6 Ergebnisse

▼ 49 (fortgesetzt)

In der Theorie stammen die IFNγ-Spots im ELISpot-Assay von spenderspezifischen T-Zellen des Transplantatempfängers, die durch Spenderleukozyten stimuliert wurden. Da jedoch keine weiteren Zytokinmuster oder Oberflächeneigenschaften der sezernierenden Zellen bekannt sind, ist nicht 100 % sicher, dass die Spots tatsächlich von T-Zellen stammen, da theoretisch auch andere Zellen, vorrangig NK-Lymphozyten, IFNγ sezernieren können. Auch die Spezifität der IFNγ-produzierenden Zellen bezüglich des Spenders nicht zu beweisen, da unspezifische Zellen durch die Bildung großer Mengen Zytokine durch benachbarte, spezifische T-Zellen ebenfalls aktiviert werden und IFNγ produzieren könnten (sog. „Byständer“-Effekt). Im Nachfolgenden wird daher statt „spenderspezifische T-Zellen“ nur der Begriff der „spenderreaktiven Zellen“ verwendet. Die Anzahl der spenderreaktiven, IFNγ-produzierenden Zellen bezieht sich immer auf 3*105 PBMZ, die vom Patienten zum entsprechenden Messzeitpunkt präpariert und im Assay stimuliert wurden. Sie entspricht der Anzahl der Spots/Well. Einen Überblick über die Anzahl und Höhe der ermittelten Werte gibt Tabelle 2.

Tabelle 2 Extremwerte und Mediane der zu den verschiedenen Messzeitpunkten ermittelten Werte für spenderreaktive, IFNγ-produzierende Zellen aller 52 Patienten der Studie ,Spots/3*105 PBMZ

▼ 50 

Bei 14 Patienten konnten weder vor noch zu irgendeinem Zeitpunkt nach Transplantation spenderreaktive, IFNγ-produzierende Zellen im venösen Blut gemessen werden, bei neun Patienten nahm die hohe Anzahl vor Transplantation unter Immunsuppression ab. Bei weitern neun Patienten stieg die Zahl der messbaren spenderreaktiven, IFNγ-produzierenden Zellen nach Transplantation auf Werte, die höher waren als vor Transplantation, bei 14 Patienten waren die Zellen erstmalig nach Transplantation nachweisbar. Bei 38 der 52 Patienten konnten post-Tx maximal über 10 IFNγ-Spots, bei 25 Patienten über 40 IFNγ-Spots und bei zehn Patienten über 100 IFNγ-Spots gezählt werden.

Zweimal kam es vor, dass sehr viele die Spots zu einer roten Fläche konfluierten, so dass die Kamera diese nicht mehr vollständig diskriminieren konnte. In die Auswertung gingen diese Werte mit durch Messerfahrung geschätzten 1000 Spots ein. Waren die Spots ungleichmäßig nur auf einer Hälfte des Well konfluiert, so wurde der Wert auf 600 geschätzt. Letzteres spielte aber nur für die methodischen Optimierungsversuche eine Rolle und werden in Diagrammen mit einem Pfeil nach oben gekennzeichnet.

Bei der Messung ergaben sich zwei Probleme:

▼ 51 

Die Bestrahlung der Spenderleukozyten mit 30 Gray konnte deren IFNγ-Sekretion nicht vollständig unterdrücken. Im Gegenteil, sie schien sogar eine spontane IFNγ-Sekretion der Spenderleukozyten zu begünstigen. Das führte mitunter zu hohen Messwerten für IFNγ-produzierende unstimulierte Spenderleukozyten (Stimulatorzellenleerwerte). Da ein Doppelansatz für solche zufälligen Fehler nicht ausreicht, ergab sich nach Abzug des Leerwerts vom Messwert teilweise eine negative Anzahl IFNγ-produzierenderZellen des Empfängers. Dies konnte jedoch im Laufe der Studie durch die Lagerung der Zellen auf Eis während der Bestrahlung vermindert werden. Obwohl solche negativen Werte biologisch nicht begründbar sind, wurden sie dennoch vollständig in der Auswertung berücksichtigt, da der Fehler zufällig und eine statistische Auswertung trotzdem möglich war.

Die ungenügende Deaktivierung der Spenderleukozyten führte zweitens dazu, dass Patienten, die mit OKT3 behandelt wurden, besonders hohe Werte für IFNγ-produzierende Zellen aufwiesen. OKT3 aktiviert T-Zellen unspezifisch, wodurch sie IFNγ bilden können. Allerdings schienen in diesen Fällen nicht die Patienten-PBMZ selbst IFNγ zu bilden, da eine spontane Bildung von IFNγ in den Leerwerten der Patienten-PBMZ nicht zu beobachten war und auch nicht nach Stimulation der Patienten-PBMZ mit PHA, sondern die Spenderleukozyten. Diese wurden möglicherweise durch unspezifisch an Patientenleukozyten gebundenes OKT3 aktiviert. Die Werte, die zum Zeitpunkt der Verabreichung von OKT3 bzw. einige Tage danach gemessen wurden, konnten somit nicht in die Analyse mit einbezogen werden.

Diese beiden Probleme motivierten zu dem Versuch, neben der Patientenstudie das ELISpot-Assay zu optimieren und die IFNγ-Sekretion der Spenderleukozyten zu unterbinden.

6.1  Einige Patientenbeispiele im Verlauf

6.1.1  Patienten ohne Nachweis spenderreaktiver, IFNγ-produzierender Zellen

▼ 52 

Bei 14 Patienten konnten zu keinem Zeitpunkt weder vor noch nach der Nierentransplantation spenderreaktive, IFNγ-produzierende Zellen gemessen werden (zu jedem Messzeitpunkt < 10 IFNγ-Spots). In Abbildung 4 sind drei dieser Patienten exemplarisch dargestellt. Während der ersten drei Monate nach Transplantation lagen bei diesen Patienten die Serumkreatininwerte im Normbereich unter 1 mg/dl. Bei keinem der drei Patienten konnte eine frühe akute Rejektionsepisode beobachtet werden. Die Nierenfunktion dieser Patienten war ein Jahr post-Tx mit einer GFR von über 69 ml/min/1,73m2 und einem Serumkreatininwert von unter 1 mg/dl jeweils sehr gut. Die Patienten hatten eine Kadaverspende erhalten und wurden mit Basiliximab, Tacrolimus und Steroiden immunsuppressiv behandelt.

