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Einleitung

1.1  Ziel der Arbeit

Die Entstehung maligner Tumoren beruht auf einem gestörten Gleichgewicht zwischen Zellvermehrung und Zelltod. Krebszellen können sich unkontrolliert teilen, ohne durch den programmierten Zelltod (Apoptose) zu Grunde zu gehen. Die derzeit praktisch einzige Therapiestrategie gegen eine weitere Ausbreitung der Tumorzellen im Körper ist die systemische Chemotherapie. Sie wirkt meist unspezifisch antiproliferativ über eine Hemmung des DNA Stoffwechsels bzw. der Zellteilung und stellt gleichzeitig einen Auslöser für das apoptotische Programm dar. Krebszellen entwickeln jedoch Mechanismen, sich vor dem Selbstmordprogramm zu schützen und können sich so trotz Anwesenheit zytostatischer Wirkstoffe weiter ausbreiten. Bei vielen Tumoren etabliert sich im Laufe der Behandlung solch eine Chemoresistenz gegen strukturell unterschiedliche Substanzen. Dieser Vorgang ist häufig therapielimitierend und ein großes Problem in der heutigen Krebstherapie.

Es konnten bereits viele unterschiedliche, molekulare Mechanismen aufgeklärt werden, die Krebszellen vor chemotherapeutischen Wirkstoffen und der Apoptose schützen. Die Tatsache, daß die Entwicklung der Chemoresistenz eines Tumors auf vielen zellulären Ebenen basiert, macht die Entwicklung neuer rationaler Strategien zur effektiveren Krebsbehandlung zu einer besonderen Herausforderung. Durch wachsende Einblicke in die Biologie vieler Tumoren werden Mechanismen und Strukturen gefunden, die nicht oder nur sehr eingeschränkt in gesundem Geweben vorkommen. Es ist so möglich Substanzen zu entwickeln, die selektiv nur auf Krebszellen wirken. Tumorzellspezifische Wirkstoffe könnten in Zukunft alleine oder in Kombination mit etablierten Therapieverfahren effektive und nebenwirkungsarme Behandlungsformen für refraktäre Tumoren darstellen.

In dieser Arbeit sollen zwei neue, rationale Strategien vorgestellt werden, die Tumorzellen selektiv eliminieren bzw. gegenüber Standardtherapien wieder sensitivieren sollen. Es handelt sich um zwei unterschiedliche, neuentwickelte Wirkstoffe, die an verschiedenen Krebszellinien und im Mausmodell untersucht wurden und sollen im Folgenden kurz vorgestellt werden.

Die Auslösung der Apoptose wird von verschiedenen Proteinen unterschiedlich beeinflusst. Es steht fest, daß Tumorzellen Proteine überexprimieren, die sie vor der Apoptose und somit vor chemotherapeutischen Wirkstoffen schützen. Die Bcl-2 Familie spielt in diesem Zusammenhang eine zentrale Rolle (1). Proteine, die zur Bcl-2 Familie gehören regulieren die Apoptoseauslösung in gegensätzlicher Weise (2). Zwei wichtige Mitglieder dieser Familie sind Bcl-2 und Bcl-xL1 , die in unterschiedlichen Krebszellen entscheidend an der Chemoresistenzentwicklung beteiligt sind (3,4). Es wurden bereits erste Erfolge erzielt mittels Antisense Molekülen die Bildung eines dieser beiden Proteine spezifisch zu hemmen (5) und so Tumoren gegenüber


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Standardtherapien wieder sensitivieren (6,7). Bcl-2 Antisense Oligonukleotide wurden auch schon in klinischen Studien an Patienten getestet (8,9). Durch Auffinden von Homologieregionen in der mRNA von bcl-2 und bcl-xL, ist es möglich, mit einem dazu komplementär sequenziertem Antisense Oligonukleotid bcl-2 und bcl-xL mRNA gleichzeitig zu degradieren und so die Exprimierung beider Proteine zu hemmen (10).

Die Wirkung des bispezifischen 4625 Antisense, bezüglich Proteindegradierung beider Zielproteine, Proliferationshemmung und Apoptoseinduktion wurde alleine und in Kombination mit etablierten Chemotherapeutika in vitro und im Mausmodell untersucht. Fragestellung und Ziel dieser Untersuchung bestand insbesondere darin, ob Tumorzellen unabhängig von ihren Bcl-2/Bcl-xL Expressionsmustern auf das 4625 Antisense ansprechen und/oder gegenüber Zytostatika in vitro und in vivo sensitiviert werden können.

Ep-CAM (17 1-A Antigen oder EGP2) ist ein 38 kDa Oberflächenglykoprotein, das häufig von soliden Tumoren exprimiert wird (11,12). Neben der gesicherten Funktion als Adhäsionsmolekül konnte eine Beteiligung von Ep-CAM an Prozessen wie Invasion und Metastasierung bisher noch nicht ausreichend geklärt werden. Die Karzinomspezifität wurde allerdings in der Vergangenheit sowohl für diagnostische als auch therapeutische Zwecke genutzt (13,14). Ep-CAM stellt u.a. das Antigen für den monklonalen Antikörper 31 (MOC31) dar. Der MOC31 wurde in vorhergehenden Experimenten bereits nach Fusion mit dem Pseudomonas Exotoxin A athymischen Mäusen injiziert und inhibierte so das Wachstum humaner Tumoren (15). Geringe Tumorpenetration, Seruminstabilität bei 37°C und die murine Struktur des MOC31 begründeten weitere Anstrengungen den Antikörper und somit das Immunotoxin zu verkleinern, zu humanisieren und zu stabilisieren. Die variablen Fragmente des MOC31 wurden auf ein humanes Peptidgerüst (4D5) transferiert und nach weiteren Modifikationen entstand der bei 37°C stabile Miniantikörper scFv 4D5MOC-B (16). Durch Fusion mit den zytotoxisch wirksamen Domänen II und III des Pseudomonas Exotoxin A, entstand das Immunotoxin 4D5MOC-B-ETA.

