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4  Ergebnisse Teil 1

4.1 In vitro

4.1.1 Transfektion mit 4625

4.1.1.1 Western Blot

Da verschiedene Krebszellen Bcl-2 und Bcl-xL unterschiedlich exprimieren, wurden die basalen Proteinlevel mit Western-Blot Analysen ermittelt. Es ergaben sich die in der Tabelle dargestellten Expressionsmuster. SW2 und A-549 Zellen wurden mit 600 nM 4625 bzw. 4626 transfiziert und 72 Stunden später lysiert. 20 mg Protein wurden elektrophoretisch aufgetrennt und die Bcl-2 und Bcl-xL Expression im Immuno-Blot nacheinander auf derselben Membran bestimmt.

Abb. 4 Darstellung der Bcl-2 und Bcl-xL Expression von A-549, Colo-320 und SW2 Zellen im Western Blot 72 Stunden nach Transfektion mit den Oligonukleotiden 4625 und 4626

A-549 Zellen, welche mit dem bispezifischen Antisense behandelt worden waren, zeigten eine deutlich sichtbare Minderexpression von Bcl-xL durch 4625. SW2 Zellen wurden mit 300 und 600 nM Oligonukleotid transfiziert. Es konnte so eine dosisabhängige Runterregulierung beider Proteine durch 4625 sichtbar gemacht werden. Das 4626 Kontrolloligonukleotid zeigte keinen Effekt auf Expression von Bcl-2 bzw. Bcl-xL bei 600 nM.

++= starke Expression; += normale Expression; -= schwache/keine Expression


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4.1.1.2 Proliferationsassays

Bcl-2 und Bcl-xL sind für Tumorzellen wichtige Faktoren, um sich vor dem Selbstmordprogramm zu schützen. Das bispezifische 4625 Antisense hemmt die Exprimierung beider Proteine und kann so die apoptotische Maschinerie von Tumorzellen in Gang setzen, was zu einem langsameren Wachstum führt. Es wurden insgesamt acht verschiedene Zellinien von Bronchial- (SW2, NCI-H125, A-549), Kolon- (LoVo, Colo-320, HT-29) und Mammakarzinomen (MCF-7, MDA-MB-231) auf ihre Sensitivität gegenüber dem 4625 Oligonukleotid im MTT Assay untersucht. Bis auf zwei Ausnahmen wurde das Wachstum aller Zellinien signifikant und dosisabhängig durch das 4625 Oligonukleotid über 72 Stunden gehemmt. Die IC50 variierten von etwa 215 nM für Colo-320 bis 1150 nM für MCF-7 Zellen. Bei Konzentrationen über 600 nM nahm der unspezifische zytostatische Effekt des 4626 Oligonukleotids zu. Die optimale 4625 Konzentration liegt damit unter 600 nM, weil der Unterschied zwischen Antisense und Kontrolloligonukleotid die sequenzspezifische Wirkung des Antisense angibt (p-Werte). Eine Konzentration von 600 nM inhibierte die Proliferation von A-549 um über 90%. HT-29 Zellen reagierten selbst bei 1200 nM weder auf das 4625 noch das 4626 Oligonukleotid. Das Wachstum von Colo-320, LoVo und MDA-MB-231 Zellen wurde bereits durch 75 nM 4625 gehemmt.

Abb.5 MTT-Assay unterschiedlicher Tumorzellen 72 Stunden nach Transfektion mit den beiden Oligonukleotiden 4626 und 4625. p-Werte wurden mit dem zweiseitigem student-t-test erstellt.

4.1.1.3 Trypan Blau Exklusionstest

Um herauszufinden, wie viele der mit Oligonukleotiden behandelten Tumorzellen auch tatsächlich sterben, wurden transfizierte Zellen mit Trypan Blau gefärbt und die Fraktion der apoptotischen oder zumindest toten Zellen durch Zählen der blau gefärbten Zellen quantifiziert. A-549, H-125 und Colo-[Seite 31↓] 320 Zellen zeigten bei 600 nM etwa 50% Trypan Blau Aufnahme und reagierten somit am empfindlichsten auf das 4625 Antisense Oligonukleotid. Dies entspricht den Ergebnissen des MTT-Assays. Im Gegensatz dazu waren hier nicht MDA-MB-231, sondern LoVo Zellen am stärksten von dem zytotoxischen Effekt des 4626 betroffen. HT-29 Zellen waren auch bei dieser Untersuchung praktisch resistent gegenüber beiden Oligonukleotiden.