6.1.2 Patienten mit spenderreaktiven Zellen prä-Tx

Alle Patienten mit > 200 IFNγ-Spots/3*105 PBMZ vor Transplantation erlitten eine frühe akute Rejektion. Die fünf betroffenen Patienten erhielten eine Kadaverspende und wurden mit Basiliximab, Tacrolimus und Kortikosteroiden immunsuppressiv behandelt - mit Ausnahme von Patient 5, der zunächst mit FTY720, Ciclosporin A und Steroiden therapiert, sechs Wochen nach Transplantation auf Tacrolimus und MMF umgestellt wurde.

In Abbildung 5 ist der Verlauf der Messwerte für drei der Patienten mit > 200 Spots vor Transplantation dargestellt. Diese drei Patienten erlitten eine schwere akute Rejektionsepisode innerhalb der ersten Woche, die in einem Fall zum Verlust der Organfunktion (Patient 5) und in den anderen Fällen zu einer deutlich eingeschränkten Nierenfunktion ein Jahr nach Transplantation führte (GFR: 33,7 ml/min/1,73m2 bzw. 37,5 ml/min/1,73m2). Die beiden letztgenannten Patienten wiesen interessanterweise zu einem Zeitpunkt vor der Transplantation PRA > 40 % auf. Zwei der akuten Rejektionen wurden mit OKT3 behandelt. Die Serumkreatininwerte der Patienten 4 und 5 lagen in den ersten drei Monaten post-Tx überwiegend weit über dem Normbereich. Bei Patient 6 fiel der Serumkreatininwert vorübergehend in den Normbereich ab.

▼ 53 

In Abbildung 6 kann man die Messwerte der anderen beiden Patienten mit > 200 IFNγ-Spots vor Transplantation verfolgen. Sie erlebten zwar ebenfalls akute Rejektionen (Patient 8 sogar zwei), die jedoch zu einem späteren Zeitpunkt auftraten (Monat 6 bzw. Woche 6 und Monat 4 post-Tx) und mit Kortikosteroiden beherrschbar waren. Das Serumkreatinin lag dabei in den ersten drei Monaten post-Tx über dem Normbereich. Die Nierenfunktion dieser zwei Patienten war nach einem Jahr post-Tx jedoch deutlich besser als die der anderen drei Patienten (GFR: 58 ml/min/1,73m2 bzw. 63,5 ml/min/1,73m2).

Abbildung 4 Patienten ohne Nachweis spenderreaktiver Zellen vor und nach Nierentransplantation. Die dargestellten Patienten blieben rejektionsfrei und wiesen innerhalb des Messzeitraums Serumkreatininwerte im Normbereich sowie eine gute Nierenfunktion ein Jahr nach Transplantation auf. ELISpot-Messwerte liegen nur zu den beschrifteten Zeitpunkten vor.

Abbildung 5 Patienten mit spenderreaktiven, IFNγ-produzierenden Zellen vor der Nierentransplantation. Die dargestellten Patienten erlitten eine schwere akute Rejektion innerhalb der ersten Woche post-Tx. Während des Messzeitraums lagen die Serumkreatininwerte überwiegend über dem Normbereich. Die Nierenfunktion war ein Jahr nach Transplantation stark eingeschränkt. ELISpot-Messwerte liegen nur zu den beschrifteten Zeitpunkten vor. Unter OKT3-Behandlung sind diese grün abgebildet

▼ 54 

Abbildung 6 Patienten mit spenderreaktiven, IFNγ-produzierenden Zellen vor Ttransplantation (2). Die dargestellten Patienten erlitten min. eine akute Rejektion. Bei Patient 8 wurde direkt vor Rejektionsverdacht ein hoher Wert für spenderreaktive Zellen gemessen (70 IFNγ-Spots). Während des Messzeitraums lagen die Serumkreatininwerte über dem Normbereich. Die Nierenfunktion war ein Jahr nach Transplantation jedoch überdurchschnittlich. ELISpot-Messwerte liegen nur zu beschrifteten Zeitpunkten vor.

6.1.3 Patienten mit spenderreaktiven Zellen post-Tx

Bei sieben Patienten, die eine frühe akute Rejektion ihres Organs erlebten, konnte erst nach der Transplantation ein Anstieg der spenderreaktiven, IFNγ-produzierenden Zellen beobachtet werden, bei fünf von diesen auf Werte von > 40 IFNγ-Spots. Der Verlauf drei dieser Patienten ist in Abbildung 7 beispielhaft dargestellt. Diese drei Patienten wiesen während der ersten drei Monate post-Tx überwiegend stark erhöhtes Serumkreatinin auf. Patient 10 und Patient 11 hatten direkt vor einer rejektionsbeweisenden Biopsie einen Anstieg der Anzahl der IFNγ-Spots. Direkt vor der ersten akuten Rejektion für Patient 11 wurde kein ELISpot-Messwert ermittelt. Bei Patient 9, bei dem zu dem Zeitpunkt, an dem die Zahl der IFNγ-produzierenden Zellen zumindest leicht anstieg, aus klinischen Gründen keine Biopsie möglich war, verbesserte die explorative Gabe hochdosierter Kortikosteroide die Nierenfunktion, was auf eine stattgehabte akute Rejektion hindeutet. Ein Jahr nach Transplantation war die Nierenfunktion der drei Patienten jedoch höchst unterschiedlich zwischen 17,5 ml/min/1,73m2 und 58,5 ml/min/1,73m2, wobei das Transplantat von Patient 11 zusätzlich einen toxischen Tubulusepithelschaden aufwies. Alle drei Patienten hatten eine Kadaverspende erhalten und wurden mit Basiliximab, Tacrolimus und Steroiden immunsuppressiv behandelt.

Bei 15 Patienten, bei denen zu einem oder mehreren Zeitpunkten nach Transplantation eine hohe Anzahl von IFNγ-produzierenden Zellen (> 40 IFNγ-Spots) gemessen wurde, konnte keine frühe akute Rejektion nachgewiesen werden. In Abbildung 8 wird der Verlauf der Messwerte von vier dieser Patienten exemplarisch verdeutlicht. Trotz fehlenden Nachweises schädigender Einflüsse wie Toxizität von Immunsuppressiva, Hochdruckschäden, Harnstauung oder Entzündungen des Transplantats waren die Kreatininwerte bei diesen vier Patienten innerhalb der ersten drei Monate nach Transplantation überwiegend über den Normbereich erhöht und die Nierenfunktion war ein Jahr post-Tx mit einer GFR von jeweils unter 44 ml/min/1,73m2 bei allen vier Patienten eingeschränkt. Die Patienten hatten eine Kadaverspende erhalten und wurden mit Basiliximab, Tacrolimus und Steroiden immunsuppressiv behandelt.

