei eine funktionelle Beziehung zwischen Ausmaß von Überexpression und Resistenz besteht. Der zugrundeliegende Mechanismus ist nicht geklärt; Vermutungen reichen von Interaktionen des Plastin-assoziierten Actin mit der intrazellulären Verteilung von Cisplatin bis zur Beeinflussung des für den Cisplatin-Efflux verantwortlichen Transporter (Hisano et al., 1996).
Neben den genannten Actin-bindenden Proteinen zeigten sich Proteinspots in den thermoresistenten Pankreaslinien EPP85-181-P-TR und EPP85-181-RNOV-TR überexprimiert, die sich massenspektrometrisch als Formen des γ-Actins herausstellten, obwohl der isoelektrische Punkt dieser Spots deutlich basischer ist als der des an bekannter Stelle fokussierenden Actins. Die Bedeutung dieser Isoformen ist weiterhin klärungsbedürftig; möglicherweise handelt es sich auch um gemischte Spots aus Actin und einem wegen geringen Mengen nicht zu identifizierenden Actin-bindenden Protein oder um durch Stoffwechselvorgänge verändertes Actin.
Die übrigen Proteine, die in den chemo- und thermoresistenten Magen- und Pankreas-Karzinomlinien differentielle Expression aufwiesen, sind bisher nicht im Zusammenhang mit Resistenzmechanismen von Tumorzellen beschrieben worden.
Einige der Proteine repräsentieren bekannte Enzyme regulärer Stoffwechselwege der Zelle, wie Phosphoglyceromutase (hochreguliert in EPP85-181-P-TR), Aldehyd-Dehydrogenase 1 (Unterexpression in EPG85-257-P und Überexpression in EPP85-181-P-TR), Kreatinkinase (B chain hochreguliert in EPP85-181-P-TR und EPP85-181-RNOV-TR) und Enoyl CoA Hydratase (Überexpression in EPP85-181-P-TR).
Transgelin (hochreguliert in der atypisch chemoresistenten Linie EPG85-257-RNOV und herunterreguliert in ihrer thermoresistenten Variante) ist ein Actin-assoziiertes Polypeptid (Shapland et al., 1993), das in glatten Muskelzellen und anderen mesenchymalen Zellen vorkommt; Daten bezüglich seiner Funktion sind spärlich. Mitofilin ist ein erst kürzlich charakterisiertes, ursprünglich auch als heart muscle protein bezeichnetes Protein; es ist ein transmembranäres Protein der inneren mitochondrialen Membran, dessen Funktion bisher nicht bekannt ist (Gieffers et al., 1997). Es wird vermutet, dass es als ATP-gesteuertes Motor-Protein mit Zytoskelett-Komponenten interagiert (Icho et al., 1994).
Das Protein „Cancer Oncogene“ (identifiziert per Datenbankanalyse), das in beiden chemo-thermoresistenten Magenkarzinomlinien und der thermoresistenten chemosensiblen Pankreaskarzinomlinie überexprimiert war, ließ sich aufgrund seiner vagen Bezeichnung nicht weiter spezifizieren und damit keinem speziellen Onkogen zuordnen, was eine Hinterfragung seiner Rolle bei der Thermoresistenz praktisch unmöglich macht, obwohl es zumindest in den Magen-CA-Linien durch sein Expressionsmuster ein Kandidatenprotein für die Untersuchung von Interaktionen zwischen Chemo- und Thermoresistenz wäre.
Eine vergleichbare Proteinexpression in den untersuchten Magenkarzinomlinien wie Cancer Oncogene zeigte das G1 Cyclin D2. Dieses ist neben anderen Cyclinen vielfach als überexprimiert in Tumorzellen beschrieben. Darüber hinaus wurden Hypothesen aufgestellt, dass es in die Pathogenese von chronischen B-Zell-Leukämien eingreift, eventuell indem es die Zellen vor programmiertem Zelltod schützt, während die Cyclin D2-Überexpression mit keinerlei Modifikationen des Zellzyklus in diesen Zellen einherging. Aus den mittels Proteom-Analyse gewonnenen Daten lässt sich keine Aussage darüber machen, ob die Überexpression von Cyclin D2 durch Zellzyklus-Veränderungen der thermoresistenten Zellinien hervorgerufen wird, oder an der Entwicklung der Resistenz direkt beteiligt ist.
