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3  Methoden

3.1 In vitro

3.1.1 Zellkultur

Kolon- und Lungenkarzinomzellinien wuchsen in RPMI Medium mit 10% FCS, 1% Glutamin und 1% Penicillin/Streptomycin (P/S) (++Medium) und wurden jeden 3-4 Tag durch Reduzieren auf 1/8 bzw. 1/10 des Zellvolumens in der Wachstumsphase gehalten. MCF-7 Zellen wurden zusätzlich zu FCS, Glutamin und P/S in 1% Temed und 1% Pyruvat haltigem RICH Medium gehalten. MDA-MB-231 Zellinien wuchsen in FCS, Glutamin und P/S haltigem DMEM/High Glucose Medium. Sämtliche Zellen wurden bei 37 °C, 100% Luftfeuchtigkeit und 5% CO² Atmosphäre kultiviert und einen Tag vor Beginn des Experimentes in die jeweiligen Well-Platten pipettiert. Die Zellzahl pro mL wurde durch Zählen der mit Trypan-Blau gefärbten lebenden Zellen auf einem Neubauer Objektträger ermittelt. Für die Bestimmung wurden insgesamt mindestens 200 Zellen gezählt.

3.1.2 Behandlung mit Zytostatika

5-Fluorouracil bzw. Paclitaxel wurde unmittelbar vor der Behandlung in dem der Zellinie entsprechendem ++Medium auf die doppelte der gewünschten Konzentration verdünnt und dem gleichen Volumen zellhaltigem Medium beigefügt.

3.1.3 Transfektion mit 4625

Zur Transfektion wurden die Zellen in entsprechendem Kulturmedium ohne P/S (+-Medium) ausplatiert, weil Antibiotika die Zellaufnahme von Oligonukleotiden hemmen. Am nächsten Tag wurde zuerst Lipofectin in FCS und P/S-freiem --Medium eine halbe Stunde bei Raumtemperatur inkubiert (Lösung B). Lösung A bestand aus 6.6 mM Oligonukleotid in --Medium, welches sich über zehn Minuten mit dem 10% Lipofectin in Lösung B verbinden durfte. Danach wurde die für die gewünschte Oligonukleotidkonzentration Menge +-Medium dazugegeben und in die Wells pipettiert. Die Dauer der Transfektion betrug mit Ausnahme der MDA-MB 231 und der nicht adhärent wachsenden SW2 Zellinie, die 8 bzw. 48 Stunden transfiziert wurden, 20 Stunden. Die jeweils angegebenen Transfektionszeiten bezeichnen diese Zeiträumen plus der Zeit, die bis zur Beendigung der Kultivierung gewartet wurde. Das Verhältnis zwischen Lipofectin und dem Nukleotid wurde stets konstant gehalten (w/w). Als Beispiel werden hier die Konzentrationen für eine Endkonzentration von 500 nM und einem Volumen von 1 mL angegeben.

A: 155 µL = 153 µL Medium + 2µL ON stock (500µM)

B: 155 µL = 139.5 µL Medium + 15.5 µL Lipofectin

A + B +690µL Medium = 1mL (1µM ON Lösung)


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3.1.4  Kombinationsbehandlung

Es ergeben sich viele verschiedene Möglichkeiten für eine Kombinationsbehandlung von Tumorzellen in vitro mit Standard-, also Chemotherapie und zusätzlichem Wirkstoffen. Im Falle eines bcl-2/bcl-xL Antisense Oligonukleotids, welches die an der Chemoresistenz beteiligten Proteine herunter-regulieren soll, erscheint es sinnvoll die Tumorzellen mit dem Oligonukleotids gegenüber dem Zytostatikum erst zu sensitivieren, also die Zellen vor Zugabe des Chemotherapeutikums mit 4625 zu transfizieren. Nach 20-stündiger Transfektion (8 Stunden für MDA-MB-231) wurde das ON-Medium entfernt. Im Falle der Western-Blot und FACS Analysen wurden die im abgezogenem Überstand enthaltenden Zellen pelletiert, um den Wells in P/S, L-Glu, FCS Medium entweder mit oder ohne Zytostatika wieder zugeführt zu werden. So wurde eine Selektion der ädhärenten Zellen vermieden.