Die zellspezifische Blockierung der Proteinsynthese, Proliferationshemmung, Zytotoxizität und anti-tumorale Wirkung in vivo wurde an verschiedenen Ep-CAM positiven Krebszellinien ermittelt. Von besonderem Interesse war hiebei, ob und inwiefern es gelungen ist die antitumorale Wirkung des 4D5MOC-B-ETA im Vergleich zu dem MOC31-ETA zu steigern.

1.2 Krebs, Chemotherapie und Chemoresistenz

1.2.1 Lungentumoren

Bronchialkarzinome stellen die häufigste Krebs assoziierte Todesursache westlicher Staaten dar (17). Insbesondere Raucher haben durch die Inhalation des Teers und der Mitverbrennstoffe ein signifikant erhöhtes Risiko an Lungenkrebs zu erkranken. Die Inzidenz steigt insbesondere bei Frauen gegenwärtig weltweit.

Klinisch und morphologisch gilt es das kleinzellige (SCLC) vom nicht kleinzelligen Bronchialkarzinom (NSCLC) zu unterscheiden. Histologisch werden diese in weitere Subgruppen unterteilt. Das schnell wachsende und früh metastasierende SCLC macht etwa 20% aller Lungenkarzinome aus. Es spricht initial sehr gut auf [Seite 10↓] Chemotherapie an und hat trotzdem eine sehr schlechte Prognose. Aufgrund von Rezidiven und Resistenzentwicklungen beträgt die beträgt 5 Jahres Überlebensrate lediglich 5%. Die serologischen Marker beim SCLC, die Neuronen spezifische Enolase, L-Dopa Dekarboxylase, Neurofilamente, etc. und die endokrin bedingten paraneoplastischen klinische Symptomatik deuten auf einen neuroendokrinen Ursprung des SCLC’s hin. Allerdings treten sowohl Symptome als auch die neuroendokrine Marker auch bei NSCLC auf und bei manchen Patienten entwickeln sich Kombinationstumoren. Zu den NSCLC Tumoren zählen Adeno-, Plattenepithel- und grosszelliges Bronchialkarzinom, die etwa im Verhältnis 3:3:1 auftreten. Im Allgemeinen haben das Adeno- und das grosszellige Bronchialkarzinom durch ihre ausgeprägtere Angioinvasion und hämatogene Streuung trotz langsameren Wachstums eine schlechtere Prognose als das Plattenepithelkarzinom. Wegen der späteren Metastasierung des NSCLC ist ein chirurgischer Eingriff zum Zeitpunkt der Diagnosestellung häufiger indiziert als beim SCLC. Die 5-Jahre Überlebensrate liegt dann bei etwa 50%.

Die Therapieform von Bronchialkarzinomen hängt bei beiden Formen im Wesentlichen vom Tumorstaging ab. Ein operativ kurativer Eingriff ist wegen der häufig bereits fortgeschrittenen Organmetastasierung zum Zeitpunkt der Diagnosestellung beim SCLC selten sinnvoll. Bei den systemischen Therapieformen sind Kombinationsbehandlungen den Monotherapien meist überlegen. Für fortgeschrittene Tumoren ab Stadium 3 sind Bestrahlung des Primärtumors und der befallenen Lymphknoten und die Hochdosistherapie mit autologer Knochenmarkstransplantation weitere Möglichkeiten einer Behandlung des SCLC’s.

1.2.2 Brustkrebs

Brustkrebs ist die am häufigsten diagnostizierte Krebserkrankung bei Frauen. Ein erhöhtes Risiko und ein Zeichen gesteigerter Malignität stellen dabei genetische Mutationen in den BRCA1 (18), BRCA2 und im p53 Gen dar, wobei das Risiko an genetisch bedingtem Brustkrebs zu erkranken mit zunehmendem Alter scheinbar abnimmt. Beim Mammakarzinom spielen hormonelle Einflüsse sowie autokrin stimuliertes Wachstum eine größere Rolle als beim Bronchialkarzinom. Es werden die östrogenrezeptorpositiven (ER+) von den östrogenrezeptornegativen (ER-) Mammakarzinomen unterschieden. Ein positiver ER Status wird als gutes prognostisches Zeichen gedeutet, unter anderem weil die pharmakologische Blockierung der Rezeptoren mit Östrogenantagonisten eine Behandlungsmöglichkeit darstellen kann. Auch wenn manche ER- Mammakarzinomzellen aus bisher unbekannten Gründen auch auf Antiöstrogene ansprechen, gelten diese als therapieresistenter. Pathohistologisch existieren unterschiedliche und komplizierte Klassifizierungen von Brustkrebs. Bei den invasiven Karzinomen unterscheidet man das duktale, medulläre, lobuläre, papillär, tubuläre muzinöse, apokrine und adenoidzystische Karzinom, denen noch verschiedene Komponenten zugeordnet werden können. Die Therapieform wird wie beim Bronchialkarzinom wesentlich vom Zeitpunkt der Diagnosestellung bestimmt. Auf einen operativen Eingriff wird bei fortgeschrittenem Tumorstadium häufig verzichtet und auch die Chemotherapie hat dann eine “nur” noch palliative Funktion. Nach wie vor häufig angewandte Systemtherapien bei Brustkrebs sind einerseits anthrazyclinhaltige Schemata und CMF (Cyclophosphamide, Methotrexat und 5-Fluorouracil) Andererseits Hormontherapien, wie Tamoxifen oder Aminoglutethimid. Neuere Wirkstoffe mit einer Response Rate von über 50% sind Taxane, wie beispielsweise Paclitaxel. Zwei für den europäischen Markt insbesondere zur Brustkrebstherapie neu zugelassene Wirkstoffe sind Herceptin und Capecitabine. Hier werden tumorspezifische Antigene bzw. Enzyme benutzt um eine [Seite 11↓] effektive und nebenwirkungsärmere Wirkung zu erzielen, die allerdings bisher noch nicht durch Langzeitstudien untersucht werden konnte.

