Maligne Tumorerkrankungen stellen bei Kindern, nach Unfällen, die zweithäufigste Todesursache dar. Jährlich erkranken in Deutschland etwa 2000 Kinder an malignen Neoplasien [Creutzig, 2005Kaatsch P, 2002Tallen, 2003]. Der Erkrankungsgipfel liegt im Säuglingsalter. Jungen erkranken 1,2-fach häufiger als Mädchen.

Verschiedene Formen der Leukämie machen ein Drittel der Neuerkrankungen aus. Zu den weiteren häufigen Diagnosegruppen zählen die Hirntumoren (20%) und Lymphome (12,7%). Betrachtet man die Einzeldiagnosen so treten am häufigsten die akute lymphoblastische Leukämie (ALL, 27,9%), das Neuroblastom (8,6%), das Astrozytom (8,5%), das Nephroblastom (Wilms Tumor, 6,1%) und das Non-Hodgkin-Lymphom (6,5%) auf [Creutzig, 2005Gurney, et al., 1995Tallen, 2003].

In den ersten fünf Lebensjahren ist das Risiko, an Krebs zu erkranken etwa doppelt so groß wie im späteren Kindesalter. Dies weist darauf hin, dass ein großer Teil von Tumoren im Kindesalter pränatal gebahnt wird. Diese Tumoren bezeichnet man als embryonale Tumoren. Zu ihnen zählt das Neuroblastom, Nephroblastom, Medulloblastom, Retinoblastom, Rhabdomyosarkom, Keimzelltumoren und das Hepatoblastom. Bei Jugendlichen hingegen treten eher Knochentumoren und Hodgkin-Lymphome auf.

Erfreulicherweise haben sich die Behandlungsmöglichkeiten und Überlebensraten für Kinder mit malignen Tumorerkrankungen in den letzten Jahrzehnten erheblich verbessert [Creutzig, 2005]. Aufgrund ihres Wachstumsverhaltens sind die Tumoren des Kindesalters oft einer kurativen Therapie zugänglich. Operative Resektion, Radiotherapie und zytostatische Therapie sind mögliche Therapieoptionen.

Die Entwicklung spezifischer Therapieformen, wie z.B. der Einsatz von Hochdosischemotherapie mit einer anschließenden Knochenmarkstransplantation, haben die Überlebenschancen deutlich verbessert [Graham, et al., 1997]. Durch die Anwendung einer hochdosierten Zytostatikatherapie können heute z.B. bei Kindern mit prä-B/T ALL Heilungsraten bis zu 80% erzielt werden [Henze, 1997Henze, et al., 1981Ravindranath, 2003Rubnitz undPui, 2003].

Auch bei Hirntumoren, wie dem Medulloblastom, hat die zytostatische Therapie Eingang in Therapieprotokolle gefunden [MacDonald, et al., 2003Packer, 1995]. Besonders bei kleinen Kindern versucht man zunehmend, zur Vermeidung neuropsychologischer Spätfolgen, die Radiatio durch potente zytostatische Therapien verzichtbar zu machen. Im Hirntumorprotokoll HIT 2000 erhalten Kinder unter 4 Jahren mit Medulloblastom ohne Metastasen keine Bestrahlung [Rutkowski, 2003].

Die verbesserten Überlebensraten haben dazu geführt, dass ein zunehmendes Augenmerk auf die Spätfolgen der Therapien gelegt wurde. Dabei wurde auch festgestellt, dass Zytostatika zu einer signifikanten Neurotoxizität führen können [Hussain, et al., 1993Verstappen, et al., 2003]. Die am häufigsten vorkommenden neurologischen Komplikationen umfassen akute Bewusstseinseinschränkungen, zerebrale Krampfanfälle, zerebrale Infarkte, Paralysen, Neuropathien, Leukenzephalopathien und die Ototoxizität [Reddy undWitek, 2003].

