7 Diskussion

▼ 80 

Zusammenfassend konnte mit dieser Arbeit die eingangs gestellte Frage nach der klinischen Bedeutung der im ELISpot-Assay gemessenen spenderreaktiven, IFNγ-produzierenden Zellen von nierentransplantierten Patienten folgendermaßen beleuchtet werden: Bereits vor Transplantation konnte mit Hilfe des Assays eine Gruppe von Patienten mit früher akuter Rejektion ihres Organs identifiziert werden; nach Transplantation konnte ein Zusammenhang zwischen der Anzahl spenderreaktiver Zellen im peripheren Blut, besonders in Woche 2 und 3 und bei Patienten ohne frühe akute Rejektion, und der Nierenfunktion ein Jahr nach Transplantation festgestellt werden, wobei der HLA-Mismatch und die Art der Spende einen Einfluss auf die Anzahl der gemessenen Zellen zu haben schien. Zur Beantwortung der Frage nach einer methodischen Optimierung des Assays konnten Aussagen über die einzusetzenden Zellkonzentrationen und die Inhibition der IFNγ-Sekretion durch die Stimulatorzellen beigesteuert werden. Der Variationskoeffizient des Assays, der bis zu 42 % betrug, könnte demnach durch eine Erhöhung und Standardisierung der verwendeten Anzahl der Responder-T-Zellen sowie durch den Einsatz von Stimulatorzellen im Überschuss, aus welchen zuvor alle CD2posLeukozyten entfernt wurden, verringert werden.

7.1  Bewertung der angewandten Methodik

7.1.1  Bestimmung spenderreaktiver Zellen in PBMZ

Die Bestimmung spenderreaktiver Zellen in PBMZ stellte insofern eine interessante Aufgabe dar, als dass PBMZ in relativ großer Menge (etwa eine Million Zellen/ml venöses Blut) in kurzen Zeitabständen ohne Risiko einer Schädigung des Transplantats mit der im Vergleich zur Nierenbiopsie „noninvasiven“ Technik der peripheren Punktion einer Vene gewonnen werden können, wobei für den Patienten nur geringstmögliche Unannehmlichkeiten bestehen. Damit existieren ideale Voraussetzungen für ein immunologisches Monitoring, welches zu jedem gewünschten Zeitpunkt Auskunft über die jeweilige Immunaktivierung gegen das Transplantat geben könnte.

Heeger et al. hatten zwar über einen Zusammenhang zwischen spenderreaktiven Gedächtniszellen im Blut vor Transplantation und dem Auftreten von akuten Rejektionen berichtet [95], es stellte sich jedoch die Frage, ob sich dies in einer anderen Patientengruppe reproduzieren lässt und ob sich der Blutkreislauf auch nach Transplantation als geeignetes Kompartiment zur Messung spenderreaktiver Zellen erweist oder ob die jetzt zu betrachtenden schon geprimten und aktivierten Effektor-T-Zellen durch im Gegensatz zu naiven T-Zellen vermehrte Expression von Adhäsionsmolekülen (LFA1, VLA4) oder Chemokinrezeptoren (CCR1, CCR2, CCR5, CXC Chemokinrezeptor) [97] nicht viel eher im Transplantat akkumulieren, während sie im Blut eine Frequenz unterhalb der Nachweisgrenze aufweisen.

▼ 81 

Es konnte eindeutig gezeigt werden, dass spenderreaktive, IFNγ-produzierende Zellen auch nach Transplantation und unter Immunsuppression im ELISpot-Assay nachweisbar sind. Zusätzlich konnte für einige Patienten kurz vor oder während einer akuten Rejektion des Transplantats ein Anstieg der spenderreaktiven Zellen beobachtet werden und ein generell erhöhtes Niveau war mit einer eingeschränkten Nierenfunktion ein Jahr post-Tx assoziiert. Die Messung spenderreaktiver, IFNγ-produzierender Zellen in PBMZ mittels des ELISpot-Assays erscheint diesbezüglich als zukünftige Methode des Immunmonitoring nierentransplantierter Patienten geeignet.

7.1.2 Stellenwert des ELISpot-Assays

Das ELISpot-Assay wird vielseitig unter anderem für das Monitoring antigenspezifischer Immunantworten im Kontext der Vakzinenentwicklung, Krebs- und Autoimmunitätsforschung verwendet [98, 99, 100]. Der im Gegensatz zum LDA-Verfahren relativ geringe Arbeitsaufwand und die vom jeweils zu bestimmenden Zytokin abhängende kurze Dauer des Assays bieten zusammen mit der hohen Sensitivität mit einer Detektionsschwelle von weniger 1/106 Zellen unübersehbare Vorteile, die vor allem für das routinemäßige Immunmonitoring transplantierter Patienten von Bedeutung sein könnten. Demgegenüber stehen allerdings nicht zu vernachlässigende Einschränkungen: Im Gegensatz zu durchflusszytometrischen Messungen z.B., können mit dem ELISpot-Assay keine Aussagen über den Phänotyp der untersuchten Zellen, deren Subpopulationen und weiteren Funktionen getroffen werden, da in einem Ansatz neben dem gemessenen Zytokin keine weiteren Zytokine oder Oberflächenmarker erfasst werden können.

Obwohl in einigen Studien eine Korrelation zwischen der Anzahl der Zellen gemessen im
ELISpot-Assay und der von Vorläuferzellen gemessen mittels LDA anhand mehrerer Effektorfunktion gefunden wurde[101], so ließ die Reproduzierbarkeit des in dieser Arbeit verwendeten Verfahrens zu wünschen übrig. Während die Messung antigenspezifischer T-Zellen (CMV) zwischen einzelnen Wells bei hohen T-Zell-Antworten durchschnittlich einen Variationskoeffizienten von 8 %, bei niedrigen 21 % ergab, so variierten die Antworten auf verschiedenen 96-Well-Platten bei hohen Antworten um 25 %, bei niedrigen um 42 %. Das aber bedeutet einen Unterschied zwischen zwei theoretisch gleichen Ansätzen von mehr als 100 % ! Bei der Messung alloreaktiver T-Zellen betrug der Variationskoeffizient innerhalb der einzelnen Wells zwischen 28 % und 13 %. Bei einem niedrigen Cut-Off von 10 bzw. 40 Spots, wie er sich hier für die Messung spenderreaktiver, IFNγ-produzierender Zellen für Woche zwei und drei bzw. dem maximalen Wert post-Tx als günstig erwies, wäre das von entscheidender Bedeutung. Die Arbeitsgruppe um Heeger et al., die das Assay ebenfalls auf Reproduzierbarkeit getestet hat, kommt auf ähnliche Ergebnisse [102]. In einer von ihnen durchgeführten Analyse der Reproduzierbarkeit alloreaktiver T-Zell-Antworten in Nierentransplantierten mit stabiler Nierenfunktion wurden Abweichungen zwischen den Messwerten verschiedener Untersucher von bis zu 27 % beobachtet. Da der Fehler einer Messung durch genügend Ansätze in den Hintergrund tritt, hat die Verbesserung der Intra-Assay-Reproduzierbarkeit Vorrang.

▼ 82 

Ein weiterer Nachteil des ELISpot-Assays besteht in der fehlenden Vergleichbarkeit der Werte zwischen verschiedenen Laboren. Trotz computergestützter Analyse herrscht ein großes Maß an Subjektivität bezüglich der Interpretation der Spotanzahl, da die vielen vom Benutzer gewählten Analysebedingungen wie Empfindlichkeit, Helligkeit, Gradient, Kontrast, Spottrennbarkeit und Spotgröße nicht standardisiert sind.

