4. Diskussion

▼ 35 (fortgesetzt)

4.1  Allgemeine Betrachtung

Maligne Tumoren und hämatologische Systemerkrankungen im Kindesalter sprechen auf eine Behandlung mit Zytostatika in der Regel gut an. Solide Tumoren werden heute aufgrund ihrer frühen Metastasierung auch als systemische Erkrankungen aufgefasst. Aus diesem Grund steht die zytostatische Therapie im Mittelpunkt der Behandlungsstrategie.

Neue Therapieverfahren, wie etwa die Hochdosischemotherapie führten zu großen Fortschritten in der Behandlung dieser Tumoren [MacDonald, et al., 2003Rubnitz undPui, 2003]. Durch den Einsatz von Wachstumsfaktoren und der Entwicklung der Knochenmarkstransplantation wurde die Knochenmarkstoxizität als limitierender Faktor der Chemotherapie überwunden. Heute führen die neurotoxischen Wirkungen der Therapie häufig zu einer Dosisanpassung und Modifikation der Therapie. Neuropsychologische Defizite reduzieren die Lebensqualität der Patienten in erheblichem Maße. Aus diesem Grund stellt die Vermeidung therapieinduzierter unerwünschter neurotoxischer Wirkungen eine große Herausforderung dar.

4.2 Neurotoxizität von Cyclophosphamid und Thiotepa

▼ 36 

Die Ergebnisse dieser Untersuchung zeigen, dass die systemische Applikation von Cyclophosphamid und Thiotepa im infantilen Rattengehirn eine massive Neurotoxizität auslösen. Die histologischen Präparate zeigten in der Übersichtsfärbung nach De Olmos ausgeprägte Zelldegenerationen. Die Zelluntergänge konzentrierten sich auf den Hippocampus und die thalamischen Kerngebiete. Die immunhistochemischen und ultrastrukturellen Veränderungen ließen erkennen, dass sowohl ein exzitotoxischer als auch ein Caspase-vermittelter Zelltodmechanismus daran beteiligt ist.

4.2.1  Exzitotoxizität

Die positive TUNEL-Färbung deutet auf einen aktiven apoptotischen Pathomechanismus hin, erlaubt jedoch keine spezifische Differenzierung des Zelltodmechanismus. Aus diesem Grund wurde die elektronenmikroskopische Untersuchung angeschlossen. Ultrastrukturell ließen sich bereits zu einem frühen Zeitpunkt nach der Applikation der Zytostatika anschwellende Dendriten nachweisen. Die präsynaptischen Axonendigungen blieben erhalten. Diese ultrastrukturellen Veränderungen weisen auf einen exzitotoxischen Zelltodmechanismus hin, wie sie von Olney in Versuchen zum durch Glutamat getriggerten neuronalen Zelltod erstmals beschrieben wurden [Olney, et al., 1971]. Allerdings konnten in den durchgeführten Versuchen keine Neurone identifiziert werden, die ein geschwollenes Zytoplasma oder angeschwollene Mitochondrien zeigen, beides Phänomene, die im Rahmen von klassischen exzitotoxischen Läsionen im infantilen Rattengehirn beschrieben wurden. Solche Veränderungen wurden zu einem frühen Zeitpunkt, d.h. einige Stunden, nach der Gabe von exzitotoxischen Aminosäuren, einer hypoxischen Ischämie oder einem Trauma beobachtet [Ikonomidou, et al., 1989Ikonomidou, et al., 1989Ikonomidou, et al., 1996Olney, et al., 1971].

4.2.2 Caspase-vermittelter Zelltod (Apoptose)

In Übereinstimmung mit den Arbeiten von Ishimaru und Dikranian zeigte sich, dass nach längeren Überlebenszeiten der Tiere sich weitere ultrastrukturelle Veränderungen fanden, die auf einen apoptotischen Zelltodmechanismus hindeuten [Dikranian, et al., 2001Ishimaru, et al., 1999]. Hierzu zählt die Verdichtung des Nukleoplasmas als auch die Kondensation des Zytoplasmas bei noch intakten Zellorganellen. Im weiteren Verlauf kam es zu Rissen in der Kernmembran, einer Vermischung von Nukleoplasma und Zytoplasma sowie zur Bildung von so genannten apoptotischen Körperchen.

▼ 37 

Die durchgeführte immunhistochemische Untersuchung für aktivierte Caspase 3 zeigte eine deutlich positive Färbung. Dies deutet ebenfalls auf das Vorhandensein apoptotischer Zelltodvorgänge nach Applikation der Zytostatika hin.

Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Studie, dass der neuronale Zelltodprozess nach der systemischen Gabe der Zytostatika sowohl aus einer frühen exzitotoxischen als auch einer späten aktiven (apoptotischen) Komponente besteht.