Zusammenfassend können folgende Punkte festgestellt werden:
An der Entwicklung von Chemo- und Thermoresistenz sind offenbar verschiedenste Chaperone aus mehreren subzellulären Kompartimenten (u.a. Cytoplasma, Nucleolus, ER) beteiligt. Davon am besten untersucht sind die Heat Shock Proteine im eigentlichen Sinne. Einige davon, z.B. HSP70 und HSP27, sind, wie vielfach in unterschiedlichen Zellinien beschrieben, an der Entwicklung von Thermotoleranz beteiligt. Um dieses Phänomen zu untersuchen, hat man verschiedene permanent hitzeresistente Linien etabliert, abgeleitet von tierischen und menschlichen Organen. Aus diesen Studien ergaben sich mehrere Konzepte und Schlussfolgerungen, die von Laszlo und Venetianer 1998 zusammengefasst wurden: wenn die Expression eines der großen Hitzeschockproteine HSP90, 70, 60 oder 27 gesteigert wurde unter normalen Wachstumsbedingungen, entwickelten die Zellen Resistenz gegenüber hitzeinduzierter Zytotoxizität (Laszlo und Venetianer, 1998). Daneben kann eine derartige Hitzeresistenz auch in Abwesenheit der Expression von Hitzeschockproteinen entstehen.
Bei der Proteinanalyse der Magenkarzinomlinie EPG85-257, der Pankreaskarzinomlinie EPP85-181 sowie deren resistenten Varianten konnten diese Resultate bestätigt werden. Es zeigte sich, dass in jeder der sechs thermoresistenten Linien mindestens ein Mitglied einer großen Familie der Heat Shock Proteine überexprimiert wird. Diese Ergebnisse lassen sich mit den umfangreichen Erkenntnissen, die es inzwischen über die Stressproteine gibt, in Einklang bringen. Darüber hinaus fand sich neben den Hitzeschockproteinen im engeren Sinne differentielle Expression von anderen Proteinen mit Chaperonaktivität, darunter Annexin 1, FKBP4 und Chaperone des ER (Calnexin, Calreticulin) und Nucleus (Nucleophosmin).
Die Mechanismen der Resistenzphänomene liegen wahrscheinlich auf mehreren Ebenen. Einerseits wirkt die Chaperonfunktion direkt durch Verhinderung oder Reparatur von Pro
Zusätzlich zu den Chaperonen ergaben sich bei einigen thermoresistenten Karzinomzellinien signifikante Veränderungen von Proteinen, die in den Arzneimittelstoffwechsel eingreifen, darunter Thioredoxin-Peroxidase, Glyoxalase I und GST M3. Proteine dieser Art spielen bekanntermaßen eine Rolle bei der Entwicklung von Chemoresistenz, ihre Funktion bei Thermoresistenz ist noch nicht geklärt. Auch die Rolle der Cytokeratine und des Vimentin bei hitzeinduzierter Resistenz bleibt zu untersuchen, deren Expression stark zelltypabhängig zu sein scheint, wie die z.T. umgekehrten Ausprägungslevel von CK19, CK7 und CK8 vermuten lassen.
Einige andere Proteine lassen sich hinsichtlich ihrer Funktion auf der aktuellen Basis der Erkenntnisse nicht so recht in Resistenzphänomene einordnen, darunter die metabolischen Enzyme (Aldehyde Dehydrogenase 1, Phosphoglyceromutase).