7.1.3 Versuch der Optimierung des Assays

Einfluss von Bestrahlung mit 30 Gray

Die Bestrahlung von Stimulatorzellen hat sich im MLR-Verfahren hinsichtlich verlässlicher Proliferationsinhibition bewährt. Trotzdem in dieser Arbeit gezeigt werden konnte, dass sie auch einen hemmenden Einfluss auf die IFNγ-Sekretion durch PBMZ besitzt, so war dieser doch zu gering um sicher zu sein, dass die im ELISpot-Assay gemessene Zytokinsekretion ausschließlich von Responderzellen stammt. Dies ist jedoch wichtig, da bei der Nierentransplantation vorrangig die Immunantwort des Transplantatempfängers gegen das Transplantat von Interesse ist. Weiterhin fiel eine erhöhte spontane Produktion von IFNγ durch unstimulierte, bestrahlte Zellen auf. Diese wurde ebenfalls von Heeger et al. [1] beschrieben und von Galdiero et al. als dosisabhängiger Effekt der γ-Bestrahlung auf die Zytokinproduktion von Lymphozyten charakterisiert [103]. Durch die Erhöhung der Leerwerte nach Bestrahlung kam es teilweise zu negativen Werten spenderspezifischer T-Zellfrequenzen, was einen weiteren Nachteil der Bestrahlung von Stimulatorzellen bedeutet, die deshalb in keinem weiteren ELISpot-Assay dieser Art mehr Anwendung finden sollte.

▼ 83 

Zelldepletion

Da nach theoretischen Überlegungen vor allem T- und NK-Zellen für eine IFNγ-Sekretion der Stimulatorzellen verantwortlich sind, konnte in dieser Arbeit durch Depletion CD2posT- und NK-Zellen mit Hilfe magnetischer Antikörper eine Stimulatorzellpopulation generiert werden, die in Folgeuntersuchungen tatsächlich weder auf Antigenstimulation mit PHA noch auf Alloantigenstimulation eine IFNγ -Produktion zeigte. Somit ist davon auszugehen, dass nach Stimulation mit derartig generierten Spenderzellen jeder IFNγ-Spot im ELISpot-Assay von einer Responderzelle stammte.

T-Zell-Anzahl

▼ 84 

Bei den durchflusszytometrischen Untersuchungen von PBMZ nierentransplantierter Patienten wurde deutlich, dass der Anteil der T-Zellen an PBMZ von Patient zu Patient differiert und auch innerhalb eines Patienten zu verschiedenen Zeitpunkten vor und nach Transplantation starken Schwankungen unterworfen ist. Schwankungen des T-Zellanteils in PBMZ, die z.B. durch Tageszeit, Stress und Entzündungen beeinflusst werden, sind auch bei Normalprobanden zu beobachten. Sie werden können jedoch durch einige Immunsuppressiva verstärkt werden. Das Immunsuppressivum FTY720 beschleunigt das chemokinabhängige Lymphozyten-Homing in sekundäre lymphatische Organe. Der T-Zell-Antikörper OKT3 führt in Dosierungen einer Antirejektionstherapie über die Induktion von Apoptose in bereits vorher aktivierten Zellen und die Opsonierung von T-Zellen mit anschließender Phagozytose in der Leber zu einer biologischen T-Zell-Depletion. Eine funktionelle T-Zell-Depletion aus dem Blut wirkt über die Internalisierung des OKT3-T-Zell-Rezeptor-Komplexes. Diese T-Lymphopenie ist allerdings reversibel und wird innerhalb einiger Wochen wieder ausgeglichen. Ein weiteres Problem stellte bei einzelnen nierentransplantierten Patienten ein erhöhter Granulozytenanteil der PBMZ dar. Für eine bessere Reproduzierbarkeit der Werte für spenderreaktive, IFNγ-produzierende Zellen, für die Ermöglichung eines direkten Vergleichs des zellulären immunologischen Aktivierungszustands zweier Patienten oder innerhalb eines Patienten zu verschiedenen Zeitpunkten und für die Bildung eines Cut-Offs, der klinisch relevante Werte von Normalwerten sicher unterscheiden kann, sollte eine Standardisierung der Anzahl der als Responderzellen verwendeten T-Zellen angestrebt werden. Dies könnte z.B. durch die durchflusszytometrische Messung des T-Zell-Anteils vor jedem Einsatz von PBMZ im ELISpot-Assay und der Einstellung der verwendeten PBMZ auf eine bestimmte Anzahl von T-Zellen erfolgen.

Gesamtzellkonzentration

Die durchgeführten Zellzahl-Optimierungsversuche haben außerdem gezeigt, dass die Stimulatorzellen für die vollständige Erfassung der alloreaktiven T-Zell-Alloantwort im ELISpot-Assay nicht - wie bei der MLR - im Verhältnis 1:1 zu den Responderzellen sondern im Überschuss eingesetzt werden sollten. Das optimale Verhältnis zwischen Stimulatorzellen und Responderzellen muss aber möglicherweise für zukünftige Studien erneut austitriert werden, da Spender-PBMZ und Spendersplenozyten eine unterschiedliche Zellzusammensetzung aufweisen.

▼ 85 

Um eine Erhöhung der Anzahl der Responder- und Stimulatorzellen im Assay, und damit eine Verstärkung der Alloantwort zu ermöglichen ohne diese durch die limitierte Nährstoffmenge des Mediums einzuschränken, könnte eine zusätzliche Depletion von Monozyten und B-Zellen aus den Responder-PBMZ - z.B. ebenfalls mit Hilfe magnetischer Antikörper – hilfreich sein. Zwar hat sich eine Zellkonzentration von mehr als einer Million Zellen proWell noch nicht als kritisch erwiesen; trotzdem könnte man spekulieren, dass Monozyten und B-Zellen aus den Empfänger-PBMZ den Boden des Wells unnötig bedecken und zu wenig Platz für alle Empfänger-T-Zellen lassen, deren sezerniertes IFNγ nicht am Boden des Wells gebunden werden kann.

Fazit

Für weitere Studien sowie den Einsatz bei patientenbezogenen klinischen Fragestellungen erscheint die folgende Modifikation des ELISpot-Assays zur Messung spenderreaktiver, IFNγ-produzierender Zellen nötig:

▼ 86 

7.1.4 Einschränkung der Interpretation der Werte

Die aufgelisteten methodischen Probleme innerhalb des verwendeten ELISpot-Assays führten zu einer eingeschränkten Relevanz einzelner Werte. Da jedoch alle Blut- und Gewebeproben gleich behandelt und alle Platten gleich ausgewertet wurden, waren Abweichungen vom „wahren“ Wert, wenn auch mitunter groß, zufällig und in beide Richtungen möglich. Diese zufälligen Abweichungen, auch in den negativen Zahlenbereich, heben sich statistisch gesehen auf, womit allgemeingültige Aussagen getroffen werden können. Die in dieser Studie so gefundenen biologischen Aussagen sind daher erstaunlich klar und lassen bei methodischer Verbesserung (siehe oben) noch aussagekräftigere Daten erwarten. Es ist zu beachten, dass p bei der Untersuchung von Korrelationen nur die Wahrscheinlichkeit angibt, mit der die untersuchte Patientenstichprobe aus einer Gesamtpopulation stammt, bei der zwischen den untersuchten Merkmalen überhaupt kein Zusammenhang besteht. Es bezieht sich dabei nicht auf den Korrelationskoeffizienten und macht keine Aussage über die Stärke des Zusammenhangs. In einer kleinen Stichprobe mit einer großen Varianz der Werte ( wie im vorliegenden Fall) ist es daher wahrscheinlicher, einen starken Zusammenhang zu finden als einen schwachen. Das deutet darauf hin, dass in einer erneuten Studie an einer größeren Patientengruppe, in der ein verbessertes ELISpot-Assay verwendet würde, die in dieser Arbeit beschriebenen Zusammenhänge stärker hervorkämen und schwächere Zusammenhänge, die anhand dieser Patientenstichprobe nicht gefunden werden konnten, sichtbar würden.