1.2.3 Kolonkarzinome

Das kolorektale Karzinom ist die dritthäufigste krebsassozierte Todesursache und betrifft beide Geschlechter gleichermaßen. Risikofaktoren wie fett- und cholesterinreiche Nahrung erklären, daß die höchsten Inzidenzen in den Industrieländern vorkommen. Weitere prädisponierende Faktoren sind in erster Linie genetische Syndrome wie die FAP (Familiäre adenomatöse Polypose) und HNPCC (Heriditäre, nicht polypöse kolorektale Karzinome). Die bei diesen Patienten auftretenden multiplen Adenome des Darmtrakts entarten häufig zu malignen Karzinomen. Chronische Darmerkrankungen, wie Colitis ulcerosa und M. Chron, sowie idiopathische, adenomatöse Polypen sind weitere Risikofaktoren. Pathohistologisch sind fast 95% aller kolorektalen Karzinome Adenokarzinome und das histologische Grading korreliert eng mit der prognostischen Überlebenszeit. Den Gradings 1-3 stehen 5-Jahresüberlebenszeiten von 50-100%, 33-80% und 11-58% gegenüber. Folglich wird die Prognose auch hier im Wesentlichen durch die Früherkennung bestimmt. Chirurgische Resektion und postadjuvante Bestrahlung spielen bei dieser Tumorart eine wichtige Rolle. Gegen Ausbreitung und Organmetastasierung wird 5-Fluorouracil seit 50 Jahren noch immer als Monotherapie oder mit Methyl-CCNU und Vincristin eingesetzt.

1.2.4 Chemotherapie und Chemoresistenz

Vor der Entwicklung chemotherapeutischer Wirkstoffe, war Krebs nur lokal durch chirurgische Eingriffe oder Bestrahlung behandelbar. Aufgrund hämatologischer Krebserkrankungen und Metastasierungen solider Tumoren, stellen systemisch wirkende Zytostatika einen wesentlichen Fortschritt in der Tumorbekämpfung dar. Auch wenn die Entwicklung neuer Chemotherapeutika und Kombinationstherapien in den letzten Jahren dieBehandlungssituation bei einigen Tumorarten entscheidend verbesserte, sind insbesondere die häufig vorkommenden und prognostisch schlechten Karzinome, wie Bronchial-, Kolon- und Mammakarzinom, nach wie vor nicht erfolgreich therapierbar.

Man unterscheidet zwischen phasen-spezifischen und phasen-unspezifischen Zytostatika. Zur ersten Gruppe gehören Antimetabolite (wie auch 5-FU), Mitosehemmstoffe (Vinca-Alkaloide) und Paclitaxel. Zu den phasen-unspezifischen (oder zyklusspezifischen) zählen Platinkomplexverbindungen, Alkylantien und zytostatische Antibiotika. Klinisch werden die adjuvante (prae- oder postoperative) und die palliative Chemotherapie unterschieden, wobei erstere auf eine vollständige Tumoreradikation und Heilung, letztere dagegen auf eine Verbesserung der Lebensqualität abzielt. Die vollständige Eliminierung aller Tumorzellen spielt bei der adjuvanten Therapie deshalb eine so wichtige Rolle, weil theoretisch aus jeder Zelle wieder ein Rezidiv entstehen kann. Wenn man von einer initialen Tumormasse von etwa einem Kilogramm (1012 Zellen) ausgeht, ergibt sich eine klinisch vollständige Remission nach einer Zellreduzierung um 99.9%. Dies entspricht einem Tumorgewicht von 1 g und immer noch 109 Krebszellen. Solide Tumoren bestehen einerseits aus einer Wachstumsfraktion und andererseits aus Zellen die sich in der Ruhephase, also der G0 Phase befinden und durch verschiedene Einflüsse wieder zum Wachstum rekrutiert werden können. Das Wachstum eines Tumors [Seite 12↓] hängt im Wesentlichen von der Grösse der Wachstumsfraktion ab. Die sogenannte Generationszeit (die Dauer des Zellzyklus zwischen zwei Mitosen) spielt dabei eine untergeordnete Rolle und kann zwischen 20 und 100 Stunden schwanken. Insbesondere Tumorzellen der Wachstumsfraktion, die sich in der S oder M Phase des Zellzyklus befinden, sprechen auf Zytostatikatherapie an. Die aus der unspezifischen, antiproliferativen und zytotoxischen Wirkung resultierenden Nebenwirkungen von Chemotherapeutika betreffen vor allem die schnell proliferierenden Gewebe, wie das hämatopoetische Knochenmark, den Magen-Darm Trakt, die Haut und Haarfollikel. Diese unerwünschten Arzneimittelwirkungen beschränken oft die Dosis und Dauer der Therapie. Viele Tumorarten entwickeln während der Chemotherapie Resistenzen gegenüber strukturell unterschiedlichen Zytostatika und es werden zahlreiche Mechanismen diskutiert, die zur Entwicklung dieser Resistenzen beitragen. Viele sind bereits experimentell nachgewiesen und lassen sich auf die Expression inaktivierender Enzyme, wie Glutathion-S-transferase, Glutathionperoxidase oder auf Überexprimierung anti-apoptotischer Proteine zurückführen. Eine wichtige Rolle in der Chemoresistenz spielt auch das mdr-1 Gen, dessen Protein, ein membranständiges Glykoprotein, die antitumoralen Wirkstoffe in einem energieabhängigen Prozess regelrecht aus der Zelle pumpt und somit von ihrem Wirkort entfernt. In den letzten Jahren konnte gezeigt werden, daß Tumorzellen, welche durch ein Zytostatikum eliminiert werden, überwiegend durch Apoptose zu Grunde gehen. Diese Einsicht macht Apoptose-regulierende Substanzen zu neuen potentiellen Wirkstoffen zur erfolgreicherenKrebstherapie. Auch die Untersuchung pro- und anti-apoptotische wirkender Proteine ist ein wichtiger Bestandteil der gegenwärtigen Krebsforschung. Insbesondere die Bcl-2 Familie scheint eine entscheidende Rolle in der Chemoresistenzentwicklung zu spielen. Auch, wenn gegensätzliche Aufassungen über bcl-2 bezüglich der prognostischen Beurteilung von Tumorleiden existieren (19), so scheint doch die Tatsache gesichert, daß Bcl-2 überexprimierende Tumoren, sich weniger durch ein schnelles Wachstum, als vielmehr durch erhöhte Resistenz gegenüber Chemo- und Radioresistenz ausgezeichnen und als hochmaligne angesehen werden müssen. Die Tatsache, daß Bcl-2 Apoptose von Zellen in Abwesenheit, überlebenswichtiger Zytokine verhindert, könnte auch einen Beitrag zur Metastasierung erklären. Die Überexprimierung des Onkogens könnte einzelne, zirkulierende Tumorzellen vor dem Selbstmordprogramm schützten. Bcl-xL konnte bereits eine an der Metastasierung beteiligte Funktion in Mammakarzinomzellen nachgewiesen werden (20)

