Aus dem Institut für Medizinische Immunologie
und der Klinik für Nephrologie und internistische Intensivmedizin CVK
der Medizinischen Fakultät der Charité - Universitätsmedizin Berlin

DISSERTATION

Bestimmung spenderreaktiver, IFNγ-produzierender Zellen
vor und nach Nierentransplantation im ELISpot-Assay -
Zusammenhang mit frühen akuten Rejektionen und mit dem klinischen Ausgang

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité -
Universitätsmedizin Berlin

vorgelegt von: Franziska Presber
aus Berlin

Dekan: Dekan: Prof. Dr. med. Martin Paul

Gutachter:
1. Prof. Dr. H.-D. Volk
2. Dr med. Manfred Lehmann
3. Dr. med Ulrich Sack

Datum der Promotion: 11. 07. 2005

Abstakt

Hintergrund: Um akute Rejektionen nach Nierentransplantation früh erkennen und behandeln zu können, gleichzeitig die Nebenwirkungen einer immunsuppressiven Therapie zu minimieren, wäre die Etablierung eines “Immunmonitorings”, welches zu jedem Zeitpunkt Hinweise auf die Aktivierung des Immunsystems des Empfängers gegen das Transplantat gibt, wünschenswert.

Methodik: In dieser Studie wurden die Anzahl der spenderreaktiven, IFNγ-produzierenden T-Zellen von 52 nierentransplantierten Patienten zu verschiedenen Zeitpunkten vor (prä-TX) und nach Transplantation (post-TX) im ELISpot-Assay gemessen und in Zusammenhang mit der klinischen Entwicklung gebracht. Außerdem wurde das Assay auf Reproduzierbarkeit untersucht und versucht zu optimieren.

Ergebnisse: Eine stark erhöhte Anzahl spenderreaktiver Zellen prä-TX (>200 IFNγ-spots/3*10⁵ PBMZ, n = 5) war immer mit einer akuten Rejektion des Transplantats assoziiert. Post-TX korrelierte die Anzahl der spenderreaktiven, IFNγ-produzierenden Zellen mit der Nierenfunktion ein Jahr nach Transplantation. Diese Korrelation wurde in den Wochen 2 und 3 post-TX und bei Patienten ohne akute Rejektion, besonders deutlich. Hinsichtlich der methodischen Optimierung hat sich die magnetische Depletion CD2^pos-Zellen als effektiv gezeigt, die IFNγ-Sekretion von Stimulatorzellen zu unterbinden. Um die Reproduzierbarkeit des Assays zu verbessern sollten Stimulatorzellen im Überschuss und Empfänger-T-Zellen in einer konstanten Anzahl eingesetzt werden. Dabei sollte die Gesamtzellzahl über 10⁶ Zellen/ml betragen.

Conclusion: Das ELISpot-Assay ist zur Erkennung klinisch relevanter T-Zellsensibilisierungen vor und nach Transplantation geeignet. Vor einem Einsatz in der klinischen Routine sollten jedoch einige methodische Verbesserungen vorgenommen werden.

Eigene Schlagworte: Nierentransplantation,, spenderspezifische T-Zellen, , ELISpot-Assay, , Interferon gamma

Abstract

Background: In order to perform early diagnosis and treatment of acute rejections after renal transplantation while minimizing side effects of immunosuppression, an immune monitoring tool is needed, which gives information on the activation state of the immune system of the transplant recipient against the allograft at any given time.

Methods: In this study, frequencies of donor-reactive, IFNγ-producing T cells where measured in 52 renal transplant recipients at different time points before (pre-TX) and after transplantation (post-TX) using the ELISPOT-assay. The frequencies were correlated with clinical outcome. Also, the reproducibility of the assay and possibilities of optimization were tested.

Results: Highly elevated frequencies of donor-reactive cells pre-TX (>200 IFNγ-spots/3*10⁵ PBMC´s, n = 5) were always associated with acute rejection episodes after transplantation. Post-TX frequencies of donor-reactive, IFNγ-producing cells correlated significantly with graft function one year post-TX. This correlation was strongest for frequencies in week 2 and 3 post-TX and in patients without acute rejection. Regarding the methodical optimization, magnetic CD2^pos-cell depletion of donor leucocytes proved useful to inhibit IFNγ secretion of stimulating cells. To improve reproducibility of the assay stimulating cells should be used as a surplus, a constant number of responding T cells should be chosen, and overall cell concentration should exceed 10⁶ cells/ml.

Conclusion: The ELISPOT-assay is a useful tool to detect clinically relevant T cell sensibilisation pre- and post-TX. Before it is routinely used some methodical alterations must be performed.

