Zusammenfassung

Abkürzungsverzeichnis

1 Einleitung

2 Theoretischer Hintergrund

• 2.1  Die akute Rejektion

  • 2.1.1  Diagnose

  • 2.1.2 Risikofaktoren

  • 2.1.3 Therapie

  • 2.1.4 Komplikationen

• 2.2 Die CTN- die chronische Transplantat-Nephropathie

  • 2.2.1  Diagnose

  • 2.2.2 Pathogenese

• 2.3 Der Tod des Patienten bei funktionsfähigem Transplantat

  • 2.3.1  Kardiovaskuläre Erkrankungen

  • 2.3.2 Tumore

  • 2.3.3 Infektionen

• 2.4 Die Immunantwort

  • 2.4.1  Bedeutung von T-Zellen

  • 2.4.2 T-Zellaktivierung

  • 2.4.3 Immunität gegen das Transplantat

  • 2.4.4 Bedeutung von IFNγ

  • 2.4.5 Gedächtniszellen und Effektorzellen

• 2.5 Das ELISpot-Assay - Enzyme-Linked Immunosorbent Spot Assay

3 Aufgabenstellung

4 Methoden

• 4.1 

  • 4.1.1  Studiendesign

  • 4.1.2 Zellpräparation

  • 4.1.3 Zellzahlbestimmung

  • 4.1.4 Kryokonservierung von Spenderzellen

  • 4.1.5 ELISpot-Assay

  • 4.1.6 CD2^posZelldepletion durch MACS - Magnetic Cell Sorting

  • 4.1.7 Messung des Anteils der T-Zellen in PBMZ

  • 4.1.8 Erfassung transplantationsspezifischer Daten

  • 4.1.9 Statistische Analysen

5  Materialien

• 5.1 

  • 5.1.1  Patienten und Probanden

  • 5.1.2 Verbrauchsmaterialien und wiederverwendbare Materialien

  • 5.1.3 Geräte

  • 5.1.4 Puffer, Lösungen, Zellkulturmedien

  • 5.1.5 MACS-Puffer

  • 5.1.6 Zellstimulantien undAntikörperkonjugate

  • 5.1.7 Verwendete Software

6 Ergebnisse

• 6.1  Einige Patientenbeispiele im Verlauf

  • 6.1.1  Patienten ohne Nachweis spenderreaktiver, IFNγ-produzierender Zellen

  • 6.1.2 Patienten mit spenderreaktiven Zellen prä-Tx

  • 6.1.3 Patienten mit spenderreaktiven Zellen post-Tx

  • 6.1.4 Patienten, die eine OKT3-Induktionstherapie erhielten

• 6.2 Spenderreaktive, IFNγ-produzierende Zellen prä-Tx

  • 6.2.1  Zusammenhang mit frühen akuten Rejektionen

  • 6.2.2 Zusammenhang mit der Nierenfunktion

  • 6.2.3 Zusammenhang mit Sensibilisierungsfaktoren

  • 6.2.4 Zusammenhang zwischen spenderreaktiven Zellen prä- und post-Tx

• 6.3 Spenderreaktive, IFNγ-produzierende Zellen post-Tx

  • 6.3.1  Zusammenhang mit der Nierenfunktion

  • 6.3.2 Zusammenhang mit frühen akuten Rejektionen

  • 6.3.3 Zusammenhang mit Sensibilisierungsfaktoren

• 6.4 Besonderheiten immunsuppressiver Therapieschemata

  • 6.4.1  Patienten, die mit FTY720 behandelt wurden

  • 6.4.2 Patienten, die eine OKT3-Induktionstherapie erhielten

  • 6.4.3 Patienten, die eine Lebendspende erhielten

• 6.5 Versuch der Optimierung des ELISpot-Assays

  • 6.5.1  Reproduzierbarkeit

  • 6.5.2 Ciclosporin A

  • 6.5.3 Tacrolimus

  • 6.5.4 CD2^pos-Zelldepletion

  • 6.5.5 Bestrahlung

  • 6.5.6 Anteil der T-Zellen an Responder-PBMZ

  • 6.5.7 Optimale Zellkonzentrationen

7 Diskussion

• 7.1  Bewertung der angewandten Methodik

  • 7.1.1  Bestimmung spenderreaktiver Zellen in PBMZ

  • 7.1.2 Stellenwert des ELISpot-Assays

  • 7.1.3 Versuch der Optimierung des Assays

  • 7.1.4 Einschränkung der Interpretation der Werte

• 7.2 Immunologische Interpretation

  • 7.2.1  Allgemeine Interpretation der gemessenen Zellen

  • 7.2.2 Subklinische Rejektion

  • 7.2.3 Direkte versus indirekte Präsentation

  • 7.2.4 T1/T2-Polarisation

  • 7.2.5 CD4^pos-/CD8^posT-Zellen

  • 7.2.6 Regulatorisches IFNγ?

