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6  Zusammenfassung und Diskussion

Im ersten Teil dieser Arbeit wurden acht Krebszellinien mit dem kürzlich in unserem Labor entwickeltem bcl-2/bcl-xL bispezifischen 4625 Antisense Oligonukleotid transfiziert. Dieses 4625 Antisense zeigte, im Vergleich zum 4626 Kontrolloligonukleotid, Degradation beider Zielproteine, zytostatische Effekte und sequenzspezische Toxizität in vitro. Die systemische Applikation von 4625 in Nacktmäuse führte weiterhin zu einer Verstärkung der wachstumshemmenden Wirkung von Paclitaxel und 5-Fluorouracil auf menschliche Kolon- und Mammakarzinome.

Im zweiten Teil wurde die Wirkung des rekombinanten, Ep-CAM spezifischen Immunotoxins 4D5MOC-B-ETA auf drei unterschiedliche Tumorzellen untersucht. Dieses scFv Immunotoxin wurde zuvor in einer Kollaboration mit dem Biochemischen Institut der Universität Zürich entwickelt. 4D5MOC-B-ETA zeigte eine starke karzinomzellspezifische Blockierung der Proteinsynthese und führte bereits in sehr geringen Konzentrationen zu einer Wachstumshemmung von Tumorzellen in vitro. Weiterhin bewirkte die systemische Applikation von 4D5MOC-B-ETA ein verlangsamtes Wachstum bzw. Schrumpfen von unterschiedlichen Karzinomen in vivo.

6.1  Teil 1

Die beiden anti-apoptotischen Proteine Bcl-2 und Bcl-xL werden von vielen soliden Tumoren exprimiert und blockieren unterschiedlich den durch Zytostatika induzierten Zelltod (66). Bei Brustkrebs soll vor allem Bcl-2 mit Chemoresistenz assoziiert sein (67). Dagegen gibt es Hinweise, daß metastatisches Potential und Malignität bei Brust- und Kolonkarzinomen mehr von Bcl-xL bestimmt werden (20,68). Viele Bronchialkarzinome exprimieren beide Proteine.

Die bisher beschriebenen Antisense Oligonukleotide sind entweder für bcl-2 oder bcl-xL monospezifisch und ihre therapeutische Anwendbarkeit ist somit limitiert. Das bispezifische 4625 Antisense Oligonukleotid degradiert sowohl bcl-2 als auch bcl-xL, durch gezielte Hybridisierung mit einer geeigneten Homologieequenz in der bcl-2/bcl-xL mRNA. Zusätzliche Zuckermodifikationen erhöhen sequenzspezifische Affinität und Nukleasenresistenz des 4625 Antisense. Sie bewirken auch weniger “nicht Antisense vermittelte” Toxizität, als Oligonukleotide der ersten Generation. In vitro hemmt 4625 alleine nicht nur die Bildung von Bcl-xL und Bcl-2, sondern induziert auch Apoptose in histologisch unterschiedlichen Tumorzellen und hemmt das Wachstum menschlicher Tumoren in Nackmäusen (59).

Die biologische Wirkung von 4625 auf Krebszellen war praktisch unabhängig von deren basalen Bcl-2/Bcl-xL Expressionsmustern. Die Affinität von 4625 liegt aufgrund der drei “mismatches” gegenüber bcl-xL für die bcl-2 mRNA über der von bcl-xL (10). Trotzdem reagierten A-549 Zellen, welche nur bcl-xL exprimieren, sowohl imMTT-Assay als auch im Trypan-Blau Exklusionstest mit am sensitivsten auf eine Transfektion mit 4625. Krebzellen, die beide Proteine besitzen (SW2, MDA-MB und H-125), wuchsen bei 400-500 nM 4625 um 50% langsamer als die mit 4626 behandelten Tumorzellen. Die Ansprechbarkeit der unterschiedlichen Zellen muß [Seite 52↓] also von anderen Proteinen abhängen, deren Funktionen sich nach der Transfektion in vitro unterschiedlich auswirken. Das verhältnismäßig schlechte Ansprechen der MCF-7 Zellen auf 4625 kann damit zusammenhängen, daß ihnen das Genprodukt von Caspase 3 fehlt (69) und die Apoptoseinduzierung dadurch insgesamt beeinträchtigt oder verlangsamt ist. Das Kontrolloligonukleotid 4626 hatte im Vergleich zu 4625 insbesondere bei LoVo Zellen einen unspezifischen zytotoxischen Effekt in hohen Konzentrationen. Diese Krebszellinie trägt das wild-Typ p53 Gen (31). Der Zusatz von Lipofectin und Phosphorothioate Oligonukleotiden reicht so schon aus, um eine gewisse Zellfraktion in vitro zu töten.

