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5  Ergebnisse Teil 2

5.1 In vitro

5.1.1 Ep-CAM Detektion

Vier unterschiedliche Krebszellinien wurden in der Durchflußzytometrie auf Ep-CAM Exprimierung untersucht. Zur negativen Kontrolle wurden Zellen nur mit dem zweiten FITC-markierten Antikörper inkubiert, um die Hinter­grund­fluoreszenz anschließend vom gemessenen Wert abzuziehen. Die höchste Ep-CAM Dichte wurde in drei unabhängigen Messungen für HT-29 Zellen bestimmt. SQ20B Pharynxkarzinomzellen exprimieren nur geringfügig weniger Ep-CAM. SW2 Zellen stellten sich in der Facs Analyse heterogener dar. Eine Subpopulation dieser Zellen (ca. 10%) exprimiert deutlich weniger Ep-CAM als die Hauptfraktion. RL Zellen stammen von einer Lymphomzellinie und tragen, wegen ihres nicht-epithelialen Ursprungs auch kein Ep-CAM auf ihre Oberfläche.

Abb. 18 Ep-CAM-Expression auf drei epithelialen Karzinomen in der Facs Analyse nach Markierung mit einem fluoreszierenden Antikörper. Lymphatische RL Zellen exprimieren praktisch kein Ep-CAM.

5.1.2 Leucin Einbautest

Leucin kann als essentielle Aminosäure nicht von Zellen selbst synthetisiert werden und sie sind auf die Aufnahme von außen angewiesen. Der anschließende Einbau exogenen Leucins in Proteine korreliert mit der zellulären Proteinsyntheseaktivität, weil die Aminosäure relativ gleichmäßig in den meisten Proteinen vorkommt. Das Pseudomonas Exotoxin A blockiert die Proteinsynthese und die betroffenen Zellen bauen so auch kein Leucin mehr ein. SW2 und Ep-CAM negative RL Zellen wurden in Leucin freiem Medium kultiviert und nach 4D5MOC-B-ETA Behandlung [H3] markiertes Leucin hinzugefügt. Anschließend wurde der zelluläre Einbau in Proteine quantifiziert. 4D5MOC-B-ETA Konzentrationen um 20 fM hatten eine um 50% verminderte


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Abb. 19 (H3) Leucin Aufnahme von SW2 Zellen nach 24 stündiger Behandlung mit 4D5MOC-E-ETA im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle.

Leucininkorporation der SW2 Zellen zur Folge. 1 pM bewirkte nach bereits 24 Stunden eine vollständige Blockierung der Proteinsynthese. Die Ep-CAM negativen RL Kontrollzellen zeigten sogar bei 10 pM 4D5MOC-B-ETA keinerlei verminderte Leucinaufnahme bzw. Einbau. Die Wirkung des 4D5MOC-B-ETA ist somit stark antigenabhängig.

5.1.3 Proliferationsassays

Die Blockierung der zellulären Proteinsynthese führt zu einer Wachstumshemmung und früher oder später zu Zelltod und Apoptose (65). Mit steigenden Konzentrationen 4D5MOC-B-ETA behandelte Zellen zeigten im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle, das in den Diagrammen dargestellte Wachstum. Am sensitivsten reagierten SW2 Zellen auf 4D5MOC-B-ETA. Die Wachstumskurve entspricht nahezu den für die Leucinaufnahme nach 24stündiger Behandlung gemessenen Werten. Sie wuchsen bereits bei einer Konzentration von 10 fM 4D5MOC-B-ETA um fast 20% langsamer. Diese Konzentration hatte auf die anderen Ep-CAM positiven Zellen keinen Einfluß. Bei 1 pM betrug die Proliferationshemmung der SCLC Zellen nahezu 100 %. Das Wachstum von SQ20B wurde durch die gleiche Konzentration um nur 50% gehemmt. HT-29 Zellen lagen dazwischen. Auch die höchste Konzentration von 10 nM reichte nicht aus um ihr Wachstum um 100% zu inhibieren. Die kleinen Standardabweichungen der Wachstumskurve bei Immunotoxinkonzentrationen von 10 pM bis 10 nM zeigen, daß in allen drei Experimenten nach 72 Stunden mindestens 6-8% HT-29 Zellen im Vergleich zur Kontrolle noch leben und enzymatisch aktiv sind.


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Abb. 20 MTT-Assay von drei Ep-CAM positiven und einer Ep-CAM negativen Zellinien nach 72 stündiger Behandlung mit 4D5MOC-B-ETA. Die Diagramme stellen Mittelwerte aus drei Experimenten mit ihren Standardabweichungen dar.

Ep-CAM negative RL Zellen reagierten, wie auch im Leucineinbautest nicht auf das 4D5MOC-B-ETA Immunotoxin.

