4 Methoden

4.1.1  Studiendesign

Die Patientenstudie wurde mit Genehmigung der Ethikkommission des Universitätsklinikums Charité Berlin durchgeführt. Sie war als prospektive, beobachtende Studie angelegt.

52 Patienten, die zwischen Juni 2001 und Mai 2002 in der Charité, Campus Virchow, nierentransplantiert wurden, wurden in die Studie eingeschlossen.

Wenn organisatorisch möglich, wurden im Rahmen eines stationären Aufenthaltes in der Charité oder zu Routineuntersuchungszeitpunkten in der Transplantationsambulanz der Charité direkt vor der Nierentransplantation und vor Anfang einer Immunsuppression, am Tag 1, danach wöchentlich bis Woche 12 von jedem Patienten (in Einzelfällen auch etwa 6-7 Monate post-Tx) 20 ml venöses Vollblut unter Verwendung von Zitratmonovetten abgenommen und am gleichen Tag PBMZ präpariert.

Spenderzellen bei Kadaverspenden wurden am Tag der Transplantation aus einem Stück Milz des Spenders, welches vom HLA-Labor der Charité zur Verfügung gestellt wurde, und bei Lebendspenden aus 500 ml venösem Spenderblut eine Woche vor der Transplantation präpariert. Einige Spenderzellen wurden daraufhin im ELISpot-Assay eingesetzt, die anderen wurden kryo-konserviert, um bei späteren Messzeitpunkten zur Verfügung zu stehen.

PBMZ der Empfänger wurden zu den genannten Zeitpunkten mit frischpräparierten oder kryokonservierten Spenderzellen im ELISpot-Assay stimuliert und die Anzahl resultierender IFNγ-Spots gemessen, welche als Ausdruck aktivierter, spenderreaktiver T-Zellen des Patienten gewertet wurden. Da das Spenderzellmaterial limitiert war, konnte nicht bei allen 52 Patienten zu jedem genannten Zeitpunkt eine Messung durchgeführt werden.

Immunologisch sensibilisierende Charakteristika der Patienten wurden vor Transplantation, eine verzögerte Funktionsaufnahme des Organs sowie akute Rejektionsepisoden innerhalb der ersten sechs Monate post-Tx wurden nach Transplantation erfasst. Etwa sechs und 12 Monate nach Transplantation wurde mit Hilfe der MDRD-Formel und der zu diesen beiden Zeitpunkten im klinischen Labor ermittelten Werte für Serumkreatinin, Serumharnstoff und Albumin die GFR der Spenderniere der Patienten abgeschätzt, da die GFR die Nierenfunktion besser widerspiegelt als das schneller zu bestimmende Serumkreatinin. Die GFR eines gesunden Menschen mit zwei funktionstüchtigen Nieren beträgt etwa 85-135 ml/min/1,73m² (altersabhängig). Ein Anstieg des Serumkreatinins aus dem Normbereich (0,5-1,2 mg/dl, abhängig von Muskelmasse, Stoffwechsel, Labor) ist jedoch erst bei einer pathologischen Verminderung der GFR um mindestens 50 % zu erwarten.

	Abbildung 1 Studiendesign

Für methodische Untersuchungen wurde gesunden Probanden venöses Vollblut abgenommen.

Präparation mononukleärer Zellen aus Zitratblut

1. 20 ml Zitratblut wurden mit PBS im Verhältnis 1:1 in einem 50 ml-Röhrchen verdünnt.
2. In 14 ml -Röhrchen wurden je 3 ml des Lymphozytentrennmediums Ficoll-Paque vorsichtig mit je 8ml des verdünnten Zitratblutes überschichtet.
3. Die Röhrchen wurden bei Raumtemperatur und 1000 g für 20 min zentrifugiert. Dabei bildeten sich 4 Phasen aus: Ein Pellet aus Erythrozyten und Granulozyten, darüber eine Schicht mit Lymphozytentrennmedium, auf der sich ein dünner, weißer Ring mit mononukleären Zellen befand. Die oberste Schicht bestand aus Plasma und Zellfragmenten.
4. Mit einer Pasteur-Pipette wurde der weiße Ring möglichst vollständig abgesaugt und in ein 50 ml Röhrchen überführt.
5. In diesem Röhrchen wurden die mononukleären Zellen zweimal mit 50 ml PBS gewaschen und bei Raumtemperatur und 200 g für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und jeweils verworfen.
6. Die Zellen wurden in Kulturmedium aufgenommen, vorsichtig resuspendiert, auf
   3-5*10⁶/ml eingestellt und über Nacht im Brutschrank gelagert.