Das 4625 Antisense verstärkte weiterhin die zytotoxische Wirkung der beiden Zytostatika Paclitaxel und 5-FU in je zwei unterschiedlichen Mamma- bzw. Kolonkarzinomzellinien. Paclitaxel konnten im Laufe der letzten Jahre unterschiedliche molekulare Wirkungsmechanismen nachgewiesen werden. Als erstes wurde es als Mikrotubuli stabilisierender Wirkstoff beschrieben. Hierbei hemmt es die Depolymerisierung des Spindelapparates. Diese Mechanismen gelten auch heute noch als wesentlich. Neben anderen potentiellen Wirkungsmechanismen ist in unserem Fall die Phosphorylierung von Bcl-2 und Bcl-xL besonders interessant. Auch wenn nicht klar ist auf welchem Wege dies geschieht, so soll phosphorylisiertes Bcl-2 die Fähigkeit verlieren mit Bax zu heterodimerisieren (78). Andere Untersuchungen zeigten, daß die Paclitaxel induzierte Phosphorylierung von Bcl-2 dazu führt, daß Bcl-2 mit anderen Proteinen assoziiert und so dessen anti-apoptotische Wirkung verloren geht. Es wurde daraufhin eine Bcl-2 unabhängige Wirkung von Paclitaxel postuliert. Untersuchungen mit Bcl-2 Antisense Oligonukleotiden zeigten aber eine Verstärkung in vivo (79), was eine völlige Unabhängigkeit Paclitaxels von Bcl-2 unwahrscheinlich macht.

MDA-MB-231 und MCF-7 Zellen sind einerseits ER negative und andererseits ER positive Mammakarzinomzellen. In unterschiedlichen Studien konnte Östrogen eine Steigerung der Chemoresistenz über eine Stimulierung der Bcl-2 Expression in Tumorzellen nachgewiesen werden (67,70). Bcl-2 verhinderte außerdem eine Tumorregression in Nacktmäusen, die durch Östrogen-Entzug induziert wurde (71). MCF-7 Zellen sprachen nur sehr schwach auf eine Transfektion mit dem 4625 Antisense an. Andererseits war die chemosensitivierende Wirkung von 4625 bei dieser Zellinie, sowohl im Proliferationstest als auch in der Facs-Analyse stärker ausgeprägt, als für MDA-MB-231. Der positive Östrogenrezeptorstatus führt eventuell in Kulturmedium (das Östrogen in geringen Mengen enthält) über bcl-2 zur Resistenzentwicklung gegenüber Zytostatika. Die Behandlung von MCF-7 Zellen mit 4625 oder Paclitaxel alleine ist anscheinend nicht ausreichend, um die apoptotische Schwelle der Zellen zu überwinden. Die Kombination aus beiden Stoffen bewirkt über Degradierung von Bcl-2 durch das Antisense womöglich eine Ausschaltung der durch Östrogen vermittelten Chemoresistenz und Paclitaxel ist dann um ein Vielfaches wirksamer.