Keywords: renal transplantation,, donor-specific T cells, , elispot-assay, , interferon gamma

Inhaltsverzeichnis

• Zusammenfassung
• Abkürzungsverzeichnis
• 1 Einleitung
• 2 Theoretischer Hintergrund
  • 2.1  Die akute Rejektion
    • 2.1.1  Diagnose
    • 2.1.2 Risikofaktoren
    • 2.1.3 Therapie
    • 2.1.4 Komplikationen
  • 2.2 Die CTN- die chronische Transplantat-Nephropathie
    • 2.2.1  Diagnose
    • 2.2.2 Pathogenese
  • 2.3 Der Tod des Patienten bei funktionsfähigem Transplantat
    • 2.3.1  Kardiovaskuläre Erkrankungen
    • 2.3.2 Tumore
    • 2.3.3 Infektionen
  • 2.4 Die Immunantwort
    • 2.4.1  Bedeutung von T-Zellen
    • 2.4.2 T-Zellaktivierung
    • 2.4.3 Immunität gegen das Transplantat
    • 2.4.4 Bedeutung von IFNγ
    • 2.4.5 Gedächtniszellen und Effektorzellen
  • 2.5 Das ELISpot-Assay - Enzyme-Linked Immunosorbent Spot Assay
• 3 Aufgabenstellung
• 4 Methoden
  • 4.1 
    • 4.1.1  Studiendesign
    • 4.1.2 Zellpräparation
    • 4.1.3 Zellzahlbestimmung
    • 4.1.4 Kryokonservierung von Spenderzellen
    • 4.1.5 ELISpot-Assay
    • 4.1.6 CD2^posZelldepletion durch MACS - Magnetic Cell Sorting
    • 4.1.7 Messung des Anteils der T-Zellen in PBMZ
    • 4.1.8 Erfassung transplantationsspezifischer Daten
    • 4.1.9 Statistische Analysen
• 5  Materialien
  • 5.1 
    • 5.1.1  Patienten und Probanden
    • 5.1.2 Verbrauchsmaterialien und wiederverwendbare Materialien
    • 5.1.3 Geräte
    • 5.1.4 Puffer, Lösungen, Zellkulturmedien
    • 5.1.5 MACS-Puffer
    • 5.1.6 Zellstimulantien undAntikörperkonjugate
    • 5.1.7 Verwendete Software
• 6 Ergebnisse
  • 6.1  Einige Patientenbeispiele im Verlauf
    • 6.1.1  Patienten ohne Nachweis spenderreaktiver, IFNγ-produzierender Zellen
    • 6.1.2 Patienten mit spenderreaktiven Zellen prä-Tx
    • 6.1.3 Patienten mit spenderreaktiven Zellen post-Tx
    • 6.1.4 Patienten, die eine OKT3-Induktionstherapie erhielten
  • 6.2 Spenderreaktive, IFNγ-produzierende Zellen prä-Tx
    • 6.2.1  Zusammenhang mit frühen akuten Rejektionen
    • 6.2.2 Zusammenhang mit der Nierenfunktion
    • 6.2.3 Zusammenhang mit Sensibilisierungsfaktoren
    • 6.2.4 Zusammenhang zwischen spenderreaktiven Zellen prä- und post-Tx
  • 6.3 Spenderreaktive, IFNγ-produzierende Zellen post-Tx
    • 6.3.1  Zusammenhang mit der Nierenfunktion
    • 6.3.2 Zusammenhang mit frühen akuten Rejektionen
    • 6.3.3 Zusammenhang mit Sensibilisierungsfaktoren
  • 6.4 Besonderheiten immunsuppressiver Therapieschemata
    • 6.4.1  Patienten, die mit FTY720 behandelt wurden
    • 6.4.2 Patienten, die eine OKT3-Induktionstherapie erhielten
    • 6.4.3 Patienten, die eine Lebendspende erhielten
  • 6.5 Versuch der Optimierung des ELISpot-Assays
    • 6.5.1  Reproduzierbarkeit
    • 6.5.2 Ciclosporin A
    • 6.5.3 Tacrolimus
    • 6.5.4 CD2^pos-Zelldepletion
    • 6.5.5 Bestrahlung
    • 6.5.6 Anteil der T-Zellen an Responder-PBMZ
    • 6.5.7 Optimale Zellkonzentrationen
• 7 Diskussion
  • 7.1  Bewertung der angewandten Methodik
    • 7.1.1  Bestimmung spenderreaktiver Zellen in PBMZ
    • 7.1.2 Stellenwert des ELISpot-Assays
    • 7.1.3 Versuch der Optimierung des Assays
    • 7.1.4 Einschränkung der Interpretation der Werte
  • 7.2 Immunologische Interpretation
    • 7.2.1  Allgemeine Interpretation der gemessenen Zellen
    • 7.2.2 Subklinische Rejektion
    • 7.2.3 Direkte versus indirekte Präsentation
    • 7.2.4 T1/T2-Polarisation
    • 7.2.5 CD4^pos-/CD8^posT-Zellen
    • 7.2.6 Regulatorisches IFNγ?
  • 7.3 Klinische Relevanz der Ergebnisse
    • 7.3.1  Bestimmung spenderreaktiver, IFNγ-produzierender Zellen prä-Tx
    • 7.3.2 Bestimmung spenderreaktiver, IFNγ-produzierender Zellen post-Tx
• 8. Literaturverzeichnis
• Danksagung
• Eidesstattliche Erklärung
• Lebenslauf