Um diese durch die Proteinanalyse gewonnenen komplexen Informationen zu betätigen und zu erweitern, sind Untersuchungen auf anderen Ebenen (DNA, mRNA) sinnvoll. Mit Hilfe von Transfektionsexperimenten lässt sich die Beteiligung bestimmter Proteine und Proteingruppen an Chemo- und Thermoresistenzphänomenen nachweisen oder ausschließen, und die Anwendung von Proteinaktivitätstest könnte die Beteiligung weiterer Proteine an diesen Phänomenen erkennen lassen, da die Untersuchung der Proteinexpression mittels 2D-Elektrophorese durch alleinige Darstellung von Spotintensitäten ihre Grenzen hat, und die möglicherweise erhöhte Aktivität bei gleichbleibender Expression von Proteinen außer acht lässt. Unter Umständen wären auch funktionelle Untersuchungen mit Hemmsubstanzen in Zellkulturen angebracht, z.B. mit dem Stoff Quercetin, der die HSP-Synthese inhibiert. Dadurch kann man die Auswirkungen einer solchen Behandlung auf die Zellen und ihre Kompensations- und Ersatzmöglichkeiten bei der Entwicklung von Resistenzen gegen zellschädigende Agenzien wie Zytostatika und Hyperthermie austesten.
Die moderne Onkologie bedient sich eines multimodalen Therapiekonzeptes, das neben den Hauptbehandlungsmodalitäten operatives Vorgehen, Chemotherapie und Radiatio auch neuere Methoden wie Hyperthermie integriert.
Hyperthermie kann einerseits auf verschiedene Weise die Effektivität einer Chemotherapie verstärken, z.B. durch Steigerung der Perfusion im Tumorgewebe und konsekutiver Verbesserung der Zytostatikaanflutung und scheint z.T. sogar in der Lage zu sein, multidrug resistance (MDR), die ein Hauptproblem von Chemotherapie darstellt, zu überwinden. Andererseits ermöglichen Schutzmechanismen der thermisch gestressten Zellen, wie z.B. eine verstärkte Expression von Hitzeschockproteinen, neben der Entwicklung einer hitzeresistenten Subpopulation auch ein Überleben der Zellen gegenüber zytotoxischer Schädigung durch Zytostatika.
Um derartige Wechselwirkungen zu untersuchen, eignen sich Experimente an Zellkulturen, die verschiedene resistente Phänotypen aufweisen.
In dieser Arbeit wurde die globale Proteinexpression von chemo- und thermoresistenten Varianten zweier Karzinomzellinien mit Hilfe der Proteom-Analyse (Kombination aus zweidimensionaler Elektrophorese und Massenspektrometrie) untersucht. In diesem Zusammenhang wurde eine mit Maldi-TOF kompatible Spezialsilberfärbung neu entwickelt. Als Ausgangspunkt der Proteom-Analyse lagen sechs Zellinien der Magenkarzinomlinie EPG85-257 und sechs äquivalente Linien der Pankreaskarzinomlinie EPP85-181 vor: jeweils eine parentale Linie, eine Linie mit atypischer MDR gegenüber Mitoxantron und eine weitere Linie mit typischer MDR gegenüber Daunorubicin sowie für jede dieser Linien eine thermoresistente Variante.
Es zeigte sich eine Überexpression einer Vielzahl von Proteinen in den thermoresistenten Zellen, die sich unterschiedlichen funktionellen Gruppen zuordnen lassen. Besonders auffällig war die Hochregulation von Proteinen mit Chaperonaktivität aus nahezu allen subzellulären Kompartimenten, darunter verschiedene HSPs (u.a. HSP90, HSX70 und HSP27), Ca2+-bindende Chaperone (Calnexin, Calreticulin, Reticulocalbin, BIP), Mitglieder der 14-3-3-Familie, Annexin I und Nucleophosmin. Daneben ließ sich in thermoresistenten daunorubicin- und mitoxantronresistenten Linien eine Überexpression von Enzymen des Glutathion-Detoxifikationsweges und des Thioredoxinstoffwechsels beobachten. Darüber hinaus trat beim Magenkarzinom nur in diesen Zellen ein gesteigerter Level eines Immunophilins, des FK506 binding protein 4 (FKBP52), auf.
Die Mechanismen der Resistenzphänomene können auf mehreren Ebenen begründet sein und scheinen für jeden Karzinomtyp gesondert untersucht werden zu müssen, wie z.T.