HT-29 Zellen reagierten sowohl im MTT als auch in der Trypan Blau Aufnahme nicht auf eine Transfektion mit 4625 bzw. 4626. Auch der Unterschied zwischen 4625/5-FU zur 4626/5-FU Kombinationsbehandlung war für diese Zellen minimal, obwohl im Western Blot eine deutlich sichtbare Minderexprimierung von Bcl-2 und Bcl-xL durch 400 nM 4625 in diesen Zellen erreicht wurde. HT-29 Zellen können die Bak Expression in Gegenwart von 5-FU umd das bis zu sechsfache steigern (31). Kombinationsbehandlungen mit dem bispezifischen Antisense und 5-FU müssten also einen verstärkten Anstieg der Bak/Bcl-xL bzw. Bak/Bcl-2 Ratio in HT-29 zur Folge haben. Trotzdem gelang es insgesamt nicht eine deutliche apoptoseinduzierende oder chemosensitivierende Wirkung mit 4625 in diesen Zellen zu erreichen. HT-29 sind folglich nicht so sehr auf bcl-2/bcl-xL, als Überlebensfaktoren angewiesen, wie dies bei den anderen Tumorzellen der Fall ist. [Seite 53↓] Möglicherweise stellen der Differenzierungsstatus und/oder fehlende genetische Schäden keine ausreichenden Auslöser für das apoptotische Programm dar oder andere Faktoren sind für den Schutz vor Apoptose und Zytostatika in HT-29 Zellen verantwortlich. Gründe für die geringe biologische Wirkung nach Bcl-2 und Bcl-xL Degradation verbleiben zu untersuchen. Die zytostatische Wirkung von 5-FU auf Colo-320 Zellen wurde im Proliferationsassay durch vorhergehende Transfektion mir 4626 vermindert. Es konnte bereits gezeigt werden, daß Oligonukleotide Krebszellen unspezifisch vor unterschiedlichen chemotherapeutischen Wirkstoffen schützen können (58). In der Facs Analyse ist die Wirkung von 4626 und 5-FU jedoch nicht antagonistisch und auch in vivo war keine abschwächende Wirkung von 5-FU durch das Kontrolloligonukleotids sichtbar.

Mit Ausnahme der HT-29 Zellen führte das 4625 Antisense in der Konzentration, welcher der IC50 MTT entspricht, zu mehr toten Zellen in der Facs-Analyse, als 5-FU und Paclitaxel bei diesen Konzentrationen. 400 nM 4625 induzierte mehr als drei Mal so viel Apoptose in MDA-MB-231 Zellen, wie 400 nM Paclitaxel.

Das Tiermodell, als weiteren Schritt zur klinischen Anwendung, ermöglicht die Beurteilung der Wirksamkeit eines Stoffes nach systemischer Applikation. In unserem Fall zeigt die Wachstumshemmung menschlicher Tumoren in der Maus eine ausreichende Stabilität und geringe Immunogenität des 4625 Antisense. Weiterhin ist die Penetration von dichtem Tumorgewebe und somit die Zugänglichkeit vieler Krebszellen durch das 4625 Oligonukleotid gewährleistet. In den vorhergehenden Experimenten konnte eine Minderexpremierung von Bcl-2 und Bcl-xL und Apoptoseinduktion in den Tumorzellen durch das 4625 mit immunhistochemisch gefärbten Schnitten und TUNEL Assays gezeigt werden (59). Da sich das 4625 Oligonukleotid mit je 6 Basen von muriner bcl-2 und bcl-xL mRNA unterscheidet, können über Antisense vermittelte Nebenwirkungen mit diesem Tiermodell keine Aussagen getroffen werden.

Die Kombinationsbehandlung der Versuchstiere mit Chemotherapie und Oligonukleotiden zeigte für MDA-MB-231 und Colo-320 Xenotransplantate ein gegenüber den Monotherapien verlangsamtes Tumorwachstum. Für die Kolonkarzinome war der wachstumshemmende Effekt stärker ausgeprägt. 5-FU bewirkte in den Vorversuchen mit der Monotherapie und in der Kombinationsbehandlung nach Behandlungsende keine Wachstumshemmung mehr auf die Xenotransplantate. Die Kombinationsbehandlung mit 5-FU und dem 4625 Antisense bewirkte einen nachhaltigen wachstumshemmenden Effekt von 74% bis zum Tag 38 (p=0.029). Die Wirkung von Kontrolloligonukleotid 4626 und 5-FU beeinflusste das Tumorwachstum im Vergleich zur 5-FU Monotherapie nicht (p=0.91). Der sequenzspezifische Antisense Effekt von 4625 ist also auch in vivo entscheidend für die chemosensitivierende Wirkung.

Das Wachstum von MDA-MB-231 Xenotransplantaten wurde durch 4625 in Kombination mit Paclitaxel im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe bis zum Tag 21 um etwa 40% inhibiert. Diese scheinbar schwächere Wirkung ist wahrscheinlich wesentlich durch die nur langsam wachsenden Tumoren bedingt. Es konnte ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den Tumorgrößen der Mäuse festgestellt werden, die zum einen mit Paclitaxel und Antisense und zum anderen mit Paclitaxel und Kontrolloligonukleotid über drei Wochen behandelt wurden (p=0.037 ).