6.1.4 Patienten, die eine OKT3-Induktionstherapie erhielten

▼ 55 

Zwei Patienten erhielten als immunsuppressive Therapie ein spezielles Induktionsschema. Dabei wurde unter anderem OKT3 perioperativ als Bolus (bei Patient 16 auch am Tag 4 nach Transplantation) gegeben. Ziel dieser Therapie ist eine Induktion von AICD ( activation induced cell death) der Gedächtniszellen. OKT3 bindet an das CD3-Molekül von T-Zellen und führt zu ihrer Aktivierung und zur Sekretion von IFNγ. Da diese IFNγ-Sekretion alloantigenunabhängig ist, konnten die gemessenen Werte für den Zeitraum der Behandlung mit OKT3 sowie einige Tage danach nicht in die Analyse miteinbezogen werden. Bei beiden Patienten wurde zu einem späteren Zeitpunkt nach Transplantation eine erhöhte Anzahl von IFNγ-produzierenden Zellen nachgewiesen (Patient 16: Woche 8 und Woche 11; Patient 17: Woche 4, Woche 8 und Monat 7 - letzteres nicht dargestellt). Trotzdem sank das Serumkreatinin nach Transplantation dauerhaft auf Normwerte und keiner der beiden Patienten erlitt eine frühe akute Rejektionsepisode. Beide hatten ein Jahr nach Transplantation eine gute Nierenfunktion (GFR: 72,7 ml/min/1,73m2 bzw. 109,17 ml/min/1,73m2) [Abbildung 9].

Abbildung 7 Patienten mit spenderreaktiven, IFNγ-produzierenden Zellen nach der Nierentransplantation. Die dargestellten Patienten erlitten mindestens eine frühe akute Rejektion. Teilweise konnte direkt nach dem Anstieg der Werte für spenderreaktive, IFNγ-produzierende Zellen die Diagnose einer akuten Rejektion gestellt werden. Während des Messzeitraums lagen die Serumkreatininwerte über dem Normbereich. Die Nierenfunktion war ein Jahr nach Transplantation teilweise stark eingeschränkt. ELISpot-Messwerte liegen nur zu den beschrifteten Zeitpunkten vor.

Abbildung 8 Patienten mit spenderreaktiven, IFNγ-produzierenden Zellen nach Transplantation (2). Bei den dargestellten Patienten wurde keine akute Rejektion diagnostiziert. Trotzdem lagen die Serumkreatininwerte während des Messzeitraums über dem Normbereich und die Nierenfunktion war ein Jahr post-Tx eingeschränkt. ELISpot-Messwerte liegen nur zu den beschrifteten Zeitpunkten vor.

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Abbildung 9 Patienten mit OKT3-Induktionsschema. Obwohl bei den zwei Patienten einige Wochen post-Tx erhöhte Werte für spenderreaktive Zellen gemessen werden konnten, stiegen die Serumkreatininwerte während des Messzeitraums nie über den Normbereich und die Nierenfunktion war ein Jahr post-Tx sehr gut. Unter OKT3-Therapie stiegen die Messwerte fehlerhaft an (grün). ELISpot-Messwerte liegen nur zu den beschrifteten Zeitpunkten vor.

Für die statistische Analyse aller Werte wurde die untersuchte Patientengruppe als Ganzes, sowie die nach immunsuppressiven Therapieschemata unterschiedenen Subgruppen untersucht.

6.2 Spenderreaktive, IFNγ-produzierende Zellen prä-Tx

6.2.1  Zusammenhang mit frühen akuten Rejektionen

▼ 57 

Bei 42 der 52 an der Studie beteiligten Patienten konnte direkt vor Transplantation und vor Beginn einer immunsuppressiven Therapie die Anzahl der spenderreaktiven, IFNγ-produzierenden Zellen in PBMZ im ELISpot-Assay bestimmt werden. Dabei liegen von zwei der insgesamt 18 Patienten, die eine frühe akute Rejektion ihres Organs erlitten, keine prä-Tx-Werte vor.

Patienten mit einer frühen akuten Rejektion zeigten signifikant höhere Frequenzen IFNγ-produzierender Zellen als Patienten ohne nachgewiesene akute Rejektionsepisode (p = 0,047). Während jedoch eine Zellzahl von < 200/3*105 PBMZ keinen Vorhersagewert besaß, erlitten alle fünf Patienten mit Werten über 200 Spots eine frühe akute Rejektion [Abbildung 10].

Abbildung 10 IFNγ-produzierende, spenderreaktive Zellen vor Transplantation bei Patienten mit und ohne Nachweis einer akuten Rejektion ihrer Spenderniere.

▼ 58 

In Abschnitt 6.1 und Tabelle 3 werden Transplantatverlauf und transplantationsspezifische Charakteristika dieser fünf Patienten näher aufgeführt.

Tabelle 3 Sensibilisierungsfaktoren und Transplantationsverlauf der Patienten mit über 200 IFNγ-produzierenden, spenderreaktiven Zellen/ 3*105 PBMZ vor Transplantation.

6.2.2 Zusammenhang mit der Nierenfunktion

Weder innerhalb der Gruppe aller 42 Patienten noch in nach den verschiedenen immunsuppressiven Therapien unterteilten Subgruppen konnte ein signifikanter Zusammenhang zwischen der Anzahl IFNγ-produzierender Zellen vor der Transplantation und der Nierenfunktion sechs Monate und ein Jahr nach der Transplantation gezeigt werden.

6.2.3 Zusammenhang mit Sensibilisierungsfaktoren

▼ 59 

Patienten, bei denen vor Transplantation nie PRA (max.) nachgewiesen werden konnten, wiesen generell statistisch signifikant weniger spenderreaktive, IFNγ-produzierende Zellen vor Transplantation auf als Patienten, bei denen vor Transplantation PRA gemessen werden konnten (p = 0,026). Trotzdem konnten auch bei drei der 27 Patienten, bei denen vor Transplantation nie PRA nachgewiesen werden konnten, hohe Zellfrequenzen über 200 Spots und bei zwei weiteren über 100 Spots prä-Tx gemessen werden [Abbildung 11].

Abbildung 11 IFNγ-produzierende, spenderreaktive Zellen vor Transplantation bei Patienten mit und ohne Nachweis präformierter Anti-HLA-Antikörper (PRA).

Bei vier von fünf Patienten mit über 200 Spots prä-Tx waren direkt vor der Transplantation keine PRA (akt.) messbar und der fünfte Patient wies lediglich ein PRA-Niveau von 4 % auf. Bei dem Patienten mit dem höchsten Wert für PRA direkt vor der Transplantation von über
80 % konnten nur sechs spenderreaktive, IFNγ-produzierende Zellen auf 3*105 PBMZ mittels ELISpot-Assay gemessen werden.