Allerdings war das 4625 Antisense dem 4626 Oligonukleotid geringfügig überlegen. Bei MCF-7 Zellen war die sequenzspezifische Wirkung des 4625 ähnlich schwach ausgeprägt wie im Proliferationstest (p=0.056). Insgesamt konnte die unterschiedliche Wirksamkeit des 4625 auf die unterschiedlichen Krebszellinien bestätigt werden. Für LoVo, HT-29 und MCF-7 ergab sich kein signifikanter Unterschied zwischen 4625 und 4626. Die p-Werte lagen bei 0.1, 0.49 und 0.56. Für alle anderen Zellinien war der Unterschied signifikant (p=0.05).

Abb. 6 Trypan-Blau-Aufnahme unterschiedlicher Tumorzellen nach Transfektion mit 600 nM 4625/4626. Die Balken repsräsentieren die Standardabweichungen von drei Analysen.

4.1.2 Behandlung mit Standardtherapien

Die beiden Kolonkarzinomzellinien Colo-320 und HT-29 sprachen einerseits sehr gut, andererseits kaum auf die Transfektion mit dem 4625 Antisense an. Ähnlich verhielt es sich mit den beiden Mammakarzinomzellen MDA-MB-231 und MCF-7. Da viele Bcl-2 und Bcl-xL Antisense Oligonukleotide alleine häufig noch keine antiproliferative oder apoptotische Wirkung auf Krebszellen ausüben, sondern lediglich zytotoxische Wirkung [Seite 32↓] von Chemotherapie verstärken (54), war die ausgeprägte antitumorale Wirkung durch das 4625 Antisense alleine überraschend. Ob dieses Oligonukleotid auch bei den scheinbar unempfindlichen Zellen einen sensitivierenden Effekt gegenüber Zytostatika zu vermitteln vermag, wurde daraufhin an diesen vier Krebszellen untersucht.

5-Fluorouracil und Paclitaxel sind als Antimetabolit bzw. Mitosehemmstoff beides phasenspezische Chemotherapeutika. Wegen häufiger klinischer Anwendung bei Kolon- bzw Mammakarzinomerkrankungen wurden sie in folgenden Experimenten auch auf unsere Krebszellinien in vitro angewandt.

4.1.2.1 Western Blot

Einige in der Literatur beschriebenen Experimente zeigten, daß sowohl 5-FU als auch Paclitaxel Bcl-2 und Bcl-xL in vitro kurzfristig herunterregulieren bzw. modifizieren können (31,55,56). Um die Wirkung der beiden Zytostatika bezüglich Expression oder postranslationaler Modifizierung von Bcl-2/Bcl-xL zu untersuchen, wurden die mit Chemotherapie behandelten Zellen lysiert und beide Proteine im Western Blot quantifiziert. Da Wirkstoffkonzentration und Dauer der Behandlung hier möglicherweise eine entscheidende Rolle spielen, wurde die Proteinexpression von Bcl-2 und Bcl-xL mit zwei unterschiedlichen Konzentrationen 5-Fluorouracil

Abb.7 Western Blot Analysen der Bcl-2/Bcl-xL Expression nach Behandlung mit Chemotherapeutika nach 10, 24 und 48 Stunden zu jeweils zwei Konzentrationen.

bzw. Paclitaxel nach drei unterschiedlichen Behandlungszeiträumen untersucht. Colo-320 und MCF-7 Zellen scheinen Bcl-2 bei längeren Inkubationszeiten in 5-FU bzw. Pacitaxel enthaltendem Kulturmedium vermehrt zu exprimieren. Dies konnte in einer zweiten Analyse allerdings nicht bestätigt werden. Fraglich bleibt, ob Bcl-2/Bcl-xL insbesondere unter dem Einfluss von Paclitaxel phosphoryliert werden. Eine Zunahme um nur wenigen Phosphatresten bewirkt eine relativ geringe Gewichtszunahme der Proteine, die womöglich keine sichtbare Änderung in der Bandendarstellung zur Folge hätte.


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4.1.2.2 Proliferationsassay

Um geeignete Kombinationsverhältnisse für eine Behandlung von Krebszellen mit dem Antisense Oligonukleotid in Kombination mit der jeweiligen Standardtherapie zu ermitteln, wurde zunächst das Wachstums­verhalten der Zellen in Gegenwart der Zytostatika 5-Fluorouracil bzw. Paclitaxel über verschiedene Zeiträume untersucht.

