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2  Materialien

2.1 Tumorzellinien

A-549

Nicht-kleinzelliges Bronchialkarzinom

H-125

Nicht-kleinzelliges Bronchialkarzinom

SW2

Kleinzelliges Bronchialkarzinom

MCF-7

ER positives Mammakarzinom

MDA-MB-231

ER negatives Mammakarzinom

Colo-320

Kolorektales Karzinom

HT-29

Kolorektales Karzinom

LoVo

Kolorektales Karzinom

SQ20B

Larynxkarzinom

RL

B-Zell Lymphom

Die beiden Zellinien SW2 und SQ20B stammen vom Dana Faber Institute (Boston, MA, USA). Alle anderen Zellinien wurden vom American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA) bezogen.

2.2 Chemikalien und Reagenzien


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DMEM/RPMI Medium

Hyclone Europe (Cramlington, UK)

FCS

Hyclone Europe (Cramlington, UK)

Hepes

Kantonsapotheke (Zürich, CH)

L-Glutamin

Gibco BRL, Life Technologies (Paisley, UK)

Penicillin/Streptomycin

Gibco BRL, Life Technologies (Paisley, UK)

RPMI-1640

Hyclone Europe (Cramlington, UK)

Trypsin/EDT

Biochrom (Berlin, GER)

APS

Gibco BRL, Life Technologies (Paisley, UK)

BSA

Fluka (Buchs, CH)

DMF

Fluka (Buchs, CH)

DTT

Sigma (St. Louis, MO, USA)

EDTA

Sigma (St. Louis, MO, USA)

HCl

Fluka (Buchs, CH)

Lipofectin

Gibco BRL, Life Technologies (Paisley, UK)

Methanol

Fluka (Buchs, CH)

MTT

Sigma (St. Louis, MO, USA)

NaCl

Fluka (Buchs, CH)

Trockenmilchpulver

Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA, USA)

Paraformaldehyde

Kantonsapotheke (Zürich, CH)

PBS

Kantonsapotheke (Zürich, CH)

PMSF

Sigma (St. Louis, MO, USA)

Propidiumiodid

Sigma (St. Louis, MO, USA)

Rotiphorese Gel 30

Carl Roth GmbH & Co (Karlsruhe, GER)

SDS

Fluka (Buchs, CH)

TBS

Kantonsapotheke (Zürich, CH)

TEMED

Fluka (Buchs, CH)

Tris

Sigma (St. Louis, MO, USA)

Trypan-Blau

Sigma (St. Louis, MO, USA)

Tween 20

Sigma (St. Louis, MO, USA)

Mercaptoethanol

Sigma (St. Louis, MO, USA)

Antikörper

Anti-Bcl-2 (monoklonal, Maus)

Dako Diagnostics AG (Glostrup, DK)

Anti-Bcl-xL (polyklonal, Kaninchen

ICN Biomedicals Inc. (Aurora, OH, USA)

Anti-Aktin (monoklonal, Maus)

Transduction Lab’s (Lexington, KY, USA)

Anti-Hisidin-Tag (monoklonal, Maus)

DKFZ (Heidelberg, GER)

Anti-Maus (Peroxidase konjugiert, Kaninchen)

Sigma, (St. Louis, MO, USA)

Anti-Kaninchen(Peroxidase konjugiert, Ziege)

Sigma, (St. Louis, MO, USA)

Kits

Pierce BCA Kit

Pierce (Rockford, IL, USA)

ECLTM Detection Reagent

Amersham Pharmacia (Dübendorf, CH)

Geräte und Software

Dual Gel Caster (mit Elektrophoresezubehör)

Amersham Pharmacia (Dübendorf, CH)

Polyvinyl Fluorid Membran

Millipore Corp. (Bedford, MA, USA)

Agfa X-Ray Filme

FUJIFILM, Fuji (Zürich, CH)

Entwickler

AGFA Curix 60

Semi-dry Blotting Kammer

Amersham Pharmacia (Dübendorf, CH)

SCANware/Software

HP Intelligent/HP PrecisionScan Pro 2.0

FACScalibur Durchflusszytometer

Becton Dickinson (Mtn. View, CA, USA)

CellQuest Software

Becton Dickinson (Mtn. View, CA, USA)