Präparation mononukleärer Zellen aus Spendermilzanteilen

1. Das kleine Stück Spendermilz wurde aus seinem Kulturmedium entfernt und auf einer sterilen Zellkulturschale von seiner Kapsel und Bindegewebssträngen befreit und in etwa kirschgroße Stücken geschnitten.
2. Die Milzstückchen wurden mit Hilfe eines sterilen Einmalspritzenstempels durch einen 100 µm Maschenfilter (Cellstrainer) in 50 ml Röhrchen gedrückt, wobei häufig mit PBS gespült wurde. Die Filter mit Geweberesten wurden verworfen.
3. Die Zellsuspension wurde mit PBS im Verhältnis 1:1 verdünnt.
4. In 50 ml Röhrchen wurden je 15 ml Lymphozytentrennmedium Ficoll-Paque mit 35 ml Milzzellsuspension überschichtet.
5. Die Röhrchen wurden nun bei Raumtemperatur und 1000 g für 20 min zentrifugiert. Dabei bildeten sich erneut 4 Phasen aus (siehe oben).
6. Der weiße Ring auf dem Lymphozytentrennmedium wurde wieder möglichst vollständig abgesaugt und in 50 ml Röhrchen überführt.
7. In diesem Röhrchen wurden die mononukleären Zellen zweimal mit 50 ml PBS gewaschen und bei Raumtemperatur und 200 g für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und jeweils verworfen. Manchmal neigten die Zellen zu Verklumpungen und mussten zwischendurch erneut durch einen 100 µm Maschenfilter (Cellstrainer gedrückt werden).
8. Die Zellen wurden vorsichtig resuspendiert, in Zellkulturflaschen in Kulturmedium aufgenommen, auf 3 - 5*10⁶/ml eingestellt und über Nacht im Brutschrank gelagert.

Zählen von frisch präparierten, vitalen Zellen :

1. 10 µl der Zellsuspension wurden mit 190 µl 3 % Essigsäure in Mikrotitierplatten verdünnt.
2. Deckgläser wurden angefeuchtet und gegen die Neubauer-Zählkammer gedrückt bis sogenannte Newton´sche Ringe entstanden.
3. 10 µl der verdünnten Zellsuspension wurden in die Zählkammer eingefüllt.
4. Die hellen, leuchtenden Zellen wurden unter dem Mikroskop in 4 Quadranten gezählt.

Erythrozyten werden bei dieser Methode durch Essigsäure lysiert. Nichtvitale Zellen leuchten zwar auch hell, durch die Präparation werden jedoch zuvor die meisten nichtvitalen Zellen aus der Zellsuspension entfernt.

Die Zellzahl pro ml ergibt sich aus: Mittelwert*20*10⁴ = Zellen/ml

Zählen von aufgetauten, potentiell nichtvitalen Zellen :

Statt Essigsäure wurde 1 % Trypanblau verwendet.

Nichtvitale Zellen werden bei dieser Methode blau. Erythrozyten leuchten zwar auch hell, durch die Kryokonservierung werden jedoch die meisten Erythrozyten zerstört.

Einfrieren von Spenderzellen :

1. Die am Tage zuvor präparierten Spendermilzzellen oder Spender-PBMZ wurden aus dem Brutschrank genommen und die Zellzahl bestimmt.
2. In 50 ml Röhrchen wurden die Zellen bei 200 g für 10 min zentrifugiert und der Überstand abgenommen und verworfen. Das Röhrchen mit dem Zellpellet wurde auf Eis gelagert.
3. Das Pellet wurde in eiskaltem Kryomedium (hitzeinaktiviertes FKS+10% DMSO) folgenden Volumens resuspendiert: Gesamtzellzahl/12 *10⁶*1,8 ml.
4. Die Zellsuspension wurde auf Eis zu je 1,8 ml in Kryoröhrchen aliquotiert.
5. Die Kryoröhrchen wurden in Iso-Propylalkohol-Gefriergefäßen bei -84 °C eingefroren.

