Aus der Klinik für Pädiatrie mit Schwerpunkt Neurologie
der Medizinischen Fakultät der Charité – Universitätsmedizin Berlin

DISSERTATION

Die neurotoxische Wirkung der Zytostatika Cyclophosphamid und Thiotepa im infantilen Gehirn der Ratte

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité – Universitätsmedizin Berlin

Von
Susanne Pruskil
aus Tübingen

Dekan: Prof. Dr. med. Martin Paul

Gutachter:
1. Prof. Dr. H. Ikonomidou
2. Prof. Dr. I. Krägeloh-Mann
3. PD. Dr. U. Felderhoff-Müser

Datum der Promotion: 24.02.2006

Widmung

In memoriam meinem Großvater

Otto Litz

Inhaltsverzeichnis

• Abkürzungsverzeichnis
• 1. Einleitung
  • 1.1  Maligne Tumorerkrankungen im Kindesalter
  • 1.2 Die Periode des rapiden Hirnwachstums (Brain growth spurt period)
  • 1.3 Pathophysiologie der zentralnervösen Toxizität der Zytostatika
  • 1.4 Exzitotoxizität
  • 1.5 Apoptose
    • 1.5.1  Morphologische Kennzeichen der Apoptose
    • 1.5.2 Die genetische Regulation der Apoptose
  • 1.6 Die Zytostatika Cyclophosphamid und Thiotepa
    • 1.6.1  Cyclophosphamid
    • 1.6.2 Thiotepa
  • 1.7 Formulierung der zentralen Fragestellung der Arbeit
• 2. Material und Methoden
  • 2.1  Tierversuche: Tiere, Injektionen, ethische Richtlinien
  • 2.2 Perfusion, Einbettung, Schnitt
  • 2.3 De Olmos Kupfersilberfärbung
  • 2.4 Morphometrie
  • 2.5 Statistische Auswertung
  • 2.6 TUNEL-Färbung
  • 2.7 Immunhistochemie für aktivierte Caspase 3 und den Fas Rezeptor
  • 2.8 Elektronenmikroskopie
• 3. Ergebnisse
  • 3.1  Die Zytostatika Cyclophosphamid und Thiotepa rufen einen Zelluntergang im infantilen Rattengehirn hervor
  • 3.2 Quantifizierung der Zelldegeneration nach Gabe von Cyclophosphamid und Thiotepa im infantilen Rattengehirn
  • 3.3 Die ultrastrukturellen Merkmale der Zelldegeneration nach Cyclophosphamid
  • 3.4 Immunhistochemie für Caspase 3 und den Fas Rezeptor
  • 3.5 Dosisabhängigkeit der Schädigung durch Cyclophosphamid und Thiotepa
  • 3.6 Altersabhängigkeit der Schädigung durch Cyclophosphamid
• 4. Diskussion
  • 4.1  Allgemeine Betrachtung
  • 4.2 Neurotoxizität von Cyclophosphamid und Thiotepa
    • 4.2.1  Exzitotoxizität
    • 4.2.2 Caspase-vermittelter Zelltod (Apoptose)
  • 4.3 Dosisabhängigkeit der neurotoxischen Wirkung der Zytostatika
  • 4.4 Altersabhängigkeit der neurotoxischen Wirkung
  • 4.5 Wirkungsverstärkung der Neurotoxizität
  • 4.6 Klinische Aspekte
  • 4.7 Fehlermöglichkeiten
  • 4.8 Ausblick
• 5. Zusammenfassung
• 6. Literaturverzeichnis
• Publikationen
• Eidesstattliche Erklärung
• Danksagung

