Zur Aufspaltung der Zellen wird ein Lysepuffer nach Rabilloud (Rabilloud, 1998) verwendet, der aus 7M Harnstoff, 2M Thioharnstoff, 4% CHAPS, 20mM Spermin und 40mM DTT besteht. Davon werden je nach Zellquantität auf das entsprechende Zellpellet zwischen 80 und 300µl pipettiert. Nach 60 Minuten Äquilibrierung bei Raumtemperatur mit zwischenzeitlichem Vortexen wird die Zellsuspension in ein Zentrifugenröhrchen überführt. Anschließend wird die Lösung bei 14000 rpm und 4°C eine Stunde lang zentrifugiert, danach der Überstand ohne die ausgefällte DNA in ein neues Eppendorf-Hütchen abpipettiert.

Es folgt eine photometrische TCA-Proteinkonzentrationsbestimmung (Cheung et al., 1987) mit 1:5 und 1:10 verdünnten Aliquots der Probe. Als Proteinstandards werden Lyphochek I (Gesamtproteinkonzentration 67,0 mg/ml (chargenabhängig)) und Lyphochek II (Konzentration 45,0 mg/ml) verwendet. Für die Eichkurve wird eine Standardreihe mit folgenden Konzentrationen hergestellt:

a)

5mg/ml:

100µl Lyphochek I + 1240µl Lysepuffer

b)

2mg/ml:

200µl aus 5mg/ml + 300µl Lysepuffer

c)

1mg/ml:

100µl aus 5mg/ml + 400µl Lysepuffer

d)

0,2mg/ml:

20µl aus 5mg/ml + 480µl Lysepuffer

Die Kontrollreihe sieht folgendermaßen aus:

a)

4,5mg/ml:

20µl Lyphochek II + 180µl Lysepuffer

b)

3,5mg/ml:

20µl Lyphochek II + 238µl Lysepuffer

c)

2,5mg/ml:

20µl Lyphochek II + 340µl Lysepuffer

d)

1,5mg/ml:

20µl Lyphochek II + 580µl Lysepuffer

Es werden nacheinander je zweimal 35µl Standard, Kontrolle und Probe auf eine Rundboden-Mikrotiterplatte aufgetragen (Doppelbestimmung), anschließend wird mit je 100µl 0,1N HCL, dann mit 25µl 20% TCA überschichtet. Dann werden die Konzentrationen am Tecan Spectra Reader bestimmt.

Aliquots der Proteinlösungen der Zellinien, die miteinander verglichen werden sollen, werden durch Verdünnung mit Lysepuffer auf einheitliche Konzentrationen (im Bereich 1-4mg/ml) gebracht und ebenso wie die restlichen Proben bei -80°C eingefroren.

Für die isoelektrische Fokussierung (IEF) in der 1. Dimension wird das von Anderson entwickelte ISO-DALT System (Modell ID 125) verwendet (Anderson und Anderson, 1982).

Zum Gießen der Gele und für die eigentliche Fokussierung dient ein und dasselbe System, bestehend aus einer großen unteren Pufferkammer und einer darin einzuhängenden oberen, in der die 20 Glasröhrchen (28cm bzw. 16cm Länge, 1,5mm ID) befestigt werden. Für den Gießvorgang wird an deren unterem Ende ein Reservoir für die Gellösung montiert; es werden 20 Gele simultan gegossen.

Für die Durchführung der ersten Dimension wurden zwei verschiedene, in Bezug auf die Länge der Gele, ihre Zusammensetzung und einige weitere Details variierende Konzepte angewandt; erstens ein 28cm-Gelsystem nach den Empfehlungen des ISO-DALT-Herstellers zur Darstellung der größtmöglichen Anzahl von Proteinspots (Konzept A) und zweitens ein nach J.E. Celis modifiziertes 16cm-Gelsystem (http://proteomics.cancer.dk) mit deutlich verbessert aufgelöstem sauren Bereich und Möglichkeit der Identifizierung von Proteinen durch mit Hilfe dieses Systems generierten 2D-Gel-Datenbanken (Konzept B). Der bei beiden Methoden erreichte pH-Gradient liegt im mittleren Bereich etwa zwischen 4 und 8.