Auftauen von kryokonservierten Spenderzellen

1. Die Kryoröhrchen mit den aufzutauenden Zellen wurden aus dem Tiefkühler herausgenommen und auf Eis gelagert.
2. Im 37 °C Wasserbad wurden sie so lange aufgetaut bis nur noch ein kleiner Eisrest übrig blieb, danach wurden sie sofort wieder auf Eis gelagert.
3. Mit einer Pipette wurde die Zellsuspension in ein 50 ml Röhrchen überführt.
4. Auf Eis gelagert wurde zunächst langsam, tropfenweise später etwas großzügiger eiskaltes Kulturmedium hinzugegeben bis eine Verdünnung des Kryomediums von mindestens 1:10 erreicht worden war.

Prinzip: Für dieses Assay werden 96-Well Platten mit einer synthetischen, weißen Membran am Boden der Wells benutzt. Die Membran wird mit Primärantikörpern gegen das interessierende sezernierte Zytokin (z.B. IFNγ) beschichtet (a). Dann wird eine definierte Anzahl von Immunzellen (z.B. PBMZ der Transplantatmpfänger) zusammen mit einem Antigenstimulus (z.B. inhibierte Leukozyten des Transplantatspenders) in die einzelnen Wells pipettiert (b). Wenn die Immunzellen auf den Stimulus reagieren, produzieren sie Zytokine, die direkt neben ihnen vom Primärantikörper festgehalten werden bevor sie sich im Well verteilen oder von anderen Zellen absorbiert werden können (c). Nach einer bestimmten Zeit (z.B. 24 h) werden die Zellen und das Antigen aus den Wells herausgewaschen (d) und ein biotinylierter Sekundärantikörper gegen das interessierende Zytokin hinzugefügt, der nur an Stellen, an denen das Zytokin gebunden wurde, haften bleibt (e). Der überschüssige Rest wird ausgewaschen. Streptavidin, welches eng an Biotin bindet, führt nach Zugabe über eine enzymatische Reaktion zur Ausfällung eines Chromogens (3-Amino-9-Ethyl-Carbazol) an den Stellen, an denen Zellen das interessierende Zytokin gebildet haben (f). Kleine Flecken, die sogenannten „Spots“, werden dort sichtbar.

	Abbildung 2 Schema zum Mechanismus des ELISpot-Assays

Ein spezielles computergestütztes Gerät (Bioreader) zählt die Anzahl der Spots über eine Kamera, die der Anzahl der zytokinsezernierenden Zellen entspricht.

	Abbildung 3 Kamerablick auf IFNγ-Spots spenderreaktiver Zellen im ELISpot-Assay

Als Antigene für die Aktivierung von T-Zellen kommen sowohl spezifische als auch unspezifische Substanzen in Frage:

• Fremd-MHC-Peptid-Komplexe oder fremde präsentierte Peptide auf der Oberfläche von Stimulatorzellen aktivieren Effektorzellen via T-Zell-Rezeptor.
• Superantigene wie PHA, ConA oder SEB können über eine direkte Bindung an den T-Zell-Rezeptor an einem Ort, der nicht für die MHC-Komplex-Bindung zuständig ist, unabhängig von einer Kostimulation eine Aktivierung der T-Zelle auslösen.
• Peptide bestimmter Länge, die zu den zu untersuchenden Immunzellen gegeben werden, können bei einem Peptidüberschuss kompetetiv die zelleigenen Peptide aus der Bindungsgrube der MHC-Komplexen verdrängen und ersetzen. Nun präsentieren die zu untersuchenden Zellen auf ihren MHC-Molekülen Fremdpeptide, die wiederum spezifische T-Zellen der untersuchten Zellpopulation aktivieren und zur Zytokinproduktion anregen können.