▼ 60 

Weiterhin konnte kein signifikanter statistischer Zusammenhang zwischen spenderreaktiven, IFNγ-produzierenden Zellen vor der Transplantation gemessen im ELISpot-Assay und der Anzahl vorhergehender Schwangerschaften, Bluttransfusionen, vorhergehender Allotransplantationen, der Hämodialysedauer in Monaten und dem HLA-Mismatch zwischen Spender und Empfänger (schwankte z.B. bei Patienten mit prä-Tx-Werten von über 200 Spots zwischen 0 und 6) gefunden werden. Auch gab es keine signifikanten Unterschiede der IFNγ-produzierenden Zellen vor Transplantation im Zusammenhang mit der Primärfunktion versus verzögerte Transplantatfunktion und den CMV-Serologien der Spender und Empfänger.

6.2.4 Zusammenhang zwischen spenderreaktiven Zellen prä- und post-Tx

Die Zahl der vor Transplantation gemessenen spenderreaktiven, IFNγ-produzierenden Zellen zeigte eine signifikante Korrelation mit der nach Transplantation gemessenen Anzahl am Tag 1 post-Tx (rs = 0,465; p=0,005; n = 35), in Woche 3 (rs = 0,467; p = 0,019; n = 25) und dem maximalen nach der Transplantation gemessenen Wert (rs = 0,542; p = 0,000; n = 42). Dabei erreichten drei Patienten mit Werten über 200 Spots vor Transplantation auch die höchsten Werte am Tag 1 post-Tx, welche gleichzeitig auch die Maximalwerte nach Transplantation darstellten. Unabhängig von diesen drei Patienten korrelierten die Werte vor Transplantation jedoch trotzdem mit dem höchsten gemessenen Wert nach Transplantation (rs = 0,454; p = 0,004; n = 39).

6.3 Spenderreaktive, IFNγ-produzierende Zellen post-Tx

6.3.1  Zusammenhang mit der Nierenfunktion

Bei allen 52 in der Studie eingeschlossenen Patienten konnte zumindest einmal innerhalb von drei Monaten nach Transplantation ein Wert für spenderreaktive, IFNγ-produzierende Zellen gemessen werden und daher ein Maximalwert bestimmt werden. Die Mittelwerte aller, jedoch mindestens drei Werte nach Transplantation innerhalb der ersten drei Monate, konnten für 41 Patienten errechnet werden. Zusätzlich wurde analysiert inwieweit bestimmte Zeitpunkte für die Messung von spenderreaktiven, IFNγ-produzierenden Zellen nach Transplantation entscheidend sind. In die Untersuchung gingen somit sowohl die maximalen und mittleren ELISpot-Werte als auch die einzelnen Wochenwerte sowie Mittelwerte zweier aufeinander folgender Wochen ein.

▼ 61 

Sowohl in der gesamten Kohorte als auch in den Untergruppen
(a) ohne Patienten, die mit FTY720 oder OKT3-Induktionsschema behandelt wurden (n = 43)
(b) nur mit Tacrolimus behandelte Patienten (n = 35)
korrelierten der maximale und der mittlere ELISpot-Wert nach Transplantation signifikant negativ mit der GFR nach einem Jahr post-Tx.

Interessanterweise zeigten die durchschnittlichen spenderreaktiven Zellfrequenzen aller untersuchten Patienten der Woche 1 und 2 und der Woche 2 und 3 post-Tx eine signifikant positive Korrelation mit dem Serumkreatinin nach sechs Monaten und einem Jahr post-Tx und eine signifikant negative Korrelation mit der GFR nach sechs Monaten und einem Jahr post-Tx. Tabelle 4 fasst diese Ergebnisse für die gesamte Patientengruppe zusammen:

Tabelle 4 Korrelationen zwischen der Anzahl spenderreaktiver, IFNγ-produzierender Zellen und der Nierenfunktion sechs Monate bzw. ein Jahr post-Tx innerhalb der gesamten untersuchten Patientengruppe,1: n = 51; 2: n = 48; 3: n = 40; 4: n = 39; 5: n = 41; 6: n = 42

▼ 62 

Ein ähnlicher Zusammenhang fand sich auch allein zwischen den ELISpot-Werten der Woche 2 und der Nierenfunktion nach Transplantation. Er war allerdings nicht so deutlich ausgeprägt und für die GFR nach sechs Monaten auch nicht signifikant (GFR nach einem Jahr post-Tx:
rs = 0,36; p = 0,036; n = 34). Die ELISpot-Werte der Woche 1 korrelierten nur mit der GFR ein Jahr nach Transplantation (rs = 0,396; p = 0,045; n = 26).

Um die Zusammenhänge grafisch zu verdeutlichen, wurde für die maximalen, die mittleren und die durchschnittlichen ELISpot-Werte der Wochen 2 und 3 ein Cut-Off gewählt, der bei 40, 5 bzw. 10 Spots liegt. Die Gruppen der Patienten, deren Werte für spenderreaktive Zellen über bzw. unterhalb dieses Cut-Offs liegen, unterscheiden sich im Median ihrer GFR ein Jahr nach Transplantation [Abbildung 12]:

Abbildung 12 Nierenfunktion ein Jahr post-Tx bei Patienten mit Werten spenderreaktiver Zellen post-Tx über bzw. unter einem experimentell ermittelten Cut-Off. Die Gruppen unterscheiden sich in ihrem Median ( schwarzer Balken) teilweise signifikant.

▼ 63 

Überraschenderweise fielen allerdings drei Patienten auf, die bei hohen maximalen Zellfrequenzen nach Transplantation eine gute Nierenfunktion und keine Rejektionsepisode aufwiesen. Patient 18 der Tacrolimusgruppe erreichte in Woche 3 einen Spitzenwert von über 300 Spots (Serumkreatinin ein Jahr post-Tx: 1 mg/dl; GFR ein Jahr post-Tx: 69,1 ml/min/1,73m2).

Auffallend war, dass dieser Patient in der Zeit vor der Transplantation 20 Bluttransfusionen erhalten hatte. Bei den Patienten 16 und 17, die mit dem OKT3-Induktionsschema behandelt wurden, waren zu viel späteren Zeitpunkten über 100 Spots (Woche 11) bzw. über 200 Spots (Monat 7) nachweisbar (Serumkreatinin und GFR ein Jahr post-Tx siehe Abschnitt 6.1 ).

6.3.2 Zusammenhang mit frühen akuten Rejektionen

Da akute Rejektionen einen Risikofaktor für die Langzeitfunktion der Transplantatniere darstellen, sollte im folgenden geprüft werden, inwieweit auch subklinische Prozesse erfasst werden.

▼ 64 

Auch bei der Analyse der Patientengruppe, in der keine klinisch detektierbaren akuten Rejektionen auftraten, korrelierten der maximale und der mittlere Wert spenderreaktiver Zellen nach Transplantation signifikant negativ mit der GFR nach einem Jahr post-Tx, auch in den Untergruppen (a) und (b).

