2. Material und Methoden

▼ 16 (fortgesetzt)

2.1  Tierversuche: Tiere, Injektionen, ethische Richtlinien

Han Wistar-Ratten im Alter von 7, 14, 21 und 28 Tagen wurden für die Versuche benutzt. Geliefert wurden die Tiere vom Bundesinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin (BGVV). Die Versuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien von Tierversuchen der Society for Neuroscience durchgeführt [Society of Neuroscience, Polycy of Ethics]. Die Tiere wurden in gut belüfteten Käfigen gehalten und mit artgerechter Nahrung und Wasser ad libitum versorgt. Bis zum Zeitpunkt der Perfusion, blieben die juvenilen Ratten bei ihren Muttertieren. Alle Tierversuche wurden vom Landesamt für technische Sicherheit und Arbeitsschutz Berlinüberprüft und genehmigt.

Den Tieren wurde im Alter von 7, 14, 21 und 28 Tagen die zu testenden Medikamente oder isotone Kochsalzlösung intraperitoneal (i.p.) injiziert. Das Injektionsvolumen betrug 10 ml/kg Körpergewicht. Die Tiere wurden nach einer Beobachtungszeit ihren Müttern zurückgegeben, um für sie den Stress so gering wie möglich zu halten und einer möglichen Hypothermie vorzubeugen. Um Verzerrungen durch Mangelernährung zu vermeiden, wurden die Wurfgrößen zwischen zehn und fünfzehn Wurfgeschwistern gehalten. Sowohl die Tiere, die mit Kochsalzlösung behandelt wurden, als auch die Tiere, welche Cyclophosphamid und Thiotepa erhielten, waren Wurfgeschwister, und wurden gemeinsam unter den gleichen Bedingungen gehalten. Tieren der Kontrollgruppe wurde isotone Kochsalzlösung (Natriumchlorid per injectionem, Braun Ingelheim, Deutschland) intraperitoneal injiziert.

2.2 Perfusion, Einbettung, Schnitt

▼ 17 

24 Stunden nach der Injektion wurden die Versuchstiere mit einer Überdosis Chloralhydrat (Braun, Ingelheim, Deutschland) getötet. Anschließend wurde das Herz und die Aorta ascendens frei präpariert. Nach einem breitem Einschnitt des rechten Vorhofes und einem Einschnitt der linken Herzkammer an der Kammerspitze, wurde sofort aber sehr behutsam die Perfusionskanüle in die Aorta vorgeschoben und das Tier darüber perfundiert.

Die Perfusionslösung bestand aus 4%igem Paraformaldehyd (Merck-Suchard, Hohenbrunn, Deutschland), gelöst in Phosphatpuffer (Sigma, St. Louis, USA, pH-Wert=7,4).

Nach vollendeter Perfusion wurden die Gehirne in toto behutsam aus dem Schädel präpariert und bis zur Färbung in 4%iger Paraformaldehydlösung nachfixiert. Anschließend wurden die Gehirne in reiner Phosphatpufferlösung gelagert.

▼ 18 

Im nächsten Arbeitsschritt wurden die Gehirne in Agar (Sigma, St. Louis, USA) eingebettet und am Rotationsvibratom (Typ OTS 3000, Electron Microscopy Sciences, USA) in 70µm dünne coronare Serienscheiben geschnitten.

Etwa jeder 7. Schnitt wurde zur Silberfärbung ausgewählt und zur Nachfixierung in 4%iger Paraformaldehydlösung eingelegt. Anschließend wurden die Schnitte nach dem De Olmos Protokoll gefärbt (siehe 2.3).