Colo-320 und HT-29 wurden mit 5-Fluorouracil behandelt. Während eine Konzentration von mehr als 30 mM über 48 Stunden das Wachstum von HT-29 Zellen um 50% inhibierte, erzielten bereits 20 mM 5-FU den gleichen Effekt bei der Colo-320 Zellinie. Behandlung der resistenten HT-29 Zellen mit 5-Fluorouracil zeigte bei 10 und 24 Stunden nahezu keinen proliferationshemmenden, sondern einen eher stimulierenden Effekt. Auch niedrige Konzentrationen hemmten das Wachstum von Colo-320 Zellen stärker als das von HT-29. Auffallend war weiterhin, daß Konzentrationen über 40 mM beide Zellinien nicht wesentlich mehr in ihrem Wachstum beeinträchtigten.

Abb.8 Mtt-Assay von zwei Kolon- bzw Mammakarzinomzellen in Anwesenheit steigender Konzentrationen zu unterschiedlichen Zeitpunkten 5-FU bzw. Paclitaxel. Die Diagramme stellen den Mittelwert aus drei Experimenten mit ihren Standardabweichungen dar.

Der Einfluss von Paclitaxel auf das Wachstum der beiden Brustkrebszellinien MDA-MB-231 und MCF-7 war mehr zeit- als konzentrationsabhängig. Eine Bestimmung der IC50 war so nicht möglich. Bei 48 Stunden Behandlungszeit wurde durch keine Konzentration eine Wachstumshemmung um 50% erreicht. Konzentrationen über 600 nM überschreiten die in vivo therapeutisch relevanten Plasmakonzentrationen und bewirkten auch keine stärkere Proliferationsinhibition im MTT. Insgesamt reagierten MCF-7 Zellen empfindlicher auf die Taxantherapie als MDA-MB-231.


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4.1.3  Kombinationsbehandlung

Es existieren drei verschiedene Möglichkeiten, wie zwei Wirkstoffe miteinander interagieren können. Eine Kombination aus beiden kann entweder synergistisch, additiv oder antagonistisch sein. Nur eine Kombination definierter, gleichbleibender Verhältnisse beider Stoffe erlaubt Aussagen über Antagonismus, Addition oder Synergismus (57). Für die Kolonkrebszellinien wurden also die Antisense- bzw. Zytostatikakonzentrationen bestimmt, die im Proliferationsassay nach 72 bzw. 48 Stunden das Wachstum um 50% verlangsamten. MDA-MB-231 und MCF-7 Zellen wurden mit einer Paclitaxel/4625 Ratio von 1:1 behandelt. Es ergaben sich somit die hier angegebenen Ratios:

Kolonkarzinomzellen

4625 (IC50)

Zytostatikum (IC50)

Ratio

Colo-320

200 nM

2.5 mg/mL 5-FU (20 mM)

1:100

HT-29

n.d. (400 nM)

3.8 mg/mL 5-FU (30 mM)

1:75

Brustkrebszellen

MCF-7

400 nM

400 nM Taxol

1:1

MDA-MB 231

400 nM

400 nM Taxol

1:1

4.1.3.1 Western Blot

Nachdem die Krebszellen über 20 Stunden mit den Oligonukleotiden transfiziert worden waren, wurde das Transfektionsmedium, durch Zytostatika-haltiges Medium ersetzt und für weitere 48 Stunden inkubiert. Eine durch 5-FU oder Paclitaxel alleine induzierte Minderexpression von Bcl-2 oder Bcl-xL konnte, wie beschrieben nicht beobachtet werden. Um eine durch die Kombination mit den Oligonukleotiden veränderte Proteinexpression zu ermitteln, wurden Bcl-2/Bcl-xL Proteinmengen nach kombinierter Behandlung im Western
Abb. 9 Western-Blot Analyse von Bcl-2 und Bcl-xL bei HT-29 Zellen nach Transfektion mit 400 nM 4625/4626 alleine und in Kombination mit 30 mM 5-FU

Blot ermittelt. Bei HT-29, die gegenüber dem 4625 zwar hinsichtlich Wachstumshemmung unempfindlich sind, bewirkt das Antisense und die Kombination mit 5-FU eine sichtbare Bcl-xL Degradation. Die Proteinbande von Bcl-2 wurde nach 15 minütiger Belichtungszeit ebenfalls auf dem Film sichtbar. Man erkennt auch hier eine Proteinverminderung der Zellen, die mit dem 4625 transfiziert worden waren. 5-FU und 4626 alleine beeinflußten die Bcl-2/Bcl-xL Expression nicht. Allerdings ist in den Zellen, die mit der Kombination aus 4626 und 5-FU behandelt worden waren, ebenfalls eine Aufhellung beider Proteinbanden erkennbar.