Der Zusammenhang zwischen der durchschnittlichen Anzahl spenderreaktiver, IFNγ-produzierender Zellen in Woche 2 und 3 post-Tx und der Nierenfunktion sechs Monate und ein Jahr post-Tx wurde bei Patienten ohne nachgewiesene Rejektion sogar noch deutlicher. Dies gilt auch für die untersuchten Untergruppen (a) und (b).

Tabelle 5 gibt einen Überblick über die Korrelationen von spenderreaktiven Zellen und der Nierenfunktion nach Transplantation bei Patienten ohne frühe akute Rejektionsepisode:

▼ 65 

Tabelle 5 Korrelationen zwischen der Anzahl spenderreaktiver, IFNγ-produzierender Zellen und der Nierenfunktion sechs Monate bzw. ein Jahr post-Tx innerhalb der Patientengruppe ohne frühe akute Rejektionen, 1: n = 33; 2: n = 32; 3: n = 27; 4: n = 26; 5: n = 29; 6: n = 28; 7: n = 30

Von besonderer Bedeutung scheinen die Messwerte der IFNγ-produzierenden Zellen in Woche 2 nach Transplantation zu sein, da diese auch allein mit der GFR nach sechs Monaten und nach einem Jahr korrelieren: rs= 0,411; p = 0,030; n = 28 bzw. rs = 0,570; p = 0,002; n = 27.

Bei den Patienten ohne akute Rejektion unterscheiden sich die Gruppen der Patienten, deren Werte für spenderreaktive Zellen über bzw. unterhalb eines Cut-Offs liegen, im Median ihrer GFR ein Jahr post-Tx [ Abbildung 13 ]:

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Abbildung 13 Nierenfunktion ein Jahr nach Transplantation bei Patienten OHNE AKUTE REJEKTION mit Werten spenderreaktiver Zellen post-Tx über bzw. unter einem experimentell ermittelten Cut-Off. Die Gruppen unterscheiden sich in ihrem Median (schwarzer Balken) teilweise signifikant.

In der Gruppe der Patienten mit mindestens einer frühen akuten Rejektion (n = 18), konnte jedoch keiner dieser Zusammenhänge und auch keine andere signifikante Korrelation zwischen spenderreaktiven, IFNγ-produzierenden Zellen zu irgendeinem Zeitpunkt nach Transplantation und der Nierenfunktion nach Transplantation festgestellt werden. Dies wird auch durch Abbildung 14 deutlich:

Abbildung 14 Zusammenhang zwischen der Anzahl spenderreaktiver, IFNγ-produzierender Zellen post-Tx und der Nierenfunktion ein Jahr nach Tansplantation bei Patienten mit und ohne Nachweis einer akuten Rejektion. Während bei Patienten mit akuter Rejektion kein Zusammenhang zwischen beiden Parametern besteht, korreliert der Mittelwert der spenderreaktiven Zellen innerhalb der ersten drei Monate gut mit der GFR und dem Serumkreatinin ein Jahr post-Tx. Diese Beziehung ist bis auf zwei Ausnahmen sogar nahezu linear.

▼ 67 

Andererseits konnte innerhalb der in dieser Arbeit untersuchten Patientengruppe kein statistisch signifikanter Unterschied bezüglich der maximalen und mittleren Anzahl IFNγ-produzierender Zellen oder der Zellzahl zu einem bestimmten Zeitpunkt nach Transplantation zwischen Patienten mit akuten Rejektionsepisoden und Patienten ohne nachgewiesene Rejektionen gezeigt werden.

6.3.3 Zusammenhang mit Sensibilisierungsfaktoren

Die Patienten mit den höchsten maximalen (> 140 Spots) und mittleren (> 50 Spots) ELISpot-Werten nach Transplantation wurden vor Transplantation alle mindestens 79 Monate dialysiert. Darunter befanden sich auch drei Patienten mit dem maximalen ELISpot-Wert am Tag 1 post-Tx, die auch Werte über 200 Spots vor der Transplantation hatten und eine akute Rejektion erlitten. Unterhalb dieser Spitzenwerte variierte die Dauer der Hämodialysezeit jedoch erheblich [ Abbildung 15 ]:

Abbildung 15 Zusammenhang zwischen der Dauer der Hämodialyse und der Anzahl spenderreaktiver, IFNγ-produzierender Zellen post-Tx. Patienten mit der größten maximalen oder mittleren Anzahl Zellen wurden insgesamt mindestens 79 Monate hämodialysiert.

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Unter den Patienten mit diesen höchsten Werten war vor Transplantation nur bei einer Patientin eine Gravidität aufgetreten, wobei bei dieser Patientin nicht einer der drei höchsten maximalen oder mittleren Werte gemessen wurde.

Bei den zehn Patienten mit der höchsten Anzahl spenderreaktiver, IFNγ-produzierender Zellen innerhalb der Wochen 1 und 2 nach Transplantation konnten interessanterweise vor Transplantation nie PRA nachgewiesen werden. Patienten mit den höchsten Zellfrequenzen vor Transplantation, am Tag 1 post-Tx und ab Woche 3 nach Transplantation wiesen hingegen zumindest teilweise PRA vor der Transplantation auf.

In der gesamten Patientengruppe gibt es zwischen den einzelnen Wochenwerten post-Tx und dem HLA-Mismatch mehrere Zusammenhänge. So besteht ein signifikanter Zusammenhang zwischen dem HLA-A-Mismatch und den ELISpot-Werten der Woche 4 post-Tx, dem HLA-B-Mismatch und den ELISpot-Werten der Woche 2 post TX, dem HLA-DR-Mismatch und den ELISpot-Werten der Wochen 3 und 5 post-Tx, und dem HLA-Gesamt-Mismatch und den
ELISpot-Werten der Wochen 2 und 4 post-Tx. Nimmt man jedoch von der Analyse die mit FTY720 behandelten Patienten und die Patienten mit OKT3-Induktionstherapie aus, so ergibt sich ein signifikanter Zusammenhang zwischen allen betrachteten HLA-Mismatchformen und den Werten der Woche 2 post-Tx (für HLA-Gesamt-Mismatch: rs = 0,484; p = 0,004; n = 33) [Abbildung 16]:

▼ 69 

Abbildung 16 Beziehung zwischen dem HLA-Gesamt-Mismatch und der Anzahl der spenderreaktiven Zellen in Woche 2 post-Tx