Während die zweite Möglichkeit, z.B. die Stimulation der Leukozyten mit PHA (PHA aktiviert T-Zellen unspezifisch über die Kreuzvernetzung ihrer CD3-Moleküle. Die resultierende IFNγ-Sekretion dient somit als Kontrolle der Messbarkeit aktivierter T-Zellen im Assay.) als Positivkontrolle des Assays fungieren kann, eignet sich das letzte Verfahren z.B dazu, die Frequenz CMV-spezifischer Effektor-T-Zellen anhand der Reaktion auf die Präsentation verschiedener Peptide des pp65-Proteins, welches von CMV gebildet wird, zu messen.

Durchführung: Die Behandlung aller Zellen, die im ELISpot-Assay eingesetzt wurden, erfolgte vor bzw. während der Inkubation im Assay unter sterilen Bedingungen.

Tag 1:

1. Die PBMZ der zu untersuchenden Person wurden aus 20 ml Zitratblut präpariert, auf
   3-5*10⁶/ml in Kulturmedium eingestellt und über Nacht im Brutschrank gelagert.
2. Die 96-Well Multiscreen-Mikrotitierplatte wurde mit einer 12-Kanal-Pipette mit Primär-IFNγ-Antikörpern in sterilem PBS beschichtet (3 µg Primärantikörper/ml PBS;
   100 µl/Well) und über Nacht in Frischhaltefolie eingewickelt und für mindestens 8 h bei
   4 ºC im Kühlschrank inkubiert.

Tag 2:

1. Die mit Antikörpern beschichtete Platte wurde dreimal mit einer 12-Kanal-Pipette mit
   200 µl PBS/Well gewaschen und auf trockenen Papiertüchern ausgeklopft. Anschließend wurde die Platte für 1-4 h bei Raumtemperatur mit „Blocking Solution“ (PBS-BSA,
   200 µl/Well) mit Hilfe einer Mehrkanal-Pipette „geblockt“.
2. Die PBMZ der zu untersuchenden Person aus dem Brutschrank wurden auf 3*106/ml Kulturmedium eingestellt.
3. Die Spendermilzzellen/-PBMZ wurden in 50 ml Röhrchen aufgetaut und anschließend im Blutbestrahlungsgerät mit 30 Gray bestrahlt***. Dabei zeigte sich, dass eine Bestrahlung auf Eis eine ungewollte IFNγ-Produktion vermindert. Danach wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen (beim ersten Mal auf 50 ml mit PBS aufgefüllt, beim zweiten mal mit 50 ml PBS) und für jeweils 10 min bei 200 g zentrifugiert. Der Überstand wurde mit einer Pipette abgenommen und verworfen. Die Zellen wurden in Kulturmedium aufgenommen, resuspendiert und auf 3*10⁶/ml eingestellt.
4. Nach dem Blocken wurde die Platte dreimal mit 200 µl PBS/Well gewaschen und auf trockenen Papiertüchern ausgeklopft.

Die Stimulationsansätze auf der Platte wurden immer als Doppelansatz geführt mit einem Gesamtvolumen von 200 µl/Well. Es wurden pro untersuchter Person und Untersuchungstag:

• eine Negativkontrolle der Responderzellen (zwei Wells mit je 100 µl Kulturmedium plus 100 µl PBM-Zellsuspension; Gesamtzellkonzentration: 3*10⁵/Well),
• eine Negativkontrolle der Stimulatorzellen (zwei Wells mit je 100 µl Kulturmedium plus 100 µl Spendermilzzellsuspension; Gesamtzellkonzentration: 3*10⁵/Well),

• eine Positivkontrolle der Responderzellen (zwei Wells mit je 100 µl PHA-Lösung einer Konzentration von 20 µg PHA/ml plus 100 µl PBM-Zellsuspension; Gesamtzellkonzentration: 3*10⁵/Well; Gesamt-PHA-Konzentration:10 µg/ml)
• ein Stimulationsansatz der Responder- und Stimulatorzellen im Verhältnis 1:1 (zwei Wells mit je 100 µl PBM-Zellsuspension plus 100 µl Spendermilzzellsuspension; Gesamtzellkonzentration: 6*10⁵/Well)

angesetzt. Dabei wurden die Ansätze pro Well jeweils mit einer neuen, sterilen Pipettenspitze vorsichtig durchmischt um später eine möglichst gleichmäßige Verteilung der Zellen auf dem Boden des Wells zu erzielen.