• 7.3 Klinische Relevanz der Ergebnisse

  • 7.3.1  Bestimmung spenderreaktiver, IFNγ-produzierender Zellen prä-Tx

  • 7.3.2 Bestimmung spenderreaktiver, IFNγ-produzierender Zellen post-Tx

8. Literaturverzeichnis

Danksagung

Eidesstattliche Erklärung

Lebenslauf

Tabelle 1 Charakterisrika der untersuchten Patienten, n = 52

Tabelle 2 Extremwerte und Mediane der zu den verschiedenen Messzeitpunkten ermittelten Werte für spenderreaktive, IFNγ-produzierende Zellen aller 52 Patienten der Studie ,Spots/3*10⁵ PBMZ

Tabelle 3 Sensibilisierungsfaktoren und Transplantationsverlauf der Patienten mit über 200 IFNγ-produzierenden, spenderreaktiven Zellen/ 3*10⁵ PBMZ vor Transplantation.

Tabelle 4 Korrelationen zwischen der Anzahl spenderreaktiver, IFNγ-produzierender Zellen und der Nierenfunktion sechs Monate bzw. ein Jahr post-Tx innerhalb der gesamten untersuchten Patientengruppe,1: n = 51; 2: n = 48; 3: n = 40; 4: n = 39; 5: n = 41; 6: n = 42

Tabelle 5 Korrelationen zwischen der Anzahl spenderreaktiver, IFNγ-produzierender Zellen und der Nierenfunktion sechs Monate bzw. ein Jahr post-Tx innerhalb der Patientengruppe ohne frühe akute Rejektionen, 1: n = 33; 2: n = 32; 3: n = 27; 4: n = 26; 5: n = 29; 6: n = 28; 7: n = 30

Tabelle 6 Sensibilisierungsfaktoren und Transplantationsverlauf der Patienten, die als immunsuppressive Therapie FTY720 erhielten

Tabelle 7 Sensibilisierungsfaktoren und Transplantationsverlauf Transplantationsverlauf der Patienten, die ein OKT3-Induktionschema erhielten

Tabelle 8 Sensibilisierungsfaktoren und Transplantationsverlauf der Patienten, die eine Lebenspende erhielten

Abbildung 1 Studiendesign

Abbildung 2 Schema zum Mechanismus des ELISpot-Assays

Abbildung 3 Kamerablick auf IFNγ-Spots spenderreaktiver Zellen im ELISpot-Assay

Abbildung 4 Patienten ohne Nachweis spenderreaktiver Zellen vor und nach Nierentransplantation. Die dargestellten Patienten blieben rejektionsfrei und wiesen innerhalb des Messzeitraums Serumkreatininwerte im Normbereich sowie eine gute Nierenfunktion ein Jahr nach Transplantation auf. ELISpot-Messwerte liegen nur zu den beschrifteten Zeitpunkten vor.

Abbildung 5 Patienten mit spenderreaktiven, IFNγ-produzierenden Zellen vor der Nierentransplantation. Die dargestellten Patienten erlitten eine schwere akute Rejektion innerhalb der ersten Woche post-Tx. Während des Messzeitraums lagen die Serumkreatininwerte überwiegend über dem Normbereich. Die Nierenfunktion war ein Jahr nach Transplantation stark eingeschränkt. ELISpot-Messwerte liegen nur zu den beschrifteten Zeitpunkten vor. Unter OKT3-Behandlung sind diese grün abgebildet

Abbildung 6 Patienten mit spenderreaktiven, IFNγ-produzierenden Zellen vor Ttransplantation (2). Die dargestellten Patienten erlitten min. eine akute Rejektion. Bei Patient 8 wurde direkt vor Rejektionsverdacht ein hoher Wert für spenderreaktive Zellen gemessen (70 IFNγ-Spots). Während des Messzeitraums lagen die Serumkreatininwerte über dem Normbereich. Die Nierenfunktion war ein Jahr nach Transplantation jedoch überdurchschnittlich. ELISpot-Messwerte liegen nur zu beschrifteten Zeitpunkten vor.

Abbildung 7 Patienten mit spenderreaktiven, IFNγ-produzierenden Zellen nach der Nierentransplantation. Die dargestellten Patienten erlitten mindestens eine frühe akute Rejektion. Teilweise konnte direkt nach dem Anstieg der Werte für spenderreaktive, IFNγ-produzierende Zellen die Diagnose einer akuten Rejektion gestellt werden. Während des Messzeitraums lagen die Serumkreatininwerte über dem Normbereich. Die Nierenfunktion war ein Jahr nach Transplantation teilweise stark eingeschränkt. ELISpot-Messwerte liegen nur zu den beschrifteten Zeitpunkten vor.

