Materialien

▼ 39 (fortgesetzt)

5.1.1  Patienten und Probanden

Von den 52 Patienten erhielten 44 Patienten eine Kadaverspende, wovon 32 mit einer immunsuppressiven Therapie bestehend aus anti-IL2R-mAk (Basiliximab), Calcineurininhibitor (Tacrolimus n = 31, Ciclosporin A n = 1), Mycophenolat Mofetil (MMF) und Methylprednisolon (MP), drei mit Tacrolimus, dem Leflunomidanalogon FK778 und MP (wobei nach drei Monaten FK 778 gegen MMF ersetzt wurde) und sieben der Patienten mit FTY720, Ciclosporin A und MP behandelt wurden. Zwei der Patienten, die eine Kadaverspende erhielten, waren durch frühere Transplantationen mit einem rejektionsassoziierten frühen Organverlust sensibilisiert und erhielten eine spezielle Induktionstherapie bestehend aus einer Niedrigdosis OKT3, anti-TNF-mAk (Etanercept) und anti-CD20-mAk (Rituximab) perioperativ sowie fünf Plasmapheresen postoperativ. Danach wurde auf konventionelle Immunsuppression mit Tacrolimus und MP umgestiegen. Acht Patienten erhielten ein Transplantat von einem Lebendspender und wurden mit anti-IL2R-mAk (Basiliximab), Ciclosporin A, MMF und MP behandelt. Ein Patient der Studie war Asiat, alle anderen Kaukasier. Weitere wichtige Charakteristika der untersuchten Patientengruppe sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

Tabelle 1 Charakterisrika der untersuchten Patienten, n = 52

5.1.2 Verbrauchsmaterialien und wiederverwendbare Materialien

▼ 40 

10 ml Zitratmonovetten

SARSTEDT, Nümbrecht, Deutschland

14 ml „Cellstar“ Polypropylenröhrchen

Greiner GmbH, Frickenhausen, Deutschland

2070 FALCON-Röhrchen (50 ml)

Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland

2052 FALCON-Röhrchen (15 ml)

Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland

FALCON-Glaspipetten, steril (2-25 ml)

Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland

Sterile Transferpipetten

SARSTEDT, Nümbrecht, Deutschland

Sterile Pipettenspitzen (100 μl, 1000 μl)

SARSTEDT, Nümbrecht, Deutschland

Sterile Pipettenspitzen (20 µl)

Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland

Eppendorfgefäße (0,5-2 ml)

Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland

Zellkulturflaschen (50 ml, 100 ml)

Greiner GmbH, Frickenhausen, Deutschland

Sterile Filtersysteme (500 ml)

Corning Incorporated, Corning, N.Y.,USA

FALCON-Zellkulturschalen

Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland

FALCON-„Cellstrainer“ (100 µm mesh)

Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland

Einmalspritzen, steril (10 ml)

Braun, Melsungen ,Deutschland

Einmal-Skalpelle

Becton Dickinson, N.Y.,USA

Objektträger

Menzel-Gläser A1, Essex, England

Prä-Separations Filter

Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach,Deutschland.

LD-MACS-Zellseparationssäulen

Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland

FALCON 96-Well-Mikrotestplatten

Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland

Tieffrierröhrchen (1,8 ml)

Nunc Inter Med, Roskilde, Dänemark

96-Well-Multiscreen Mikrotitierplatten
Prod. Name MAIPS 4510

Millipore Corporation, Bedford, USA

Pipetten (10-1000 µl)

Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland

12-Kanal-Pipetten (30-300 µl)

Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland

Röhrchenständer

Neolab, Heidelberg, Deutschland

Neubauer-Zählkammer

Feinoptik, Bad Blankenburg, Deutschland

MACS-MultiStand

Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland

MidiMACS, Magnet

Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland

5100 Cryo 1 °C Freezing Container

Nalge Nunc International, Rochester, USA

5.1.3 Geräte

FACSCalibur-Durchflusszytometer

Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland

Zentrifuge Centrifuge 5810

Eppendorf, Hamburg, Deutschland

Kühlzentrifuge,CR4 22

Jouan, Saint Nazaire, Frankreich H GmbH,

Schüttler,Vortex-Genie2

Scientific Industries, INC, Bohemia, USA

Absaugpumpe Laboport

Neuberger, Freiburg, Deutschland

Pipettierhilfe Pipetus R Standard

Labinstruments GmbH, Crailsheim,Deutschland

Brutschrank EG 110 R

Jouan, Saint Nazaire, Frankreich

Lichtmikroskop

Olympus, Tokio, Japan

Tiefkühltruhe BT 02 (2722)

COTECH GmbH, Berlin, Deutschland

BIOreader R 3000C

BioSys GmbH, Leverkusen, Deutschland

Wannenbad

Grant Instruments, Cambridge, UK

Laminar-Flow-Box

Kendo, Hanau, Deutschland

Blutbestrahlungsgerät IBL-437C

CIS biointernational, Gif-Sur-Yvette,Frankreich

5.1.4 Puffer, Lösungen, Zellkulturmedien

phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)

DULBECCO´s, GIBCO, Großbritannien

▼ 41 

Kulturmedium

1640 RPMI-Medium (500 ml)

Biochrom KG, Berlin, Deutschland

+50 ml Fetales Kälberserum
hitzeinaktiviert, 30 min Wasserbad 57 °C

Biochrom KG, Berlin, Deutschland

+2 mM L-Glutamin

Biochrom KG,Berlin, Deutschland

+100 I.E. Penicillin/ Streptavidin

Invitrogen, Karlsruhe, Deutschlan

♢Nach dem Mischen wurde steril gefiltert.