5. Die Platte wurde nun mit Frischhaltefolie umwickelt und im Brutschrank bei 37 °C und
5 % CO2 inkubiert. Die Inkubationszeit lag beim IFNγ-ELISpot-Assay bei 24 h.

Tag 3:

1. Die Platte wurde aus dem Brutschrank genommen, ausgeklopft und dreimal mit einer 12-Kanal-Pipette mit 200 µl PBS/Well gewaschen, wieder auf trockenem Papier ausgeklopft und dreimal mit 200 µl PBS-Tween/Well (Washing Solution) erneut gewaschen.
2. Vor dem letzten Ausklopfen ließ man das PBS-Tween bei Raumtemperatur für 10 min einwirken.
3. 100 µl biotinylierter IFNγ-Sekundärantikörper/Well wurden in einer Konzentration von
   2 µg/ml PBS mit einer Mehrkanal-Pipette hinzugegeben.
4. Die Platte wurde über Nacht, jedoch mindestens 4 h, im Kühlschrank bei 4 °C in Frischhaltefolie eingewickelt inkubiert.

Tag 4:

1. Die Platte wurde aus dem Kühlschrank genommen, ausgeklopft und viermal mit 200 µl PBS-Tween/Well gewaschen und auf trockenem Papier ausgeklopft.
2. 100 µl Streptavidin/Well wurden in einer 1:2000 fachen Verdünnung in PBS-BSA-Tween hinzugegeben und für 2-4 h bei Raumtemperatur inkubiert.
3. Anschließend wurde die Platte je dreimal mit 200 µl/Well PBS-Tween und PBS gewaschen und ausgeklopft.

1. In jedes Well der Platte kamen 200 µl „Visualisierungslösung“. Sie musste stets frisch kurz zuvor aus AEC-Lösung und AEC-Puffer zubereitet werden: AEC-Lösung und AEC-puffer wurden im Verhältnis 1:30 vermischt, durch einen 0,45 µm-Filter gegeben. Ein 2000stel des AEC-Puffervolumens H₂O₂ wurde hinzugefügt.

Unter Einwirkung des AECs entwickelten sich in den Wells rosafarbene Punkte (Spots) an den Stellen, an denen sich zuvor eine IFNγ-produzierende Zelle befand. Die Entwicklung dauerte
1-5 min. Bevor sich der Hintergrund des Wells ebenfalls rosa färbte, wurde die Reaktion durch Spülung mit Aqua dest. gestoppt.

Die Unterseite der Platte wurde entfernt, damit die Bodenmembran der Wells an der Luft trocknen konnte. Anschließend wurde die Platte mit Hilfe des BIOreaders ausgewertet, der die Punkte (Spots) pro Well zählte. Aus jedem Doppelansatz wurde der Mittelwert errechnet.

***Nur für methodische Untersuchungen wurden PBMZ von Probanden oder Spendermilzzellen vor Stimulationsbeginn wie folgt behandelt:

• Es folgte keine Behandlung.
• Die Zellen wurden mit 30 Gray bestrahlt und anschließend zweimal in PBS gewaschen.
• Die Zellen wurden für 30 min, 60 min, 90 min, 120 min oder 24 h mit 1000 ng/ml Ciclosporin im Brutschrank inkubiert und anschließend zweimal in PBS gewaschen.
• Die Zellen wurden für 2 h mit 200 ng/ml Tacrolimus im Brutschrank inkubiert und anschließend zweimal in PBS gewaschen.
• CD2-positive Leukozyten wurden mittels MACS (Magnetic Cell Sorting) aus dem Stimulatorzellgemisch entfernt (CD2-depletiert).
• Die Zellen wurden CD2 depletiert, mit 30 Gray bestrahlt und anschließend zweimal in PBS gewaschen.

Um den Einfluss dieser Maßnahmen auf die IFNγ-Sekretion der Zellen zu überprüfen, wurden sie mit 1 µg/Well pp65-Gesamtpeptidmischung, 10 µg/Well PHA oder ebenso behandelten Leukozyten anderer Probanden stimuliert. Näheres Abschnitt 6.5.