Colo-320 Zellen reagieren in vitro mit einer Wachstumshemmung auf geringere Konzentrationen 4625, wie MDA-MB-231 Zellen. Möglicherweise ist für den Therapieerfolg in vivo das Ansprechen der Krebszellen insbesondere bei geringen Konzentrationen entscheidend. Die Menge Oligonukleotid, die letztendich in die xenotransplantierten Tumorzellen in der Maus gelangt, ist wahrscheinlich ebenfalls sehr gering.


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Antisense Oligonukleotide gegen unterschiedliche Tumorproteine bzw RNA zeigten in der Vergangenheit wirkungsvolle Effekte in vitro und im Xenografttiermodell (5,54,72). Refraktäre Tumorzellen können mit bcl-2 und bcl-xL Antisense Oligonukleotiden gegenüber chemotherapeutischen Wirkstoffen sensitiviert werden (6,7). Bei der Entwicklung von bcl-xL Antisense Oligonukleotiden ergibt sich ein weiteres Problem. Bcl-xS ist eine Splicevariante von bcl-xL mit einer nicht eindeutig bekannten Wirkung. Einige bcl-xL Antisense-Oligonukleotide besitzen eine Zielsequenz, die in beiden mRNAs vorkommt und degradieren somit neben Bcl-xL auch Bcl-xS. Es konnte aber gezeigt werden, daß Bcl-xS unter bestimmten Umständen Apoptose auslößt (76). Deswegen sollte eine Degradierung der bcl-xS mRNA möglichst vermieden werden. Die Zielsequenz des bispezifischen 4625 Antisense Oligonukleotids befindet sich in einer Spliceregion, die nur in der bcl-xL mRNA vorkommt. So bleibt die Expression des eventuell proapoptotisch wirkenden Bcl-xS vom 4625 Antisense unbeeinflusst.

Das bekannteste bcl-2 Antisense Oligonukleotid ist das G3139 oder Augmerosen der Firma Genta. Es ist ein 18-mer Phoshorothioate Oligonukleotid und richtet sich gegen die ersten 6 Codons in der bcl-2 mRNA. In einerStudie mit non-Hodgkin Lymphom Patienten führte die systemische Applikation von G3139 bei einigen zur Tumorregression, zur Verminderung von Bcl-2 in Lymphomzellen und einer Verbesserung der Blutparameter und des Allgemeinbefindens (8). Weiterhin konnte Augmerosen in einer anderen Studie mit 14 Patienten maligne Melanome gegenüber Dacarbazin sensitivieren (9). Das G3139 Antisense enthält eine, häufig in bakterieller DNA vorkommende Zweiersequenz Cytidin mit darauffolgendem Guanin (CG). Bei Wirbeltieren führt diese Sequenzfolge über bisher nicht bekannte Mechanismen zur Immunstimulation. Die Phosphorothioat Modifikationen (CpGp) verstärken diesen Effekt. Die 4625/4626 Oligonukleotide enthalten keine dieser immunstimulatorischen CG Seguenzen. Der anti-tumorale Effekt in vivo ist somit eventuell mehr auf die Antisense-vermittelte Wirkung zurückzuführen, als dies in Untersuchungen mit G3139 der Fall ist. In der G3139 Studie mit non-Hodgkin Lymphom Patienten wurden bei allen Teilnehmern lokale Inflammationen an den Injektionsstellen beobachtet, die in einem Fall eine Weiterbehandlung ausschloss. Es kam aber zu keinen weiteren schwerwiegenden Nebenwirkungen. Die maximal tolerierte Dosis des G3139 wurde nicht erreicht. Sie lag in einer späteren Studie mit G3139 bei 147 mg/m2 und führte zu Thrombozytopenie, Müdigkeit und Fieber. Die relativ schwachen, systemischen Nebenwirkung von bcl-2 Antisense Oligonukleotiden in Patienten zeigen, daß das Überleben gesunder Zellen weniger von der Expression dieses Proteins abhängt. Tumorzellen enthalten dagegen viele genetische Schäden, die ein Signal für die Apoptoseauslösung darstellen. Sie durchlaufen den programmierten Zelltod, wenn das Rheostat der pro- und anti-apoptotischen Proteine zugunsten der Apoptose verschoben wird.