▼ 87 

Korrelationen wurden mit Hilfe des nichtparametrischen Spearman-Rho-Testes untersucht, der lediglich auf einen vorhandenen jedoch nicht auf einen linearen Zusammenhang testet und damit keine Aussagen zu einer prädiktiven Assoziation macht.

Obwohl die vorliegenden Ergebnisse ermutigend sind und die Werte der hohen Alloantworten prä-Tx schon jetzt große klinische Relevanz besaßen, kann der einzelne Patient nur Nutzen aus dem Verfahren ziehen, wenn es in Zukunft generell einen prädiktiven Wert bekommt. Vor Einsatz in einer klinischen Studie, die beispielsweise eine Therapieänderung oder die Durchführung einer Biopsie in Abhängigkeit der im ELISpot-Assay ermittelten Werte nach sich zöge, sollten die methodischen Probleme verringert werden, um eine höhere Reliabilität und ggf. klinische Relevanz zu erlangen.

7.2 Immunologische Interpretation

7.2.1  Allgemeine Interpretation der gemessenen Zellen

Zellen prä-Tx

▼ 88 

Vor Transplantation gemessene spenderreaktive, IFNγ-produzierende Zellen konnten nicht in Zusammenhang mit dem HLA-Mismatch zwischen Spender und Empfänger gebracht werden. Sie können als präformierte Gedächtnis-T-Zellen interpretiert werden, die durch ein unbekanntes Antigen geprimt wurden und nach Transplantation mit dem fremden Gewebe kreuzreagierten. Der fehlende Zusammenhang zu Schwangerschaften, Transfusionen, vorherigen Transplantationen und CMV-Infektionen deutet womöglich auf die vielseitige Genese der Zellen in dieser kleinen untersuchten Patientengruppe hin. Andere Virus- und Bakterieninfektionen können eine Rolle spielen.

Humorale versus zelluläre Sensibilisierung

Obwohl Patienten, die humoral nicht sensibilisiert waren, das heißt, bei denen vor der Transplantation nie präformierten Antikörper gegen fremde HLA-Moleküle nachweisbar waren, im allgemeinen auch niedrigere Frequenzen spenderreaktiver Zellen aufwiesen, zeigte sich wie auch in der Arbeit von Heeger et al. [95], dass Patienten mit den höchsten Frequenzen spenderreaktiver Zellen unter Umständen keine präformierten Antikörper besaßen und Patienten mit dem größten gemessenen Prozentsatz an präformierten Antikörpern niedrige Frequenzen spenderreaktiver Zellen vor der Transplantation zeigten. Die zelluläre Sensibilisierung gegen körperfremdes Gewebe scheint daher von der humoralen Sensibilisierung teilweise unabhängig.

▼ 89 

Einfluss der zellulären Sensibilisierung

Alle fünf Patienten mit Werten von über 200 Spots prä-Tx erlitten eine frühe akute Rejektion, allerdings taten sie dies zu völlig unterschiedlichen Zeitpunkten und mit unterschiedlicher Schwere. Die Transplantatbeschaffenheit (Vorschäden, Peritransplantationsstress), die Einfluss auf die Antigenität des Transplantats hat, die Art der Immunsuppression (z.B. FTY720, siehe Patient 5 und Abschnitt 7.3) und eventuell eine zusätzliche humorale Sensibilisierung, wobei antikörpervermittelte Komplementreaktionen zu einer Gewebsschädigung und damit ebenfalls zu einer erhöhten Antigenität des Transplantats führen (siehe Patient 4 und 6 und Abschnitt 7.3), können womöglich die Auswirkung einer zellulären Sensibilisierung auf das Transplantat modifizieren.

Zellen post-Tx

▼ 90 

Nach Transplantation konnte man im ELISpot-Assay sowohl überlebende präformierte Gedächtniszellen als auch aus naiven T-Zellen neu gegen den Spender geprimte Effektor-T-Zellen messen. Bei den Patienten 4, 5, 6 und 7 sank zwar die Anzahl der gemessenen spenderreaktiven, IFNγ-produzierenden Zellen vom prä-Tx-Wert zum Wert des Tag 1 post-Tx, diese können aber immer noch als Gedächtniszellen gedeutet werden. Dass die Anzahl der gemessenen Zellen vor Transplantation mit der am Tag 1 post-Tx, in Woche 3 und der maximalen Anzahl post-Tx korrelierten, bezeugt den Anteil, den möglicherweise auch proliferierte Gedächtniszellen an den jeweiligen Messwerten post-Tx hatten. Dagegen ließen sich bei Patient 10, 11, 13 und 14 erst nach der Transplantation spenderreaktive, IFNγ-produzierende Zellen nachweisen, die als neu geprimte Effektorzellen gedeutet werden können. Im Gegensatz zu den Gedächtniszellen prä-Tx korrelierte die Anzahl der gemessenen Zellen post-Tx mit dem HLA-Mismatch, besonders in Woche 2, was ebenfalls für die Generation neuer spenderreaktiver Effektorzellen spricht.

Eine mögliche durch längere Ischämiezeit bei Kadaverspenden entstandene Schädigung mit zugehöriger höherer Antigenität des Transplantats könnte eine Erklärung für die höheren maximalen Frequenzen spenderreaktiver Zellen post-Tx bei Patienten mit Kadaverspende im Vergleich zu Patienten mit einer Lebendspende sein.

Interessant war die Feststellung, dass Patienten mit den höchsten maximalen und mittleren Werten post-Tx jeweils mindestens 79 Monate hämodialysiert wurden. Nach klinischer Erfahrung haben Dialysepatienten neben der renalen Anämie und daher erhöhtem Transfusionsbedarf auch ein deutlich erhöhtes Infektionsrisiko, was zusammen eine erhöhte Wahrscheinlichkeit immunologischer Sensibilisierungen bedeutet. Drei der Patienten wiesen tatsächlich auch höchste prä-Tx-Werte auf.

7.2.2 Subklinische Rejektion

▼ 91 

Die Arbeitsgruppe um D. Rush untersuchte die Unterschiede zwischen klinischer und subklinischer Rejektion anhand von Aktivierungsmarkern in Nierentransplantatbiopsaten. Sie stellten eine Zunahme der Expression von inflammatorischen Markern in normalen Biopsien, über Biopsien mit subklinischen zu klinischen akuten Rejektionen für alle Zellen der lymphatischen und monozytären Reihe fest. Während jedoch keiner der anderen Marker zu einer Diskriminierung zwischen subklinischer und klinischer Rejektion beitrug, war der Aktivierungsmarker für Makrophagen AIF1 über zehnmal stärker in klinischen akuten Rejektionen exprimiert als in subklinischen Rejektionen. Das deutet darauf hin, dass die Einschränkung der Nierenfunktion durch eine klinische akute Rejektion zumindest zum Teil auf vasokonstriktorische oder zytotoxische Substanzen zurückgeht, die von Makrophagen stammen [104].

In einer Untersuchung nierentransplantierter Patienten ohne klinische akute Rejektion durch Legendre et al. ging der Entwicklung einer CTN zwei Jahre post-Tx eine subklinische akute Rejektion, innerhalb der ersten drei Monate post-Tx voraus [105]. Zwei weitere Studien zeigten, dass subklinische Rejektionen zu einer Zunahme der Fibrosierung in Protokollbiopsien bei Kindern führten [106, 107]. Insofern liegt die Vermutung nahe, dass subklinische Rejektionen zu der Entstehung einer CTN beitragen.

Eine andere Beobachtung widerspricht dieser These nicht. Einige Autoren erbrachten Hinweise, dass sowohl für direkt wie auch indirekt geprimte Zellen die Frequenz der auftretenden T-Zellen entscheidend für das Organ ist, wobei es unter einer bestimmten Schwelle nicht zu einer akuten Rejektion, sondern zu einer geringfügigeren Schädigung des Organs kommen könnte, die allerdings in Fibrose und Vaskulopathie im Sinne einer CTN mündet [108, 109, 110, 111]. Man könnte daher vermuten, dass eine zu kleine Anzahl spenderreaktiver T-Zellen nicht ausreicht, um eine suffiziente DTH-Reaktion - zytotoxische T-Zellantwort und Makrophagenaktivität - zu generieren, und damit eine akute klinische Rejektion mit einer eingeschränkten Nierenfunktion zu vermitteln. Stattdessen kommt es zu einer subklinischen Rejektion, die trotzdem die Bildung einer CTN begünstigt.