Prinzip: Zellen mit bestimmtem Oberflächenmolekülen können durch dafür spezifische magnetische Antikörper markiert werden. Nur diese markierten Zellen werden dann in einer aus Eisenkügelchen bestehenden Säule in einem Magnetfeld festgehalten, während alle Zellen ohne diese entsprechenden Oberflächenmoleküle mit Hilfe eines Fließmediums (MACS-Puffer, PBS) ungehindert hindurchgelangen. CD2 ist ein Oberflächenmolekül, welches sich auf T-Lymphozyten, Thymozyten und Natürlichen Killerzellen befindet. Durch die Depletion CD2^pos Leukozyten können alle IFN-produzierenden Zellen aus einem Leukozytengemisch entfernt werden.

Durchführung:

1. Die frisch präparierten mononukleären Zellen wurden gezählt, mit PBS gewaschen, für 10 min bei 200 g zentrifugiert und der Überstand vollständig abgenommen und verworfen.
2. Das Pellet wurde in einem Gesamtvolumen von 40 µl MACS-Puffer/10⁷ Zellen resuspendiert und mit 10 µl CD2-Hapten-Antikörper (Miltenyi) pro 10⁷ Zellen für 15 min bei 4 °C im Kühlschrank inkubiert.
3. Danach wurden 30 µl MACS-Puffer/10⁷ Zellen und 20 µl Anti-Hapten-MicroBeads-FITC/10⁷ Zellen hinzugefügt, gut durchgemischt (Schüttler) und die Zellen für 20 min bei 4 ºC im Kühlschrank inkubiert.
4. Ab jetzt musste möglichst schnell und kühl/auf Eis gearbeitet werden, um eine erneute unspezifische Bindung der Antikörper zu verhindern.
5. Die Zellen wurden mit dem 20-fachen Färbevolumen MACS-Puffer gewaschen, bei 300 g für 10 min bei 4 ºC in der Kühlzentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und verworfen, das Zellpellet in 500 µl kaltem MACS-Puffer pro 10⁸ Zellen resuspendiert.
6. Der MidiMACS-Magnet wurde an dem Magnetständer befestigt, eine LD-MACS-Säule für Zelldepletion wurde in den Magneten gehängt und mit 2 ml MACS-Puffer gespült (dabei sollte der Puffer nur durchtropfen, nicht durchgedrückt werden).
7. Die Zellsuspension wurde mit einer Pipette durch einen Prä-Separationsfilter auf die Säule gedrückt, durch die sie tropfenweise durchlief und unterhalb der Säule in einem Röhrchen als CD2-Negativfraktion aufgefangen wurde. Anschließend wurde die Säule mit 3 ml MACS-Puffer gespült, der ebenfalls als Negativfraktion aufgefangen wurde.
8. Die Negativfraktion wurde in PBS gewaschen und in Kulturmedium aufgenommen. Die Reinheit konnte durchflusszytometrisch kontrolliert werden.

Prinzip: Die Durchflusszytometrie ermöglicht die Charakterisierung von Zellen anhand spezifischer Antigene, die durch die Markierung mit fluoreszierenden Antikörpern erfasst werden können. Die zu messenden Zellen werden in den Strahlengang eines Lasers gebracht. Haben Zellen mit den zu untersuchenden Antigenen den Antikörper gebunden, so absorbiert der Fluoreszenzfarbstoff die Energie des Lasers und emittiert ein Licht mit der für den Farbstoff spezifischen Wellenlänge, welches gemessen wird. Gleichzeitig erfährt der Laserstrahl durch Größe und Granularität der Zelle eine charakteristische Streuung, deren Erfassung Informationen über diese Eigenschaften liefert. Zur Messung des Anteils der T-Zellen wurden die Oberflächenantigene CD45 und CD3 mit Hilfe der Farbstoffe Peridinin Chlorophyll-Protein (PerCP) und Allophycocyanin (APC) markiert. Da CD45 auf allen Leukozyten und CD3 nur auf T-Zellen exprimiert wird, konnten somit Leukozyten von Verunreinigungen getrennt und der prozentuale Anteil der T-Zellen bestimmt werden.