In der Literatur liegen verschiedene Studien zur Neurotoxizität von Zytostatika vor. Die in vitro Untersuchungen haben sich insbesondere mit der Neurotoxizität des Cisplatins und der Vinca Alkaloide im sympathischen Nervensystem und in Motoneuronen beschäftigt, um die Frage der häufig beobachteten peripheren Neuropathien als Folge der zytostatischen Therapie zu untersuchen [Gozdz, et al., 2003Macdonald, 1991Park, et al., 1998Park, et al., 1998]. Zur Neurotoxizität im ZNS liegen Untersuchungen für Methotrexat vor. Diese Untersuchungen wurden an den Kleinhirnen von Meerschweinchen durchgeführt. Die Degeneration von Purkinjezellen, die durch den Schwund und die Verzerrung der Perikarien sichtbar wurden, sind beschrieben [el-Badawi, et al., 1990].

▼ 38 

Die Mechanismen der Zellschädigung, die für die Exzitotoxizität verantwortlich sein können, sind möglicherweise mit einer Störung im mitochondrialen Energiestoffwechsel verbunden. Diese Störungen führen zum oxidativen Stress und einer erhöhten Vulnerabilität der Neurone gegenüber physiologischen Glutamatkonzentrationen [Murphy, et al., 1999Souid, et al., 2003]. Es konnte gezeigt werden, dass DNA Schäden zu einer Mobilisation der poly (ADP-ribose) Polymerase (PARP) führt, welche die Ribosylierung von Zielproteinen für die aktive DNA Reparatur aktiviert [Ha undSnyder, 2000Zhou undElledge, 2000]. Das Substrat von PARP ist ein höchst energetisches Molekül (NAD+). Die Aktivierung von PARP vermindert möglicherweise die zellulären Energievorräte, was zu einer neuronalen Membrandepolarisation mit einer erweiterten Signalgebung durch den N-Methyl-D-Aspartat Rezeptor (NMDAR) und schließlich zum exzitotoxischen Zelltod führt [Ha undSnyder, 2000]. Zusätzlich führt die Unterbrechung des energieabhängigen Glutamat-Aufnahmesystems zu einer erhöhten extrazellulären Glutamatkonzentration und zum Anstoß einer langsamen exzitotoxischen Kaskade.

Andere Untersuchungen zeigen, dass die meisten Zytostatika durch die Aktivierung von Caspasen den Tumorzelltod induzieren [Kim, et al., 2002Solary, et al., 2000]. Untersuchungen der molekularen Mechanismen, die zur Apoptose in Tumorzellen führen, haben gezeigt, dass Zytostatika verschiedene Wege aktivieren, die den aktiven Zelltodprozess regulieren. Ein Hauptweg wird durch die Ausschüttung von Molekülen aus dem intermembranösen Spalt der Mitochondrien in das Zytosol getriggert. Dies geschieht unter der Kontrolle von Bcl-2 und Bcl-2-verwandter Proteine und wahrscheinlich unter der Kontrolle von Bax, welches die Formationsänderung von Poren in der äußeren Mitochondrienmembran zur Folge hat. Zu diesen Molekülen gehört auch das Cytochrom-c, welches durch den Eintritt in das Zytosol die Oligomerisation von APAF-1 (apoptotic protease aktivierender Faktor 1) durch ATP induziert [Hu, et al., 1999Li, et al., 1997]. Dies führt zur Aktivierung von Caspase 9 und den absteigenden Caspasen. Ein anderer gut beschriebener Weg, der in Tumorzellen zum aktiven Zelltod führt, ist Fas abhängig. Fas und der Fas- Rezeptor werden auf verschiedensten Geweben exprimiert. Über Fas/FasL kommt es zur Formierung des Death initiating signaling Komplexes (DISC), welcher FADD (fas associated death domain) und die Procaspase 8 einbezieht. Die Oligomerisation der Procaspase 8 in DISC führt zur Aktivierung proteolytischer Enzyme und Aktivierung der Caspasen-Kaskade. Es konnte gezeigt werden, dass Zytostatika eine Hochregulierung von FasL und dessen Interaktion mit Fas auf der Oberfläche von Tumorzellen induziert [Friesen, et al., 1996Fulda, et al., 2000Muller, et al., 1998].

4.3 Dosisabhängigkeit der neurotoxischen Wirkung der Zytostatika

Neurotoxische Nebenwirkungen im Rahmen einer zytostatischen Therapie führen häufig zu einer Dosisanpassung. Seit die Knochenmarksdepression, einer der limitierenden Faktoren in den meisten Chemotherapieprotokollen, durch die Gabe von Wachstumsfaktoren oder einer Stammzelltransplantation überwunden werden konnte, ist der Einsatz von Hochdosischemotherapien mit einem erhöhten Risiko der Neurotoxizität verbunden [Verstappen, et al., 2003]. Hier handelt es sich insbesondere um die Therapieschemata solider Tumoren, wie zum Beispiel Hirntumoren, Weichteilsarkome und Keimzelltumoren.