3.1.5 Behandlung mit 4D5MOC-B-ETA

Für den MTT wurden 360.000 Zellen für den Leucin-Einbautest 1.200.000 Zellen in 6 mL ++Medium in eine 96-Well Platte ausplatiert und am nächsten Tag steigende Konzentrationen des 4D5MOC-B-ETA Immunotoxin hinzugefügt. Die Inkubationszeit war für den MTT-Proliferationstest 72h und für den Leucin-Einbautest 24h.

3.1.6 Proliferations (MTT) Assay

Hierfür wurden die Zellen in 96er Well-Platten behandelt und nach Ablauf des Behandlungs-bzw. Transfektionszeitraumes 10 mL MTT Reagenz zu den 100 mL bzw. 200 mL dazugegeben. Das MTT Reagenz stellt ein Substrat für mitochondriale Dehydrogenasen dar. Durch Reduktion entsteht ein in Wasser unlösliches Salz. Nach 90 minütiger Inkubation unter Kulturbedingungen wurde die Reaktion durch Zugabe von 100 mL MTT-Lysispuffer gestoppt und das Substrat gleichzeitig gelöst. Die Menge des umgesetzten Tetrazoliumsalzes verhält sich proportional zur enzymatisch aktiven Zellzahl. Die Extinktionen wurden am nächsten Tag mit SPECTRAmax 340 microplate reader bei 570 nm gemessen und anschließend mithilfe der SOFTmax PRO Software analysiert. Da davon ausgegangen werden kann, daß nach eineinhalb Stunden sämtliches Substrat umgewandelt wurde, handelte es sich hierbei um eine Endpunktmessung. In sämtlichen Experimenten repräsentiert ein Wert den Mittelwert aus drei Wells. Aus sechs unbehandelten (Kontrolle) und sechs Proben ohne Zellen (Leerwert) wurden der 100% und der 0% Wert bestimmt.

3.1.7 Trypan Blau Exklusion

Behandelte und unbehandelte Zellen wurden mit 0.004% Trypan Blau gefärbt, um anschliessend tote von lebenden Zellen auf dem Neubauer Objekträger unterscheiden und zählen zu können. Die Ergebnisse der Trypan Blau Exklusion sind gut mit denen der PI Aufnahme in der FACS Analyse vergleichbar. Zur Quantifizierung der toten Zellfraktion wurden mindestens 200 Zellen gezählt.


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3.1.8  Durchflusszytometrie (FACS)

FACS steht für Fluorescence Associated Cell Sorter und ermöglicht die Fluoreszenz Intensität verschiedener Zellpopulationen (z.B. nach Markierung mit einem fluoreszierenden Antikörper) zu messen. FACS Analysen wurden einerseits zur Bestimmung der Apoptosefraktion nach Propidiumiodidaufnahme und andererseits zur Ep-CAM Detektion auf den Zelloberflächen durchgeführt. Für sämtliche Experimente wurde ein FACScalibur Fluozytometer und CellQuest Software (Beckton Dickinson) verwendet.

3.1.8.1 PI-Aufname

Nach dem Pelletieren und Waschen der behandelten und unbehandelten Zellen mit PBS, wurden diese 10 Minuten in 250 mL PBS mit 0.5 mg/mL Propidiumiodid (PI) inkubiert. PI hat die Eigenschaft mit DNA zu interkalieren, kann aber nur in Zellen mit einer gestörten Membranstruktur eindringen und so tote Zellen markieren. Zellenfraktionen mit erhöhter Fluoreszenz wurden mit dem FACS bestimmt. Zelldebris und Hintergrundfluoreszenz wurde durch angemessenes “light scatter gating” ausgeschlossen.

3.1.8.2 Detektion von Ep-CAM

Für die Zelltypisierung bezüglich Ep-CAM Expression wurde mit der FACS Analyse semiquantitativ der Ep-CAM Status bestimmt. Dazu wurden 500.000 Zellen zunächst mit FACS-Puffer gewaschen um anschliessend in einer 1:50 Verdünnung mit dem murinen monoklonalen anti 40 kDa pan carcinoma Antikörper über 45 Minuten auf Eis inkubiert zu werden. Nach einem weiteren Waschgang wurde der zweite Anti-Maus FITC-markiertem Antikörper (Ziege) in Facs Puffer 1:100 verdünnt, um für 30 Minuten im Dunkeln und auf Eis dem Zellpellet zugefügt zu werden. Die gemessene Fluoreszenz abzüglich der Hintergrundfluoreszenz von nur mit dem zweiten Antikörper inkubierten Zellen wurde bestimmt und der Mittelwert aus drei unabhängig durchgeführten Analysen berechnet.