▼ 92 

Serón et al berichteten, dass der Grad der interstitiellen Infiltration in Protokollbiopsien sechsWochen post-Tx bei 35 nierentransplantierten Patienten mit stabiler Transplantatfunktion negativ mit der Nierenfunktion sechs Monate post-Tx korrelierte [112]. Da auch die Anzahl der in der vorliegenden Arbeit gemessenen spenderreaktiven, IFNγ-produzierenden Zellen im Blut innerhalb der ersten drei Monate post-Tx mit der Nierenfunktion sechs Monate, aber auch ein Jahr post-Tx negativ assoziiert war, könnten die in dieser Arbeit gemessenen Zellen im Blut Korrelate der transplantatinfiltrierenden Zellen darstellen - möglicherweise vor Infiltration.

In diesem Falle würde die Messung spenderreaktiver, IFNγ-produzierender Zellen im Blut als noninvasiver, früher Marker für subklinische und klinische akute Rejektionen fungieren, und damit auch als prognostischer Marker.

7.2.3 Direkte versus indirekte Präsentation

Eine Kernidee in der Transplantationsmedizin ist die Annahme, dass direkt geprimte T-Zellen vor allem akute Rejektion in der Frühphase nach Transplantation initiieren, während die spezifische Alloantwort nach Absterben der antigenpräsentierenden Zellen des Spenders später überwiegend mittels indirekt geprimter T-Zellen vermittelt wird. Der indirekte Weg der Präsentation wird daher auch mit einer chronischen Schädigung des Organs im Sinne einer CTN in Verbindung gebracht.

▼ 93 

Experimente von Lechler et al. führten zu der Beobachtung, dass in Ratten durch die Depletion der Spenderleukozyten aus Nierentransplantaten ein permanentes Überleben der transplantierten Organe zu erreichen war. Die Injektion von dentritischen Zellen des Spenders hingegen führte zu einer abrupten akuten Rejektion des Organs [113, 114]. Daraus schlussfolgerte man, dass die dentritischen Zellen des Spenders T-Zellen des Empfängers über den direkten Präsentationsweg aktivierten, die eine akute Rejektion des Organs vermittelten. In diesem Model tragen direkt geprimte T-Zellen zu einer Tubulitis des Transplantats - durch direkte Erkennung der fremden Tubuluszellen - und zu einer Vaskulitis - durch direkte Erkennung der fremden Endothelzellen-, welche beide kennzeichnend für eine akute Rejektion sind, bei.

Da dieser Weg nur innerhalb der ersten paar Wochen nach Transplantation, solange dentritische Zellen des Spenders zur Verfügung stehen, beschritten werden kann, müsste nach dieser Zeit die indirekte Präsentation in den Vordergrund treten. Dies unterstützend beobachteten mehrere Autoren eine spenderspezifische Hyporeagibilität für direkt geprimte CD4pos- und CD8pos-Zellen im Verlauf nach Nierentransplantation [115], die entweder durch Deletion oder Anergie der betreffenden Zellen verursacht sein könnte. Diese Beobachtung konnte man in Patienten mit einer CTN und in Patienten mit stabiler Transplantatfunktion gleichermaßen machen, weshalb vermutet wurde, dass direkt geprimte T-Zellen nicht Hauptakteure bei der Entstehung einer chronischen Rejektion sind. Andererseits beschrieben viele Studien eine erhöhte Frequenz alloreaktiver indirekt geprimter T-Zellen in Patienten mit chronischer Transplantatschädigung nach Herz-, Nieren- und Lungentransplantation [26, 68]. Indirekt geprimte T-Zellen können aber auch allein eine akute Rejektion auslösen, wie in Mausmodellen an Hauttransplantaten gezeigt wurde [116, 117], dazu kommt, dass sie in kleiner Population (1-5 % aller T-Zellen) schon nach 11 Tagen post-Tx in Lymphknoten nachgewiesen werden konnten [118].

Der Mechanismus, über den indirekt geprimte T-Zellen akute und chronische Rejektion vermitteln, ist nicht vollständig verstanden. Als mögliche Erklärungen werden die „Delayed Type Hypersensitivity“-Reaktion (DTH) und der Angriff auf eingewandertes Endothel des Empfängers ins Transplantat angeführt. Bei dem ersten werden indirekt geprimte CD4posT-Zellen durch ins Transplantat eingewanderte Monozyten und Makrophagen, welche endozytiertes Spenderantigen präsentieren, aktiviert und sezernieren Zytokine (z.B. IFNγ), die wiederum Makrophagen aktivieren zytotoxische Mediatoren wie Nitritoxid, freie Radikale, TNFα auszuschütten. Durch Bystander-Aktivierung können auch unspezifische T-Zellen mit einbezogen werden. Beim zweiten würden eingewanderte Endothelzellen des Empfängers, welche theoretisch Spenderantigen endozytieren und präsentieren könnten, ein direktes Ziel für indirekt geprimte CD8posT-Zellen darstellen, wodurch es zu Gefäßschäden und ischämischer Zerstörung des Transplantats kommen könnte. He et al. konnten im Mausmodell zeigten, dass CD8pos-Zellen ein Hauttransplantat zerstören konnten, ohne dabei Antigen - präsentiert durch Hautzellen des Spenders - zu erkennen [119].

▼ 94 

Die in dieser Arbeit gemessenen Zellen wurden wahrscheinlich sowohl durch den direkten Weg als auch durch den indirekten Weg geprimt. Theoretisch wurde im verwendeten ELISpot-Assay mit ganzen Zellen stimuliert. Da Zellen unter Kryokonservierung jedoch zerstört werden können, ist es nicht ausgeschlossen, dass sich unter dem Stimulationszellgemisch auch Zellfragmente befanden. Monozyten und B-Zellen des Empfängers könnten diese Zellfragmente phagozytiert und Spenderantigene präsentiert haben. Durch die direkte und indirekte Präsentation von Spenderantigen könnten direkt und indirekt geprimte T-Zellen aktiviert und zu einer IFNγ-Produktion animiert worden sein.

Auf der anderen Seite sprechen die Messzeitpunkte innerhalb der ersten drei Monate post-Tx für eine Dominanz der direkten Antwort. Die meisten der ermittelten Werte für spenderreaktive, IFNγ-produzierende Zellen liegen innerhalb der ersten vier Wochen post-Tx vor. Auch die meisten maximalen Werte wurden in diesem Zeitraum gemessen. In diesem Zeitraum wurden daher möglicherweise überwiegend direkt geprimte T-Zellen gemessen. Bereits innerhalb der ersten Woche nach Transplantation kommt es zu einer Migration der Spenderleukozyten aus dem Transplantat in die Empfängerlymphknoten und zur Aktivierung naiver T-Zellen durch direkte Präsentation mit anschließendem Ausschwärmen ins Blut. Nach klinischer Erfahrung erleiden nierentransplantierte Patienten in diesem Zeitraum die meisten akuten Rejektionen. Die Korrelation der Messwerte mit der Nierenfunktion ein Jahr post-Tx lässt sich damit eher auf eine Schädigung der Organe durch subklinische und klinische akute Rejektionen hervorgerufen durch direkt geprimte T-Zellen als durch eine chronische Schädigung durch indirekt geprimte T-Zellen erklären.