▼ 39 

In dieser Arbeit zeigt die histologische Untersuchung der Gehirne acht Tage alter Ratten, dass die Zytostatika Cyclophosphamid und Thiotepa eine ausgeprägte, dosisabhängige Neurodegeneration im infantilen Rattengehirn während der Phase des rapiden Hirnwachstums hervorrufen. Für Cyclophosphamid konnte ein signifikanter Anstieg der Zelldegeneration ab einer Dosis von 400 mg/kg KG beobachtet werden. Ab einer Dosierung von 600 mg/kg KG Cyclophosphamid zeigen sich maximale Schädigungen. Besonders betroffen waren die Regionen im Bereich des parietalen, cingulären und retrosplenialen Cortex und dem Gyrus dentatus. Weniger stark betroffen waren die Regionen des Nucleus caudatus und der thalamischen Kerngebiete (s. Abb. 2B, 3B, Tabelle 2).

Für eine signifikante neurotoxische Wirkung nach Applikation von Thiotepa im Gehirn acht Tage alter Ratten war eine einmalige Gabe von 15 mg/kg KG ausreichend, eine maximale Schädigung zeigte sich ab einer Dosierung von 45 mg/kg KG. Auch hier waren insbesondere die Regionen des Gyrus dentatus betroffen (s. Abb. 5B). Zusätzlich fanden sich ausgeprägte zytotoxische Effekt im Bereich des parietalen, cingulären und retrosplenialen Cortex, sowie der thalamischen Kerngebiete (s. Abb. 6B).

Ähnliche Ergebnisse konnten in in vitro Versuchen gezeigt werden. Eine signifikante Toxizität zeigte sich 24 h nach der Applikation von 50 µM Cyclophosphamid und Thiotepa [Rzeski, et al., 2004]. Zusammenfassend kann also gesagt werden, dass beide Substanzen zu einer dosisabhängigen neuronalen Schädigung führen.

4.4 Altersabhängigkeit der neurotoxischen Wirkung

▼ 40 

Während der Synaptogenese, auch bekannt als Phase des rapiden Hirnwachstums, sind Neurone sehr anfällig für Störungen in ihrer Umgebung. Während dieser Phase führen abnorme Stimulationen des NMDA-Glutamatrezeptors zum neuronalen exzitotoxischen Zelltod. Andererseits führt eine Blockade des NMDA Rezeptors oder eine Stimulation des GABAA Rezeptors zu einer apoptotischen Neurodegeneration [Ikonomidou, et al., 1999Ikonomidou, et al., 2000]. In dieser Entwicklungsphase reicht bereits eine vorübergehende Störung, die nur einige Stunden andauert aus, um entweder eine exzitotoxische oder apoptotische Neurodegeneration zu induzieren.

Neben der bereits beschriebenen Dosisabhängigkeit, zeigen klinische Studien eine altersabhängige Neurotoxizität im Rahmen einer zytostatischen Therapie im Kindesalter [Reddy undWitek, 2003]. Deshalb wurden für die Beurteilung der Vulnerabilität des infantilen Rattengehirns in dieser Studie verschiedene Altersgruppen untersucht. Es zeigte sich, dass die Schwere der neuronalen Schädigung bei den 7 Tage alten Ratten am höchsten war. Bei den untersuchten Ratten nach 14, 21 und 28 Tagen fiel die Schädigung deutlich geringer aus. Es zeigt sich also eine deutlich altersabhängige neuronale Schädigung. Dieser Verlauf korreliert mit der Hirnwachstumsgeschwindigkeit der Ratte wie sie in Abbildung 1 dargestellt ist.

Während bei den jüngeren Tieren viele Gehirnregionen betroffen waren, zeigte sich bei den 14-28 Tage alten Tieren lediglich eine Schädigung im Bereich des Cortex und des Gyrus dentatus. Bei den älteren Tieren ließen sich zusätzlich Mikrohämorrhagien im Bereich des Cortex beobachten.

4.5 Wirkungsverstärkung der Neurotoxizität

▼ 41 

In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Exzitotoxizität bei der Entstehung neurologischer Komplikationen einer zytostatischen Therapie eine wichtige Rolle spielen kann. Olney wies nach, dass die extrazelluläre Glutamatkonzentration ein wichtiger Triggerfaktor für die Exzitotoxizität darstellt [Olney, 1971]. Tierexperimentelle Untersuchungen von Ikonomidou et al. belegten, dass Zustände wie Sepsis, Trauma, Epilepsie, Hypoxie oder Ischämie exzitotoxische Zelluntergänge verursachen [Ikonomidou, et al., 1989Ikonomidou, et al., 1989Ikonomidou, et al., 1996]. Treten mehrere dieser Zustände gleichzeitig auf, summieren sie sich möglicherweise in ihrer neurotoxischen Wirkung. Für die sichere Durchführung einer zytostatischen Therapie erscheint es als sinnvoll, alle potentiell neurotoxischen Faktoren zu erfassen und nach Möglichkeit zu minimieren.