▼ 42 

„Blocking Solution“ PBS-BSA

500 ml phosphatgepuff. Kochsalzlösung

DULBECCO´s, GIBCO, Großbritannien

+5 g Bovines Serum Albumin

SERVA, Heidelberg, Deutschland

♢Nach dem Mischen wurde steril gefiltert.

▼ 43 

„Washing Solution“ PBS-Tween

500 ml phosphatgepuff. Kochsalzlösung

DULBECCO´s, GIBCO, Großbritannien

+250 µl Tween 20
Polyoxyethylen-Sorbitanmonolaureat

SERVA, Heidelberg, Deutschland

PBS-Tween-BSA

▼ 44 

500 ml phosphatgepuff. Kochsalzlösung

DULBECCO´s, GIBCO, Großbritannien

+5 g Bovines Serum Albumin

SERVA, Heidelberg, Deutschland

+250 μl Tween 20
Polyoxyethylene-Sorbitanmonolaureat

SERVA, Heidelberg, Deutschland

Tieffriermedium

50 ml Fetales Kälberserum
hitzeinaktiviert, 30 min Wasserbad 57°C

Biochrom KG, Berlin, Deutschland

+10 % Dimethylsulfoxid (DMSO)

SIGMA, Steinheim, Deutschland

5.1.5 MACS-Puffer

▼ 45 

♢ Vor der Verwendung musste der MACS-Puffer entgast werden.

500 ml phosphatgepuff. Kochsalzlösung

DULBECCO´s, GIBCO, Großbritannien

+0,5 % Bovines Serum Albumin

SERVA, Heidelberg, Deutschland

+2 mM EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure

SIGMA, Steinheim, Deutschland

FACS-Puffer

▼ 46 

500 ml phosphatgepuff. Kochsalzlösung

DULBECCO´s, GIBCO, Großbritannien

+0,5 % Bovines Serum Albumin

SERVA, Heidelberg, Deutschland

+0,1 % Natriumazid (NaN3)

SERVA, Heidelberg, Deutschland

AEC-Lösung

100 mg AEC (3-Amino-9-Ethyl-Carbazol)

SIGMA, Steinheim, Deutschland

in 10 ml DMF (N,N Dimethylformamid)

Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland

▼ 47 

AEC-Puffer

148 ml 0,2 M Essigsäure

Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland

+352 ml 0,2 M Natrium-Azetatlösung
Trihydrate ACS Reagent [613-90-4]

SIGMA, Steinheim, Deutschland

+500 ml Aqua dest.

Braun, Melsungen, Deutschland

♢Der pH-Wert wurde auf 5 eingestellt.

▼ 48 

weitere Chemikalien

Ficoll-PaqueTM PLUS

Amersham Bioscience, Uppsala, Sweden

Rotipuran ® 2-Propanol

Carl Roth GmbH&Co, Karlsruhe, Deutschland

Biotin

Endogen, Illinois, USA

Streptavidin HRP

Dako, Glostrup, Dänemark

Trypanblau 1 %

Fluka Chemie, Buchs, Deutschland

Essigsäure (Eisessig)

Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland

H2O230 %

SIGMA, Steinheim, Deutschland

Ethanol 70 %

Merck, Darmstadt, Deutschland

Sandimmun ®(Optoral) Lösung 1 ml
Ciclosporin

Novartis Pharma GmbH, Nürnberg, Deutschland

Prograf ® (tacrolimus injection) 1 ml

Fujisawa GmbH, München, Deutschland

5.1.6 Zellstimulantien undAntikörperkonjugate

Phytohemagglutinin (PHA)

SIGMA, Steinheim, Deutschland

CMV-pp65-Gesamtpeptidmischung
Swiss.Prot accession Nr. P0672515-AS-Peptide (11 Überlappungen)

Jerini Biotools, Berlin, Deutschland

IFNγ-Primärantikörper

Endogen, Illinois, USA

IFNγ-Sekundärantikörper

Endogen, Illinois, USA

Anti-CD2 MicroBeads

Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach,
Deutschland

Anti-CD3-APC

Becton Dickinson, San Jose, USA

Anti-CD45-PerCP

Becton Dickinson, San Jose, USA

5.1.7 Verwendete Software

▼ 49 

SPSS 11.5 für Windows

SPSS Inc., Chicago, USA

MS Office 2003

Microsoft Corp.; Redmont, USA

CellQuest Pro

Becton Dickinson, San Jose, USA


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13.07.2007