Für die Werte vor Transplantation bzw. zu einem späteren Zeitpunkt nach Transplantation ist ein höherer Anteil indirekt geprimter T-Zellen aber denkbar. Für weitere Studien zu späteren Messzeitpunkten, bei einem angenommenen Überwiegen der indirekt geprimten T-Zellen, könnte sich ein für die Messung indirekt geprimter T-Zellen modifizierter Ansatz als sinnvoller erweisen, z.B. durch Stimulation mit reinen Zellfragmenten von Spenderzellen [120] oder spenderspezifischen Peptiden [121].

7.2.4 T1/T2-Polarisation

▼ 95 

IFNγ wurde in dieser Arbeit als Marker für Effektor- und Gedächtniszellen benutzt. Auf diese Weise konnten jedoch nicht alle spenderreaktiven T-Zellen bestimmt werden, da nicht alle aktivierten Spenderreaktiven Zellen IFNγ produzieren.

Dem Th1/Th2 Paradigma zufolge differenzieren T-Helferzellen nach Aktivierung in Abhängigkeit von bestimmten Zytokinen der Umgebung und der Bindung zur antigenpräsentierenden Zelle in Effektorzellen mit einem Th1-Muster, die vorrangig IL2, IFNγ und TNFα sezernieren und eine starke Makrophagenaktivität und zellvermittelte Immunität hervorrufen, oder mit einem Th2-Muster, die IL4, IL5, IL6, IL9, IL10, and IL13 ausschütten, welches zu einer Hemmung der Makrophagenaktivität, einer starken Antikörperbildung durch B-Zellaktivierung (besonders IgG1 und IgE) und Rekrutierung von eosinophilen Granulozyten führt. Eine Th1-Antwort des Immunsystems findet sich bei Virusinfektionen, intrazellulären Bakterien und Autoimmunkrankheiten wie z.B. Morbus Crohn. Wurm- und viele Parasitenerkrankungen führen zu einer Th2-Antwort. Aber auch Allergiker und Atopiker leiden unter einer übermäßigen Th2-Antwortbereitschaft. Ein ähnliches Model besteht auch für CD8pos-T-Zellen (Tc1/Tc2).

Lange Zeit nahm man an, dass ein Überwiegen von T1-polarisierten Zellen mit der akuten Rejektion eines Organs nach Transplantation assoziiert ist [82, 122, 123], während eine T2-basierende Immunantwort zur Entwicklung von Toleranz gegenüber dem Transplantat führt, welche mit einem langen Transplantatüberleben assoziiert ist [124]. Dafür spricht z.B. auch, dass der wirkungsvolle Anti-CD3-Antikörper OKT3, der erfolgreich gegen akute Rejektionen eingesetzt wird, zu einer T-Zell-Depletion vor allem T1-polarisierter Zellen im Blut führt [125]. In nierentransplantierten Mäusen unter Immunsuppression konnten Saggi et al. IFNγ-mRNA nur in Transplantaten mit akuter Rejektion nachweisen, während IL10 mRNA nur in tolerierten Transplantaten messbar war [126]. Trotzdem und im Gegensatz dazu konnte jedoch gezeigt werden, dass ein Th1 Profil für eine Rejektion nicht unbedingt erforderlich ist und eine Th2-gesteuerte Immunantwort ebenfalls eine akute Rejektion hervorrufen kann und keinesfalls nur transplantatprotektiv wirkt [127]. Im Widerspruch zu der Arbeit von Saggi et al stellten einige Arbeitsgruppen sogar eine signifikante Beziehung zwischen einer akuten Rejektion und der Expression von IL10 im Transplantat fest [128]. In SCID Mäusen ohne funktionelle T- oder B-Zellen konnte sowohl mit der alleinigen Injektion von transplantatreaktiven Th1- als auch Th2-Zellen eine akute Rejektion eines Herztransplantates ausgelöst werden [129]. Ein ähnliches Experiment zeigte, dass auch Tc1-Zellen und Tc2-Zellen jeweils eine akute Rejektion verursachen können, wenn auch unter unterschiedlichem histologischen Bild [130]. Bei Th2-getriggerten Rejektionen ist z.B. eine Rekrutierung von eosinophilen Granulozyten typisch [131]. In einigen Arbeiten scheint ein bestimmtes Verhältnis zwischen Th1 und Th2-Muster [132] oder aber auch ein Wechsel zwischen beiden relevant für das Auftreten einer akuten Rejektion zu sein [133].

▼ 96 

In der vorliegenden Arbeit wurden daher möglicherweise nicht alle für das Transplantationsergebnis entscheidenden T-Zell-Subgruppen erfasst, da nur T1-polarisierte Zellen gemessen wurden. Trotzdem unterstützt diese Arbeit die Vorstellung, dass T1-polarisierte T-Zellen mit einer überwiegenden Sekretion von IFNγ einen wesentlichen Beitrag für die Pathologie von Nierentransplantaten in den ersten drei Monaten post-Tx leisten. Das steht in Übereinkunft mit Arbeiten von Heeger et al. und Hricik et al., die ebenfalls spenderreaktive, IFNγ-produzierende Zellen in Nierentransplantierten prä-Tx bzw. post-Tx gemessen haben und eine Assoziation zum Auftreten akuter Rejektionen bzw. der Nierenfunktion nach sechs Monaten post-Tx feststellen konnten [95, 134]. Es ist außerdem konsistent mit Arbeiten von van Besouw et al. [82], Segerer et al. [122] und D´Élios et al. [123], die in Herztransplantaten bzw. Nierentransplantaten eine prädominante Infiltration von T1-Zellen in Transplantatbiopsien während akuter Rejektionsepisoden beobachteten.

Möglicherweise würde eine zusätzliche Messung T2-polarisierter Zellen weitere diagnostische und prognostische Informationen liefern. Obwohl jedoch die Messung von IL4 und IL5 im ELISpot-Assay generell ebenso möglich ist, und IL4- und IL5-produzierende T-Zellen in PBMZ von Allergikern im ELISpot-Assay durchaus hohe Frequenzen aufweisen können [95, 132], konnten bisher im ELISpot-Assay nach Nierentransplantation keine spenderreaktiven, IL4-, IL5- oder IL10-produzierenden Zellen gemessen werden [102]. Inwieweit das nur eine Frage der Anzahl T2-polarisierter Zellen im peripheren Blut, oder aber eine Frage der Bedeutung dieser Zellen für das Transplantat innerhalb dieses frühen Zeitraums post-Tx ist, bleibt noch offen.

7.2.5 CD4pos-/CD8posT-Zellen

Bei den in dieser Arbeit gemessenen Zellen kann es sich sowohl um CD4pos als auch CD8pos Effektor-T-Zellen handeln, da beide T-Zell-Subgruppen IFNγ produzieren können.

▼ 97 

Mit der Methode der LDA können spenderreaktive T-Helferzellen und zytotoxische T-Zellen differenziert und quantifiziert werden. Eine Unterscheidung zwischen naiven Zellen und Effektorzellen wurde bisher aber meist nicht unternommen:

Van der Mast et al. fanden eine höhere Anzahl Helfer-Zellen im Blut vor der Transplantation bei Nierenpatienten, die später eine akute Rejektion ihres Organs erlebten [91] während van Hoffen et al. bei Herztransplantierten erhöhte Frequenzen von Th2-Zellen bei Patienten beobachteten, die später keine akute Rejektion erlitten [135]. Hu et al. beschrieben dagegen eine signifikant höhere Anzahl zytotoxischer T-Zellen im Blut bei Patienten vor Transplantation, die später ihr Herztransplantat abstießen [136]. Und Bouma et al. schließlich fanden in nichtsensibilisierten Nierentransplantationspatienten gar keinen Zusammenhang zwischen den Frequenzen von weder zytotoxischen T-Zellen noch Helfer-T-Zellen im peripheren Blut vor Transplantation und dem Auftreten einer akuten Rejektion oder der Langzeitfunktion des Transplantats [137].