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4.1.3.2 Proliferationsassay

Die Tumorzellen wurden wie beschrieben zuerst mit den Oligonukleotiden transfiziert und danach mit Chemotherapie behandelt. Um den sequenzspezifischen, chemosensitivierenden Effekt zu ermitteln, muss die Differenz zwischen Zytostatikum alleine und der Zytostatika/4625 Kombination mit der Differenz zwischen ersterem und der Zytostatika/4626 Kombination verglichen werden. Den am eindeutigsten sequenzspezifisch, chemosensitivierenden Effekt lieferte das 4625 Oligonukleotid auf Colo-320 Zellen (p=0.05).

Abb. 10 MTT-Assay und Median Effekt Analysen von Colo-320 und HT-29 Zellen nach Kombinationsbehandlung mit Oligonukleotiden und 5-FU über 68 bzw. 48 Stunden. Die oberen Diagramme zeigen die Zellproliferation im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Die unteren Diagramme geben die Art der Wechselwirkung zwischen 4625 und Chemotherapie an. Ein Wert unter 1 steht für eine synergistische Interaktion.

Die Kombination von 4626 mit 5-FU hatte nämlich eine eher antagonistische Wirkung zur Folge. Auch wenn die Proliferationsrate der Zellen, die nur mit 4626 transfiziert wurden, nicht zunahm, schwächte das Kontrolloligonukleotid die Wirkung von 5-FU auf Colo-320 Zellen ab. Eine unspezifisch protektive Wirkung von Oligonukleotiden auf Tumorzellen nach Behandlung mit zytotoxischen Wirkstoffen, in vitro wurde bereits beschrieben (58). Das Wachstum von HT-29 Zellen wurde sowohl durch die 5-FU/4625, als auch durch die 5-FU/4626 Kombinationsbehandlung stärker inhibiert, als durch eine Monotherapie. Die Proliferationsinhibition war allerdings nach 5-FU/4625 Behandlung am stärksten ausgeprägt und der Unterschied zwischen Monotherapie und Kombination nahm bis 800 nM kontinuierlich zu. Der p-Wert der 4625/5-FU Behandlung im Vergleich zur 4626/5-FU Behandlung betrug für diese Zellinie 0.51. Es kann also bei diesen Zellen nicht von einem Antisense-vermitteltem sensitivierendem Effekt im MTT-Assay gesprochen werden.


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Die optimale chemosensitivierende Wirkung von 4625, also der Unterschied zwischen alleiniger und kombinierter Behandlung, wurde für Colo-320 Zellen über 200 nM wieder geringer. Die Art der Wechsel­
Abb. 11 MTT-Assay und Median-Effekt Analysen von MDA-MB-231 und MCF-7 Zellen nach Kombinationsbehandlung mit 4625/4626 und Paclitaxel über 68 bzw. 48 Sunden. Taxol und 4625 wirken über einen weiten Bereich synergistisch auf die Proliferation von MCF-7 Zellen (Kombinationsindex < 1).

wirkung zwischen 5-FU und 4625 ist in den unteren Diagrammen dargestellt. Der Kombinationsindex gibt die Art der Interaktion beider Wirkstoffe an. Ist der Wert kleiner als 1, so ist die Wechselwirkung synergistischer Natur. Bei einem Wert gleich 1 additiv und grösser 1 antagonistisch.

Bei beiden Brustkrebszellen war die Verstärkung der zytostatischen Wirkung durch das Antisense, ausgeprägter, als für das Kontrolloligonukleotid. Es ergab sich für beide Zellinien ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen der Behandlung mit 4625/Paclitaxel und 4626/Paclitaxel (pMDA-MB-231=0.001; pMCF-7=0.0025). Die Wachstumskurve der mit 4626/Paclitaxel behandelten Zellen, verläuft nahezu parallel zu der fast waagerechten, also konzentrationsunabhängigen Paclitaxel Monotherapie. Der Unterschied zwischen beiden Kombinationsbehandlungen nimmt so mit steigenden Konzentrationen zu. Sowohl Antisense alleine, als auch die 4625/Paclitaxel Kombination wirkten in einer konzentrationsabhängigen Weise zytostatisch. Antisense Konzentrationen über 400 nM für MCF-7 Zellen und über 500 für MDA-MB-231 erzielten einen stärkere Wachstumshemmung als Paclitaxel. Bei höheren Konzentrationen nimmt der chemosensitivierende Effekt des 4625 wieder ab. Das Antisense wirkt dann alleine fast genauso stark wachstunshemmend wie in Kombination mit Paclitaxel.