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1.3 Apoptose

Apoptose (gr. apoptos: Das Herabfallen) ist ein kontrollierter, energieabhängiger, sogenannter “programmierter Zelltod”, der im Laufe der Embryonal- und Organentwicklung von ganzen Zellverbänden zu unterschiedlichen Zeitpunkten durchlaufen werden muß, um die Integrität des Gesamtorganismus nicht zu gefährden. Praktisch jede Körperzelle ist mit dem Programm für die Apoptose ausgestattet und adäquate Stimuli können dieses Programm auslösen. Morphologisch geht die Apoptose mit einer Kondensierung des Chromatins, einer blasigen Veränderung und Schrumpfung von Kern und Zelle (Schrumpfnekrose) einher und endet schliesslich mit der Auflösung der Zelle in viele Zellkörperchen (apoptotic bodies). Die Apoptose läuft im Gegensatz zur Nekrose ohne Entzündungsreaktion ab, weil einzelne Zellkörperchen von Makrophagen phagozytiert werden und so keine inflammatorisch wirkenden zytosolischen Zellbestandteile in den Extrazellulärraum gelangen.


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Neben Krebs werden heute eine Reihe verschiedener Erkrankungen auf eine Störung in der Apoptose zurückgeführt. Aus diesem Grund erwarten mehrere Fachrichtungen der Medizin grosse Erfolge von neuen, therapeutischen Apoptose-regulierenden Substanzen, die entweder Apoptose induzieren oder hemmen (21).

Für die Auslösung des programmierten Zelltodes kann man einen rezeptorvermittelten, also exogen ausgelösten und einen mitochondrialen, also endogenen Signaltransduktionweg unterscheiden. Diese beiden “pathways” besitzen eine gemeinsame Endstrecke in der Aktivierung von ICE related Proteasen (Caspasen). ICE steht für Interleukin-1ß Converting Enzyme und bezeichnet eine Familie hochspezifischer Proteasen. Sie liegen intrazellulär als inaktive Proenzyme vor und werden nach proteolytischer Spaltung in die aktive Form überführt. Daraufhin bauen sie zelluläre Bestandteile ab und aktivieren weitere Caspasen, die den programmierten Zelltod vollstrecken.

Die molekularen Mechanismen der Apoptose wurden anfangs am besten an dem Nematoden Caenorhabditis elegans untersucht. Es konnten drei verschiedene Proteine isoliert werden, die für die normale Entwicklung von C. elegans erforderlich sind. Ced-3, Ced-4 und Ced-9. Der Funktionsverlust oder das Fehlen von Ced-3 und/oder Ced-4 erschwert die Auslösung der Apoptose in den betroffenen Zellen. Verlust von Ced-9 führt dagegen zu einer erhöhten Apoptosebereitschaft. Ced-4 kann sowohl an Ced-3 als auch an Ced-9 binden. Im ersten Fall wird die proteolytische Aktivität von Ced-3 aktiviert. Im zweiten Fall hindert Ced-9 Ced-4 an der Aktivierung von Ced-3. Da es sich hierbei um phylogenetisch alte Gene handelt, haben die Proteine des Nematoden eine starke Ähnlichkeit mit denen des Säugerorganismus. Spätere Experimente konnten zeigen, daß Ced-3 den Caspasen der Säugetiere ähnelt. Ced-9 dagegen entspricht dem Bcl-2 Protein (22, 23) und Apaf-1 stellte sich schliesslich als lang gesuchtes Korrelat zu Ced-4 heraus (24).

1.3.1 Die Bcl-2 Familie

Bcl-2 steht für B-cell lymphoma. Bcl-2 ist ein 26 kDa Protein und wurde das erste mal in Lymphomzellen mit einer 14/21 Translokation entdeckt. Hierbei wird das bcl-2 Gen unter die Kontrolle des Immunglobulinpromoters gestellt und überexprimiert, woraufhin die betroffenen Zellen apopotoseresistent werden (25). Mittlerweile sind mindestens 17, sowohl pro-, als auch anti-apoptotisch wirkende Proteine identifiziert worden, die aufgrund der strukturellen Ähnlichkeit zur Bcl-2 Familie zusammengefaßt werden. Zu den anti-apoptotischen gehören Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1 und NR-13. Bax, Bak, Bad, Bcl-xS und EGL-1 sind die wichtigsten pro-apoptotischen Mitglieder der Bcl-2 Familie. Alle diese Proteine enthalten zumindest eine der vier konservierten Domänen, die als BH (Bcl-Homology) bezeichnet werden (BH1-BH4). Bcl-2 und Bcl-xL enthalten alle vier homologe Regionen BH1-BH4, wohingegen die proapoptotischen Gegenspieler oft nur BH1, BH2, und/oder nur BH3 enthalten. Inwieweit die einzelnen Domänen in Bindungen mit anderen regulatorischen Proteinen involviert sind, ist derzeit noch nicht vollständig geklärt. Der BH3 Domäne scheint allerdings eine besondere Rolle im pro-apoptotischen “signaling” zuzukommen. Dies läßt sich auf jeden Fall annehmen, da einige Proteine isoliert wurden, die ausschließlich BH3 enthalten (BH3-domain-only proteins) und eine pro-apoptotische Wirkung zeigen. Die BH4 Region scheint dagegen eher anti-apoptotische Eigenschaften zu haben und stellt evtl. die Bindungsstelle für die CED4 ähnliche Domäne von Apaf1 dar.