Der Einsatz therapeutischer Antisense Oligonukleotide zeigte bereits erste Erfolge bei Patienten mit malignen Erkrankungen. Chemische Modifikationen gewährleisten hohe Nukleasenresistenz und Affinität zur Ziel mRNA. Sie erlauben weiterhin teilweise orale Applikationen (60,80). Unspezifische, also von der Nukleotidstruktur vermittelte Effekte, wie Immunstimulation und Hemmung der Angiogenese machen die Antisense Strategie für die antineoplastische Therapie besonders interessant. Die fortschreitende Entdeckung unterschiedlicher Proteine, die an Prozessen wie Chemoresistenzentwicklung, Entdifferenzierung und Metastasierung beteiligt sind, werden in Zukunft die Auswahl molekularer Zielscheiben zur erfogreicheren Krebsbehandlung entscheidend vergrößern. Es bleibt allerdings fraglich, ob die Degradation eines Proteins zu einem langzeitigen Nutzen für den Patienten werden kann. Bcl-2 und bcl-xL wirken offensichtlich sowohl [Seite 55↓] redundant als auch pleiotrop und Tumorzellen können unter gewissen Umständen die Expression von Bcl-2 zu Bcl-xL wechseln (73). Innerhalb eines soliden Tumors sind Bcl-2 und Bcl-xL heterogen verteilt und viele Tumoren exprimieren sowohl Bcl-2 als auch Bcl-xL.

Ein bcl-2/bcl-xL bispezifisches Antisense könnte deswegen in Zukunft eine breitere Anwendbarkeit und wirksamere Effekte bei Patienten mit refraktären Tumoren erreichen.

6.2 Teil 2

Das Oberflächenglykoprotein Ep-CAM wird von vielen soliden Tumoren exprimiert. Neben der Rolle als Adhäsionsmolekül, sind weitere Funktionen zur Zeit noch ungeklärt. Eine Beteiligung an Metastasierung und Entdifferenzierung ist zumindest umstritten. Der Grad der Expression von Ep-CAM korreliert allerdings mit einer hohen Proliferationsrate und mit der Minderexpression von Differenzierungsmarkern (10). Die geringe Expression auf gesundem Gewebe machen Ep-CAM zu einem interessanten Antigen für die Antikörper-basierte Krebstherapie.

Das 4D5-MOC-B Antikörperfragment ist 6 mal kleiner, als der ursprüngliche, monoklonale Antikörper MOC-31 und erreichte in Mäusen mit Ep-CAM positiven Xenotransplantaten 24 Stunden nach Applikation noch eine Tumor:Blut Ratio von 5.5 (16).

Das 4D5MOC-B-ETA Immunotoxin enstand durch Fusion dieses scFv Antikörpers mit dem Pseudomonas Exotoxin ohne Domäne 1. Da beide Bauteile einzelsträngige Proteine sind kann 4D5MOC-B-ETA von Bakterien als Gesamtprotein (~ 70 kDa) exprimiert werden. Die geringe Größe und die hohe Affinität gegenüber Ep-CAM bieten optimale Voraussetzung für die Behandlung solider Tumoren.

Die Konzentrationen 4D5MOC-B-ETA, welche im MTT-Assay eine Wachstumshemmung um 50% bewirkten, reichten von 0.02 pM bis 1 pM. Damit ist dieses Immunotoxin in vitro etwa 1000 mal wirksamer, als das MOC31- ETA Immunotoxin (15). SW2 Zellen exprimieren weniger Ep-CAM als HT-29 und SQ20B Zellen und waren trotzdem im MTT am empfindlichsten. Zum einen tragen die unterschiedlichen Generationszeiten der Zellinien zu diesem Ergebnis bei, zum anderen ist denkbar, daß die in Suspension wachsenden SW2 Zellen dem Immunotoxin eine größere zugängliche Zelloberfläche bieten, als adhärent wachsende HT-29 und SQ20B Zellen. Die Trypan Blau Exklusionen zeigen allerdings, daß SQ20B Zellen nach Behandlung mit 4D5MOC-B-ETA in größerem Ausmaß und insbesondere schneller sterben als SW2 und HT-29. Die hohe Zellspezifität und somit auch geringe Toxizität im Organismus, konnte mit nicht epithelialen, Ep-CAM negativen RL Zellen bestätigt werden. Proteinsyntheseaktivität und Wachstum dieser Lymphomzellen blieben sogar bei 10 nM 4D5MOC-B-ETA unbeeinflußt.