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4.1.3.3  PI- Aufnahme

Ähnlich wie Trypan Blau diffundiert auch Propidiumiodid durch gestörte Membranstrukturen toter Zellen und kann diese so markieren. Die Fluoreszenzintensität kann dann mit der FACS Analyse bestimmt werden, was den Zeitaufwand bei vielen Proben im Vergleich zur Zellzählung nach Trypan Blau Färbung erheblich vermindert. Beide Methoden liefern vergleichbare Ergebnisse.

Für beide Kolonkarzinomzellen zeigte sich hinsichtlich Zelltod eine weitaus größerer verstärkender Effekt der Kombinationsbehandlung als im Proliferationsassay. Die Konzentrationen der Oligonukleotide und der Chemotherapeutika entsprechen den im MTT ermittelten IC50.

Über 30% der Colo-320 Zellen sind bei einer 50% Proliferationshemmung im MTT durch das bispezifische Antisense tatsächlich tot. Bei der IC50 von 5-FU (20 mM) sind dagegen lediglich knapp 15% nach 72 Stunden gestorben, was bedeuten kann, daß die zytostatische Wirkung des Antimetaboliten in vitro überwiegend durch Proliferationshemmung bedingt ist.

Die Zelltod-induzierende Wirkung durch 5-FU war für HT-29 Zellen ausgeprägter und erreichte fast 30% bei 40 mM. Dies liegt wahrscheinlich auch der Tatsache zu Grunde, daß unbehandelte Colo-320 Zellen stärker proliferieren und sich so die Wachstumshemmung der behandelten Zellen im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle schon bei geringeren Konzentrationen 5-FU im MTT auswirken konnte. 13.5 % der mit 400 nM Antisense transfizierten HT-29 Zellen starben. Im Vergleich zu 10.8% toten HT-29 Zellen nach Transfektion mit dem 4626 Oligonukleotid ist also die sequenzspezifische Wirkung des 4625 (wie auch schon bei dem Trypan Blau Exklusiontest mit 600 nM) auf HT-29 Zellen falls überhaupt vorhanden nur schwach ausgeprägt. Die Wirkung der 4625/5-FU Kombination ist zumindest additiv, allerdings im Vergleich zur 4626/5-FU Kombinationsbehandlung bei HT-29 praktisch gleich. Das 4625 Antisense vermittelt also für diese Zellinie keine sequenzspezifische sensitivierende Wirkung gegenüber 5-FU in vitro. Bei den Colo-320 Zellen ist der Unterschied zwischen 5-FU alleine und der Kombination mit 4625 deutlich vorhanden (p=0.006). Die chemosensitivierende Wirkung von 4625 auf diese Zellen ist auch deutlicher ausgeprägt, als für die 4626/5-FU Kombination.

Im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle waren 20% MCF-7 Zellen 72 Stunden nach Transfektion mit dem bispezifischen Antisense gestorben. Das 4626 Oligonukleotid führte zu keiner eindeutigen Zunahme der toten Zellfraktion. Die Zelltod induzierende Wirkung des 4625 Antisense betrug für MDA-MB-231 Zellen knapp 35%. Die Behandlung mit 600 nM Taxol erreichte bei beiden Zellinien weniger als 10% tote Zellen im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Der spezifisch chemosensitivierende Effekt des 4625 Antisense war für MCF-7 ausgeprägter als für MDA-MB-231. Auch hier verstärkte das 4626 Kontrolloligonukleotid die Wirkung von Taxol auf beide Zellinien (p=0.001).


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Abb. 12, 13 Propidiumiodid Aufnahme der Kolon- und Mammakarzinomzellen nach Behandlung mit 4625/4626 alleine und in Kombination mit 5-FU bzw. Paclitaxel. Die Konzentrationen entsprechen den im MTT-Assay ermittelten IC50 nach 72 (Oligonukleotid) bzw. 48 Stunden (Chemotherapie). Die Balken repräsentieren die Standardabweichung aus zwei Facs Analysen. Zell Debris wurde durch angepasstes light scatter gating ausgeschlossen.

4.2 In vivo

Um zu untersuchen, ob die chemosensitivierende Wirkung von 4625 in vitro, auch einen therapeutischen Nutzen in vivo besitzt, wurden Experimente an Nacktmäusen durchgeführt. In vorhergehenden Untersuchungen konnte eine statistisch signifikante Wachstumsinhibition von Colo-320 und MDA-MB-231 Tumorxenotransplantaten nach systemischer Applikation von 20mg/kg KG 4625 in Nacktmäusen nachgewiesen werden (59). Dabei wurde die Oligonukleotide täglich über drei Wochen ohne einen Transfektionszusatz intraperitoneal injiziert. Das 4626 Oligonukleotid zeigte im Vergleich zu einer unbehandelten Kontrolle keine Wirkung auf das Tumorwachstum.