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Die verschiedenen Bcl-2 Familienmitglieder interagieren unterschiedlich miteinander und es ergeben sich komplizierte Regulationsmechanismen der Apoptose insgesamt. Generell kann man sich ein rheostatisches Gleichgewicht der verschiedenen pro- und anti-apoptotischen Faktoren vorstellen, welches das Schicksal der Zelle bestimmt.

Bcl-2 und Bcl-xL sind über karboxyterminale, hydrophobe Domänen in der äußeren Mitochondrienmembran, im ER und der Kernmembran verankert (26). Unterschiedliche Experimente konnten zeigen, daß Bcl-2 und auchBcl-xL die Fähigkeit besitzen Apaf1 zu binden und damit diesen Apoptose aktivierenden Faktor zu inaktivieren (27). Dieses sogenannte displacement Modell entspricht den für C. elegans nachgewiesenen Wechselwirkungen der CED-Moleküle miteinander und wird derzeit auch für andere apoptoseregulierende Proteine diskutiert. So wurde beispielsweise gezeigt, daß Bcl-2 und Bcl-xL ihren proapoptotischen Gegenspieler Bax binden und somit inaktivieren können. Die Frage, ob hierbei Bcl-2 und Bcl-xL die pro-apoptotische Wirkung von Bax unterdrücken oder selbst auch anti-apoptotisch wirken, wird laut neueren Erkenntnissen wohl so beantwortet werden, daß beide beides können (28). Die Zucht von knock-out Mäusen ermöglicht tiefere Einblicke in die Regulationsmechanismen der Apoptose und es stellte sich heraus, daß Bax auch in der Abwesenheit von Bcl-2 und Bcl-xL pro-apoptisch wirkt und andersherum (29). Mutanten der Proteine, die trotz dem Verlust der Fähigkeit zu dimerisieren, noch eine anti- bzw pro-apoptotische Wirkung zeigten, konnten dies bestätigen.

Die Bcl-2/Bax bzw. Bcl-xL/Bax Ratio wird gegenwärtig als ein entscheidend für den programmierten Zelltod insbesondere im Rahmen der Chemoresistenzentwicklung angesehen (30). Dabei sollen einige Zytostatika kurzfristig, d.h. innerhalb von Stunden bis wenigen Tagen die Exprimierung von Bcl-2/Bcl-xL und Bax/Bak gegensätzlich beeinflussen (31, 32). Auch eine Änderung des Membranpotentials der Mitochondrien (y) gilt als ein möglicher Auslöser für Apoptose (33), der durch Bcl-2 und Bcl-xL verhindert wird. Der pH Gradient, durch die Atmungskette aufrecht erhalten, besteht zwischen der intramitochondrialen Matrix und dem intermembranösen Raum. Die äußere Membran ist für Ionen frei permeabel. In der Änderung von pH und Ionenkonzentration während der Apoptose wirken Bcl-2/Bcl-xl und Bax/Bak ebenfalls antagonistisch (34), indem erstere sog. Porin-Proteine oder VDACs (Voltage Dependent Anion Channels) zu schließen und letztere zu öffnen vermögen (35). Einige Untersuchungen gingen sogar noch weiter und zeigten, daß sowohl Bcl-2 und Bcl-xL als auch Bax in vitro Kanäle in biologische Membranen formen können (36-38). Die 3-dimensionale Struktur von Bcl-xL zeigt eine gewisse Ähnlichkeit mit Membranporen bildenden, bakteriellen Toxinen und es ist derzeit noch nicht vollständig geklärt, ob und welche Stoffe durch einen solchen Kanal gelangen können. Anderen Substanzen wird dagegen der Austritt aus dem mitochondrialen Kompartiment durch Bcl-2/Bcl-xL erschwert. In diesem Zusammenhang sollen Bcl-2 und Bcl-xL den Ausstrom von mitochondrialen Cytochrom c verhindern (39). Es wurde gezeigt, daß die aminoterminale Bindungsstelle von Apaf1 (CARD =CAspase Recruitment Domain) unter dem Einfluß von Cytochrom c konfirmatorisch im Sinne einer verstärkten Bindung und somit Aktivierung der Caspase-9 modifiziert wird. Der Komplex aus Apaf1, Caspase-9 und Cytochrom c erhielt wegen seiner entscheidenden Funktion auch den Namen Apoptosom. Cytochrom c ist für die Zelle also ein Signal für die Apoptose. Die Tatsache, daß Bcl-2 überexprimierende Zellen durch Mikroinjektion großer Mengen von Cytochrom c nicht apoptotisch werden, zeigt allerdings, daß dies nicht als isolierter Mechanismusverstanden werden darf und auch nicht der einzige Auslöser für Apoptose sein kann.


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In jüngster Zeit konnte immer wieder gezeigt werden, daß manche Bcl-2 Proteine auch einer posttranslationalen Modifizierung unterliegen und die anti-apoptotische Wirkung von Bcl-2 durch Phosphorylierung verschieder Threonin Reste abgeschwächt werden kann. Gerade auch im Zusammenhang mit der Wirkung von Paclitaxel wird eine Phosphorylierung und somit Inaktivierung von Bcl-2 und diskutiert (40). Die Relevanz dieser Mechanismen ist jedoch umstritten (41).

1.3.2 APO/Fas-Rezeptoren

Eine Zelle im Gesamtorganismus ist zum Überleben stets auf Reize von außen angewiesen. Im Falle des Kontaktverlusts oder Zytokinentzug kann die apoptotische Maschinerie in Gang gesetzt werden. Im Gegensatz zu diesen negativen Reizen gibt es auch positive, die durch Aktivierung bestimmter Zellrezeptoren Apoptose auslösen können. Hierzu gehören Liganden, wie Glukokorticoide, TNF und Lymphotoxin a.