Tabellen

• Tabelle 1: Übersicht über die durchgeführten Experimente, die verwendeten Dosierungen und Substanzen
• Tabelle 2: Das Zytostatikum Cyclophosphamid erhöht den Zelluntergang im Gehirn acht Tage alter Ratten. Am siebten Lebenstag erhielten Ratten entweder Plazebo (Natriumchlorid) oder Cyclophosphamid 600 mg/kg KG intraperitoneal. 24 Stunden nach der ersten Injektion, am postnatalen Tag acht, wurden die Ratten getötet. Mit der stereologischen Dissektionsmethode wurden an nach Nissl gefärbten Hirnschnitten die numerischen Dichten von Neuronen in 14 Hirnregionen bestimmt (Zellen/mm3, n=5, Spalte 1). In den nach der De Olmos Methode gefärbten Hirnschnitten wurden dann die numerischen Dichten degenerierter Zellen (Zellen/mm3) in diesen 14 Hirnregionen von mit Cyclophosphamid (n=4) und Plazebo behandelten Ratten (n=5) ermittelt. Das Ausmaß der Apoptose wird als Quotient der numerischen Dichte degenerierender Zellen zur Gesamtzelldichte ermittelt und in Prozent ausgedrückt (Mittelwert ± SEM). Die statistischen Vergleiche zwischen der Plazebo und der Cyclophosphamid Gruppe erfolgten mittels Student´s t-Test: *= P< 0,5 und **= P <0,01
• Tabelle 3: Das Zytostatikum Thiotepa erhöht den Zelluntergang im Gehirn acht Tage alter Ratten. Am siebten Lebenstag erhielten Ratten entweder Plazebo (Natriumchlorid) oder Thiotepa 45 mg/kg KG intraperitoneal. 24 Stunden nach der ersten Injektion, am postnatalen Tag acht, wurden die Ratten getötet. Mit der stereologischen Dissektionsmethode wurden an nach Nissl gefärbten Hirnschnitten die numerische Dichte von Neuronen in 14 Hirnregionen bestimmt (Zellen/mm3, n=5, Spalte 1). In den nach der De Olmos Methode gefärbten Hirnschnitten wurden dann die numerischen Dichten degenerierter Zellen (Zellen/mm3) in diesen 14 Hirnregionen von mit Thiotepa (n=4) und Plazebo behandelten Ratten (n=5) ermittelt. Das Ausmaß der Apoptose wird als Quotient der numerischen Dichte degenerierender Zellen zur Gesamtzelldichte ermittelt und in Prozent ausgedrückt (Mittelwert ± SEM). Die statistischen Vergleiche zwischen der Plazebo und der Thiotepa Gruppe erfolgten mittels Student´s t-Test: *= P< 0,5 und **= P <0,01