Tabelle 1: Übersicht über die durchgeführten Experimente, die verwendeten Dosierungen und Substanzen

2.3 De Olmos Kupfersilberfärbung

▼ 19 

Die De Olmos Kupfersilberfärbung kann zur Darstellung von degenerierten Zellen und Axonen benutzt werden, die entweder durch Apoptose oder andere Mechanismen zu Grunde gehen. Die degenerierten Zellen färben sich dunkelbraun bis schwarz an und heben sich deutlich vom goldgelben Hintergrund ab [DeOlmos undIngram, 1971]. Dies beruht auf einer Reaktion des Axoplasmas der degenerierten Neurone mit dem Silbersalz, welches aufgrund der durchlässig gewordenen Zellmembran in die Zellen eindringen kann. Die Färbung ist kostengünstig, leicht durchführbar und eignet sich besonders gut für Screeninguntersuchungen und, wie in diesem Fall, für Experimente, bei denen es auf große Fallzahlen ankommt.

Die De Olmos Kupfersilberfärbung sagt nichts über den Pathomechanismus aus, der zur neuronalen Degeneration geführt hat. Sie zeigt lediglich, dass Zellen zu Grunde gegangen sind. In dieser Arbeit wurde sie zur Übersichtsfärbung verwendet, um die Ausbreitung und numerische Dichte von degenerierten Zellen sichtbar zu machen.

Im ersten Arbeitsschritt wurden die Schnitte in einer Kupfer-Silber-Lösung für 48-72 Stunden im Dunkeln inkubiert. Die verwendete Lösung setzte sich aus folgenden Komponenten zusammen:

▼ 20 

1,5 g Silbernitrat, 3 ml 0,5%ige Kupfernitratlösung, 15 ml 0,1% Allantoinlösung, 9 ml Boratpuffer, 17 ml Ethanol absolut und 9 ml Pyridin.

Anschließend wurden die Schnitte mit reinem Aceton gewaschen und im nächsten Arbeitsschritt für 35 Minuten in einer Silber-Diamin Lösung inkubiert. Die Lösung bestand aus folgenden Komponenten:

24g Silbernitrat, 120 ml zweifach destilliertes Wasser, 60 ml 0,4%ige Natronlauge und 30 ml Ammoniak.

▼ 21 

Zur Reduktion wurden die Schnitte unter Agitation in eine ethanolische Lösung aus Formaldehyd und Zitronensäure überführt. Die genaue Zusammensetzung war:

135 ml zweifach destilliertes Wasser, 15 ml Ethanol (100%, 180 µl 37%ige Formaldehydlösung und 10,5 mg Zitronensäure.

Im Anschluss wurden die Schnitte einzeln mit 0,3%iger Kaliumferrizyanidlösung gebleicht. Nach zweimaligem Waschen mit zweifach destilliertem Wasser wurden die Schnitte über eine Minute in 0,1%iger Natriumthiosulfatlösung gegeben um das Färbeergebnis zu stabilisieren. Nach Dehydration in einer absteigenden Alkoholreihe wurden die Präparate mit Hilfe von Paramount-Medium auf Objektträger aufgebracht und mit Deckgläsern versehen.

2.4 Morphometrie

▼ 22 

Im infantilen Rattengehirn können während der physiologischen Entwicklung apoptotische Vorgänge beobachtet werden. Deshalb ist eine genaue Quantifizierung des Ausmaßes der Degeneration bei mit Cyclophosphamid, Thiotepa und Plazebo behandelten Tieren notwendig.

Für diese Untersuchung wurde die stereologische Dissektionsmethode eingesetzt (unibased stereological dissector method) [Cruz_Orive undWeibel, 1990]. Ihr liegt die Aufspaltung des großen, „unzählbaren“ Gewebeblocks, in kleine, „zählbare“ Untereinheiten (Fractionation) zugrunde. Die Fragmente werden zufällig ausgewählt und mit Hilfe eines fixen Zählrahmens ausgezählt. Der Zählrahmen gibt die Ausdehnung in einer Ebene vor. Die dritte Dimension, die zur Beurteilung eines dreidimensionalen Objektes notwendig ist, wird durch die Dicke des Schnittes bestimmt. Das Ergebnis der ausgezählten Untereinheit wird mit der Gesamtzahl aller Untereinheiten multipliziert. Das Endresultat stellt die Zellzahl in einem bestimmten Gewebevolumen dar.