Abbildung 8 Patienten mit spenderreaktiven, IFNγ-produzierenden Zellen nach Transplantation (2). Bei den dargestellten Patienten wurde keine akute Rejektion diagnostiziert. Trotzdem lagen die Serumkreatininwerte während des Messzeitraums über dem Normbereich und die Nierenfunktion war ein Jahr post-Tx eingeschränkt. ELISpot-Messwerte liegen nur zu den beschrifteten Zeitpunkten vor.

Abbildung 9 Patienten mit OKT3-Induktionsschema. Obwohl bei den zwei Patienten einige Wochen post-Tx erhöhte Werte für spenderreaktive Zellen gemessen werden konnten, stiegen die Serumkreatininwerte während des Messzeitraums nie über den Normbereich und die Nierenfunktion war ein Jahr post-Tx sehr gut. Unter OKT3-Therapie stiegen die Messwerte fehlerhaft an (grün). ELISpot-Messwerte liegen nur zu den beschrifteten Zeitpunkten vor.

Abbildung 10 IFNγ-produzierende, spenderreaktive Zellen vor Transplantation bei Patienten mit und ohne Nachweis einer akuten Rejektion ihrer Spenderniere.

Abbildung 11 IFNγ-produzierende, spenderreaktive Zellen vor Transplantation bei Patienten mit und ohne Nachweis präformierter Anti-HLA-Antikörper (PRA).

Abbildung 12 Nierenfunktion ein Jahr post-Tx bei Patienten mit Werten spenderreaktiver Zellen post-Tx über bzw. unter einem experimentell ermittelten Cut-Off. Die Gruppen unterscheiden sich in ihrem Median ( schwarzer Balken) teilweise signifikant.

Abbildung 13 Nierenfunktion ein Jahr nach Transplantation bei Patienten OHNE AKUTE REJEKTION mit Werten spenderreaktiver Zellen post-Tx über bzw. unter einem experimentell ermittelten Cut-Off. Die Gruppen unterscheiden sich in ihrem Median (schwarzer Balken) teilweise signifikant.

Abbildung 14 Zusammenhang zwischen der Anzahl spenderreaktiver, IFNγ-produzierender Zellen post-Tx und der Nierenfunktion ein Jahr nach Tansplantation bei Patienten mit und ohne Nachweis einer akuten Rejektion. Während bei Patienten mit akuter Rejektion kein Zusammenhang zwischen beiden Parametern besteht, korreliert der Mittelwert der spenderreaktiven Zellen innerhalb der ersten drei Monate gut mit der GFR und dem Serumkreatinin ein Jahr post-Tx. Diese Beziehung ist bis auf zwei Ausnahmen sogar nahezu linear.

Abbildung 15 Zusammenhang zwischen der Dauer der Hämodialyse und der Anzahl spenderreaktiver, IFNγ-produzierender Zellen post-Tx. Patienten mit der größten maximalen oder mittleren Anzahl Zellen wurden insgesamt mindestens 79 Monate hämodialysiert.

Abbildung 16 Beziehung zwischen dem HLA-Gesamt-Mismatch und der Anzahl der spenderreaktiven Zellen in Woche 2 post-Tx

Abbildung 17 Maximale Anzahl spenderreaktiver, IFNγ-produzierender Zellen nach Transplantation bei Patienten mit Lebenspenden und bei Patienten mit Kadaverspenden.

Abbildung 18 IFNγ-Sekretion CMV-spezifischer T-Zellen nach 24h Ciclosporin A-Wirkung

Abbildung 19 IFNγ-Sekretion CMV-spezifischer T-Zellen nach 2h Tacrolimus-Wirkung

Abbildung 20 Übertragung der Wirkung von Tacrolimus auf unbehandelte CMV-spezifische T-Zellen

Abbildung 21 IFNy-Sekretion CD2-depletierter Leukozyten unter PHA-Stimulation

Abbildung 22 Aktivierung alloreaktiver T-Zellen durch CD2-depletierte allogene Leukozyten

Abbildung 23 IFNγ-Sekretion (nach allogenem Stimulus) und Allogenität bestrahlter Leukozyten

Abbildung 24 Prozentualer Anteil von T-Zellen an PBMZ nierentransplantierter Patienten zu verschiedenen Messzeitpunkten vor und nach Nierentransplantation. Die einzelnen Patienten werden durch unterschiedliche Farben symbolisiert.

Abbildung 25 IFNγ-Spots im ELISpot Assay bei T-Zell-Alloreaktionen im Zusammenhang mit der Anzahl der Stimulator- und Responderzellen

Abbildung 26 Die alloreaktive T-Zell-Antwort konvergiert bei einer sättigenden Stimulation