Bilder

• Abbildung 1: Die Periode des rapiden Hirnwachstums „Brain growth spurt period“ beim Menschen, beim Affen, beim Schwein und bei der Ratte [Dobbing, 1974]
• Abbildung 2: Detailaufnahme aus den Laminae II und IV des Cortex parietalis acht Tage alter Ratten 24 Stunden nach Behandlung mit Placebo (A) oder Cyclophosphamid 600 mg/kg KG (B): Placebo (Natriumchlorid) oder Cyclophosphamid 600 mg/kg KG (zum Zeitpunkt 0) wurden Ratten am siebten Lebenstag intraperitoneal injiziert. Die Tiere wurden am achten Lebenstag getötet und perfundiert. Die histologischen Schnitte wurden nach De Olmos gefärbt. Die dunkel angefärbten Punkte zeigen degenerierte Zellen. In den mit Placebo behandelten Tieren ist die Zahl degenerierter Zellen im parietalen Cortex sehr gering und zum Teil fast gar nicht nachweisbar. Das Gehirn der mit Cyclophosphamid behandelten Ratten (B) zeigt dagegen deutlich mehr dunkle (degenerierte) Zellen in der Lamina II des parietalen Cortex. Vergleich zum gleichaltrigen, mit Natriumchlorid behandelten Tier (A). Vergrößerungsfaktor x 100.
• Abbildung 3: Detailaufnahme aus dem Gyrus dentatus acht Tage alter Ratten 24 Stunden nach Behandlung mit Placebo (A) oder Cyclophosphamid 600 mg/kg KG (B): Placebo (Natriumchlorid) oder Cyclophosphamid 600 mg/kg KG (zum Zeitpunkt 0) wurden Ratten am siebten Lebenstag intraperitoneal injiziert. Die Tiere wurden am achten Lebenstag getötet und perfundiert. Die histologischen Schnitte wurden nach De Olmos gefärbt. Die dunkel angefärbten Punkte zeigen degenerierte Zellen. In den mit Placebo behandelten Tieren (A) ist die Zahl degenerierter Zellen im Gyrus dentatus sehr gering und zum Teil fast gar nicht nachweisbar. Das Gehirn der mit Cyclophosphamid behandelten Ratte (B) zeigt dagegen deutlich mehr dunkle (degenerierte) Zellen im Hilus und den Körnerzellen des Gyrus dentatus. Vergleich zum gleichaltrigen, mit Natriumchlorid behandelten Tier (A). Vergrößerungsfaktor x 100.
• Abbildung 4: Detailaufnahme aus dem Thalamus und Gyrus dentatus acht Tage alter Ratten 24 Stunden nach Behandlung mit Cyclophosphamid 600 mg/kg KG (A-B): Placebo (Natriumchlorid) oder Cyclophosphamid 600 mg/kg KG (zum Zeitpunkt 0) wurden Ratten am siebten Lebenstag intraperitoneal injiziert. Die Tiere wurden am achten Lebenstag getötet und perfundiert. Beide Schnitte wurden nach TUNEL gefärbt. Das Gehirn der mit Cyclophosphamid behandelten Ratte zeigt deutlich dunkle (degenerierte) Zellen im Bereich des Thalamus(A) und Gyrus dentatus (B). Die TUNEL-Färbung und die Kupfersilberfärbung nach De Olmos färben die gleichen Populationen degenerierter Zellen an. Zu beachten ist der pyknotische Aspekt der degenerierten Zellen. Vergrößerungsfaktor x100.
• Abbildung 5: Detailaufnahme aus dem Cortex und Gyrus dentatus acht Tage alter Ratten 24 Stunden nach Behandlung mit Thiotepa 45 mg/kg KG: Thiotepa 45 mg/kg KG (zum Zeitpunkt 0) wurde Ratten am siebten Lebenstag intraperitoneal injiziert. Die Tiere wurden am achten Lebenstag getötet und perfundiert. Die histologischen Schnitte wurden nach De Olmos gefärbt. Die dunkel angefärbten Punkte zeigen degenerierte Zellen. Die Gehirne der mit Thiotepa behandelten Ratten (A und B) zeigen deutlich die degenerierte Zellen im Bereich der Laminae II und IV des Cortex frontalis (A) und der Körnerzellen des Gyrus dentatus (B). Vergrößerungsfaktor x 100.