Die am besten beschrieben Rezeptoren sind der FAS/Apo1/CD95 Rezeptor und der TNFR1/p55/CD120a Rezeptor (42). Rezeptoren der TNF-Familie scheinen eine in sich antagonistische Wirkung zu haben. So wirkt der TNFR1 pro- ,der TNFR3 dagegen überwiegend anti-apoptotisch und der TNFR2 nimmt eine Mittelstellung ein. Die intrazelluläre C-terminale Domäne des CD95 Rezeptors gleicht der des TNFR1 Rezeptors und enthält eine Bindungsstelle für zytoplasmatische Liganden, die sogenannte “Death Domain” (DD). Nach Ligandenbindung des CD95 oder TNFR1 dimerisieren die Death Domains eines Rezeptors, woraufhin das Adapterprotein FADD (Fas-Associated Death Domain) mit einer eigenen DD an den Komplex bindet und mit einer anderen Domäne, der DED (Death Effector Domain) mit dem Zymogen von Caspase 8 (FLICE) dimerisiert. Dabei wird durch die Aktivierung der CARD (CAspase Recruitment Domain), welche in verschiedenen Capasen vorhanden ist, die Protease gespalten und in ihre aktive Form überführt. Caspase 8 aktiviert dann weitere Effektor-Caspasen und die Apoptose wird durchlaufen.

1.3.3 Caspasen

Caspasen erhielten ihren Namen Mitte der neunziger Jahre durch ihre Substratspezifität (Cystein; ASPArtat) und stellen das Korrelat zu CED-3 von C. elegans dar. Mittlerweile sind etwa 13 Isoenzyme identifiziert, welche je nach Entdeckungszeitpunkt von 1-13 durchnumeriert wurden. Es sind Proteasen die bei Entzündungsreaktionen und bei der Apopotose eine wichtige Rolle spielen. Alle Caspasen werden als inaktive Proenzyme exprimiert und bestehen aus drei Domänen. Einer NH2-terminalen, einer Großen und einer Kleinen. Nach proteolytischer Spaltung zwischen der großen (~20 kDa) und der kleinen (~10 kDa) Untereinheit, verbinden sich beide zu einem Heterodimer, woraufhin zwei dieser Heterodimere zum Tetramer fusionieren und die aktive Form der Caspasen, mit zwei unabhängig voneinander funktionierenden aktiven Zentren bilden.

In der Apoptose stellen Caspasen die gemeinsame Endstrecke des extrinsischen und intrinsischen Weges dar, wobei Caspase 8 das Bindeglied für den rezeptorvermittelten und Caspase 9 für den mitochondrial eingeleiteten programmierten Zelltod sind (43). Caspasen werden oft als Vollstrecker der Apoptose angesehen. Dies trifft vor allem auf die Effektor Caspasen 3, 6 und 7 zu. Substrate der Caspasen sind einerseits wiederum andere Caspasen die sich daraufhin gegenseitig im Sinne einer sich selbst verstärkenden Kaskade aktivieren und andererseits verschiedene Endonukleasen, die die genomische DNA zu spalten vermögen. Hierdurch entstehen die nach elektrophoretischer Auftrennung Apoptose typischen DNA Leitern (DNA-laddering). Bei der Substratspezifität [Seite 16↓] der Caspasen wird insbesondere diskutiert, ob die Proteasen im Rahmen der Apoptose Proteine inaktivieren, die an der Unterdrückung des Zelltodes beteiligt sind (44). Da die Proteolyse ein irreversibler Vorgang ist und eine proteolytische Kaskade, wenn einmal gestartet kaum mehr gestoppt werden kann, müssen Caspasen in besonderem Maße reguliert werden. Dies geschieht einerseits durch zytosolische Proteine (IAP, Survivin) und durch positive und negative Rückkopplung der Substrate.

Abb. 1 : Abgebildet sind der intrinsische und extrinsische Signaltransduktionsweg der Apoptose,welche in der Aktivierung der Effektorcaspasen 3, 6 und 7 enden. Die apoptotische Maschinerie wird auf unterschiedlichen Stufen reguliert und gehemmt. P53 und einige Proteine der Bcl-2 Familie bewirken eventuell eine rezeptorvermittelte Aulösung beider Transduktionwege. (HSP = Heat Shock Protein; IAP’s = Inhibitors of Apoptosis; Apaf = Apoptosis inducing factor; FADD = Fas Associated Death Domain; CARD = CAspase Recruitment Domain

1.4 Neue Therapiemethoden

1.4.1 Antisense Nukleotide

Antisense Nukleotide sind neuartige pharmakologische Wirkstoffe, deren Effektivität und Sicherheit zum großen Teil noch experimentell ermittelt wird. Es wurden allerdings auch schon klinische Studien mit Mono- und Kombinationstherapien bei unterschiedlichen Krebserkrankungen durchgeführt. Zur antineoplastischen Behandlung befinden sich beispielsweise Bcl-2 Antisense Moleküle gerade in Phase 1 der klinischen Erprobung (45).

Die Idee bei Antisense Oligonukleotiden ist die DNA bzw. mRNA eines krankheitsrelevanten Gens mit dem dazu komplementären Antisense Molekül sequenzspezifisch zu blockieren und somit die Bildung des biologisch [Seite 17↓] aktiven Proteins zu verhindern. Besondere Herausforderungen sind hierbei zum einen geeignete chemische Modifikationen, um Stabilität und sequenzspezifische Affinität des Oligonukleotids zu erhöhen, und zum anderen die Auswahl effektiver Bindungsregionen auf der Ziel-mRNA (46,47).