Konzept A: Die Herstellung der 23cm langen vertikalen Rundgele erfolgt auf der Basis der konventionellen Gellösung von O´Farrell (O'Farrell, 1975) nach einem vom Hersteller empfohlenen Rezept (Zusammensetzung des selbst hergestellten Carrier-Ampholyt-Gemisches, aufbewahrt in 0.8ml-Aliquots: 20% pH 2.5-5.0, 30% pH 4.0-6.5, 10% pH 5.0-6.0, 20% pH 5.0-8.0, 20% pH 8.0-10.5):

Reagenz

Masse (g)

Volumen (ml)

Harnstoff

8,74

30% Acrylamid mit 1,8% Bis

2

Aqua dem.

5,17

Carrier-Ampholyt-Gemisch

0,8

Triton X 100 (20%)

1,62

nach Entgasen (ca. 5 min.):

10% Ammoniumpersulfat

100µl

10% TEMED

100µl

Tabelle 2.4: Protokoll für die Gellösung der 1. Dimension (23cm-Gele)

Das Endvolumen der Lösung beträgt 16ml und wird nach vorsichtigem Entgasen mit Hilfe einer Vakuumpumpe mit nacheinander je 100µl 10% TEMED und 10% APS zur Beschleunigung der Polymerisation versetzt. Anschließend wird die Lösung in das vorgesehene Reservoir eingefüllt und der gesamte Einsatz in die bis zur „Cast Fill“-Markierung mit Wasser gefüllte untere Pufferkammer langsam eingehängt, wobei die Gellösung durch den hydrostatischen Druck des Wassers in die Röhrchen gedrängt wird. Durch zügiges Nachgießen von Wasser wird die gewünschte Gellänge von 23cm erreicht.

Die Gele werden für mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur auspolymerisiert.

Konzept B: Hierbei werden 12,5cm lange Gele in 16cm-Glasröhrchen nach dem untenstehenden Protokoll (Celis et al., 1994) gegossen, wobei der Hauptunterschied zu Konzept A in der Carrier-Ampholyt-Zusammensetzung besteht.

Reagenz

Masse (g)

Volumen (ml)

Harnstoff

8,24

28,38% Acrylamid mit 1,92% Bis

1,95

Aqua dem.

3

Carrier-Ampholyte 5-7

0,6

Carrier-Ampholyte 3,5-10

0,2

Triton X 100 (10%)

3

nach Entgasen (ca. 5 min.):

TEMED

0,02

10% Ammoniumpersulfat

0,03

Tabelle 2.5: Protokoll für die Gellösung der 1. Dimension (12.5cm-Gele)

Der Gießvorgang erfolgt analog zur obenstehenden Beschreibung, nur dass die Gellänge hier 12,5cm erreicht.

Überschüssiges Acrylamid am unteren Ende der Gele wird mittels Skalpell entfernt und die untere Pufferkammer mit 3,26 Liter Wasser und 3,26ml 85% ortho-Phosphorsäure als Anoden-Puffer gefüllt. Als Kathoden-Puffer dient eine entgaste Lösung aus 300µl 10N NaOH ad 150ml Wasser.

Vor dem Präfokussierungs-Schritt, der dazu dient, dass sich aus dem einheitlichen Durchschnitts-pH-Wert des Gels ein linearer, monoton steigender pH-Gradient formiert, indem durch Anlegen eines elektrischen Feldes die mobilen Carrier-Ampholyte je nach Ladung in Richtung Kathode oder Anode wandern, trägt man zum Schutz der Geloberfläche 10µl einer Overlay-Lösung pro Gel auf, die aus 20% Glycerol und 2% Carrierampholyten besteht. Überschüssige Luft wird mit Hilfe einer 25µl-Hamilton-Spritze aus den Röhrchen entfernt, so dass die Geloberseite durch Overlay und obere Pufferlösung mit der Kathode, die Gelunterseite durch die untere Pufferlösung mit der Anode leitend verbunden ist.

Dann wird bei Konzept A 60 min. lang bei 200V präfokussiert; bei Konzept B erfolgt die Präfokussierung nach einem Programm mit fortschreitender Erhöhung der Voltzahl: 15 min. bei 200V, 30 min. bei 300V, 60 min. bei 400V.