Für die Messung von T-Zellen nach Transplantation stellten Ouwehand et al. einen Zusammenhang zwischen dem Anstieg von schon geprimten zytotoxischen T-Zellen mit dem Auftreten einer akuten Rejektion fest [138]. Vaessen et al hingegen beschrieben einen signifikanten Anstieg von Helfer-T-Zellen im Blut während einer akuten Rejektion eines Herztransplantats [139]. Van Besouw et al. zeigten, dass man die Immunsuppression in nierentransplantierten Patienten mit niedrigen Frequenzen zytotoxischer T-Zellen im Gegensatz zu denen mit hohen Frequenzen risikofrei für eine akute Rejektion minimieren kann [140] und Herzog et al. beschrieben das Absinken der Frequenz zytotoxischer T-Zellen als Marker für eine gute Langzeitfunktion[141]. Andere Arbeiten wiederum beobachteten eine gute Funktion von Leber- und Herztransplantaten nach über einem Jahr trotz Anwesenheit hoher Frequenzen zytotoxischer T-Zellen im peripheren Blut [142, 143]. Während die meisten Studien keine klinische Relevanz für die Frequenz von Helfer-T-Zellen im Blut nach Transplantation feststellten, beschrieben Beik et al. eine bessere Langzeitfunktion und weniger akute Rejektionen in Nierentransplantierten, in denen die Frequenz von Helfer-T-Zellen im Blut im Verlauf nach Transplantation abnahm [144]. Die Messungen der meisten dieser Studien fanden allerdings nach drei Monaten post-Tx statt.

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Anhand der Widersprüchlichkeit der genannten Studien kann man keine Aussagen über CD4pos- bzw. CD8posSubgruppen der im ELISpot in dieser Arbeit gemessenen IFNγ-produzierenden Effektorzellen machen. Da jedoch die Anzahl der gemessenen Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten post-Tx sowohl mit einem HLA-Klasse-I-Mismatch als auch mit einem HLA-Klasse-II-Mismatch korrelierten, scheinen post-Tx sowohl CD4pos- wie auch CD8posT-Zellen in dieser Studie erfasst worden zu sein.

7.2.6 Regulatorisches IFNγ?

Obwohl in dieser Arbeit eine signifikant negative Assoziation zwischen erhöhten Frequenzen spenderreaktiver, IFNγ-produzierender Zellen und der Nierenfunktion sechs Monate und ein Jahr post-Tx gefunden wurde, wiesen drei Patienten (16, 17, 18) trotz Zellfrequenzen von über 100/3*105 PBMZ post-Tx nach einem Jahr eine gute Nierenfunktion auf, und erlitten nie eine akute Rejektion. Die Messzeitpunkte der ermittelten Werte lagen zwischen drei Wochen und sieben Monaten post-Tx. Welche Funktion die gemessenen Zellen gegenüber dem Transplantat der Patienten ausübten und welcher Mechanismus jeweils zugrunde lag, kann nur spekuliert werden:

Seit einigen Jahren wird zunehmend über die Bedeutung sogenannter regulatorischer T-Zellen diskutiert. Für viele T-Zell-Subpopulationen mit CD4pos, CD8pos, CD4negCD8neg Phänotyp sowie für sogenannte natürliche Killer-T-Zellen wurde dabei ein regulatorischer Effekt in verschiedenen Situationen nach Transplantation, zum Teil über Zell-Zellkontakte zum Teil über Zytokinsekretion vermittelt, beschrieben [145]. Neben der Sekretion von IL4, IL10 oder TGFβ wurde bei CD4posCD25pos, bei natürlichen Killer-T-Zellen und bei 4C8pos T-Zellen auch IFNγ-Sekretion beobachtet [146]. Während zwar bisher in der überwiegenden Literatur IL10, TGFβ und kostimulatorische Oberflächenmoleküle für die regulatorische Funktion in vitro von CD4posCD25posT-Zellen verantwortlich gemacht wurden [147, 148], konnte in vivo gezeigt werden, dass im Gegenteil eine Immunregulation durch die genannten Zellen von einer erhöhten, antigenspezifischen Expression von IFNγ abhängt [149]. CD4posCD25pos regulatorische T-Zellen können durch CD4pos- oder CD8pos-T-Zellen vermittelte akute Rejektionen verhindern und Transplantat-Toleranz auslösen [145, 147]. Sie kommen in naiven Empfängern vor, können aber auch induziert werden. Spenderspezifische Transfusionen in Kombination mit CD4-Antikörpern können spenderspezifische regulatorische CD4posCD25pos T-Zellen generieren [147].

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Neuere Studien verweisen mittlerweile auf nicht nur proinflammatorische sondern auch regulatorische Funktionen von IFNγ. Endogenes IFNγ scheint in einigen Autoimmunmodellen eine immunsuppressive Rolle zu spielen. In Mäusen mit experimenteller Autoimmunenzephalomyelitis (EAE) führte die Behandlung mit IFNγ-Antikörpern zu einer Verstärkung der Symptome und der Mortalität [150] und IFNγ- und IFNγ-Rezeptor-Knockout-Mäuse waren sensitiver bezüglich der Induktion von EAE gegenüber dem Wildtyp [151]. Besonders interessant sind jedoch die Beobachtungen, dass sich die Rejektionsraten von Herztransplantaten zwischen IFNγ-Knockout-Mäusen und Wildtypen nicht unterscheiden und dass in IFNγ-Knockout-Mäusen keine Transplantattoleranz induziert werden kann [151, 152]. Endogenes IFNγ scheint für das Langzeitüberleben von Transplantaten verantwortlich zu sein, welches unter der medikamentösen CD28- und CD40-Kostimulationsblockade von T-Zellen auftritt [151, 156]. Außerdem kann IFNγ Th2-vermittelte Rejektionen regulieren [131].Obwohl die Sekretion von IFNγ unter bestimmten Umständen eine inflammatorische Th1-getriebene Immunantwort verkörpert, kann sie unter anderen einen immunsuppressiven Effekt vermitteln. Mögliche Mechanismen sind dabei Apoptoseinduktion und Proliferationsinhibition alloaktivierter T-Zellen [151, 154, 155]

Obwohl sehr spekulativ, könnten die hohen Frequenzen spenderreaktiver, IFNγ-produzierender Zellen post-Tx von Patient 18, der vor Transplantation 20 Transfusionen bekam, oder von den Patienten 16 und 17, die perioperativ mit CD3-Antikörper OKT3 behandelt wurden, zum Teil auch regulatorische T-Zellen repräsentieren.

7.3 Klinische Relevanz der Ergebnisse

7.3.1  Bestimmung spenderreaktiver, IFNγ-produzierender Zellen prä-Tx

Frühe akute Rejektion en

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Die vorliegende Arbeit konnte die Ergebnisse von Heeger et al. [95] innerhalb einer weiteren Patientenpopulation bestätigen, dass Patienten, die bereits vor der Nierentransplantation im Blutkreislauf eine hohe Anzahl spenderreaktiver, IFNγ-produzierender Zellen aufweisen, ein erhöhtes Risiko besitzen, ihr Transplantat abzustoßen. Dabei wurde mit einem Cut-Off von 200 IFNγ-produzierenden Zellen/3*105 PBMZ ein wesentlich höherer Wert bestimmt als von Heeger et al, bei denen bereits mehr als 50 IFNγ-produzierende Zellen/3*105 PBMZ vor der Transplantation prädiktiv für das Auftreten einer akuten Rejektion waren. (Die Unterschiede können auf die verschiedenen Patientengruppen sowie auf verschiedene Einstellungen bei der computergestützen Auswertung des ELISpot-Assays zurückgeführt werden). Eine sowohl zelluläre als auch zumindest historisch humorale Sensibilisierung von PRA 63 % bzw. 44 % (bei aktuellen PRA von 0 bzw 4 %) wie sie Patient 4 und 6 aufwiesen, könnte die Prognose des Transplantats besonders ungünstig beeinflussen. Beide Patienten erlebten in der ersten Woche post-Tx eine schwere vaskuläre Rejektion, die zu einer langfristigen Einschränkung der Nierenfunktion führte.