Da die in vivo Stabilität von ETA und 4D5MOC-B bereits bekannt war, konnte man davon ausgehen, daß dies auch auf unser 4D5MOC-B-ETA Immunotoxin zutrifft. Das Ep-CAM Oberflächenglykoprotein auf murinen Epithelzellen unterscheidet sich von dem menschlichen, sodass das von uns verwendete Antikörperfragment nicht an Maus-Ep-CAM bindet. Deshalb sind auch bei diesen in vivo Experimenten Aussagen über Toxizität des 4D5MOC-B-ETA nur beschränkt möglich. Das Tiermodell diente in diesem Fall vielmehr der Untersuchung, ob das Immunotoxin in ausreichender Menge das dichte Gewebe solider Tumoren durchdringt und so die Oberfläche vieler Krebszellen erreicht.


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Das Wachstum von SW2 Xenotransplantaten in Nacktmäusen wurde dosisabhängig durch 4D5MOC-B-ETAgehemmt. Die systemische Applikation von 5 μ g pro Maus/Tag bewirkte ein langsameres Wachstum und 10 μ g führten bereits zum Schrumpfen der Tumoren. Die anti-tumoralen Effekte beider Dosierungen, und insbesondere der niedrigeren, waren bei den schneller wachsenden HT-29 Tumoren stärker ausgeprägt. Die Applikation von 5 mg 4D5MOC-B-ETA pro Maus hatte bereits eine Abnahme der durchschnittlichen Tumorvolumina zur Folge. Bei 14 von 16 Mäusen, die 10 μ g 4D5MOC-B-ETA erhielten, schrumpften die HT-29 Tumoren über die Dauer der Behandlung. Allerdings wuchsen einige anschließend wieder in der gleichen Geschwindigkeit, wie die der unbehandelten Kontrollgruppe. Die Tatsache, daß 18 Tage später ein weiterer Behandlungszyklus über 10 Tage wieder eine Wachstumshemmung um über 50 % bewirkte, macht eine Minderexpression von Ep-CAM auf den HT-29 Xenotransplantaten, nach 10-tägiger Applikation von 4D5MOC-B-ETA unwahrscheinlich. Das Immunotoxin erreichte in den über 200 mm3 großen Tumoren beim zweiten Behandlungszyklus auch offensichtlich noch genügend Zellen um das Wachstum des gesamten Tumors deutlich zu inhibieren.

In der Studie mit dem MOC31-ETA Immunotoxin (15) hemmten 10 μ g Immunotoxin über 8 Tage (i.p.) das Wachstum von xenotransplantierten Tumorzellen fast vollständig, wenn diese ein Anfangsvolumen von nur 40 mm3 hatten. Bei Tumoren mit 120 mm3 zum Zeitpunkt des ersten Behandlungstages wuchsen diese nur noch um etwa 25% langsamer. Man kann davon ausgehen, daß subkutan injizierte Tumorzellen sich erst eine Woche nach Transplantation und ab einer Größe von 75 mm3 ausreichend etabliert haben und so den realistischen Voraussetzungen der Therapie solider Tumoren eher entsprechen. In einigen Studien mit Immunotoxinen wurde bereits am Tag der Tumorzelltransplantation oder einen Tag später mit der Behandlung begonnen. Unter solchen Bedingungen ist die anti-tumorale Wirkung nicht mit fortgeschrittenen malignen Tumoren vergleichbar. Es ist gut vorstellbar, daß durch einen längeren Behandlungszeitraum mit 4D5MOC-B-ETA die Heilung einiger Mäuse möglich gewesen wäre. Eine Therapie mit Immuno-Konjugaten über mehr als 10 Tage ist in der Regel allerdings nicht realistisch. Der Antikörper und der Toxinteil sind immunogene Stoffe, die nach mehrmaligen Applikationen zu schweren Nebenwirkungen führen können. Unerwünschte Wirkungen von Immunotoxinen in Patienten limitierten in der Vergangenheit fast immer die klinische Anwendbarkeit. Die körperfremde Proteinstruktur führt zur Bildung von Antikörpern und zur spezifischen Immunabwehr. In klinischen Studien mit monoklonalen Antikörpern, bildeten fast alle Patienten bereits nach wenigen Tagen Anti-Maus und/oder Anti-Toxin Antikörper. Wenn bereits vorher eine Immunisierung stattgefunden hat, führt das zu einer raschen Inaktivierung des Wirkstoffs durch das R.E.S. Aus diesem Grund ist das ETA dem DT Toxin bei systemischen Applikationen vorzuziehen, weil nur wenige Menschen zuvor mit dem ETA in Kontakt kamen. Eine noch häufigere Nebenwirkung von Immunotoxinen ist das “vascular leak syndrom” (VLS). Es beruht auf einer mehr unspezifsichen Toxizität. Hierbei kommt es zur Endothelzellapoptose, mit darauffolgender