Nachdem in jedes Röhrchen über die Geloberfläche 30µg (Konzept A) Proteinlösung appliziert worden ist, erfolgt die isoelektrische Fokussierung bei 1500V (Stromstärke und Leistung bei 1mA bzw. 1W eingestellt) über Nacht für 20 Stunden. Für Konzept B werden 10µg Protein appliziert und für 19 Stunden bei 400V fokussiert.

Alternativ wird für die präparativen Läufe bis 1mg (Coomassie-Gele) bzw. 100-200µg (Spezial-Silberfärbung) Gesamtprotein aufgetragen.

Für den Gießvorgang der linearen 15% Polyacrylamidgele mit 0,5% Vernetzungsgrad kommt eine bis zu 20 Gelcassetten fassende ISO-DALT Gießkammer zur Anwendung.

Die Gellösung (Celis et al., 1994) wird aus verschiedenen Lösungen zusammengesetzt:

Tabelle 2.6 und 2.7: Protokolle für Teillösungen der Gießlösung für die 2. Dimension

Arbeitsprotokoll für zwanzig 20cm x 25cm-Gele (2000 ml Gesamtlösung):

Reagenz

Masse (g)

Volumen (ml)

Lösung A

1000

Lösung B

500

Natriumthiosulfat

0,86

Aqua dem.

470

nach Entgasen (30min.):

SDS (10%)

20

TEMED

0,4

APS (10%)

10

Tabelle 2.8: Protokoll für die fertige Gießlösung der 2. Dimension

Für den Gießvorgang werden außerdem ca. 250ml 50% Glycerol, um die Gele auf die gewünschte Höhe zu bringen, und wassergesättigtes Butanol zum Überschichten benötigt.

Danach schließt sich die Polymerisationsphase für mindestens 60 min. bei Raumtemperatur an.

Die Rundgele der 1. Dimension werden direkt nach Beendigung der IEF auf die Flachgele der 2. Dimension übertragen. Dazu werden sie unter Verwendung einer 1ml-Spritze mit Hilfe von Wasserdruck aus den Glasröhrchen entladen und unter Vermeidung von Dehnung und Luftblasen nahtlos an die Flachgele angelegt. Zur Fixierung dient eine erhitzte Versiegelungslösung, bestehend aus 0,5% Agarose, 0,1% SDS, 0,29% Tris und 1,5% Glycin. Um die Proteinlauffront während der Elektrophorese verfolgen zu können, wird der Versiegelungslösung als Marker etwas Bromphenol blau zugesetzt.

Nach Verfestigung der Lösung werden je 10 Gele in einen ISO-DALT Tank eingesetzt, der mit 20L Lämmli-Puffer (siehe Tabelle) gefüllt ist.

Reagenz

Masse (g)

Volumen (ml)

Tris

58

Glycin

299

SDS (20%)

100

Aqua dem.

ad 20000

Tabelle 2.9: Protokoll für den Laufpuffer der 2. Dimension (nach Laemmli)

Die Elektrophorese wird bei 4° C beginnend mit 100 mA pro Kammer gestartet, nach 2 h auf 250 mA hochgestellt und bis zum Erreichen der Proteinfront am gegenüberliegenden Gelende bei konstanter Stromstärke weitergeführt.

Für die analytische Auswertung der Gele wird eine alkalische Silberfärbung nach Hochstrasser et al. durchgeführt (http://www.expasy.ch/ch2d/protocols/protocols.fm4.html). Die Imprägnierung erfolgt dabei mit einem Silbernitrat-Diamin-Komplex in einem stark alkalischen Milieu (Ammoniak und NaOH).

Für 10 Gele werden 2 Liter der jeweiligen Lösung bzw. Wasser verwendet, mit Ausnahme der Silberlösung (2250 ml).

Die einzelnen Schritte der Fixierung und Färbung nach Herausnehmen der Gele aus den Gelcassetten:

1. 5 min. waschen in Aqua dem.

2. 2 x 60 min. Fixierung in 40% Ethanol / 10% Essigsäure

3. 2 h bis über Nacht Fixierung in 5% Ethanol / 5% Essigsäure

4. 5 min. waschen in Aqua dem.

5. 30 min. Sensibilisierung in 1% Glutardialdhyd und 0,5 M Natriumacetat

6. 3 x 10 min. waschen in Aqua dem.