• Abbildung 6: Detailaufnahme aus den thalamischen Kerngebieten acht Tage alter Ratten 24 Stunden nach Behandlung mit Plazebo (A) oder Thiotepa 45 mg/kg KG (B): Plazebo (Natriumchlorid) oder Thiotepa 45 mg/kg KG (zum Zeitpunkt 0) wurden Ratten am siebten Lebenstag intraperitoneal injiziert. Die Tiere wurden am achten Lebenstag getötet und perfundiert. Die histologischen Schnitte wurden nach De Olmos gefärbt. Die dunkel angefärbten Punkte zeigen degenerierte Zellen. In den mit Plazebo behandelten Tieren (A) ist die Zahl degenerierter Zellen im Thalamus sehr gering und zum Teil fast gar nicht nachweisbar. Das Gehirn der mit Thiotepa behandelten Ratten (B) zeigt dagegen deutlich mehr dunkle (degenerierte) Zellen im Bereich des Thalamus. Vergleich zum gleichaltrigen, mit Natriumchlorid behandelten Tier (A). Vergrößerungsfaktor x 100.
• Abbildung 7: Schematische Darstellung der Verteilung der Neurodegeneration nach Cyclophosphamid im Gehirn 8 Tage alter Ratten: Sieben Tage alte Ratten erhielten entweder Plazebo (Natriumchlorid) oder Cyclophosphamid (600 mg/kg KG intraperitoneal). Nach 24 Stunden, am postnatalen Tag acht, wurden die Tiere getötet. Mit der stereologischen Dissektionsmethode wurden an nach De Olmos bzw. TUNEL gefärbten Hirnschnitten die Dichten degenerierender Zellen in 14 Hirnregionen ermittelt (Siehe Tabelle 2) und in zwei repräsentativen schematischen Hirnschnitten eingezeichnet: Hellgrau = < 4% degenerierende Zellen; grau = 4-6% degenerierende Zellen; dunkelgrau = > 6% degenerierende Zellen. Der rostrale Schnitt (A) zeigt die Verteilung degenerierender Zellen im Cortex frontalis (Lamina 2 und 4) und Nucleus caudatus. Der caudale Schnitt (B) auf Höhe der hinteren Thalamuskerne zeigt die Schädigung im Bereich des Cortex parietalis (Lamina 2 und 4), im Feld CA1 und im Gyrus dentatus des Hippocampus, im mediodorsalen, laterodorsalen und ventralen Thalamus sowie Nucleus ventromedialis hypothalami.
• Abbildung 8: Schematische Darstellung der Verteilung der Neurodegeneration nach Thiotepa im Gehirn 8 Tage alter Ratten: Sieben Tage alte Ratten erhielten entweder Plazebo (Natriumchlorid) oder Thiotepa (45 mg/kg KG intraperitoneal). Nach 24 Stunden, am postnatalen Tag acht, wurden die Tiere getötet. Mit der stereologischen Dissektionsmethode wurden an nach De Olmos bzw. TUNEL gefärbten Hirnschnitten die Dichten degenerierender Zellen in 15 Hirnregionen ermittelt (Siehe Tabelle 3) und in zwei repräsentativen schematischen Hirnschnitten eingezeichnet: Hellgrau = < 1% degenerierende Zellen; grau = 1-6% degenerierende Zellen; dunkelgrau = > 6% degenerierende Zellen. Der rostrale Schnitt (A) zeigt die Verteilung degenerierender Zellen im Cortex frontalis (Lamina 2 und 4) und Nucleus caudatus. Der caudale Schnitt (B) auf Höhe der hinteren Thalamuskerne zeigt die Schädigung im Bereich des Cortex parietalis (Lamina 2 und 4), im Feld CA1 und im Gyrus dentatus des Hippocampus, im mediodorsalen, laterodorsalen und ventralen Thalamus sowie Nucleus ventromedialis hypothalami.
• Abbildung 9: Die elektronenmikroskopische Aufnahme eines Dendriten in einem frühen Stadium des durch Cyclophosphamid hervorgerufenen Zelltodes: Der abgebildete Dendrit stammt aus dem Cortex parietalis einer mit Cyclophosphamid (400 mg/kg intraperitoneal) behandelten sieben Tage alten Ratte 4 Stunden nach der Injektion. Der Dendrit beinhaltet ein geschwollenes Mitochondrium. Der Dendrit zeigt zwei synaptische Verdichtungen, des weiteren ist eine präsynaptische Endigung mit synaptischen Vesikeln zu sehen. Vergrößerungsfaktor x 9,000.
• Abbildung 10: Elektronenmikroskopische Aufnahme einer Zelle, die nach Gabe von Cyclophosphamid Zeichen aktiven Zelltodes zeigt: Die abgebildete Zelle stammt aus dem Thalamus einer mit Cyclophosphamid (400 mg/kg) behandelten acht Tage alten Ratte. Man erkennt noch intakte Zellmembran. Das Nukleoplasma hat sich zu einer runden elektronendichten Masse verdichtet, die durch das Zytoplasma hindurch zum Rand der Zelle gewandert ist. Das Zytoplasma ist dunkel, die Zelle liegt einer Gliazelle an, die im Begriff ist diese aufzunehmen. Vergrößerungsfaktor x 7,000.