1.4.1.1 Struktur

Antisense Nukleotide bestehen aus 8-30 einzelsträngigen Basen, die komplementär zur mRNA-Zielregion des betreffenden Proteins sequenziert sind. Unmodifizierte Phosphodiester DNA/cDNA wird rasch von extrazellulären DNasen noch vor der Zellaufnahme abgebaut. Deswegen existieren heute verschiedene chemische Modifikationen, die vor allem das Gerüst des Nukleotidstranges, das sog. Backbone betreffen. Am besten etabliert sind die Phosphorothioate, bei denen ein Sauerstoffatom im Phosphat durch ein Schwefelatom ersetzt ist. Das Oligonukleotid ist so weitgehend vor dem enzymatischen Abbau geschützt, ohne daß es dabei an RNA Affinität verliert. Phosphorothioate Antisense Nukleotide wurden auch in den klinischen Studien verwendet. Sie können entweder teilweise (am 3’ und 5’ Ende) oder vollständig modifiziert sein. Mittlerweile existieren Antisense Nukleotide der zweiten Generation, wobei diese zusätzlich zu dem “phosphorothioated backbone” weitere Modifikationen enthalten. Insgesamt ergeben sich viele verschiedene Kombinationen der

Abb. 2 Verschiedene chemische “backbone” Modifikationen von Antisense Oligonukleotiden (Kronenwett et al. Antisense strategies for the treatment of hematological malignancies and solid tumors Ann. Hematol. 77, 1-12

einzelnen Basen- Phosphat- und Zuckermodifikationen. Bei den Zuckermodifikationen handelt es sich meist um Substituierung des Wasserstoffatoms an 2’ Position der Ribose durch Methyl, Propyl-, Pentylreste oder komplexeren Substituenten, wie in unserem Fall ein 2’-O-Methoxy-Ethoxy-Rest (MOE). Es gilt insgesamt die zelluläre Aufnahme, die Aktivierung der Ribonuklease H (RNase H) und Stabilität gegenüber DNasen zu verstärken, ohne dabei etwas von dem spezifischen Antisense Effekt einzubüßen. Durch Zuckermodifikation eines Antisense-Moleküls der zweiten Generation, nimmt beispielsweise das Ausmaß der RNase H Aktivierung zu, dafür allerdings die Sequenspezifität gegenüber der Ziel-mRNA ab. Es existieren deshalb kaum vollständig, sondern vielmehr nur an den 5’ und 3’ Enden Zucker-modifizierte Oligonukleotide. Solche sogenannten “wingmers”.wurden auch in den hier vorgestellten Experimenten verwendet.

1.4.1.2 Zelluläre Aufnahme

Aufgrund der anionischen Natur von Nukleotiden werden nackte Oligonukleotide kaum von Zellen aufgenommen und es existieren verschiedene Methoden die zelluläre Aufnahme von Antisense Molekülen in [Seite 18↓] vitro zu verstärken. Neben viralen und liposomalen Vektoren stellen lipophile, polykationische chemische Verbindung im Komplex mit dem Nukleotid eine Möglichkeit des effektiven “cell delivery” dar (48). Das negativ geladene Nukleotid bildet einen Komplex mit diesen kationischen Lipiden und ist so erstens gegen extrazelluläre enzymatische Degradation geschützt und wird zweitens 50-1000 mal stärker von Zellen aufgenommen als nackte Nukleotide. Bei der Lipid vermittelten zellulären Aufnahme durch ubiquitäre, membranständige Glykoproteine handelt es sich um eine unspezifische Endozytose, bei der die Wirkstoffe nach Internalisierung aus dem Endosom in das Zytosol freigelassen werden.

1.4.1.3 Wirkungsmechanismen

Es existieren mehrere potentielle Wirkungsmechanismen für Antisense Oligonukleotide. Hybridisierung mit einem einzelsträngigen DNA Strang nach Spaltung durch die DNA Polymerase kann die Genexprimierung auf dem Transkriptionslevel blockieren. Durch Besetzen einer Intron-Exon Verbindungszielregion wird der Spleissvorgang verhindert und durch Binden an Initiationsfaktoren und Ribosomenuntereinheiten wird die Proteinexprimierung auf der Ebene der Translation gestört. Der entscheidende Mechanismus ist allerdings die Hybridisierung mit der einzelsträngigen mRNA und nachfolgender enzymatischer Spaltung. Nach der Zellaufnahme muß das Antisense mit der Zielregion “seines” mRNA Stranges hybridisieren, um dessen enzymatischen Abbau zu provozieren. Hierbei ist es wichtig zu wissen, daß die mRNA in vivo nicht als singulärer Strang, sondern als vielfach in sich hybridisiertes Molekül vorliegt und so nur wenige Sequenzen frei liegen. Dies schränkt die Auswahl von Zielregionen erheblich ein. Im übrigen muß sicher gestellt werden, daß die zu dem Antisense komplementäre Basensequenz in keinem anderen menschlichen Gen vorkommt.

Wenn das Nukleotid seine Zielregion gefunden hat und mit der mRNA Sequenz hybridisiert, wird die RNase H durch die unnatürliche Struktur aktiviert und spaltet die mRNA jedoch nicht das modifizierte Antisense Molekül. Der Antisense Effekt wird in der Tat zum größten Teil von der Aktivierung dieser RNase H bestimmt und es ist im Prinzip möglich, daß ein Antisense-Nukleotid mehrere Ziel-mRNA Stränge zerstört.

Toxizität und Pharmakokinetik von Antisense Nukleotiden konnten in den klinischen Studien bereits bestimmt werden. So weiß man heute, daß nach i.v. Applikation All-Phosphorothioate mit niedriger Affinität an Albumin und andere Serumproteine binden. Sie verteilen sich jedoch in der gesamten Peripherie und akkumulieren in Leber, Niere, Skelettmuskel, Rückenmark und Haut. Phosphorothioate werden je nach Gewebe innerhalb weniger Tage eliminiert und können die Blut-Hirn Schranke nicht überwinden.

Es konnten am Menschen nach mehrwöchiger intravenöser Gabe von 2mg/kg/Tag keine schwerwiegenden Nebenwirkungen festgestellt werden.