Im Folgenden sollte nun untersucht werden, ob das bispezifische Antisense ebenso die antitumorale Wirkung einer suboptimalen Chemotherapiedosis verstärken kann. Es wurden Experimente mit Colo-[Seite 39↓] 320 und MDA-MB-231 Zellen durchgeführt. Die Tumoren dieser beiden Krebszellinien wuchsen in der Subkutis von Nacktmäusen und sahen sich makroskopisch sehr ähnlich. Colo-320 Tumoren wuchsen wesentlich schneller und zeigten weniger Metastasierungstendenz als MDA-MB-231 Xenotransplantate.

Tumoren derselben Zellinie etablierten sich unterschiedlich schnell und es ließ sich insgesamt ein schnelleres Wachstum bei Tumoren über 100 cm3 beobachten. Die Tatsache, daß kleine Tumoren langsamer wuchsen begründet die Darstellung der Wachstumskurven in relativen Wachstumsdiagrammen. Die einzelnen Tumorgrößen werden relativ zu ihrem Anfangsvolumen an Tag 1 dargestellt (fold increase). Größenänderungen kleiner Tumoren haben in solchen einen stärkeren Einfluß auf die Steigung der Wachstumskurve.

4.2.1 Behandlung mit Standardtherapien

In der Literatur beschriebene Behandlungen von Nacktmäusen mit Paclitaxel bzw. 5-Fluorouracil variieren stark bezüglich Dauer, Dosis und Therapieintervallen. Für die Auswahl einer geeigneten Dosis wurden insbesondere Studien berücksichtigt, in denen Nacktmäuse i.p. Taxol bzw. 5-FU in Kombination mit vergleichbaren experimentellen Wirkstoffen behandelt worden waren (60-64). Um die für unsere Zwecke gewünschte suboptimale Dosis Chemotherapie für eine kombinierte Behandlung zu ermitteln wurden Vorversuche mit einer Monoterapie über drei Wochen durchgeführt. Mäusen mit MDA-MB-231 Tumoren erhielten drei verschiedenen Dosen Paclitaxel. Colo-320 transplantierte Mäuse wurden mit zwei Dosierungen 5-FU behandelt. Der Behandlungszeitraum wurde der Antisense Therapie angepaßt und betrug somit 21 Tage, mit insgesamt 5 Applikationen 5-FU bzw. Taxol.

4.2.1.1 MDA-MB-231 Xenotransplantate

12 Tage nach Implantation der Krebszellen erreichten die Tumoren ein Volumen von etwa 110 mm3 und die Tiere erhielten die erste Dosis Paclitaxel. Anfangs wurden gleiche Volumina (200 mL) mit unterschiedlichen Konzentrationen Taxol i.p. injiziert. Die in der klinischen Therapie übliche Verdünnung beträgt 1:5 undentspricht einer Konzentration von 2.5 mg/mL. Diese Verdünnung ergab sich nur für die mit 10 mg Taxol behandelten Tiere. Die 20 mg/kg KG Dosis enthielt die doppelte Konzentration Paclitaxel. Dies führte zu lokalen Reizungen an den Bauchdecken der Mäuse, während und unmittelbar nach der Injektion. Deshalb wurden an den letzten drei Behandlungstagen allen Tieren verschiedene Volumina der 1:5 Verdünnung Paclitaxel gespritzt. So betrug die Konzentration stets 2.5 mg Paclitaxel/mL. Die angegebene Menge Taxol wurde an Tag 1, 5, 9, 13 und 17 injiziert. Es konnte insgesamt eine dosisabhängige Wachstumshemmung der subkutanen Tumoren gezeigt werden, wobei 5 mg/kg KG praktisch keine Wirkung hatte. 10 mg bzw. 20 mg Paclitaxel bewirkten eine Wachstumshemmung um 41% bzw. 52%. Zwei von acht Xenotransplantaten der Mäuse, die mit 20 mg/kg behandelt wurden schrumpften über den Zeitraum des Experimentes. In den beiden anderen Behandlungsgruppen nahm das Volumen jeweils eines Tumors ab.


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Abb.14 Relative Tumorvolumina subkutan wachsender MDA-MB-231 Xenotransplantate in Nacktmäusen während systemischer Behandlung mit paclitaxel. Im Diagramm sind die Standardfehler der unterschiedlichen Behandlungsgruppen angegeben.