3.1.9 Western-Blot

Nach Behandlung wurden die Zellen geerntet und nach einmaligem Waschen mit 1 mL PBS in etwa 100 µL kaltem Western-Blot Lysispuffer für 30 Minuten auf Eis stehen gelassen. Anschliessend wurde das lysierte Zellpellet bei 4 °C mit 13.000 U/m für 20 Minuten zentrifugiert, um den Überstand (zytosolische Proteine) vom Sediment (Kerne, Membranen) zu trennen. Die Zellysate wurden entweder sofort verwendet oder bei -70°C aufbewahrt. Nach der Proteinbestimmung mit einem BCA Protein Assay bei 560 nm wurden 20 µg - 30 µg Protein in einem 12% SDS-PAGE Gel über ca. 45 Minuten bei 30 mA (stacking gel) bzw. 40 mA (running gel) aufgetrennt und anschliessend für 60 Minuten in der semi-dry blotting Kammer bei 0.01 mA/mm³ auf eine Polyvinyl Fluorid Membran transferiert. Die Blot-Membranen wurden für eine Stunde in 5% BSA und 5% Trockenmilchpulver enthaltendem TBS geblockt. Die Inkubation mit dem ersten Antikörper fand entweder beiRaumtemperatur während 2 1/2 Stunden oder über Nacht bei 4 °C in einer 1:1000 Verdünnung des AKs in 1% TTBS statt. Nach drei Waschgängen mit TTBS (15, 5, 5 Min.) wurde die Membran in eine 1:10.000 [Seite 27↓] Verdünnung des zweite Peroxidase-konjugierte Antikörper in 1% TTBS, über 2 Stunden gegeben. Nach drei weiteren Waschgängen konnten die Immunkomplexe durch Chemiluminiszenz des ECLTM Kits auf einem x-ray Film sichtbar gemacht werden. Hierfür wurden unterschiedlich lange Belichtungszeiten (1 Minute - 20 Minuten) verwendet. Die Filme wurden durch eine Kodak Curix 60 Entwicklermaschine entwickelt und die relativen Protein Mengen durch Scion Software (Scion Corporation, Frederick, MD) auf den eingescannten Filmen quantifiziert.

Da Bcl-2 und Bcl-xL ein ähnliches Molekulargewicht besitzen, stellen sie sich nach gelelektropheretischer Auftrennung dicht benachbart dar. Die semiquantitative Analyse macht allerdings einen homogenen Hintergrund der einzelnen Proteinbanden erforderlich. Aus diesem Grunde wurden die Blots nach Visualisierung des einen Proteins gestrippt, um das andere Protein nach erfolgter Markierung mit den zwei Antikörpern auf der selben Membran analysieren zu können. Um die vorherigen Antikörper vollständig zu entfernen, mußten die Membranen in einem Ofen bei 50° C über 30 Minuten in der Stripp-Lösung mit 0.5% ME rotiert werden. Nach drei Waschgängen (10, 10, 10 Minuten) konnte die Membran erneut über 4 Stunden geblockt und in dem neuen Antikörperpuffer inkubiert werden.

3.1.10 Leucin-Einbautest

200.000 Zellen/mL leucinfreien Medium wurden in 96er Well Platten pipettiert. Im Gegensatz zu den Proliferationsassay enthielten hier die Wells 20.000 Zellen in 100 mL Medium. Nach einer Stunde wurden weitere 100 mL leucinfreies Medium mit steigenden Konzentrationen 4D5MOC-B-ETA hinzugefügt und die Platte für 24 Stunden inkubiert.