Der Zusatz „stereological dissector“ steht für die Möglichkeit mit dem Mikroskop, den Schnitt in verschiedenen Ebenen zu fokussieren.

▼ 23 

Folgende Fehlerquellen dieser Methode müssen in Betracht gezogen werden: extrem inhomogene Verteilung der zu zählenden Objekte, Schwellung oder Schrumpfung des Gesamtvolumens. In diesen Fällen wurde ein 0,05 x 0,05 mm großer Zählrahmen verwendet.

Die Schnitthöhe betrug 0,07 mm. Acht bis zehn Felder wurden innerhalb einer Hirnregion zufällig ausgewählt und ausgezählt.

Die numerische Dichte normaler Neurone wurde an nach Nissl gefärbten Schnitten ermittelt (Methylenblau, Azur II). Das Ausmaß der Apoptose wird als Verhältnis der Anzahl degenerierter Zellen zur Gesamtzahl dargestellt und als Prozentwert ausgedrückt (Mittelwert +/- Standardfehler SEM). Die Dichte der degenerierten Zellen wurde für die einzeln ausgezählten Regionen festgehalten. In einem weiteren Schritt wurden die einzelnen Zelldichtewerte zu einem Gesamtscore summiert. Somit konnten Tiere aus Kontroll- und Versuchsgruppe an Hand eines einzelnen Wertes verglichen werden.

▼ 24 

Folgende 14 Regionen wurden im Einzelnen ausgezählt:

2.5 Statistische Auswertung

Die nach De Olmos gefärbten Präparate wurden verblindet ausgezählt und von erfahrenen Untersuchern kontrolliert. Das Ergebnis wurde als numerische Neuronendichte angegeben und entspricht degenerierten Neuronen pro Kubikmillimeter. Insgesamt wurden 14 verschiedene Hirnregionen ausgewertet. Die Ergebnisse der Einzelzählungen jeder Region wurden gemittelt. Die Unterschiede zwischen den einzelnen Versuchsgruppen wurden mit Hilfe des Student´s t-Test auf ihre Signifikanz hin überprüft. Die Untersuchungen zur Alters -und Dosisabhängigkeit der von Cyclophosphamid und Thiotepa verursachten Schäden wurde mit Hilfe der ermittelten Gesamtscores und der Varianzanalyse (ANOVA) überprüft.

2.6 TUNEL-Färbung

▼ 25 

Während des apoptotischen Zelluntergangs kommt es zur Aufspaltung der nukleären DNA durch Endonukleasen in Fragmente von ca. 180 Basenpaaren Länge. Mit der TUNEL-Färbung lassen sich diese DNA-Fragmente nachweisen [Gavrieli, et al., 1992]. Das Enzym Terminaldesoxynucleotidyltransferase reagiert ausschließlich mit dem 3´-OH Ende der DNA und fügt an diese biotinylierte Polydesoxyuridylnukleotide an. Diese Biotinenden reagieren nun ihrerseits mit Avidin, das an eine Peroxidase gekoppelt ist. Diese Peroxidase katalysiert die Farbreaktion, die im histologischen Präparat sichtbar wird. Eine apoptotische Zelle ist mit der TUNEL-Methode für ca. ein bis drei Stunden nachweisbar.