Die klinische Relevanz dieses Ergebnisses liegt auf der Hand: Einige Patienten mit dem Risiko, ein bestimmtes Organ akut abzustoßen, können mit Hilfe des ELISpot-Assays vor der Transplantation identifiziert werden. Besonders bei der Transplantation einer Lebendspende, die organisatorisch genügend Zeit für die Durchführung des ELISpot-Assays lässt, könnte das Organ durch ein „zellulären Crossmatch“ besser ausgewählt werden. Bei der Transplantation von Kadaverspenden, die aufgrund des in der Wartezeit resultierenden Ischämieschadens des Spenderorgans ein Abwarten des ELISpot-Ergebnisses nicht zulässt, könnte eine zelluläre Sensibilisierung jedoch immerhin noch am ersten oder zweiten Tag post-Tx erkannt werden. Zusätzlich könnten Patienten auf der Nierentransplantationswarteliste ähnlich wie nach präformierten HLA-Antikörpern auch nach HLA-spezifischen T-Zellen gescreent werden, wobei zur Stimulation statt Spenderzellen Zelllinien mit bestimmten HLA-Molekülen (direkte Präsentation) oder Peptide von HLA-Molekülen (indirekte Präsentation), wie von Najafian et al. beschrieben [121], eingesetzt werden könnten. Bestimmte HLA-Mismatch-Kombinationen, gegen die auf zellulärer Ebene eine Sensiblisierung vorliegt, könnten vermieden und Hochrisikopatienten, die nur auf zellulärer, aber nicht auf humoraler Ebene sensibilisiert sind, sodass bei ihnen keine präformierten Antikörper detektierbar sind, erkannt werden. Nach den vorliegenden Daten ist die Identifizierung eines Patienten mit einer zellulären Sensibilisierung gegen das Spenderorgan mit dem ELISpot-Assay möglich. Zukünftige Studien, die das ELISpot-Assay mit der in der vorliegenden Studie erarbeiteten methodischen Verbesserung verwenden, müssen belegen, ob eine Anpassung der immunsuppressiven Therapie anhand von ELISpot-Messungen einen klinischen Benefit für die so behandelten Patienten darstellt.

Toleranzinduzierende Therapieschemata, die auf einer Blockade der kostimulatorischen Rezeptoren (CD28, CTLA-4, CD154) beruhen, sind möglicherweise bei sensibilisierten Patienten weniger erfolgreich, wie anhand von Tierexperimenten nahe gelegt wurde [157, 158]. Während nämlich ein Antigenkontakt einer spenderspezifischen naiven T-Zelle unter Blockade kostimulatorischer Rezeptoren zu einer Anergie der Zelle ohne Ausbildung einer entsprechenden Effektorfunktion und damit zu einer Toleranz gegenüber dem fremden Organ führt, so können Gedächtnis-T-Zellen weitgehend unabhängig von Kostimulation aktiviert werden und eine Effektorfunktion gegen das Transplantat erlangen. Für FTY720, dessen transplantatschützende Eigenschaften einer erniedrigten T-Zell-Frequenz im peripheren Blut zuzuschreiben ist, welche vor allem durch verstärktes Homing reifer T-Zellen in sekundäre lymphatische Organe wie Lymphknoten und Peyer´sche Plaques aber auch durch verminderte Emigration reifer T-Zellen aus dem Thymus sowie Apoptoseinduktion in T-Zellen erklärt wird [159, 160, 161], wurde ebenfalls eine geringere Wirkung auf Effektor-Gedächtniszellen beschrieben [162], die allerdings auch eine wesentlich schwächere Expression von Homing-Rezeptoren aufweisen. Das Beispiel des Patienten 5, der vor der Transplantation eine hohe Anzahl spenderreaktiver Zellen aufwies, mit FTY720 behandelt wurde und innerhalb der ersten Woche eine schwere akute Rejektion erlitt, die zum Verlust des Organs führte, weist darauf hin, dass auch der Einsatz von FTY720 bei zellulär sensibilisierten Patienten trotz der ausgeprägten T-Lymphozytopenie nicht erfolgreich ist.

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Ein immuntherapeutisches Regime müsste bei sensibilisierten Patienten daher andere Ansätze verfolgen. Die selektive T-Zell-Depletion hat bereits eine wichtige Bedeutung für die bisherige Behandlung sensibilisierter Patienten (z.B. Charité: 2x2,5 mg OKT3 perioperativ, z.B. USA: polyklonaler Kaninchen anti-Thymozyten-Gobulin ATG [163]). Für den T-Zell-Antikörper OKT3 wurde ein besonders depletierender Effekt bezüglich schon geprimter T-Zellen dokumentiert [125] und eine vorübergehende CD8posT-Zell-Depletion konnte die in sensibilisierten Mäusen auftretenden durch alloreaktive CD8pos-Gedächtniszellen vermittelten, CD154-Blockade-resistenten akuten Rejektionen verhindern [158]. Auch nichtdepletierende Verfahren wie die Blockade von CD4pos-oder CD8posT-Zellen durch CD4- bzw. CD8-Antikörper erwiesen sich in Tiermodellen als wirkungsvoll, da sie in geprimten, alloreaktiven T-Zellen Toleranz gegenüber dem Transplantat hervorrufen konnten [163]. Neue vor kurzem beschriebene Kostimulationswege über die nur auf aktivierten T-Zellen exprimierten Oberflächenmoleküle ICOS, OX40 und PD-1 könnten, da anscheinend ohne Effekt auf naive T-Zellen in die Reaktivierung von Gedächtniszellen involviert, neue Ansatzpunkte für die Verhinderung der Reaktivierung alloreaktiver Gedächtniszellen geben [165].

Langzeitfunktion

Trotz der Vorhersagekraft des Assays für das Auftreten einer akuten Rejektion konnte jedoch kein Zusammenhang zwischen einer erhöhten Anzahl spenderreaktiver, IFNγ-produzierender Zellen vor der Transplantation und dem Zeitpunkt (zwischen einer Woche und 6 Monaten post-Tx) oder der Stärke (zwischen „borderline changes“ und Typ 3) der akuten Rejektionsepisoden gefunden werden. Obwohl das Auftreten von akuten Rejektionen einen Hauptrisikofaktor für die Entwicklung einer CTN darstellt und prognostisch ungünstig für die Langzeitfunktion des betroffenen Nierentransplantats ist, konnte weder in dieser Studie noch von Heeger et al. ein direkter Zusammenhang zwischen einer erhöhten Anzahl spenderreaktiver, IFNγ-produzierender Zellen vor der Transplantation und der Nierenfunktion in der Nachbeobachtungszeit (ein Jahr nach Transplantation GFR zwischen 63,5 ml/min/1,73m2 und absoluten Funktionsverlust) gefunden werden. Im Gegensatz zu Heeger et al, in deren untersuchter Patientengruppe Patienten mit den niedrigsten Werten für IFNγ-produzierende Zellen prä-Tx rejektionsfrei blieben [95], erlitten 13 Patienten in dieser Studie auch ohne stark erhöhte Werte vor der Transplantation eine akute Rejektion. Eine Identifizierung der auf zellulärer Ebene sensibilisierten Patienten vor der Transplantation würde daher also nur eine kleine Gruppe von Patienten (hier ca. 10 %) mit erhöhtem Rejektionsrisiko anscheinend unabhängig von der jeweiligen Langzeitprognose erfassen. Eine Aufwand-Nutzen-Relation ist zu überdenken. In Zusammenhang mit immuntherapeutischen Studien und humoralen Sensibilisierungen erscheint der Einsatz des ELISpot-Assays sinnvoll.