Tabellen

• Tabelle 1 Charakterisrika der untersuchten Patienten, n = 52
• Tabelle 2 Extremwerte und Mediane der zu den verschiedenen Messzeitpunkten ermittelten Werte für spenderreaktive, IFNγ-produzierende Zellen aller 52 Patienten der Studie ,Spots/3*10⁵ PBMZ
• Tabelle 3 Sensibilisierungsfaktoren und Transplantationsverlauf der Patienten mit über 200 IFNγ-produzierenden, spenderreaktiven Zellen/ 3*10⁵ PBMZ vor Transplantation.
• Tabelle 4 Korrelationen zwischen der Anzahl spenderreaktiver, IFNγ-produzierender Zellen und der Nierenfunktion sechs Monate bzw. ein Jahr post-Tx innerhalb der gesamten untersuchten Patientengruppe,1: n = 51; 2: n = 48; 3: n = 40; 4: n = 39; 5: n = 41; 6: n = 42
• Tabelle 5 Korrelationen zwischen der Anzahl spenderreaktiver, IFNγ-produzierender Zellen und der Nierenfunktion sechs Monate bzw. ein Jahr post-Tx innerhalb der Patientengruppe ohne frühe akute Rejektionen, 1: n = 33; 2: n = 32; 3: n = 27; 4: n = 26; 5: n = 29; 6: n = 28; 7: n = 30
• Tabelle 6 Sensibilisierungsfaktoren und Transplantationsverlauf der Patienten, die als immunsuppressive Therapie FTY720 erhielten
• Tabelle 7 Sensibilisierungsfaktoren und Transplantationsverlauf Transplantationsverlauf der Patienten, die ein OKT3-Induktionschema erhielten
• Tabelle 8 Sensibilisierungsfaktoren und Transplantationsverlauf der Patienten, die eine Lebenspende erhielten