Sieben Tage alte Tiere erhielten Natriumchlorid oder Cyclophosphamid intraperitoneal in einer Dosierung von 600 mg/kg Körpergewicht. Nach 24 Stunden wurden die Tiere mit einer Überdosierung Chloralhydrat getötet. Die Perfusion zur Vorbereitung der TUNEL –Färbung wurde wie bereits in Abschnitt 2.3 beschrieben durchgeführt. Die Gehirne für diese Färbung wurden in Paraffin eingebettet und am Vibratom (Microm, Waldorf, Deutschland) in einer Dicke von 10 µm geschnitten und auf Objektträger aufgebracht. Acht Schnitte und zwei Kontrollen wurden aus den Bereichen des Frontal –und Parietalhirns in denen in der Übersichtsfärbung Zelluntergang gesehen wurde, ausgewählt und gefärbt. Die Färbung der Gehirne wurde mit Hilfe eines kommerziellen Kits (Apoptag, ONCOR Appligene, Heidelberg) durchgeführt und mit Methylgrün gegengefärbt. Das Ergebnis zeigte dunkelbraune Zellkerne in den Zellen, in denen es zur DNA-Fragmentierung gekommen war. Das Zytoplasma intakter Zellen färbte sich mit Methylgrün an.

2.7 Immunhistochemie für aktivierte Caspase 3 und den Fas Rezeptor

Wie in der unter 2.6 beschriebenen TUNEL- Färbung wurden auch für diese Färbung die Tiere vorbehandelt, die Gehirne in Paraffin eingebettet und am Mikrotom HM 360 (Microm, Waldorf, Deutschland) in 5 µm dicke Schnitte geschnitten und auf mit 3- aminopropyltrietoxylane (Sigma, Deisenhofen, Germany) beschichtete Objektträger aufgebracht. Die Schnitte wurden in 10 mM Zitratpuffer, pH 6,5 bei 750 W erhitzt. Die endogene Peroxidase Aktivität wurde mit 0,6% v/v Hydrogenperoxid für 15 min geblockt und im Anschluss mit Ziegenserum für 20 min inkubiert und über Nacht bei 4°C mit einem monoklonalen anti-Fas Antikörper (produziert in der Maus) (1:200, Transduction Laboratories, BD Biosciences, Heidelberg, Germany, 1:250) oder einem monoklonalen caspase 3 Antikörper (produziert im Kaninchen) (1:100, Cell Signaling, New England Biolabs GmbH, Frankfurt, Germany) inkubiert. Eine zweite Inkubation erfolgte mit Hase Anti-Maus IgG und Ziege Anti-Hase. Die Kontrollen wurden mit den passenden Blockierungspeptiden nach Herstelleranweisungen behandelt. Nach der Detektion mit dem ABC Kit (Vector Laboratories, Peterborough, UK) wurden positive Zellen mit Diaminobenzidine (DAB, Sigma, Deisenhofen, Germany) sichtbar gemacht und mit Hematoxylin-Eosin leicht gegen gefärbt.

2.8 Elektronenmikroskopie

▼ 26 

Die TUNEL-Methode alleine erlaubt keine definitive Aussage über die Art des Zelltodes, da auch im Rahmen von Nekrosen und Autolyse freie DNA-Enden vorkommen, die TUNEL-positiv reagieren [Charriaut_Marlangue undBen_Ari, 1995Grasl_Kraupp, et al., 1995]. Deshalb muss sie durch ultrastrukturelle Untersuchungen, in diesem Fall mit der Transmissionselektronenmikroskopie, ergänzt werden. Die Tierversuche wurden wie unter 2.1 durchgeführt. Perfundiert wie unter 2.2 beschrieben mit der Ausnahme, dass die Perfusionslösung aus 1,5%iger Glutaraldehydlösung in 0,1 M Pyrophosphatpuffer bestand. Die Gehirne wurden anschließend in 1 mm dünne Scheiben geschnitten, die Regionen in 1 x 3 mm große Rechtecke weiter eingegrenzt, in Osmium-Tetroxid fixiert und mit Alkohol dehydriert. Nach der Behandlung mit Toluen erfolgte die Einbettung in Epoxidharz. Am Ultramikrotom wurden 60-70 nm dünne Schnitte angefertigt. Die Ultradünnschnitte wurden mit Uranylacetat und Bleizitrat gefärbt und mittels Transmissionselektronenmikroskopie untersucht.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
XDiML DTD Version 4.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
17.08.2007