6.4 Besonderheiten immunsuppressiver Therapieschemata

6.4.1  Patienten, die mit FTY720 behandelt wurden

Sieben der 52 untersuchten Patienten bekamen als Immunsuppression FTY720, Ciclosporin A und Methylprednisolon. Keiner der Patienten hatte zuvor je eine Transplantation bekommen. Bei zwei Patienten kam es zu einer verzögerten Funktionsaufnahme des Organs, wobei FTY720 und Ciclosporin A bei Patient 24 am Tag 4 post-Tx abgesetzt und durch Tacrolimus und MMF ersetzt wurden. Bei Patient 5 kam es innerhalb Woche 1 zu einer schweren akuten Rejektion, die zum Verlust der Organfunktion führte. Hier wurden FTY720 und Ciclosporin sechs Wochen nach Transplantation durch Tacrolimus und MMF ersetzt. Während letzterer einen hohen prä-Tx Wert von über 400 Spots hatte, konnten bei dem ersten 37 Spots vor Transplantation gezählt werden. Beide hatten jedoch einen hohen maximalen Wert nach Transplantation und zwar ersterer am Tag 1 nach Transplantation (62 Spots) und der zweite innerhalb Woche 1 (74 Spots). Bei einem weiteren Patienten kam es innerhalb der ersten sechs Monate nach Transplantation zu einer akuten Rejektion, ohne dass allerdings vor Transplantation noch zu irgendeinem der Messzeitpunkte nach Transplantation spenderreaktive Zellen mittels ELISpot-Assay nachgewiesen werden konnten. Bei einem anderen Patienten, bei dem auch eine Ciclosporintoxizität festgestellt wurde, wechselte man nach sechs Monaten von FTY720 und Ciclosporin auf Tacrolimus und MMF. Eine Patientin mit sieben Schwangerschaften vor Transplantation hatte zu keinem Messzeitpunkt spenderreaktive, IFNγ-produzierende Zellen und eine gute Nierenfunktion nach einem Jahr (Serumkreatinin: 0,93 mg/dl, GFR: 74,9ml/min/1,73m2). Ein Patient mit drei Transfusionen vor Transplantation und historisch gemessenen PRA von max. 60 % wies in dieser Gruppe den höchsten maximalen Wert nach Transplantation auf, allerdings erst in Woche 9 post-Tx. Seine Nierenfunktion betrug nach einem Jahr: Serumkreatinin: 1,5 mg/dl, GFR: 46,7 ml/min/1,73m2. Die Einzelheiten sind in Tabelle 6 zusammengefasst:

Tabelle 6 Sensibilisierungsfaktoren und Transplantationsverlauf der Patienten, die als immunsuppressive Therapie FTY720 erhielten

6.4.2 Patienten, die eine OKT3-Induktionstherapie erhielten

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Bei zwei Hochrisikopatienten mit vorhergehenden Nierentransplantationen, dabei stattgehabten Rejektionen in der Anamnese und mit historischen PRA max von über 70 % wurden vor Transplantation spenderreaktive Zellen entsprechend 29 bzw. 6 Spots gemessen. Die Induktionstherapie bestand aus einer perioperativen Gabe von OKT3, anti-TNFα-mAk, anti-CD20-mAk sowie fünf Plasmapheresen an den darauf folgenden Tagen. Danach wurde zu konventioneller Immunsuppression gewechselt. Trotz hoher maximaler ELISpot-Werte nach Transplantation, die interessanterweise auch eher später auftraten (Patient 17 Monat 7: 278,5 Spots – Patient 16 Woche 11: 107,5 Spots) erlitt keiner der beiden Patienten eine akute Rejektion und beide hatten ein Jahr nach Transplantation eine gute Nierenfunktion (Serumkreatinin: 0,68 mg/dl, GFR: 109,1 ml/min/1,73m2 bzw. Serumkreatinin: 0,93 mg/dl, GFR: 72,7 ml/min/1,73m2). Weitere transplantationsspezifische Charakteristika der Patienten sind in Tabelle 7 aufgelistet:

Tabelle 7 Sensibilisierungsfaktoren und Transplantationsverlauf Transplantationsverlauf der Patienten, die ein OKT3-Induktionschema erhielten

6.4.3 Patienten, die eine Lebendspende erhielten

Acht der insgesamt 52 untersuchten Patienten erhielten eine Niere von einem Lebendspender und wurden mit anti-IL2R-mAk (Basiliximab), Ciclosporin A, MMF und Steroiden behandelt. Da eine immunsuppressive Therapie bei dem Großteil der Lebendspenden schon längere Zeit vor Transplantation organisatorisch möglich ist, gelang es nur bei drei Patienten einen Wert der spenderreaktiven, IFNγ-produzierenden Zellen vor Transplantation ohne Einwirkung von Immunsuppressiva zu bestimmen, wobei jeweils keine Zellen nachgewiesen werden konnten. Die maximalen ELISpot-Werte nach Transplantation lagen zwischen 0 und 41 Spots. Zwei der Patienten erlebten eine frühe akute Rejektion, einer der Patienten sogar zweimal. Nur bei einem Patienten nahm das Organ seine Funktion erst verspätet auf. Weitere transplantationsspezifische Charakteristika der Patienten werden in Tabelle 8 zusammengefasst. Zwar gab es eine signifikante positive Korrelation zwischen den ELISpot-Werten der Woche 2 nach Transplantation mit dem Serumkreatinin nach sechs Monaten (rs = 0,775; p = 0,041; n = 7), sonst konnte allerdings zwischen der Nierenfunktion nach einem Jahr oder dem Auftreten einer Rejektion und den maximalen und mittleren Werten, sowie zwischen den spenderreaktiven Zellen vor und nach Transplantation und dem HLA- Mismatch oder der CMV-Serologie von Spender und Empfänger kein Zusammenhang gezeigt werden. Im Vergleich zu der Gruppe der Patienten mit Kadaverspenden zeigte sich jedoch, dass Patienten mit Lebendspenden signifikant weniger spenderreaktive Zellen in Woche 3 aufwiesen (p = 0,038) und signifikant niedrige maximale Frequenzen post-Tx als Patienten mit Kadaverspenden erreichten (p = 0,04) [Abbildung 16].

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Tabelle 8 Sensibilisierungsfaktoren und Transplantationsverlauf der Patienten, die eine Lebenspende erhielten

Abbildung 17 Maximale Anzahl spenderreaktiver, IFNγ-produzierender Zellen nach Transplantation bei Patienten mit Lebenspenden und bei Patienten mit Kadaverspenden.