5.1.4 Trypan Blau Exklusionstest

Mit Trypan Blau gefärbte Zellen wurden gezählt, um die Fraktion der toten Zellen zu ermitteln. Bei dieser Untersuchung waren HT-29 Zellen am widerstandsfähigsten gegenüber 4D5MOC-B-ETA. Nach 48 Stunden zeigten sie in zwei Experimenten praktisch keine Dosisabhängigkeit und es starben weniger als 10% im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Nach 72 Stunden waren bei 0.1 pM, also einer Konzentration die nur wenig unter der IC50 im MTT-Assay liegt, kaum mehr HT-29 Zellen gestorben. 10 pM reichten nach dieser Zeit immerhin aus um knapp über 30% zu töten. Im Vergleich dazu beträgt die Fraktion toter SW2 oder SQ20B Zellen nach 72 h und 10 pM über 50%. SW2 Zellen reagierten bei der niedrigen Konzentration, wie im MTT-Assay am sensitivsten auf 4D5MOC-B-ETA. Eine Zunahme der toten Zellfraktion war bei den SCLC Zellen am deutlichsten zeitabhängig. SQ20B waren noch empfindlicher und es waren in fast allen Proben mehr blaue Zellen vorhanden, als in denen der anderen beiden Ep-CAM positiven Zellen.


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Abb.21 Trypan Blau Aufnahmevon drei Ep-CAM positiven Zellinien nach Inkubation mit zwei Konzentrationen 4D5MOC-B-ETA über zwei Unterschiedliche Zeiträume.

5.2 In vivo

Die zwei Ep-CAM positive Zellinien SW2 und HT-29 wurden in 100 mL PBS subkutan injiziert. SW2 Zellen entwickelten sich zu mäßig schnell wachsenden, festen und gut abgrenzbaren, teils hämmorrhagischen Tumoren. HT-29 zeigten ein noch schnelleres, aggressives und metastasierendes Wachstum. Die Tumorgröße zum Zeitpunkt der ersten Behandlung betrug bei den Immunotoxin Versuchen durchschnittlich 120 mm3 .

Da das 4D5MOC-B-ETA Immunotoxin bisher nicht in vivo untersucht worden war, wurde das Körpergewicht und die Ausscheidung im ersten Experiment protokolliert. Es konnten keine Anzeichen besonderer Toxizität beobachtet werden. Körpergewicht und Verhalten waren unauffällig und über den Zeitraum des Experiments konstant. Insgesamt litten einige Tiere an Diarrhoe. Allerdings waren die Tiere der Kontrollgruppe in gleichem Masse davon betroffen, was eine Immunotoxin bedingte Ursache unwahrscheinlich macht.

5.2.1 SW2 Xenotransplantate

Wegen der zunächst unbekannten Toxizität des 4D5MOC-B-ETA wurden die Tiere erst mit 5 μ g/Maus und in einem weiteren Versuch mit 10 mg/Maus über jeweils 10 Tage behandelt. Dies entspricht einer Dosierung von [Seite 48↓] etwa 250 bzw. 500 mg/kg KG. Die unterschiedliche Entwicklung der Tumorzellen im murinen subkutanen Gewebe hatte zur Folge, daß die SW2 Xenotransplantate im ersten Experiment (5μ g 4D5MOC-B-ETA + Kontrolle) langsamer wuchsen und erst nach 16 Tagen eine initiale Behandlungsgrösse von 124 cm3 erreichten. Im zweiten Experiment wurden die Mäuse bereits ab Tag 12 und mit einem durchschnittlichen Tumorvolumen von 116 cm3 behandelt. Beide Experimente beinhalteten jeweils 8 Kontrolltiere, von denen die resultierenden Mittelwerte mit den Standardfehlern in den Diagrammen dargestellt sind. 10 bzw. 5 in 100 μ L PBS gelöstes Immunotoxin wurde täglich über 10 Tage intraperitoneal injiziert. Das Immunotoxin zeigte eine hemmende Wirkung auf das Wachstum der humanen SW2 Tumoren in der Maus. 5μ g 4D5MOC-B-ETA bewirkten eine Wachstumshemmung um 20%. In der 10 μ g Versuchsgruppe nahm das Volumen von 6 aus 8 Tumoren

Abb. 22 Wachstum subkutaner SW2 Xenotransplantate während täglicher ip Injektion von 200 bzw 400 mg/kg/KG 4D5MOC-B-ETA über zehn Tage. Die Balken geben den Standardfehler (S.E.M.) an.

vorübergehend ab. Am Tag 24 waren allerdings nur noch 2 Xenotransplantate kleiner als an Tag 1. Bis zum Ende der Behandlung (Tag 10) betrug das Tumorwachstum 46% im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle (p=0.003). Die Tumoren beider Versuchsgruppen fingen wenige Tage nach Behandlungsstopp wieder an zu wachsen und erreichten nach weiteren zwei Wochen teilweise die Größe der Kontrollgruppentumoren. Zwei Wochen nach Behandlungsende waren die Tumoren der Tiere, denen 5 μ g 4D5MOC-B-ETA appliziert worden waren, immer noch halb so groß wie die der unbehandelten Kontrollgruppe (p=0.04).