Auf dem Gebiet der zytostatischen Therapie von Hirntumoren wird zusätzlich an der Entwicklung von Methoden gearbeitet, die eine bessere Penetration der Blut-Hirn-Schranke ermöglichen [Boaziz, et al., 1991Inamura, et al., 1994Jain, 1989MacDonald, et al., 2003Shapiro, et al., 1992]. Hohe Konzentrationen der Zytostatika im ZNS führen jedoch auch zu einer Zunahme neurologischer Nebenwirkungen [Garcia-Tena, et al., 1995Mizutani, 1995Steinberg, et al., 1998]. Bei der intrathekalen Gabe von Zytostatika, wie es im Fall der ALL in den heutigen Protokollen mit Methotrexat (MTX) gehandhabt wird, kommt es immer wieder zu neurologischen Komplikation. Hierbei reicht die Variation von Enzephalopathie mit oder ohne psychotischen Begleitsymptomen, Vigilanzstörungen, Krampfanfällen, Paresen, kortikaler Blindheit, Tremor, Ataxie, Neuropathien bis zu tödlich verlaufenden Leukenzephalopathien [Asato, et al., 1992Forman, 1990Highley, et al., 1992Hook, et al., 1992Kaplan undWiernik, 1982Yim, et al., 1991]. Bis heute existiert keine kausale Therapie, durch die der Untergang betroffener Nervenzellen verhindert werden kann.

Im Erhaltungschemotherapie-Arm der Hirntumorstudie HIT 91 trat in 30% der Fälle Neurotoxizität und in 35% Ototoxizität auf. In 61% der Fälle kam es aus unterschiedlichen Toxizitätsgründen zu Dosismodifikationen oder Auslassung der zytostatischen Therapie.

Langzeitstudien zeigen, dass eine zytostatische Therapie, die Entwicklung kognitiver Fähigkeiten negativ beeinflusst [Brown, et al., 1999Robison undBhatia, 2003]. Noch schlechtere Ergebnisse fanden sich bei der Kombination von zytostatischer Therapie und Bestrahlung oder im Rahmen einer Knochenmarkstransplantation [Simms, et al., 2002]. In prospektiven Studien konnte gezeigt werden, dass bei Kindern unter drei Jahren kognitive Fähigkeiten und das Sozialverhalten nach einer Knochenmarkstransplantation deutlich beeinträchtigt waren [Kramer, et al., 1997Palmer, et al., 2001Phipps, et al., 2000Simms, et al., 2002].

Im Folgenden werden die toxischen Wirkungen der Zytostatika auf das infantile Gehirn in Hinblick auf die klinischen Auswirkungen und die möglichen zugrunde liegenden Pathomechanismen näher betrachtet.

Bereits 1974 wurde von Dobbing beschrieben, dass das Säugergehirn in seiner Entwicklung eine Phase rapiden Wachstums durchläuft. Die Phase wurde von Dobbing „brain growth spurt period“ genannt. Die Lebensphase, die mit diesem rapiden Hirnwachstum korreliert, findet bei verschiedenen Spezies zu unterschiedlichen Zeiten statt. Beim Menschen beginnt sie bereits im sechsten Schwangerschaftsmonat und endet zu Beginn des dritten Lebensjahres. Die Hirnwachstumsgeschwindigkeit folgt einem sigmoidalen Kurvenverlauf und ist zum Zeitpunkt der Geburt am höchsten.

Wichtige Vorgänge, wie Migration und Differenzierung von Nervenzellen, Synaptogenese aber auch physiologischer Zelltod (Apoptose) spielen sich während der Phase des rapiden Hirnwachstums ab. Dementsprechend empfindlich ist das Gehirn gegenüber äußeren Einwirkungen [Dobbing, 1974].

Abbildung 1: Die Periode des rapiden Hirnwachstums „Brain growth spurt period“ beim Menschen, beim Affen, beim Schwein und bei der Ratte [Dobbing, 1974]

Um Vorgänge zu simulieren, die sich im menschlichen Gehirn während der Periode des rapiden Hirnwachstums abspielen, wird die Ratte während der vergleichbaren ontogenetischen Phase als Tiermodell benutzt. Bei der Ratte beginnt die Phase des rapiden Hirnwachstums postnatal und umfasst die drei ersten Lebenswochen. Die maximale Hirnwachstumsgeschwindigkeit bei der Ratte wird zwischen dem sechsten und zehnten Lebenstag beobachtet.

Die Pathogenese der neuro- und gliotoxischen Wirkung von Zytostatika wurde bisher nur in wenigen tierexperimentellen Studien untersucht. Bregman et al. haben an Mäusen gezeigt, dass Etoposid und BMY-40481 eine progrediente Ataxie und motorische Ausfälle durch eine Degeneration dorsaler Ganglienzellen induzieren können [Bregman, et al., 1994]. Wallace und Johnson zeigten an Ganglienzellen von Hühnerembryonen, dass Cytosin-Arabinosid auch auf postmitotische Zellen toxisch wirkt [Bregman, et al., 1994Wallace undJohnson, 1989]. Sie führten dies auf eine Hemmung des 2`-Deoxycytidin-abhängigen DNA- Reparaturmechanismus zurück. Die Dosisabhängigkeit der Neurotoxizität von Cyclophosphamid konnte tierexperimentell demonstriert werden [Fuchs, et al., 1990].