4.6 Klinische Aspekte

Klinische Studien zeigen, dass in Folge einer Bestrahlung oder zytostatischen Therapie häufig gravierende neuropsychologische Defizite auftreten [Kramer, et al., 1997]. Das Spektrum neurologischer Symptome umfasst Erkrankungen wie die Leukenzephalopathie, Epilepsien, Hirninfarkte, zentrale wie periphere Paresen, Neuropathien und die Ototoxizität [Reddy undWitek, 2003]. Die Vermeidung dieser, die Lebensqualität stark einschränkenden unerwünschten Wirkungen, stellt weiterhin eine große Herausforderung dar.

In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die neurotoxischen Effekte der Zytostatika eine deutliche Dosis- und Altersabhängigkeit aufweisen. Dies ist ein wichtiger Befund im Rahmen der Erforschung der Pathogenese neurologischer Komplikationen einer zytostatischen Therapie.

▼ 42 

Die Zellschäden konzentrieren sich in der vorliegenden Untersuchung auf den Hippocampus, den Thalamus und den parietalen Cortex. Die unerwünschten neurologischen Wirkungen der zytostatischen Therapie bei Kindern, lassen sich möglicherweise durch eine Schädigung dieser Gehirnareale erklären.

Prospektiv angelegte klinische Untersuchungen belegen eine deutliche Altersabhängigkeit neurokognitiver Defizite [Kramer, et al., 1997Robison undBhatia, 2003]. Bei Leukämiepatienten nach einer Knochenmarkstransplantation zeigte sich eine deutliche, altersabhängige Abnahme des Intelligenzquotienten [Kramer, et al., 1997Simms, et al., 2002]. Im Vergleich zu älteren Kindern, zeigten sich in der Untersuchung von Robinson und Bhatia, dass Kinder unter 6 Jahren, die eine Schädelbestrahlung und oder intrathekale zytostatische Therapie erhielten, signifikant häufiger besondere schulische Unterstützung benötigten [Robison undBhatia, 2003]. Auch Palmer konnte in einer klinischen Studie an Patienten zeigen, dass nach postoperativer Radiochemotherapie eines Medulloblastom es zu einer Abnahme des Intelligenzquotienten kam [Palmer, et al., 2001].

Auch in der vorliegenden Untersuchung hatte das Alter der Tiere einen starken Einfluss auf das Ausmaß der Zytotoxizität. Die größte Schädigung konnte bei den jüngsten untersuchten Tieren, sieben Tage nach Geburt, beobachtet werden. Mit zunehmendem Alter reduzierte sich die zytotoxische Wirkung. Diese Befunde unterstreichen die Bedeutung einer an das Alter und die Reife des Kindes adaptierten Therapie.

4.7 Fehlermöglichkeiten

▼ 43 

In den durchgeführten Experimenten ließ sich die Neurotoxizität von Cyclophosphamid und Thiotepa für infantile Ratten eindeutig belegen. Die Übertragung dieser Ergebnisse auf den klinischen Einsatz ist nur eingeschränkt möglich.

Die Zytostatikakonzentrationen in dieser Untersuchung lagen bewusst über den Dosierungen, die in der zytostatischen Therapie eingesetzt werden. Um deutliche neurotoxische Effekte zu erzielen, orientierte sich die Dosierung an der Maximaldosis, welche von den Tieren regelmäßig überlebt wurde. Dieses Setting führt möglicherweise zu einer Überbewertung neurotoxischer Effekte.

Andererseits konnte in dieser Untersuchung weder eine repetitive Gabe der Zytostatika noch eine Kombination verschiedener Zytostatika realisiert werden, wie es in den meisten aktuellen Chemotherapieprotokollen gehandhabt wird.

▼ 44 

Auch eine Störung in der Bluthirnschranke kann die Neurotoxizität der Zytostatika stark beeinflussen.

4.8 Ausblick

Die vorliegende Arbeit belegt, dass zwei unterschiedliche Pathomechanismen zur Neurotoxizität der Zytostatika beitragen. Möglicherweise lassen sich auf Grund dieser Erkenntnisse selektive Chemotherapeutika oder Neuroprotektiva entwickeln, um so neurologischen Komplikation der Chemotherapie vorzubeugen.

Interessant wäre auch die Identifikation von spezifischen Parametern, die einen Neuronenuntergang signalisieren und Anlass zu einer Modifikation der zytostatischen Therapie geben können.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
XDiML DTD Version 4.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
17.08.2007