Die Fülle an multifunktionellen Proteinen, die sich in den untersuchten Zellinien signifikant verändert zeigten sowie ihre komplexen Interaktionen lassen ein weites Feld für Zusatzuntersuchungen offen, die zur Klärung der mit Thermoresistenz und Wechselwirkungen zur Chemoresistenz assoziierten Mechanismen beitragen können bzw. unspezifische Begleitreaktionen erkennen lassen. Die Charakterisierung derartiger Mechanismen stellt den ersten Schritt für eine Überwindung von Chemo- und/oder Thermoresistenzphänomenen im klinischen Alltag dar.
I. Histogramme zur Veranschaulichung der differentiell exprimierten Proteine beim Magenkarzinom
1. Parentallinie EPG85-257-P versus thermoresistente Variante EPG85-257-P-TR
1a. Differentiell überexprimierte Proteine:
1b. Differentiell unterexprimierte Proteine:
2. Mitoxantronresistente Linie EPG85-257-RNOV versus thermoresistente Variante EPG85-257-RNOV-TR
2a. Differentiell überexprimierte Proteine:
2b. Differentiell unterexprimierte Proteine:
3. Daunorubicinresistente Linie EPG85-257-RDB versus thermoresistente Variante EPG85-257-RDB-TR
3a. Differentiell überexprimierte Proteine:
3b. Differentiell unterexprimierte Proteine:
II. Histogramme zur Veranschaulichung der differentiell exprimierten Proteine beim Pankreaskarzinom
1. Parentallinie EPP85-181-P versus thermoresistente Variante EPP85-181-P-TR
1a. Differentiell überexprimierte Proteine:
1b. Differentiell unterexprimierte Proteine:
2. Mitoxantronresistente Linie EPP85-181-RNOV versus thermoresistente Variante EPP85-181-RNOV-TR
2a. Differentiell überexprimierte Proteine:
2b. Differentiell unterexprimierte Proteine:
3. Daunorubicinresistente Linie EPP85-181-RDB versus thermoresistente Variante EPP85-181-RDB-TR
3a. Differentiell überexprimierte Proteine:
3b. Differentiell unterexprimierte Proteine:
Herrn Prof. Dr. Dr. P. Sinha (Institut für Laboratoriumsmedizin und Pathobiochemie, Charité, Berlin) und Herrn PD Dr. H. Lage (Institut für Pathologie, Charité, Berlin) danke ich für die Überlassung des Themas und ihre Unterstützung bei der Durchführung der Dissertation.
Bei Frau Dr. M. Schnölzer und Herrn Dr. A. Urbani (Zentrale Proteinanalytik, DKFZ, Heidelberg) bedanke ich mich für die massenspektrometrische Identifizierung der Proteine.
Weiterhin danke ich Herrn Dr. T. Rabilloud (DBMS/BECP, Grenoble, Frankreich)
und Herrn Prof. J. E. Celis (Danish Cancer Society, Kopenhagen, Dänemark) für wissenschaftliche Beratung.
Der AG Lage (insbesondere Frau Schütze, Frau Schäfer und Frau Kemmer) danke ich für die Bereitstellung der Zellpellets sowie Herrn C. Grumm für die Hilfestellung bei allen computertechnischen Problemen.
Schließlich gilt mein Dank der AG Sinha (Herrn G. Reifenberger, Frau D. Przybilla) für die gute Atmosphäre im Labor und tatkräftige Unterstützung in jeder Hinsicht.
Hiermit erkläre ich, Julia Poland, geb. 25.03.1976, an Eides Statt, dass die Dissertation mit dem Thema „Proteom-Analyse von chemo- und thermoresistenten Magen- und Pankreaskarzinomzellinien zur Untersuchung von thermoresistenzassoziierten Phänomenen und Interaktionen mit Chemoresistenz“ von mir selbst und ohne unzulässige Hilfe Dritter verfasst wurde. Sie stellt auch in Teilen keine Kopie anderer Arbeiten dar. Die benutzten Hilfsmittel sowie die verwendete Literatur sind vollständig angegeben.