El Badawi et al. beschrieben die histopathologischen Veränderungen des Kleinhirns von Meerschweinchen nach niedrig dosierter Methotrexatgabe [el-Badawi, et al., 1990]. Es fanden sich bei allen Tieren, die Methotrexat erhalten hatten, degenerierende Purkinje Zellen sowie eine Proliferation der Astrozyten und ein perivaskuläres Ödem. Für die Methotrexat- Toxizität wurden als mögliche Mechanismen Folat-Reduktionen im ZNS- Gewebe, relative Cystein- Erhöhungen mit vermehrt anfallenden exzitatorischen Aminosäuren sowie Veränderungen des Biopterin- und Adenosin- Stoffwechsels erwogen [Whitehead, et al., 1992].

W. Rzeski et al. setzte Neuronen- und Glialezellkulturen Cisplatin, Cyclophosphamid, Methotrexat, Vinblastin und Thiotepa aus. Es konnte ein dosisabhängiger Zelluntergang, hauptsächlich in der Neuronenzellkultur, gezeigt werden. Die in vitro Neurotoxizität, nicht jedoch die Gliotoxizität, konnte signifikant durch Glutamat in einer nicht toxischen Konzentration potenziert werden. Der N-Methyl-D-Aspartat (NMDA) Antagonist MK 801, der α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsäure (AMPA) Antagonist GYKI 52466 und der Caspase-3 Inhibitor Ac-DEVD-CHO verminderten die Neurotoxizität von Cisplatin, Cyclophosphamid, Methotrexat, Vinblastin und Thiotepa [Rzeski, et al., 1998Rzeski, et al., 2004].

Die Erforschung der Pathophysiologie der neuro- und gliotoxischen Wirkung der Zytostatika stellt angesichts der neuen Entwicklungen auf dem Gebiet der Hochdosischemotherapie ein wichtiges Ziel dar. Sie kann potentiell zur Entwicklung gezielter neuro- und glioprotektiver Therapien führen, welche additiv eingesetzt werden können, um das Nervensystem zu schützen.

In vielen akuten und chronischen neurologischen Schädigungsmustern, wie z.B. Ischämie, Trauma, Status epilepticus und Neurodegeneration im Rahmen mitochondrialer Dysfunktionen führen toxische Stimuli über zwei bereits gut beschriebene Mechanismen zum neuronalen Zelltod [Bossy-Wetzel, et al., 2003Lipton undRosenberg, 1994Murphy, et al., 1999Olney, 2003].

Die Exzitotoxizität ist eine passive Form des neuronalen Zelltods. Unter pathologischen Bedingungen kann eine Übererregung von Rezeptoren exzitatorischer Aminosäuren (EAA) den neuronalen Zelltod verursachen [Lipton undRosenberg, 1994Murphy, et al., 1999]. Die drei Subtypen der EAA- Rezeptoren, N-Methyl-D-Aspartat (NMDA), α-Amino-3-hydroxy-5-methylisoxazol-4-propionsäure (AMPA) und Kainat Rezeptoren, sind an einen Ionenkanal gekoppelt und werden deshalb als ionotrope Rezeptoren bezeichnet. Es konnte nachgewiesen werden, das die Übererregung ionotroper Glutamatrezeptoren in vitro und in vivo zum exzitotoxischen neuronalen Zelltod führt [Lipton undRosenberg, 1994Olney, 2003Rothman undOlney, 1995].

Ishimaru und Mitarbeiter beschrieben die lichtmikroskopisch erkennbaren und die ultrastrukturellen Veränderungen im Gehirn von Nagetieren und Primaten nach der subkutanen Applikation von Natriumglutamat [Ishimaru, et al., 1999].