6.5 Versuch der Optimierung des ELISpot-Assays

6.5.1  Reproduzierbarkeit

15 Probanden wurden in verschiedenen Kombinationen auf gegenseitige Alloreaktivität untersucht. Dabei wurden je 3*105 PBMZ von je zwei Probanden im Dreifachansatz im ELISpot-Assay miteinander inkubiert, die jeweiligen durch Alloreaktion entstandenen IFNγ-Spots der Reaktionspartner gemessen und daraus der Variationskoeffizient (=Standardabweichung/Mittelwert) der Dreifachansätze bestimmt. Außerdem wurden von einem CMV-seropositiven Probanden mit bekannter T-Zell-Reaktion auf das CMV-pp65-Peptidgemisch PBMZ zu je 2*105/Well und je 5*104/Well in je zehn Ansätzen auf zehn verschiedenen Platten mit CMV-pp65-Peptidgemisch stimuliert und die Platten getrennt entwickelt. Der Variationskoeffizient der verschiedenen PBMZ-Konzentrationen zwischen den zehn Wells und zwischen den Mittelwerten der zehn Platten wurde bestimmt.

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Je nach Höhe der Alloreaktivität schwankten die Variationskoeffizienten der Dreieransätze. Bei Antworten bis durchschnittlich 20 Spots lag der Mittelwert des Variationskoeffizienten bei 0,28 mit einer Spanne von 0,07 bis 0,5; bei Antworten zwischen durchschnittlich 20 Spots und 100 Spots gab es einen mittleren Koeffizienten von 0,22 mit einer Spanne von 0,07 bis 0,74; und bei Antworten über durchschnittlich 100 Spots ergab sich bei einem mittleren Variationskoeffizienten von 0,13 eine Spanne von 0,03 bis 0,56. Die Variationskoeffizienten der CMV-Peptid-Stimulation lagen bei den Zehneransätzen mit 2*105 PBMZ zwischen 0,04 und 0,19; im Mittelwert bei 0,08; mit 5*104 PBMZ zwischen 0,15 und 0,28; im Mittelwert bei 0,21. Die Variationskoeffizienten der Mittelwerte der Zehneransätze der zehn Platten lagen mit 2*105 PBMZ bei 0,25; mit 5*104 PBMZ bei 0,42.

6.5.2 Ciclosporin A

PBMZ von CMV-seropositiven Probanden mit einer aus durchflusszytometrischen Versuchen einer anderen Arbeitsgruppe des Labors bekannten T-Zell-Reaktion auf CMV-pp65-Gesamtpeptidgemisch wurden in Medium für 30 min, 60 min, 90 min, 120 min und 24 h mit Ciclosporin A inkubiert, danach zweimalgewaschenund mit dem CMV-pp65-Gesamtpeptidgemisch im ELISpot-Assay stimuliert. Bei keinem der Ansätze konnte eine Verminderung der Spotanzahl im Vergleich zu unbehandelten PBMZ, also eine Hemmung der IFNγ-Produktion der Zellen, beobachtet werden.

Abbildung 18 IFNγ-Sekretion CMV-spezifischer T-Zellen nach 24h Ciclosporin A-Wirkung

6.5.3 Tacrolimus

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Der gleiche Versuch wurde ebenfalls mit PBMZ CMV-seropositiver Probanden mit Tacrolimus durchgeführt. Dabei zeigte sich eine deutliche Hemmung der IFNγ-Produktion der CMV-reaktiven Zellen durch eine Abnahme der IFNγ-Spots im Vergleich zum unbehandelten Ansatz.

Abbildung 19 IFNγ-Sekretion CMV-spezifischer T-Zellen nach 2h Tacrolimus-Wirkung

Behandelte man nun allerdings PBMZ von CMV-negativen Probanden, die bisher keine CMV-spezifische T-Zell-Reaktion aufgebaut haben konnten mit Tacrolimus für 2 h, wusch sie danach zweimal und inkubierte sie zusammen im ELISpot-Assay mit unbehandelten PBMZ von CMV-seropositiven Probanden, die zusätzlich mit CMV-pp65-Peptidgemisch stimuliert wurden, so zeigte sich auch hier eine markante Hemmung der IFNγ-Sekretion der CMV-spezifischen Zellen im Vergleich zur Kontrollgruppe mit unbehandelten PBMZ seronegativer Probanden (der alloreaktive Background wurde abgezogen). Das spricht dafür, dass Tacrolimus von den behandelten PBMZ seronegativer Probanden auf die unbehandelten PBMZ seropositiver Patienten während der Inkubationszeit überging, dass Tacrolimus sich also nicht vollständig auswaschen ließ.

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Abbildung 20 Übertragung der Wirkung von Tacrolimus auf unbehandelte CMV-spezifische T-Zellen

6.5.4 CD2pos-Zelldepletion

Das CD2-Antigen befindet sich auf T-Zellen, Thymozyten und natürlichen Killerzellen. Durch Markierung der CD2 Moleküle mit magnetischen CD2-Antikörpern konnten die IFNγ-produzierenden T-und NK-Zellen aus präparierten PBMZ oder Splenozyten mittels einer aus Eisenkügelchen bestehenden Säule in einem Magnetfeld (MACS) entfernt, also depletiert werden. Nach der Depletion waren konstant weniger als 2 %, meist weniger als 1 % der behandelten Zellen T-Zellen, wie man im Durchflusszytometer anhand von über 20 Messungen zeigen konnte. CD2-depletierte PBMZ ließen sich im Gegensatz zu nichtdepletierten nicht mit PHA stimulieren, das heißt es erfolgte keine IFNγ-Produktion durch T-Zellen, da diese so gut wie vollständig eliminiert worden waren.

Abbildung 21 IFNy-Sekretion CD2-depletierter Leukozyten unter PHA-Stimulation

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Die zweite Frage war, ob die so behandelten Zellen noch Antigenität besitzen, dass heißt, ob die verbliebenen antigenpräsentierenden Zellen noch in der Lage sind, die T-Zellen der Responderzellen zu aktivieren, welche dann IFNγ produzieren. Dazu wurden wechselseitig CD2-depletierte und die nichtdepletierten PBMZ von Probanden mit bekannter, starker, gegenseitiger alloreaktiver Reaktion im ELISpot-Assay miteinander inkubiert. Die gemessenen IFNγ-Spots kamen durch die T-Zell-Alloreaktion beider Probanden zustande.

Während die CD2-depletierten PBMZ weiterhin in der Lage waren, alloreaktive Zellen des anderen Probanden im ELISpot-Assay zu aktivieren, hing die Anzahl der IFNγ-Spots davon ab, welcher Reaktionspartner CD2-depletiert wurde. Die Depletion führte zu einer Anreicherung von antigenpräsentierenden Zellen, wodurch sich bei gleicher Zellzahl im ELISpot-Assay die Konzentration der antigenpräsentierenden Zellen erhöhte und damit die Stimulation der T-Zellen des Responders verstärkte, welche dann eine stärkere alloreaktive Antwort zeigten. Im Gegenzug führte eine T-Zell-Depletion der PBMZ desjenigen Reaktionspartners mit der ursprünglich stärkeren alloreaktiven Antwort zu einer insgesamt schwächeren Antwort. Wurden die PBMZ beider Reaktionspartner CD2-depletiert, wurde keine Alloantwort beobachtet.