• Abbildung 11: Elektronenmikroskopische Aufnahme einer Zelle in einem späten Stadium des durch Cyclophosphamid hervorgerufenen aktiven Zelltodes: Die abgebildete Zelle stammt aus dem laterodorsalen Thalamus einer mit Cyclophosphamid (400 mg/kg) behandelten acht Tage alten Ratte 12h nach Injektion. Das Cytoplasma der Zelle ist dunkel gefärbt, eine Kernmembran ist nicht mehr zu erkennen, das Chromatin hat sich zu einer elektronendichten Masse verdichtet und ist bereits in die Peripherie gewandert. Vergrößerungsfaktor x 9,000.
• Abbildung 12: Immunhistochemischer Nachweis von aktivierter Caspase 3 und Expression des Fas Rezeptors: 7 Tage alte Ratten erhielten eine Einzeldosis Cyclophosphamid (600 mg/kg KG intraperitoneal) und wurden nach 16 Stunden getötet (n=4). In den lichtmikroskopischen Bildern zeigt sich eine Aktivierung der Caspase 3 (A) sowie eine erhöhte Expression des Fas Rezeptors (B) auf thalamischen Neuronen. Die immunpositiven Zellen für aktivierte Caspase und den Fas Rezeptor sind braun angefärbt. Vergrößerungsfaktor x 400 in A und x 200 in B.
• Abbildung 13: Dosis- Wirkungsbeziehung der Neurotoxizität von Cyclophosphamid: Sieben Tage alte Ratten erhielten eine Einzeldosis Cyclophosphamid (200, 400, und 600 mg/kg KG intraperitoneal) und wurden nach 24 Stunden getötet (n=5/Gruppe). In den nach De Olmos gefärbten Hirnschnitten wurde mit der stereologischen Dissektionsmethode die Dichten degenerierender Zellen (Zellen pro Kubikmillimeter) pro Gruppe in 14 Hirnregionen (siehe Tabelle 2) bestimmt. Diese Zelldichten wurden für jedes Gehirn addiert (Score). Die Säulen zeigen die Mittelwerte der ermittelten Scores ± SEM (n= 5/Gruppe) nach Gabe von Cyclophosphamid oder Placebo (K). Varianzanalyse (ANOVA) der auf diese Weise ermittelten Scores ergab einen signifikanten Effekt der Behandlung mit Cyclophosphamid auf das Ausmaß der Neurodegeneration im Gehirn [p< 0,0001].
• Abbildung 14: Dosis- Wirkungsbeziehung der Neurotoxizität von Thiotepa: Sieben Tage alte Ratten erhielten eine Einzeldosis Thiotepa (15, 30, und 45 mg/kg KG intraperitoneal) und wurden nach 24 Stunden getötet (n=4/Gruppe). In den nach De Olmos gefärbten Hirnschnitten wurde mit der stereologischen Dissektionsmethode die Dichten degenerierender Zellen (Zellen pro Kubikmillimeter) in 14 Hirnregionen (siehe Tabelle 3) bestimmt. Diese Zelldichten wurden für jedes Gehirn addiert (Score). Die Säulen zeigen die Mittelwerte der ermittelten Scores ± SEM (n=4/Gruppe) nach Gabe von Thiotepa oder Placebo (K). Varianzanalyse (ANOVA) der auf diese Weise ermittelten Scores ergab einen signifikanten Effekt der Behandlung mit Thiotepa auf das Ausmaß der Neurodegeneration im Gehirn [p<0,0001].
• Abbildung 15: Altersabhängigkeit der Neurotoxizität von Cyclophosphamid: 7, 14, 21 und 28 Tage alte Ratten erhielten eine Einzeldosis Cyclophosphamid (600 mg/kg KG intraperitoneal) und wurden nach 24 Stunden getötet (n=4-6 pro Altersgruppe). In nach De Olmos gefärbten Hirnschnitten wurden mit der stereologischen Dissektionsmethode die Dichten degenerierender Zellen (Zellen/mm ³ ) in 14 Hirnregionen bestimmt. Diese Zelldichtewerte wurden zu einem Gesamtwert für jedes Gehirn addiert (Score). Varianzanalyse (ANOVA) der auf diese Weise ermittelten Scores ergab einen signifikanten Effekt der Behandlung mit Cyclophosphamid auf das Ausmaß der Neurodegeneration im Gehirn [p<0,0001]. Um zu überprüfen, zwischen welchen Gruppen die Unterschiede liegen, die diesen signifikanten Haupteffekt verursacht haben, wurden Scheffé-Tests als Einzelvergleiche gerechnet. Dabei ergab sich, dass sich die Gruppe der 7 Tage alten Ratten signifikant von allen anderen Gruppen unterscheidet, während zwischen diesen keine Unterschiede bestehen.