Insgesamt konnten drei Tumoren der Kontrollgruppe ihr Volumen mehr als verfünffachen. Eine vergleichbare Volumenzunahme erreichten zwei der 5 mg und einer der 10 mg Dosierung. 20 mg Paclitaxel reichten nicht aus bei einem Transplantat eine Vergrösserung um das 10fache zu verhindern. Dieser Tumor hatte ein Anfangs­volumen von etwa 180 mm3 und war damit von Beginn an der größte. Zwei 10 mg Mäuse starben am achten Tag an einer Infektion. Die Tumorvolumina der mit 5 mg behandelten Mäuse wiesen die größte Standard­abweichungen auf. Aus der großen Streuung und den relativ langsam wachsenden Tumoren resultieren die geringe Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen und der Kontrolle. Eine statistische Signifikanz ließ sich deswegen nicht nachweisen.

4.2.1.2 Colo-320 Xenotransplantate

Die Colo-320 Tumoren konnten unbehandelt ihr Volumen in 40 Tagen im Durchschnitt verzehnfachen. 20 bzw. 40 mg/kg/KG 5-FU wurden i.p. an Tag 1, 5, 9, 13 und 17 injiziert. Beide Dosierungen 5-FU zeigten insgesamt eine ähnlich ausgeprägte Wachstumshemmung. In der ersten Woche war der zytostatische Effekt am deutlichsten sichtbar. Das Tumorvolumen dreier Mäuse (zwei aus der 20 mg/kg eine aus der 40 mg/kg Gruppe) war vier Tage nach der ersten Injektion kleiner als am Tag eins. Zwei davon konnten allerdings ihr Wachstum daraufhin wieder beschleunigen und ihre Größe bis zum Ende des Experiments vervielfachen. Der dritte Tumor hatte ein Anfangsvolumen von etwa 300 mm3 und lag somit über der Größe, bei welcher ein spontaner Tumorrückgang wahrscheinlich ist. Vier Tage nach Beginn des Experiments also zum Zeitpunkt der zweiten 5-FU Injektion war dieser Tumor kleiner als 100 mm3 und nahm weiterhin an Größe ab. Insgesamt erreichten 40 mg 5-FU keinen stärkere wachstumshemmende Wirkung als 20 mg.


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Abb. 15 Tumorwachstum der Colo-320 Xenotransplantate während systemischer Behandlung mit 5-FU über drei Wochen. Die Pfeile markieren die Applikationstage der beiden Dosierungen 5-FU.

Am Tag 21 betrug die Vergrößerung der Tumoren im Vergleich zum ersten Tag 3.13 für die niedrige Dosierung und 3.38 für die hochdosisbehandelten Mäuse. Die Kontrolltumoren hatten zu diesem Zeitpunkt ihre Anfangsgröße mehr als verfünffacht. Auch bei diesem Experiment waren, wegen der kleinen Fallzahlen, die Unterschiede zwischen dem Tumorwachstum in den Gruppen statistisch nicht signifikant.

4.2.2 Kombinationsbehandlung

Für die Kombinationsbehandlung ergeben sich rechnerisch 6 verschiedene Gruppen (5 Behandlungsgruppen + Kontrollgruppe). Auf eine Applikation des Kontrolloligonukleotids 4626 alleine wurde in beiden Experimenten verzichtet. Nach den Ergebnissen der Vorversuche mit Chemotherapie entschieden wir uns für 10 mg Paclitaxel und 20 mg 5-FU als Standardtherapiedosis. Einige Tiere wurden vor und nach Behandlungsbeginn ausselektioniert, um die Tumoren, deren Volumen sich nicht änderte und die auch morphologisch keine lebenden Tumorzellen vermuten ließen, nicht in die Auswertung mit einzuschließen. Den Mäusen, welchen zwei Wirkstoffen appliziert werden mußten, erhielten diese in zwei Injektionen rechts und links in den Bauchraum, um unbekannte frühzeitige Interaktionen zwischen dem Antisense und Paclitaxel bzw. 5-FU zu vermeiden. Sowohl Antisense als auch Standardtherapie wurden gut vertragen. Es konnten keine Oligonukleotid induzierte Entzündungen an den Injektionstellen festgestellt werden.