Durchführung:

1. Zu 50 µl PBMZ-Suspension einer Konzentration von 3*10⁶ Zellen/ml Medium wurden 10 µl eines Antikörpergemisches aus CD3-APC und CD45-PerCP im Verhältnis 3:1 hinzugegeben und gut mit dem Schüttler vermischt.
2. Anschließend wurden die Zellen für 20 min bei 4 ºC inkubiert.
3. Danach erfolgte ein Waschgang mit 1 ml FACS-Puffer.
4. Nach einer Zentrifugation bei 200 g für 5 min wurde der Überstand bis auf wenige µl abgesaugt, in denen das Zellpellet mit Hilfe des Schüttlers resuspendiert wurde.
5. Die Messung der Zellen erfolgte kurz darauf mit dem FACSCalibur-Durchflusszytometer, die Auswertung mit CellQuest.
6. Der verbliebene Anteil T-Zellen in CD2-depletierten PBMZ bzw. Splenozyten konnte ebenfalls über die beschriebene Färbung mit CD3-Antikörpern bestimmt werden. Auf der anderen Seite konnte die Reinheit bezüglich der Depletion auch direkt aus der MACS-Negativfraktion kontrolliert werden, da die magnetischen CD2-Antikörper zusätzlich mit dem fluoreszierenden Farbstoff Fluoreszein Isothiocyanat (FITC) markiert waren.

HLA-Typisierung : HLA-Antigene HLA-A, HLA-B und HLA-DR der Spender und Empfänger wurden mittels Standard-Lymphozytentoxizitätstests und PCR-SSP und/oder PCR-SSO durch das Institut für Transfusionsmedizin der Charité Campus Virchow identifiziert.

Bestimmung panelreaktiver Antikörper :Ein Screening zur Bestimmung von panelreaktiven Antikörpern (PRA) wurde mithilfe eines komplementabhängigen Zytotoxizitätstest bei Patienten auf der Warteliste für eine Nierentransplantation routinemäßig alle drei Monate durch das Institut für Transfusionsmedizin der Charité Campus Virchow durchgeführt. Daraus ergaben sich die historisch maximal gemessenen Werte für PRA max. Eine Bestimmung der panelreaktiven Antikörper kurz vor der Transplantation ergab die aktuellen Werte PRA akt.

Diagnose der akuten Rejektion :Eine akute Rejektion des Nierentransplantates wurde durch die histologische Beurteilung eines Transplantatbiopsates nach den Kriterien der Banff-Klassifikation von 1997 durch die Pathologie der Charité gesichert. Eine erfolgreiche, dass heißt kreatininsenkende Rejektionstherapie durch einen Kortikosteroidbolus (3*500 mg Methylprednisolon) zu einem Zeitpunkt, zu dem aus klinischen Gründen keine Biopsie möglich war, wurde ebenfalls als Beweis für eine akute Rejektion angesehen.

Bestimmung der Nierenfunktion :Die glomeruläre Filtrationsrate (GFR in ml/min/1,73m²) wurde für sechs und 12 Monate nach Transplantation nach der MDRD-Formel berechnet [96].

GFR =
(Albumin (g/dl) ^0,318 *1,180 (falls schwarze Hautfarbe) * 0,762 (falls weiblich))/
(170 * Serumkreatinin (mg/dl)^0,999 * Alter (Jahre)^0,176 * (Serumharnstoff (mg/dl) *0,467) ^0,170

Die Daten wurden statistisch mit Hilfe von SPSS 11.5 für Windows ausgewertet. Da bei den Datensätzen nicht von einer Normalverteilung ausgegangen und durch die üblichen Tests (Kolmogorov-Smirnov, Shapiro-Wilk) auch meist ausgeschlossen werden konnte, wurden alle statistischen Analysen mit parameterfreien, das heißt rangbasierten Tests durchgeführt. Für Vergleiche zwischen zwei Gruppen wurde der Mann-Whitney-U Test verwendet, zwischen mehreren Gruppen der Kruska-Wallis-Test. Zusammenhänge zwischen zwei Parametern wurden auf Korrelationen nach Spearman-Rho untersucht.