Aus der Medzinischen Klinik mit Schwerpunkt Onkologie und Hämatologie der Medizinischen Fakultät Charité der Humboldt Universität zu Berlin

Dissertation

Neue Ansätze zur zielgerichteten Behandlung solider Tumoren.
Antisense Oligonukleotide und Immunotoxine zur
tumorzellspezifischen Apoptoseinduktion

zur Erlangung des akademischen Grades Doctor medicinae
(Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité der Humboldt Universität zu Berlin

von Maximilian Posch

aus Freiburg im Br.

Dekan Prof. Dr. Joachim W. Dudenhausen

Gutachter:
1. Prof. Dr. K. Possinger
2. Prof. Dr. med G. Ehinger
3. Prof Dr. med. B . Jan sen

Datum der Promotion 18.03.02

Inhaltsverzeichnis

• 1  Einleitung
  • 1.1  Ziel der Arbeit
  • 1.2 Krebs, Chemotherapie und Chemoresistenz
    • 1.2.1 Lungentumoren
    • 1.2.2 Brustkrebs
    • 1.2.3 Kolonkarzinome
    • 1.2.4 Chemotherapie und Chemoresistenz
  • 1.3 Apoptose
    • 1.3.1 Die Bcl-2 Familie
    • 1.3.2 APO/Fas-Rezeptoren
    • 1.3.3 Caspasen
  • 1.4 Neue Therapiemethoden
    • 1.4.1 Antisense Nukleotide
      • 1.4.1.1 Struktur
      • 1.4.1.2 Zelluläre Aufnahme
      • 1.4.1.3 Wirkungsmechanismen
    • 1.4.2 Immunotoxine
      • 1.4.2.1 Struktur
      • 1.4.2.2 Zelluläre Aufnahme
      • 1.4.2.3  Wirkungsmechanismen
• 2  Materialien
  • 2.1 Tumorzellinien
  • 2.2 Chemikalien und Reagenzien
  • 2.3 Wirkstoffe
    • 2.3.1 Zytostatika
    • 2.3.2 Antisense Oligonukleotide
    • 2.3.3 4D5MOC-B-ETA
• 3  Methoden
  • 3.1 In vitro
    • 3.1.1 Zellkultur
    • 3.1.2 Behandlung mit Zytostatika
    • 3.1.3 Transfektion mit 4625
    • 3.1.4  Kombinationsbehandlung
    • 3.1.5 Behandlung mit 4D5MOC-B-ETA
    • 3.1.6 Proliferations (MTT) Assay
    • 3.1.7 Trypan Blau Exklusion
    • 3.1.8  Durchflusszytometrie (FACS)
      • 3.1.8.1 PI-Aufname
      • 3.1.8.2 Detektion von Ep-CAM
    • 3.1.9 Western-Blot
    • 3.1.10 Leucin-Einbautest
    • 3.1.11 Statistik
  • 3.2  In vivo
    • 3.2.1 Art und Haltung
    • 3.2.2 Versuchsablauf
    • 3.2.3 Statistik
• 4  Ergebnisse Teil 1
  • 4.1 In vitro
    • 4.1.1 Transfektion mit 4625
      • 4.1.1.1 Western Blot
      • 4.1.1.2 Proliferationsassays
      • 4.1.1.3 Trypan Blau Exklusionstest
    • 4.1.2 Behandlung mit Standardtherapien
      • 4.1.2.1 Western Blot
      • 4.1.2.2 Proliferationsassay
    • 4.1.3  Kombinationsbehandlung
      • 4.1.3.1 Western Blot
      • 4.1.3.2 Proliferationsassay
      • 4.1.3.3  PI- Aufnahme
  • 4.2 In vivo
    • 4.2.1 Behandlung mit Standardtherapien
      • 4.2.1.1 MDA-MB-231 Xenotransplantate
      • 4.2.1.2 Colo-320 Xenotransplantate
    • 4.2.2 Kombinationsbehandlung
      • 4.2.2.1 MDA-MB-231 Xenotransplantate
      • 4.2.2.2  Colo-320 Xenotransplantate
• 5  Ergebnisse Teil 2
  • 5.1 In vitro
    • 5.1.1 Ep-CAM Detektion
    • 5.1.2 Leucin Einbautest
    • 5.1.3 Proliferationsassays
    • 5.1.4 Trypan Blau Exklusionstest
  • 5.2 In vivo
    • 5.2.1 SW2 Xenotransplantate
    • 5.2.2 HT-29 Xenotransplantate
• 6  Zusammenfassung und Diskussion
  • 6.1  Teil 1
  • 6.2 Teil 2
• Abkürzungen:
• Referenzen
• Danksagung
• Lebenslauf von Maximilian Posch
• Veröffentlichungen:

Bilder

• Abb. 1 : Abgebildet sind der intrinsische und extrinsische Signaltransduktionsweg der Apoptose,welche in der Aktivierung der Effektorcaspasen 3, 6 und 7 enden. Die apoptotische Maschinerie wird auf unterschiedlichen Stufen reguliert und gehemmt. P53 und einige Proteine der Bcl-2 Familie bewirken eventuell eine rezeptorvermittelte Aulösung beider Transduktionwege. (HSP = Heat Shock Protein; IAP’s = Inhibitors of Apoptosis; Apaf = Apoptosis inducing factor; FADD = Fas Associated Death Domain; CARD = CAspase Recruitment Domain
• Abb. 2 Verschiedene chemische “backbone” Modifikationen von Antisense Oligonukleotiden (Kronenwett et al. Antisense strategies for the treatment of hematological malignancies and solid tumors Ann. Hematol. 77, 1-12
• Abb. 3 4D5MOC-B-ETA besteht aus der den variablen Teilen der schweren und leichten Kette (VH und VL) des MOC31. Der Austausch einiger AS gegen Histidin führte zu der hohen Serumstabilität. Das ETA enthält die mutierte KDEL Region.
• Abb. 4 Darstellung der Bcl-2 und Bcl-xL Expression von A-549, Colo-320 und SW2 Zellen im Western Blot 72 Stunden nach Transfektion mit den Oligonukleotiden 4625 und 4626
• Abb.5 MTT-Assay unterschiedlicher Tumorzellen 72 Stunden nach Transfektion mit den beiden Oligonukleotiden 4626 und 4625. p-Werte wurden mit dem zweiseitigem student-t-test erstellt.
• Abb. 6 Trypan-Blau-Aufnahme unterschiedlicher Tumorzellen nach Transfektion mit 600 nM 4625/4626. Die Balken repsräsentieren die Standardabweichungen von drei Analysen.
• Abb.7 Western Blot Analysen der Bcl-2/Bcl-xL Expression nach Behandlung mit Chemotherapeutika nach 10, 24 und 48 Stunden zu jeweils zwei Konzentrationen.
• Abb.8 Mtt-Assay von zwei Kolon- bzw Mammakarzinomzellen in Anwesenheit steigender Konzentrationen zu unterschiedlichen Zeitpunkten 5-FU bzw. Paclitaxel. Die Diagramme stellen den Mittelwert aus drei Experimenten mit ihren Standardabweichungen dar.
• Abb. 9 Western-Blot Analyse von Bcl-2 und Bcl-xL bei HT-29 Zellen nach Transfektion mit 400 nM 4625/4626 alleine und in Kombination mit 30 mM 5-FU
• Abb. 10 MTT-Assay und Median Effekt Analysen von Colo-320 und HT-29 Zellen nach Kombinationsbehandlung mit Oligonukleotiden und 5-FU über 68 bzw. 48 Stunden. Die oberen Diagramme zeigen die Zellproliferation im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Die unteren Diagramme geben die Art der Wechselwirkung zwischen 4625 und Chemotherapie an. Ein Wert unter 1 steht für eine synergistische Interaktion.
• Abb. 11 MTT-Assay und Median-Effekt Analysen von MDA-MB-231 und MCF-7 Zellen nach Kombinationsbehandlung mit 4625/4626 und Paclitaxel über 68 bzw. 48 Sunden. Taxol und 4625 wirken über einen weiten Bereich synergistisch auf die Proliferation von MCF-7 Zellen (Kombinationsindex < 1).
• Abb. 12, 13 Propidiumiodid Aufnahme der Kolon- und Mammakarzinomzellen nach Behandlung mit 4625/4626 alleine und in Kombination mit 5-FU bzw. Paclitaxel. Die Konzentrationen entsprechen den im MTT-Assay ermittelten IC50 nach 72 (Oligonukleotid) bzw. 48 Stunden (Chemotherapie). Die Balken repräsentieren die Standardabweichung aus zwei Facs Analysen. Zell Debris wurde durch angepasstes light scatter gating ausgeschlossen.
• Abb.14 Relative Tumorvolumina subkutan wachsender MDA-MB-231 Xenotransplantate in Nacktmäusen während systemischer Behandlung mit paclitaxel. Im Diagramm sind die Standardfehler der unterschiedlichen Behandlungsgruppen angegeben.
• Abb. 15 Tumorwachstum der Colo-320 Xenotransplantate während systemischer Behandlung mit 5-FU über drei Wochen. Die Pfeile markieren die Applikationstage der beiden Dosierungen 5-FU.
• Abb.16 Relative Volumina der MDA-MB-231 Xenotransplantate während 3 wöchiger Kombinationsbehandlung. 0.5 mg Oligonukleotid wurden täglich, Palitaxel nur insgesamt fünf Mal über 21 Tage i.p appliziert.
• Abb. 17 Wachstum der Colo-320 Tumoren während Kombinationsbehandlung mit Oligonukleotiden und 5-FU. Das durchschnittliche Tumorvolumen betrug an Tag 1 (6 Tage nach Implantation) 75 mm3 .
• Abb. 18 Ep-CAM-Expression auf drei epithelialen Karzinomen in der Facs Analyse nach Markierung mit einem fluoreszierenden Antikörper. Lymphatische RL Zellen exprimieren praktisch kein Ep-CAM.
• Abb. 19 (H3) Leucin Aufnahme von SW2 Zellen nach 24 stündiger Behandlung mit 4D5MOC-E-ETA im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle.
• Abb. 20 MTT-Assay von drei Ep-CAM positiven und einer Ep-CAM negativen Zellinien nach 72 stündiger Behandlung mit 4D5MOC-B-ETA. Die Diagramme stellen Mittelwerte aus drei Experimenten mit ihren Standardabweichungen dar.
• Abb.21 Trypan Blau Aufnahmevon drei Ep-CAM positiven Zellinien nach Inkubation mit zwei Konzentrationen 4D5MOC-B-ETA über zwei Unterschiedliche Zeiträume.
• Abb. 22 Wachstum subkutaner SW2 Xenotransplantate während täglicher ip Injektion von 200 bzw 400 mg/kg/KG 4D5MOC-B-ETA über zehn Tage. Die Balken geben den Standardfehler (S.E.M.) an.
• Abb. 23 Wachstum der HT-29 Xenotransplantate über 50 Tage. Die Pfeile markieren Anfang und Ende der beiden Behandlungszyklen mit 10 μ g 4D5MOC-B-ETA über 10 aufeinanderfolgende Tage.