Bilder

• Abbildung 1 Studiendesign
• Abbildung 2 Schema zum Mechanismus des ELISpot-Assays
• Abbildung 3 Kamerablick auf IFNγ-Spots spenderreaktiver Zellen im ELISpot-Assay
• Abbildung 4 Patienten ohne Nachweis spenderreaktiver Zellen vor und nach Nierentransplantation. Die dargestellten Patienten blieben rejektionsfrei und wiesen innerhalb des Messzeitraums Serumkreatininwerte im Normbereich sowie eine gute Nierenfunktion ein Jahr nach Transplantation auf. ELISpot-Messwerte liegen nur zu den beschrifteten Zeitpunkten vor.
• Abbildung 5 Patienten mit spenderreaktiven, IFNγ-produzierenden Zellen vor der Nierentransplantation. Die dargestellten Patienten erlitten eine schwere akute Rejektion innerhalb der ersten Woche post-Tx. Während des Messzeitraums lagen die Serumkreatininwerte überwiegend über dem Normbereich. Die Nierenfunktion war ein Jahr nach Transplantation stark eingeschränkt. ELISpot-Messwerte liegen nur zu den beschrifteten Zeitpunkten vor. Unter OKT3-Behandlung sind diese grün abgebildet
• Abbildung 6 Patienten mit spenderreaktiven, IFNγ-produzierenden Zellen vor Ttransplantation (2). Die dargestellten Patienten erlitten min. eine akute Rejektion. Bei Patient 8 wurde direkt vor Rejektionsverdacht ein hoher Wert für spenderreaktive Zellen gemessen (70 IFNγ-Spots). Während des Messzeitraums lagen die Serumkreatininwerte über dem Normbereich. Die Nierenfunktion war ein Jahr nach Transplantation jedoch überdurchschnittlich. ELISpot-Messwerte liegen nur zu beschrifteten Zeitpunkten vor.
• Abbildung 7 Patienten mit spenderreaktiven, IFNγ-produzierenden Zellen nach der Nierentransplantation. Die dargestellten Patienten erlitten mindestens eine frühe akute Rejektion. Teilweise konnte direkt nach dem Anstieg der Werte für spenderreaktive, IFNγ-produzierende Zellen die Diagnose einer akuten Rejektion gestellt werden. Während des Messzeitraums lagen die Serumkreatininwerte über dem Normbereich. Die Nierenfunktion war ein Jahr nach Transplantation teilweise stark eingeschränkt. ELISpot-Messwerte liegen nur zu den beschrifteten Zeitpunkten vor.
• Abbildung 8 Patienten mit spenderreaktiven, IFNγ-produzierenden Zellen nach Transplantation (2). Bei den dargestellten Patienten wurde keine akute Rejektion diagnostiziert. Trotzdem lagen die Serumkreatininwerte während des Messzeitraums über dem Normbereich und die Nierenfunktion war ein Jahr post-Tx eingeschränkt. ELISpot-Messwerte liegen nur zu den beschrifteten Zeitpunkten vor.
• Abbildung 9 Patienten mit OKT3-Induktionsschema. Obwohl bei den zwei Patienten einige Wochen post-Tx erhöhte Werte für spenderreaktive Zellen gemessen werden konnten, stiegen die Serumkreatininwerte während des Messzeitraums nie über den Normbereich und die Nierenfunktion war ein Jahr post-Tx sehr gut. Unter OKT3-Therapie stiegen die Messwerte fehlerhaft an (grün). ELISpot-Messwerte liegen nur zu den beschrifteten Zeitpunkten vor.
• Abbildung 10 IFNγ-produzierende, spenderreaktive Zellen vor Transplantation bei Patienten mit und ohne Nachweis einer akuten Rejektion ihrer Spenderniere.
• Abbildung 11 IFNγ-produzierende, spenderreaktive Zellen vor Transplantation bei Patienten mit und ohne Nachweis präformierter Anti-HLA-Antikörper (PRA).
• Abbildung 12 Nierenfunktion ein Jahr post-Tx bei Patienten mit Werten spenderreaktiver Zellen post-Tx über bzw. unter einem experimentell ermittelten Cut-Off. Die Gruppen unterscheiden sich in ihrem Median ( schwarzer Balken) teilweise signifikant.
• Abbildung 13 Nierenfunktion ein Jahr nach Transplantation bei Patienten OHNE AKUTE REJEKTION mit Werten spenderreaktiver Zellen post-Tx über bzw. unter einem experimentell ermittelten Cut-Off. Die Gruppen unterscheiden sich in ihrem Median (schwarzer Balken) teilweise signifikant.
• Abbildung 14 Zusammenhang zwischen der Anzahl spenderreaktiver, IFNγ-produzierender Zellen post-Tx und der Nierenfunktion ein Jahr nach Tansplantation bei Patienten mit und ohne Nachweis einer akuten Rejektion. Während bei Patienten mit akuter Rejektion kein Zusammenhang zwischen beiden Parametern besteht, korreliert der Mittelwert der spenderreaktiven Zellen innerhalb der ersten drei Monate gut mit der GFR und dem Serumkreatinin ein Jahr post-Tx. Diese Beziehung ist bis auf zwei Ausnahmen sogar nahezu linear.
• Abbildung 15 Zusammenhang zwischen der Dauer der Hämodialyse und der Anzahl spenderreaktiver, IFNγ-produzierender Zellen post-Tx. Patienten mit der größten maximalen oder mittleren Anzahl Zellen wurden insgesamt mindestens 79 Monate hämodialysiert.
• Abbildung 16 Beziehung zwischen dem HLA-Gesamt-Mismatch und der Anzahl der spenderreaktiven Zellen in Woche 2 post-Tx
• Abbildung 17 Maximale Anzahl spenderreaktiver, IFNγ-produzierender Zellen nach Transplantation bei Patienten mit Lebenspenden und bei Patienten mit Kadaverspenden.
• Abbildung 18 IFNγ-Sekretion CMV-spezifischer T-Zellen nach 24h Ciclosporin A-Wirkung
• Abbildung 19 IFNγ-Sekretion CMV-spezifischer T-Zellen nach 2h Tacrolimus-Wirkung
• Abbildung 20 Übertragung der Wirkung von Tacrolimus auf unbehandelte CMV-spezifische T-Zellen
• Abbildung 21 IFNy-Sekretion CD2-depletierter Leukozyten unter PHA-Stimulation
• Abbildung 22 Aktivierung alloreaktiver T-Zellen durch CD2-depletierte allogene Leukozyten
• Abbildung 23 IFNγ-Sekretion (nach allogenem Stimulus) und Allogenität bestrahlter Leukozyten
• Abbildung 24 Prozentualer Anteil von T-Zellen an PBMZ nierentransplantierter Patienten zu verschiedenen Messzeitpunkten vor und nach Nierentransplantation. Die einzelnen Patienten werden durch unterschiedliche Farben symbolisiert.
• Abbildung 25 IFNγ-Spots im ELISpot Assay bei T-Zell-Alloreaktionen im Zusammenhang mit der Anzahl der Stimulator- und Responderzellen
• Abbildung 26 Die alloreaktive T-Zell-Antwort konvergiert bei einer sättigenden Stimulation