Makroskopisch nehmen die betroffenen Hirnareale ein spongiformes Aussehen an. Die Neurone schwellen an, das Chromatin verklumpt und der Kern schrumpft zusammen (Kernpyknose). Elektronenmikroskopisch werden die ersten Veränderungen an den Dendriten sichtbar, die in erheblichem Maße dilatieren, während die Axone unverändert bleiben. Die zytoplasmatischen Organellen verändern sich ebenfalls, das endoplasmatische Retikulum vakuolisiert und zerfällt. Die Mitochondrien schrumpfen zunächst, um dann ödematös anzuschwellen.

Die Kernbestandteile zeigen erst Veränderungen, wenn die übrigen Organellen bereits verändert sind. Das Chromatin verklumpt und wandert zur Kernmembran. Anschließend verschmilzt es zu einer einzigen elektronendichten Masse. Zum Schluss werden die Zellen von benachbarten Phagozyten aufgenommen und abgebaut.

Die Exzitotoxizität ist an zahlreichen akuten und chronischen neurologischen Krankheitsbildern beteiligt. Rothman und Mitarbeiter konnten als erste zeigen, dass anoxische Zellkulturen aus dem Hippocampus exzitatorische Neurotransmitter freisetzen [Rothman, 1984]. Direkt gemessen werden konnte der extrazelluläre Glutamatanstieg in in vivo Mikrodialyse- Experimenten. Dies war in Modellen der globalen Ischämie [Benveniste, et al., 1984Globus, et al., 1988], Modellen der fokalen Ischämie [Miyashita, et al., 1994Uchiyama-Tsuyuki, et al., 1994] und Modellen der perinatalen Asphyxie/Ischämie [Silverstein, et al., 1986] möglich.

An kortikalen Nervenzellkulturen konnten Tecoma und Mitarbeiter nachweisen, dass durch ein Trauma, über die Aktivierung von NMDA Rezeptoren eine Kaskade in Gang gesetzt wird, die weit über die Dauer des eigentlichen Ereignisses hinaus Neuronen schädigt [Tecoma, et al., 1989]. Mit Hilfe von Mikrodialyseuntersuchungen an Patienten mit schwerem Schädel-Hirn-Trauma konnte ein Anstieg der Konzentration exzitatorischer Aminosäuren im extrazellulären Raum nachgewiesen werden [Persson undHillered, 1992].

Das Phänomen der Apoptose ist seit mehr als hundert Jahren bekannt (Vogt 1842; [Lawen, 2003Vaux undKorsmeyer, 1999]. Der Begriff der Apoptose wurde 1972 von Kerr geprägt und als aktive Form des Zelltodes neben der Nekrose definiert [Kerr, et al., 1972]. Seit den 1970 er Jahren werden die Auslöser und die genetische Regulation der Apoptose systematisch untersucht [Hengartner, 2000Kerr, et al., 1972]. Als Modellorganismus diente der Nematode Caenorrhabditis elegans. Im Folgenden werden die für die vorliegende Arbeit relevanten Aspekte herausgegriffen.

Cyclophosphamid und Thiotepa sind Zytostatika aus der Gruppe der alkylierenden Verbindungen. Die alkylierenden Verbindungen waren die ersten nicht hormonellen Zytostatika, die erfolgreich in der Krebstherapie eingesetzt wurden [Colvin, 1999]. Die Substanzen sind in der Lage mit vielen Zellbestandteilen und in jedem Stadium des Zellzyklus chemisch zu reagieren. Die einzelnen Substanzen unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Aktivität im Tumorgewebe und ihrer Toxizität im gesunden Gewebe.

Im Rahmen dieser Arbeit wird untersucht ob die Zytostatika Cyclophosphamid und Thiotepa eine Neurodegeneration im infantilen Rattengehirn induzieren. Dabei soll die Rolle der Exzitotoxizität und der Apoptose ermittelt werden. Ziel soll das Verständnis über die Pathogenese der Neurotoxizität im juvenilen ZNS nach zytostatischer Therapie sein. Ferner soll die Arbeit Grundlagen für die Entwicklung neuroprotektiver Therapiekonzepte, bei Kindern die einer zytostatischen Therapie unterzogen werden, schaffen.

Die in der vorliegenden Arbeit aufgeworfenen Fragestellungen berühren den histologisch nachweisbaren Zelluntergang nach Zytostatika-Applikation im infantilen Rattengehirn. Hierzu werden histologische und morphometrische Untersuchungsmethoden verwendet. Dosis-Wirkungsbeziehungen werden beschrieben, so wie Zeitverlauf der Schädigung, die Altersabhängigkeit und die Verteilung auf 14 ausgewählte Hirnregionen.