7. 2 x 30 min. Sensibilisierung in 0,05% Naphthalin-1,5-disulfonsäure

8. 4 x 15 min. waschen in Aqua dem.

9. 30 min. Imprägnierung in einer frischen Lösung aus 0,8% Silbernitrat / 1,34% Ammoniak / 0,2% 10N NaOH

10. 4 x 4 min. waschen in Aqua dem.

11. 2-5 min. Entwicklung in 0,06% Zitronensäure / 0,268% Formaldehyd

12. 30 min. Stoppen der Reaktion in 5% Tris / 2% Essigsäure

Das Resultat dieser Färbeprozedur kann anschließend der rechnergestützten Auswertung mit Hilfe des PDQuest Systems von BioRad zugeführt werden.

Für präparative Zwecke wurden zwei verschiedene Färbeprozeduren verwendet: die Coomassie-Färbung nach Neuhoff (Neuhoff et al., 1988) als Routinemethode (gut kompatibel mit der Massenspektrometrie) und eine speziell für Maldi-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight) Massenspektrometrie von unserer Arbeitsgruppe entwickelte Oberflächen-Silberfärbung (Sinha et al., 2001). Hierbei dient eine schwach acide Lösung von Silbernitrat in Wasser als Imprägnierlösung. Die Silberfärbung wird in einem speziell dafür konstruierten Apparat durchgeführt, der den Kontakt mit den Gelen auf ein Minimum reduziert. Für Einzelheiten zum Aufbau dieser Färbekammer siehe Abschnitt 3.1. mit entsprechenden Abbildungen.

Protokoll für die Coomassie-Färbung nach Neuhoff (Neuhoff et al., 1988):

1. Fixierung über Nacht in 50% Ethanol / 10% Essigsäure

2. Färbung über Nacht (mindestens 5 h) in 50% Methanol / 10% Essigsäure / 0,5 g/l Coomassie brillant blue R-250

3. Entfärbung für mindestens 4 h in 5% Methanol / 12,5% Essigsäure (Lösung mehrmals wechseln)

4. Aufbewahrung in 7% Essigsäure

Protokoll für die Oberflächen-Silberfärbung (Sinha et al., 2001):

1. 60 min. + über Nacht oder 4 x 30 min. Fixierung in 30% Ethanol / 10% Essigsäure

2. 45 min. Sensibilisierung in 0,3% Kaliumtetrathionat / 0,5 M Kaliumacetat / 30% Ethanol

3. 6 x 10 min. waschen in Aqua dem.

4. 60 min. Imprägnierung in 0,2% Silbernitrat

5. 5-15 sec. waschen in Aqua dem.

6. 30 min. Entwicklung in 3% Kaliumcarbonat / 0,03% Formaldehyd / 0,00125% Natriumthiosulfat-Pentahydrat

7. 30 min. Stoppen der Reaktion in 4% Tris / 2% Essigsäure

8. waschen in Aqua dem.

Nach Ausschneiden von silbergefärbten Spots sollten diese vor der Massenspektrometrie wieder entfärbt werden, da Silberionen einen Störfaktor darstellen. Dazu werden 2 Stammlösungen mit 30 mM Kaliumferricyanid und 100 mM Natriumthiosulfat vorbereitet, von denen eine Arbeitslösung in 1:1 ratio hergestellt wird. Diese ist instabil und sollte daher frisch sein. Jeder Spot wird mit 30-50µl bedeckt und gelegentlich vorgetextet. Nach Verschwinden der bräunlichen Farbe wird einige Male in Wasser gewaschen, um die Reaktion zu stoppen, anschließend werden 30-50µl 200 mM Ammoniumbicarbonat für 20 min. hinzugefügt. Nach dessen Entfernung und Waschen der Gelstückchen in Wasser werden diese in mehrfach gewechselter Acetonitril-Lösung dehydriert (Gharahdaghi et al., 1999).

Schritt 1: Auswahl des zu scannenden Materials (Gel) und der verwendeten Färbung (Silber), der benötigte Filter (grün, transmissiv, 530-570nm Wellenlänge) wird dann automatisch gewählt.

Schritt 2: Durchführung einer Vorschau, um die exakte Position des Objekts zu determinieren.