SPECTRAmax 340 microplate reader

Molecular Devices (Sunnyvale, CA, USA)

SOFTmax PRO software

Molecular Devices (Sunnyvale, CA, USA)

2.3 Wirkstoffe

2.3.1 Zytostatika

5-Fluorouracil (Roche Pharma, Reinau, CH) ist ein Pyrimidin Analog und wird im Körper über 5-FUMP zu 5-Fluorodeoxyuridinmonophosphat (FdUMP) umgewandelt, das eine hohe chemische Ähnlichkeit zu Thymidin aufweist. Als Antimetabolit wirkt FdUMP hemmend auf den DNA/RNA-Stoffwechsel. Es bindet die Thymidilat Synthase mit vielfach höherer Affinität als dUMP und blockiert damit den letzten Schritt der zellulären Thymidin Shynthese. Neben der DNA wird auch die RNA Synthese durch 5-FU gestört, indem zuerst gebildetes 5-FUMP in RNA eingebaut wird. Auch, wenn 5-Fluorouracil zu den alten Chemotherapeutika gehört, ist der klinische Einsatz insbesondere bei kolorektalen Tumoren auch heute noch aktuell.

Paclitaxel (Bristol-Myer Squibb AG, Baar, CH) ist die als erste zugelassene Substanz der Taxane, einer neuen Zytostatika Klasse, die als Naturstoff aus der Rinde der pazifischen Eibe gewonnen wird. Durch Hemmung der Tubulindepolymerisierung wird die Organisation des Spindelapparats vor der Mitose verhindert. Der Zyklus der [Seite 23↓] betroffenen Zellen wird in der G2/M Phase blockiert. Zugelassen ist Taxol insbesondere für therpierefraktäre metastasierende Ovarial-/Mammakarzinom, verspricht allerdings auch bei anderen soliden Tumoren Erfolge (NSCLC, Kaposi Sarkom)

2.3.2 Antisense Oligonukleotide

4625: 5’-AAGGCATCCCAGCCTCCGTT-3’ 4626: 5’-CACGTCACGCGCGCACTATT-3’

Die Sequenz des 4625 Antisense Oligonukleotids richtet sich gegen eine Region hoher Homologie in den bcl-2 und bcl-xL mRNAs (10). Die Zielsequenz von bcl-2 (605 - 624) ist zu 100% komplementär zu den 20 Basen des 4625 Antisense Nukleotids. Die bcl-xL mRNA Zielregion (687 - 706) enthält drei “Mismatch” Basen zu 4625. Um die dadurch verminderte Affinität 4625 gegenüber bcl-xL zu erhöhen, wurden beide Oligonukleotide an den 3’ und 5’ Enden chemisch modifiziert. Die unterstrichenen Nukleotide enthalten an der 2’-Position der Ribose einen MOE Rest. 4625 und 4626 sind vollständige Phosphorothioate. Beide Oligonukleotide wurden mit einem Oligopilot II (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) synthetisiert und durch HPLC aufgereinigt (53). Sie wurden bei -20 °C entweder als Pulver oder in destilliertem Wasser gelöst aufbewahrt.

2.3.3 4D5MOC-B-ETA

4D5MOC-B-ETA wurde als ein rekombinantes Protein in E.coli (SB536) kloniert und die Bakterien in 2dYT Medium (1% Glukose, 30 mg/mL Ampicillin) kultiviert. Die Expression von 4D5MOC-B wurde durch Zugabe von 1mM Isopropyl-D-Galktopyranoside (IPTG, Böhringer Ingelheim) induziert.

Das Bakterienpellet wurde danach in einer French Pressure Zellpresse (SLS Instruments Inc. Urbana Illinois, USA) lysiert. Das Lysat wurde zentrifugiert und gefiltert (0.22 mm), um es zunächst von groben Verunreinigungen zu befreien. Zur endgültigen Purifikation des Proteins wurden die verschiedenen Fraktionen zuerst durch eine Ni2+ IDA-Säule und dann mit Anionen-Austausch Chromatographie aufgetrennt. Die Reinheit wurde anschliessend im Western Blot überprüft und die Konzentration bei 280 nM spektrometrisch gemessen.


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08.06.2004