4.2.2.1 MDA-MB-231 Xenotransplantate

Weil das bispezifische Antisense Oligonukleotid 4625 noch nicht zuvor auf Chemosensitivierung in vivountersucht worden war, wurden für diesen ersten Versuch nur 5 Tiere pro Gruppe gewählt, um einen verstärkten anti-tumoralen Effekt lediglich zu erkennen. Für statistisch signifikante Ergebnisse werden bei dem zu erwartendem Unterschied mindestens 8 Mäuse pro Gruppe benötigt. Nach subkutaner Implantation wurden die Xenotransplantate über sieben Tage bis zu einer durchschnittlichen Grösse von 115 mm3 wachsen gelassen. [Seite 42↓] Anschliessend wurden 22 von 26 Tieren für eine Behandlung ausgewählt, randomisiert, markiert und erhielten die erste bzw. die ersten beiden Injektionen i.p. Bis zum Tag 15 nahm das Volumen von drei Tumoren ab. Zwei Mäuse aus der 4625/Paclitaxel und eine aus der 4625 Gruppe waren davon betroffen. Bis zum letzten Behandlungstag wurde das Tumorwachstum durch das 4625 Antisense um etwa 30% inhibiert. 10 mg Paclitaxel hatten etwa die gleiche Wirkung. Die Kombinationsbehandlung mit 4625 und Paclitaxel erreichte eine Wachstumshemmung von 40%. Eine 4626/Paclitaxel Therapie verstärkte die Wirkung gegenüber Paclitaxel alleine nicht. Der Unterschied zwischen dem Tumorwachstum der 4625 /Paclitaxel Gruppe und der 4626/Paclitaxel Gruppe erwies sich für den letzten Tag als signifikant (p=0.037). Am Tag der letzten Injektion hatte sich das Volumens eines Tumors der 4625/Paclitaxel Mäuse halbiert. Alle anderen waren größer als am ersten Behandlungstag. Die Tatsache, daß unbehandelte MDA-MB-231 Xenotransplantate sich, wie in dem vorhergehenden Experiment, innerhalb von drei Wochen nur vervierfachen, macht die Unterschiede zu nur langsamer wachsenden und nicht schrumpfenden Tumoren gering. Die Tendenz zu einer zumindest additiven Wirkung von Paclitaxel und 4625 Antisense Oligonukleotid in vivo ist allerdings erkennbar.

Abb.16 Relative Volumina der MDA-MB-231 Xenotransplantate während 3 wöchiger Kombinationsbehandlung. 0.5 mg Oligonukleotid wurden täglich, Palitaxel nur insgesamt fünf Mal über 21 Tage i.p appliziert.

4.2.2.2  Colo-320 Xenotransplantate

Bei diesem Experiment wurde bereits 6 Tage nach Tumorzelltransplantation das erste Mal behandelt. Die Tumoren hatten zu diesem Zeitpunkt ein mittleres Volumen von knapp 70 mm3 . Einerseits wird dadurch eine mögliche wachstumshemmende Wirkung stärker sichtbar, andererseits läßt es sich bei so kleinen Tumorgrößen kaum sagen, welches Transplantat tatsächlich wachsen wird. Es wurden im nachhinein 5 Tiere aus der Wertung genommen, deren Tumoren während des gesamten Experiments mehr einer Narbe als einem subkutanen Geschwulst glichen. Im Gegensatz zu den MDA-MB-231 transplantierten Mäusen wurden diese bis zum Tag 38 [Seite 43↓] nach Behandlungsbeginn am Leben gelassen, um das Tumorwachstum nach Behandlungsstopp weiter beobachten zu können. Bis zum Tag 22 hemmte das 4625 Antisense das Tumorwachstum um 54% im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Die Kombination aus 5-FU und 4625 erreichte eine Wachstumshemmung um 80% (p=0.008). Bis zum letzten Tag konnte sich die Größe von insgesamt neun Tumoren verzwanzigfachen. Drei aus der unbehandelten Kontrollgruppe, jeweils zwei der 4625 und der 5-FU/4626 Gruppe und jeweils einer aus der 4625/5-FU und 5-FU Gruppe. Bei vier der fünf unbehandelten Mäuse überschritt das Xenotransplantat am Tag 30 das Volumen von 1000 mm3. Etwa zwei Wochen nach Behandlungsende kam es zur Spontanremission einer mit 4625 und 5-FU behandelten Maus, indem die Tumorgröße um über 300 mm3 schrumpfte. Es war weiterhin langsameres Wachstum der 4625/5-FU Tumoren auch nach Beendigung der Behandlung am Tag 21 zu beobachten. Die p-Werte der Tumorgrößen 4625/5-FU im Vergleich mit der Kontrolle betrugen für Tag 21 bzw. Tag 28 0.03 bzw. 0.017.

Abb. 17 Wachstum der Colo-320 Tumoren während Kombinationsbehandlung mit Oligonukleotiden und 5-FU. Das durchschnittliche Tumorvolumen betrug an Tag 1 (6 Tage nach Implantation) 75 mm3 .


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08.06.2004