1.4.2 Immunotoxine

Immunotoxine bestehen aus einem Rezeptorliganden oder Antikörper und einer zytotoxisch hochwirksamen Substanz, die entweder chemisch oder genetisch rekombinant miteinander fusioniert wurden. Nach Antigenbindung werden die Zellgifte selektiv in Zielzellen eingeschleust. Tumorspezifische Oberflächenmoleküle können so für eine zielgerichtete Krebsbehandlung genutzt werden, indem sie die [Seite 19↓] Aufnahme von intrazellulär wirkenden Toxinen vermitteln. Gesunde Gewebe, die das Oberflächenantigen nicht tragen, bleiben dabei unversehrt. Heilversuche an Patienten, mit unterschiedlichen, austherapierten, malignen Erkrankungen, konnten in der Vergangenheit bereits öfters zu Erfolgen führen (49,50)

1.4.2.1 Struktur

Es ergeben sich unterschiedliche Herstellungsstrategien, die v.a. durch die chemische Beschaffenheit des Toxins bestimmt werden. Bei Proteinen kann das gesamte Immunotoxin von Bakterien produziert werden. Handelt es sich nicht um Proteine werden Verbindungsmoleküle benötigt, welche die chemisch unterschiedlichen Stoffe miteinander verbinden. Für die Behandlung hämatologischer Tumoren ist das daraus resultierende hohe Molekulargewicht von Vorteil, da das Immunotoxin nur schwer die Blutgefäße verlassen kann und eine lange Plasmahalbwertzeit besitzt.

Zur effizienten Therapie solider Tumoren ist ein geringes Molekulargewicht für die ausreichende Tumorpenetration erforderlich. Dafür entwickelte mAb’s (mini Antibodies) bestehen aus den variablen bzw. hypervariablen Fragmenten einer Bindungsdomäne des ursprünglichen Antikörpers und werden, wenn sie aus einer Peptidkette bestehen, als scFv (single chain Fragment variable) bezeichnet. Wenn die Bindungsregionen der VH und VL Region durch eine Disulfidgruppe verbunden sind spricht man von dsFv.

Herausforderungen für die Entwicklung therapeutischer Antikörper sind Verträglichkeit, Schutz vor dem Immunsystem des Patienten und ausreichende Serumstabilität bei 37° C. In diesen Experimenten wurde ein scFv Antikörperfragment benutzt, das durch Transfer der variablen Regionen des Ep-CAM spezifischen MOC31 auf ein 4D5 Gerüst humanisiert werden konnte. Nach Austausch ausgewählter Aminosäuren konnte die Stabilität des 4D5MOC-B in Serum bei Körpertemperatur gewährleistet werden (16). Bei dem Toxin handelt es sich um das Pseudomonas Exotoxin A. Die Domäne 1, welche die Zellaufnahme über den ubiquitären α -Makro­globulin­rezeptor vermittelt, wurde durch den 4D5MOC-B ersetzt. So entstand das Ep-CAM spezifische rekombinante scFv 4D5MOCB-ETA252-613 Immunotoxin.

1.4.2.2 Zelluläre Aufnahme

Da der erste Schritt der zellulären Aufnahme von Immunotoxinen die Bindung des Oberflächenantigens ist, wird das Ausmaß der Internalisation im Wesentlichen von der Affinität des Antikörpers und der Dichte des Antigens auf der Zelloberfläche bestimmt. Das Oberflächenmolekül wird dann gemeinsam mit dem Immunotoxin durch Endozytose aufgenommen. Die Translokation durch die Zellmembran wird häufig von anderen molekularen Strukturen mitbestimmt und Verbesserungen der zellulären Aufnahme werden oft empirisch gefunden. Im Weiteren hängt die Aufnahme ins Zytosol beim ETA von dem Transfer durch den Golgi-Apparat und das ER ab. Ein KDEL Rezeptor vermittelt die Translokation von ETA durch das ER ins Zytosol. Durch eine gentechnische Veränderung einer c-terminalen REDLK Region in KDEL kann den Transfer von ETA durch das ER erleichtert und die zytotoxische Wirkung wird so verstärkt werden (51). Solch ein KDEL-ETA wurde auch für das 4D5MOC-B-ETA Immunotoxin verwendet.


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1.4.2.3  Wirkungsmechanismen

Die Hauptwirkung von Immunotoxinen wird von der Art des gebundenen Wirkstoffes bestimmt. Bei der Auswahl eines geeigneten Toxins stehen mehrere bakterielle und pflanzliche Gifte zur Verfügung. Es werden insbesondere das Rizinus-, Diphterietoxin und, wie in dem hier beschriebenen Fall das Pseudomonas-Exotoxin A verwendet. Dieses AB-Toxin hemmt die ribosomale Proteinsynthese bereits in extrem geringen Konzentrationen.

Abb. 3 4D5MOC-B-ETA besteht aus der den variablen Teilen der schweren und leichten Kette (VH und VL) des MOC31. Der Austausch einiger AS gegen Histidin führte zu der hohen Serumstabilität. Das ETA enthält die mutierte KDEL Region.

Die biologisch wirksamen Domänen 2 und 3 (AS. 253 - 364) inaktivieren nach zellulärer Aufnahme und Translokation in die Membran des ER, die zelluläre Proteinsynthese, indem sie den Elongationsfaktor-2 ribosylieren. Nach neuen Erkenntnissen führt dieser Wirkungsmechanismus, der sich grundlegend von den Zytostatika unterscheidet, auch zur Auslösung der Apoptose (52). Nebenwirkungen und Pharmakokinetik von Immunotoxinen wird vor allem von deren Größe bestimmt. Antikörper Fragmente, wie scFv haben eine Plasmahalbwertzeit von etwa 30 Minuten und sollten deshalb öfters oder durch eine Infusion injiziert werden. Untersuchungen bei Mäusen zeigten Anreicherungen in Niere und Leber und langfristig im tumoralen Zielgewebe (75).


Fußnoten und Endnoten

1  Im folgenden Text werden zwei Schreibweisen für Bcl-2 Familienmitglieder verwendet. Wenn die Proteine gemeint sind, werden diese groß geschrieben. Sind sie kleingeschrieben bezieht es sich auf die Gene bzw. mRNA.



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08.06.2004