7.3.2 Bestimmung spenderreaktiver, IFNγ-produzierender Zellen post-Tx

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Frühe akute Rejektionen

In einer unabhängigen, methodisch ähnlichen Studie weisen Hricik et al. darauf hin, dass in ihrer Patientengruppe Patienten mit einer akuten Rejektionsepisode signifikant höhere mittlere spenderreaktive, IFNγ-produzierende Zellfrequenzen innerhalb der ersten sechs Monate post-Tx aufwiesen als Patienten ohne Rejektionsepisode, und dass Patienten mit den niedrigsten mittleren Werten für spenderreaktive Zellen innerhalb dieses Zeitraums generell rejektionsfrei blieben [134]. Dies wird in der vorliegenden Arbeit nicht unterstützt. Obwohl zumindest bei einigen Patienten während einer nachgewiesenen akuten Rejektion des Transplantats ein Anstieg der spenderreaktiven, IFNγ-produzierenden Zellen im Blutkreislauf nachvollziehbar war (siehe Abschnitt 6.1), so konnte doch kein zwingender Zusammenhang zwischen erhöhten Werten für spenderreaktive, IFNγ-produzierende Zellen nach der Transplantation und dem Auftreten einer klinischen akuten Rejektion gezeigt werden. Das kann unter anderem die weiter oben aufgeführten methodischen aber auch logistische Gründe haben. Nicht immer war es möglich, vor oder während des Verdachts auf eine akute Rejektion auch ein ELISpot-Assay durchzuführen, vor allem, wenn die Rejektionsepisode außerhalb der Studienzeit, also nach drei Monaten post-Tx lag. Die gemessenen Zellen könnten jedoch auch wie weiter oben erläutert im Zusammenhang mit dem Auftreten einer subklinischen akuten Rejektion stehen. Eine für den nierentransplantierten Patienten daher weit wichtigere Frage ist die nach der Prognose für die Langzeitfunktion des Nierentransplantates.

Langzeitfunktion

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In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Transplantationspatienten, deren Anzahl spenderreaktiver, IFNγ-produzierender Zellen im venösen Blut innerhalb der ersten drei Monate erhöht ist, ein Jahr nach Transplantation eine signifikant schlechtere Nierenfunktion aufwiesen als Patienten ohne spenderreaktive, IFNγ-produzierende Zellen in diesem Zeitraum. Dieses Ergebnis konnte durch Hricik et al. anhand von Mittelwerten über einen Zeitraum von sechs Monaten post-Tx für die Nierenfunktion sechs Monate post-Tx bestätigt werden [134]. Mehrere Studien an einigen Tausend Nierentransplantierten haben außerdem gezeigt, dass die Nierenfunktion sechs Monate bzw. ein Jahr nach Transplantation stark mit der Langzeitfunktion der Nierentransplantate assoziiert ist [2]. Insofern scheint die zelluläre Immunisierung gegen das Transplantat wie im ELISpot-Assay messbar schon innerhalb der ersten drei Monate post-Tx entscheidenden Einfluss auf die Langzeitfunktion des Nierentransplantats zu haben. Ein Anstieg der spenderreaktiven, IFNγ-produzierenden Zellen ohne Funktionsverschlechterung des Organs könnte einen Hinweis auf eine ablaufende „subklinische“ akute Rejektion geben, die einigen Autoren zufolge ähnlich wie die „klinische“ akute Rejektion prognostisch schlecht für die Langzeitfunktion des Nierentransplantates ist [9, 105, 112]. In diesem Falle würde der Anstieg spenderreaktiver, IFNγ-produzierender Zellen bei einigen Patienten (siehe Abschnitt 6.1) innerhalb der ersten drei Monate nach Transplantation sowie die eingeschränkte Nierenfunktion ein Jahr post-Tx mit einer GFR von teilweise weniger als 40 ml/min/1,73m2, ohne dass eine akute Rejektion nachgewiesen wurde, durch das Auftreten einer subklinischen Rejektion erklärbar sein.

Rush et al. konnten zeigen, dass Patienten, die innerhalb der ersten drei Monate post-Tx eine subklinische akute Rejektion erlitten, jedoch mit Kortikosteroiden therapiert wurden, signifikant weniger frühe und späte klinische akute Rejektionen durchmachten und nach zwei Jahren eine bessere Nierenfunktion hatten als Patienten, die im selben Zeitraum eine subklinische Rejektion erlebten, die nicht therapiert wurde [15]. Wenn also der Anstieg spenderreaktiver, IFNγ-produzierender Zellen im Blut Ausdruck verstärkter Immunaktivierung gegen das Transplantat ist, oder sogar ein Korrelat zu den von Rush et al. innerhalb der ersten drei Monate post-Tx gefundenen subklinischen akuten Rejektionen darstellt, so könnte eine veränderte Immunsuppression bzw. eine echte Therapie dieser subklinischen akuten Rejektion, die also im peripheren Blut messbar wäre, ebenfalls zu einer Verbesserung der Langzeitprognose des Transplantats beitragen. Dafür spricht auch die Tatsache, dass der Zusammenhang zwischen der Anzahl spenderreaktiver Zellen und Nierenfunktion nur in Patienten beobachtet wurde, bei denen keine klinische akute Rejektion festgestellt wurde. Da die klinischen akuten Rejektionen therapiert wurden, wurde zumindest bei einem Teil eine chronische Schädigung des Transplantats verhindert, wodurch sich die Nierenfunktion erholen konnte.

Während maximaler und mittlerer Wert der spenderreaktiven, IFNγ-produzierenden Zellen als Zeichen einer möglichen starken bzw. dauerhaften Immunaktivierung gegen das Transplantat sehr anschaulich sind und signifikant mit der Nierenfunktion nach einem Jahr korrelieren, so sind sie doch für die Klinik von weniger großem Nutzen, da man für ihre Bestimmung normalerweise mehrere Werte über den gesamten Zeitraum benötigt und unter Umständen z.B. für den maximalen post-Tx-Wert den richtigen Zeitpunkt „verpasst“. Dagegen stellt die routinemäßige Erfassung der spenderreaktiven, IFNγ-produzierenden Zellen aus PBMZ aller Nierentransplantierten zu einem oder mehreren Zeitpunkten zwischen Tag sieben und Tag 21 post-Tx ein weniger großes Problem dar. Da die Werte für spenderreaktive, IFNγ-produzierende Zellen in Woche 2 und noch mehr die Durchschnittswerte aus Woche 2 und 3 sehr gut, ja meistens sogar stärker mit der Nierenfunktion ein Jahr post-Tx korreliert sind, könnte das ELISpot-Assay zu diesem frühen Zeitpunkt mit der Messung spenderreaktiver, IFNγ-produzierender Zellen einen wichtigen prognostischen Marker für die Langzeitfunktion des Nierentransplantats bestimmen und Patienten identifizieren, die ein erhöhtes Risiko haben, einen immunologisch vermittelten Transplantatschaden zu erleiden, den man durch eine angepasste immunsuppressive Therapie vielleicht verhindern könnte. Aber auch eine zukünftige generelle Anpassung an aquirierte Effektormechanismen des Immunsystems wäre in diesem entscheidenden Zeitraum für alle Nierentransplantierten denkbar. Auf der anderen Seite könnte man bei Patienten, die nur geringe Frequenzen spenderreaktiver T-Zellen aufweisen, die Immunsuppression und damit die Nebenwirkungen dieser Medikamente reduzieren. So berichteten Van Besouw et al. beispielsweise, dass stabile nierentransplantierte Patienten, bei denen sich vor einer Umstellung der Immunsuppression von Ciclosporin auf entweder Azathioprin oder MMF mit zusätzlicher, langsamer Reduzierung der Dosis keine spenderspezifischen zytotoxischen T-Zellen im Blut nachweisen ließen, keine akuten Rejektionen des Transplantats erlebten. Außerdem wiesen Patienten ohne akute Rejektionen vor der Umstellung signifikant weniger zytotoxische T-Zellen im Blut auf als Patienten, die nach der Umstellung eine akute Rejektion erlebten [140].


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13.07.2007