10 mL von 100 mC/mL [H3]-Leucin haltigem Medium wurden nach dieser Inkubationszeit zu jeder Probe zugegeben. Nach weiteren sechs Stunden wurde das Zellmaterial mit einem Harvester (96 Tomtech) auf ein Filterpapier aufgetragen, auf dem Proteine, jedoch nicht einzelne Aminosäuren hängenbleiben. Dieser Filter wurde nach zweimaligem Waschen für 30 Minuten im Trockenschrank bei 90°C getrocknet. Anschliessend konnte so die in Proteine eingebaute [H3]-Leucinmenge nach Zugabe von 3 mL Szintilationsflüssigkeit im MicroBeta TriLux (Wallac) quantifiziert werden. Die gemessene Menge an H3 markierten Proteinen verhält sich proportional zur Proteinsyntheseaktivität.

3.1.11 Statistik

Die Diagramme sämtlicher in vitro Ergebnisse stellen die Standardabweichung von zwei oder drei unabhängig durchgefürten Experimenten dar. Angegebene p-Werte wurden mit dem zweiseitigem Student t-Test bestimmt. Bei den Western Blot Analysen sind die Banden eines von zwei Experimenten abgebildet.


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3.2  In vivo

3.2.1 Art und Haltung

Bei den Versuchstieren handelte es sich um CD1/nu Nacktmäuse. Diesen Tieren fehlt die zelluläre Immunabwehr und sie werden deshalb auch als athymische Mäuse bezeichnet. Durch die Abwesenheit aktiver T-Lymphozyten werden subkutan transplantierte humane Tumorzellen nicht abgestoßen und können nach einer gewissen Adaptationszeit proliferieren. Nicht mehr als vier Tiere wurden unter SPF (Specified Pathogen-Free) Bedingungen in einem luftgefilterten 300 cm³ Makrolon Typ II Käfigen nach den Richtlinien des Schweizerischen Veterinäramtes gehalten. Die Tiere erhielten steriles Futter und Wasser ad libitum. Die Käfige wurden einmal wöchentlich gereinigt und mit frischem Streu versehen.

3.2.2 Versuchsablauf

Im Alter von 6-12 Wochen wurde den Mäusen 107 in 100 µL PBS gelöste Zellen unter Äther Anästhesie mit einer 0.7 mm Kanüle subkutan in die linke Flanke injiziert. Die Tumorgröße wurde anschließend alle 4-5 Tage mittels eines Kalipers auf ein Zehntel Millimeter genau bestimmt und das Volumen noch der Formel: Breite²(mm) x Länge(mm)/2 = Volumen(mm³) berechnet. Bei einer Tumorgröße von durchschnittlich 140 mm³ wurde mit der Immunotoxinbehandlung begonnen. Oligonukleotide und Zytostatika wurden ab einem mittleren Tumorvolumen von 75 mm3 verabreicht. Die Mäuse wurden randomisiert und markiert. Die Markierung bestand aus einem dreieckigem Schnitt in die Ohrmuschel. Da jeder Käfig maximal vier Mäuse enthielt, bekamen die Tiere entweder eine linke, eine rechte, eine beidseitige oder keine Markierung und konnten somit auseinander gehalten werden. Oligonukleotide und Immunotoxin wurden mit 2,5 mRad Kanülen intraperitoneal täglich über 21 bzw. 10 Tage injiziert. Die Behandlung mit Paclitaxel und 5-FU fand pro Maus insgesamt 5 mal etwa jeden vierten Tag über drei Wochen statt. Die Injektionszeitpunkte bzw. Behandlungsende sind in den Diagrammen als Pfeile angegeben. Taxol und 5-FU wurden in 200 mL 0.9% NaCl Lösung, Oligonukleotide und das Immunotoxin in 100 mL destilliertem Wasser bzw. in PBS injiziert.

3.2.3 Statistik

Statistische Aussagen der in vivo Experimente beruhen auf Berechnungen mit Statview 5.0 Software. Die nach der oben angegebenen Formel berechneten Tumorvolumina sind mit Standardfehlern (S.E.M.) und Fallzahlen in den Diagrammen dargestellt. Tumorwachstum beschreibt die relative Größenzunahme der Tumoren im Vergleich zu Tag 1. Die angegebenen p-Werte wurden mit dem unpaired Student t-Test unter Mithilfe von Dr. Burckhardt Seifert (Dept. für Biostatistik der Universität Zürich) bestimmt. p<0.05 gilt als statistisch signifikant.


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08.06.2004