Vier Kontrolltiere und vier mit 5 μ g 4D5MOC-B-ETA behandelte Mäuse wurden am letzten Behandlungstag geopfert, die Tumoren entnommen und mit einem TUNEL Assay auf Apoptose untersucht. Die Schnittfärbungen lieferten jedoch keine deutlichen Unterschiede zwischen den behandelten und unbehandelten Tumoren.

5.2.2 HT-29 Xenotransplantate

Die Kolonkarzinomzellen wuchsen in den Nacktmäusen etwa doppelt so schnell wie die SW2 Tumoren. Bereits nach 7 Tagen wurde mit der Behandlung begonnen. Es wurden insgesamt 16 Mäuse über 10 Tage mit 10 μ g 4D5MOC-B-ETA behandelt. Sechs Mäuse aus dieser Gruppe, deren Tumoren sich nach Behandlungsende durch [Seite 49↓] ein beschleunigtes Tumorwachstum auszeichneten, erhielten daraufhin ein zweites Mal 10 μ g 4D5MOC-B-ETA über 10 Tage. So war es möglich Resistenzen gegenüber dem Immunotoxin, die insbesondere durch eine Minderexpremierung von Ep-CAM denkbar wären, beurteilen zu können. Insgesamt nahm das Volumen von 15 aus 16 Xenotransplantaten während der ersten Behandlung mit 10 μ g 4D5MOC-B-ETA ab. Es ergab sich eine Wachstumshemmung um 80% bis zum Tag 11 (p=0.0001). 14 Tumoren fingen nach Behandlungsende wieder an zu wachsen und überschritten zwei Wochen später die Größe ihres Anfangsvolumens. Ein Tumor der zwei Tage nach Beendigung der ersten Behandlung nicht mehr sichtbar war, also wahrscheinlich nur noch aus wenigen Zellen bestand, konnte sich zehn Tage später wieder entwickeln und wuchs bis zum Ende des Experiments auf das über siebenfache seiner Anfangsgröße von 101 mm3 . Der Unterschied zwischen der unbehandelten Kontrollgruppe und den mit 5 mg 4D5MOC-B-ETA behandelten Mäusen, war in diesem Experiment weitaus größer als bei den SW2 Xenotransplantaten. Applikationen von 5 μ g 4D5MOC-B-ETA hemmten das Tumorwachstum um 64% (p=0.0008). Die hohe Dosierung erzielte einen weniger deutlichen Unterschied im Vergleich zur Behandlung mit 5 mg 4D5MOC-B-ETA pro Maus, als bei den SW2 Tumoren.

Am Tag 28 wurden 6 Mäuse für den zweiten Behandlungszyklus mit 10 μ g 4D5MOC-B-ETA ausgewählt. Sie hatten zu diesem Zeitpunkt ein mittleres Tumorvolumen von 200 mm3 , was der 1.5 fachen Grösse ihrer Anfangsvolumina entspricht. Im Vergleich dazu betrug die durchschnittliche Tumorgröße, der nur mit einem Zyklus 10 μ g 4D5MOC-B-ETA behandelten 10 Mäuse 295 mm3 .Die Tatsache, daß das relative Tumor­wachstum der letzteren mit 1.2 aber unter 1.5 liegt, zeigt daß es sich hierbei um von Tag 1 an relativ große Tumoren handelte. Die 6 Mäuse sind also ausgewählt worden, um das reaktive Wachstum nach Behandlungsende wieder zu hemmen. Sowohl die Darstellung der absoluten Tumorgrößen (nicht abgebildet) als auch das Tumorwachstums-Diagramm zeigen eine eindeutig erkennbare Wachstumsinhibition, bei der die relative Tumorgrösse der zweimal behandelten Mäuse erstmals unter die der nur einmal behandelten sinkt. Die Xenotransplantate der mit zwei Zyklen 4D5MOC-B-ETA therapierten Mäuse waren am Tag 47 im Durchschnitt halb so groß, wie die der nur einmal behandelten. Während des zweiten Behandlungszyklus schrumpfte allerdings keiner der 6 Tumoren mehr. Ein wachstumshemmender Effekt ist zwar erkennbar, aber längst nicht so ausgeprägt, wie bei der ersten Behandlung. Dies könnte eventuell durch eine verminderte Antigenexprimierung der Tumorzellen begründet sein. Andererseits ist die Effizienz des Immunotoxins bei größeren Tumoren wahrscheinlich ohnehin geringer. Die Tumorzellen sind in der von ihnen geschaffenen extrazellulären Matrix unempfindlicher und der Gesamttumor besteht zu einem geringeren Teil aus Zellen weshalb das Gesamtvolumen weniger von der Wirkung des Immunotoxins beeinflusst wird.


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Abb. 23 Wachstum der HT-29 Xenotransplantate über 50 Tage. Die Pfeile markieren Anfang und Ende der beiden Behandlungszyklen mit 10 μ g 4D5MOC-B-ETA über 10 aufeinanderfolgende Tage.


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08.06.2004