Flüssigkeitsansammlung, Ödementstehung und Hypoalbuminämie. In einer klinischen Studie mit LMB-1 Immunotoxin starb ein Patient an den Folgen des VLS (74). LMB-1 besteht aus einem monoklonalen Antikörper, der über ein chemisches Linkerpeptid mit dem ETA verbunden ist. Aufgrund dieser Tatsache hat LMB-1 ein Molekulargewicht von etwa 180 kDa. Die Auslösung von VLS wird durch große Immunotoxine, die lange in der Blutbahn zirkulieren, begünstigt. Eine sinnvolle Behandlung solider Tumoren erfordert, im Gegensatz zu hämatologischen Erkrankungen, ohnehin ein geringes Molekulargewicht. Wegen ihrer geringen Größe sind rekombinante scFv-ETA [Seite 57↓] Fusionsproteine für die Behandlung solider Tumoren geeignet. Sie haben eine Plasmahalbwertzeit von etwa 30 Minuten und müssen deshalb öfters oder über eine Infusion langsam appliziert werden. Neben dem hohen Entwicklungsaufwand der für die Herstellung humanisierter scFv Immunotoxine erforderlich ist, erschweren hoher interstitieller Druck und tight junctions die ausreichende Diffusion ins Tumorgewebe und somit den Erfolg der Therapie von soliden Tumoren. Ein Antigenstatus ist durch die begrenzte Zugänglichkeit schwerer erhältlich, und Oberflächenmoleküle sind häufig heterogen verteilt. Die Wahl eines optimalen Tumorantigens und geeignete Applikationsverfahren sind wahrscheinlich entscheidend für eine klinisch erfolgreiche Therapie mit Immunotoxinen. Mit einer speziellen, intrathekalen Infusionstechnik gelang es partielle oder vollständige Remissionen von austherapierten Gehirntumoren in 9 von 15 Fällen zu erreichen (50). Ein aus Transferrin und DT bestehendes Konjugat heilte so zwei Patienten mit einem Glioblastoma multiforme und einem anaplastischem Astrozytom. Das in dieser Studie verwendete Tf-CRM107 Immunotoxin kann wegen dem Molekulargewicht von etwa 200 kDa nur in geringen Teilen die Blut Hirn Schranke überwinden und gesunde Neurone exprimieren den Transferrin-Rezeptor praktisch nicht. Für systemische Applikationen und anti-metastatisches Potential gegen solide Tumoren sind, neben Ep-CAM insbesondere das Her-2 und das Ley Antigen interessant. Nachfolger von LMB-1 sind unter anderem LMB-7 und LMB-8. Beide sind Ley-spezifische, rekombinate scFv bzw. dsFv Immunotoxine und werden zur Zeit an Patienten mit unterschiedlichen soliden Tumoren getestet (78). Das Toxin ist wie bei dem 4D5MOC-B-ETA ein KDEL-mutiertes Pseudomonas Exotoxin. Die katalytische Aktivität dieses mutierten Toxins macht nur wenige tausend Moleküle pro Zelle notwendig, um sie zu töten (75). Die Auswahl eines hochspezifischen Tumorantigens ist somit für den Erfolg der Therapie und das Ausmaß der unerwünschten Nebenwirkungen entscheidend.

Die Tatsache, daß das Ep-CAM Antigen auch von metastatischen Tumorzellen exprimiert wird, könnte möglicherweise die Überlebensrate von Patienten mit malignen Tumoren bei systemischer Gabe von 4D5MOC-B-ETA verbessern. Eine Studie mit intra-tumoraler Applikation an Patienten mit Pharynx- Zungen- und Larynxkarzinomen im UniversitätsSpital, Zürich befindet sich in der Vorbereitungsphase.


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08.06.2004