Abbildung 22 Aktivierung alloreaktiver T-Zellen durch CD2-depletierte allogene Leukozyten

6.5.5 Bestrahlung

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Mit der Methode der magnetischen CD2pos-Zelldepletion ist nun ein Verfahren etabliert worden, das effektiv die IFNγ-Produktion von T-Lymphozyten der Spenderzellen inhibiert. Mit Hilfe dieses Verfahrens konnte nun auch überprüft werden, welchen Einfluss die in der Patientenstudie verwendete Bestrahlung der Spendersplenozyten mit 30 Gray tatsächlich auf die Antigenität der antigenpräsentierenden Zellen und die IFNγ-Sekretion der Spender-T-Lymphozyten hatte. Dafür wurden PBMZ von drei Probanden teils bestrahlt, teils nicht bestrahlt und mit Spendersplenozyten, die mittels MACS CD2pos-depletiert und ebenfalls teils bestrahlt und teils unbestrahlt waren, in verschiedenen Ansätzen miteinander inkubiert. Der Anteil der T-Zellen in den PBMZ der Probanden wurde vorher durchflusszytometrisch gemessen. Pro Well wurden 3*105 T-Zellen eingesetzt - die Anzahl der PBMZ war dementsprechend größer.

Der Versuch zeigte, dass tendenziell weniger Zellen der Probanen-PBMZ nach Bestrahlung mit 30 Gray auf den Stimulus der allogenen Splenozyten hin IFNγ bildeten, dass Bestrahlung zumindest teilweise die IFNγ-Sekretion hemmen konnte. Diese Hemmung ist jedoch nicht signifikant und für die gegebene Fragestellung nicht ausreichend. Auf der anderen Seite konnten bestrahlte, CD2pos-depletierte Splenozyten die Zellen der Probanden-PBMZ mindestens genauso gut stimulieren wie unbestrahlte.

Abbildung 23 IFNγ-Sekretion (nach allogenem Stimulus) und Allogenität bestrahlter Leukozyten

6.5.6 Anteil der T-Zellen an Responder-PBMZ

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Um die Frage zu beantworten, inwieweit der Anteil der T-Zellen an PBMZ zwischen verschiedenen Messzeitpunkten und zwischen verschiedenen Patienten variiert und ob es daher gerechtfertigt ist, eine bei jeder Messung konstante Anzahl von nicht näher definierten Responder-PBMZ im ELISpot-Assay einzusetzen, wurde der prozentuale Anteil der T-Zellen an PBMZ von 15 nierentransplantierten Patienten außerhalb der durchgeführten Studie vor und zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Transplantation bestimmt. Zusätzlich wurde der Anteil der verbliebenen Granulozyten gemessen, die theoretisch durch die Präparation der PBMZ entfernt werden.

Dabei zeigte sich, dass der T-Zell-Anteil sowohl zwischen den Patienten zu gleichen Zeitpunkten als auch innerhalb eines Patienten zu verschiedenen Zeitpunkten vor und nach der Transplantation stark variierte. Während z. B. prä-Tx bei den verschiedenen Patienten ein T-Zell-Anteil zwischen 18 % und 62 % gemessen werden konnte, schwankte er post-Tx bei einem Patienten zwischen 6 % und 27 % , bei einem anderen zwischen 0,6 % und 29 %. Obwohl der Anteil der Granulozyten wie erwartet meist unter 5 % lag, so erreichte er in Einzelfällen 20 % und 30 %.

Abbildung 24 Prozentualer Anteil von T-Zellen an PBMZ nierentransplantierter Patienten zu verschiedenen Messzeitpunkten vor und nach Nierentransplantation. Die einzelnen Patienten werden durch unterschiedliche Farben symbolisiert.

6.5.7 Optimale Zellkonzentrationen

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Der Zusammenhang zwischen der Konzentration antigenpräsentierender Zellen und alloreaktiver T-Zellen und der Anzahl der IFNγ-Spots im ELISpot-Assay wurde anhand von zwei Probanden untersucht. PBMZ der Probanden wurden in verschiedenen Konzentrationen mit CD2pos-depletierten Zellen einer frisch präparierten Spendermilz in ebenfalls verschiedenen Konzentrationen stimuliert. Dabei war die Anzahl der eingesetzten T-Zellen der Responder-PBMZ durch die durchflusszytometrische Messung des Anteils der T-Zellen an den PBMZ bekannt. Die CD2pos-Zelldepletion der Milzzellen führte zu einer fast vollständigen Elimination der vorher enthaltenen T-Zellen, da jene danach in keiner Konzentration mit PHA zu einer IFNγ-Produktion zu stimulieren waren. Die IFNγ-Spots stammten daher ausschließlich von den T-Zellen der Probanden.

Der Versuch zeigte, dass die T-Zell-Antworten bei konstanter Anzahl der stimulierenden CD2-depletierten Milzzellen, wie erwartet, nahezu linear von der Anzahl der eingesetzten T-Zellen der Probanden abhing. Allerdings stieg die Höhe der Antwort ebenfalls bei konstanter Anzahl der Responder-T-Zellen aber wachsender Anzahl der eingesetzten stimulierenden Milzzellen:

Abbildung 25 IFNγ-Spots im ELISpot Assay bei T-Zell-Alloreaktionen im Zusammenhang mit der Anzahl der Stimulator- und Responderzellen

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In einem ähnlichen Experiment, in dem die PBMZ der Probanden jedoch nicht mit Milzzellen, sondern mit den CD2-depletierten PBMZ des jeweils anderen Probanden stimuliert wurden, konnte man bei konstanter Zahl der Responder-T-Zellen ab einer gewissen Stimulatorzellkonzentration einen Sättigungseffekt beobachten, wobei ein weiterer Anstieg der Anzahl der eingesetzten Stimulatorzellen zu keiner weiteren Erhöhung der alloreaktiven Antwort führte.

Abbildung 26 Die alloreaktive T-Zell-Antwort konvergiert bei einer sättigenden Stimulation

In beiden Experimenten wurden teilweise über eine Mio. Zellen pro Well eingesetzt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass im ELISpot-Assay weit über 6*105Zellen pro Well eingesetzt werden können ohne die Vitalität der Zellen und das Messergebnis zu gefährden. Zusätzlich scheint ein Verhältnis Responderzellen: Stimulatorzellen von 1:1 wie im ELISpot-Protokoll in Anlehnung an das Verfahren der MLR beschrieben nicht die gesamte alloreaktive Antwort zu erfassen.


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13.07.2007