2  Material und Methoden

In dieser Studie dienten weibliche Lewisratten (n=82) als Versuchstiere. Sie wurden von der Charles River Deutschland GmbH Sulzfeld bezogen. Bei Versuchsbeginn wogen die Ratten zwischen 180 und 210 g und wurden in einem 12-stündigen Hell-dunkel-Zyklus in Standardkäfigen des Typs III aus Makro­lon (Polycarbonat) zu maxi­mal 2 Tieren gehalten. Die Tiere erhielten Stan­dard­futter und Wasser ad libitum.

Alle Experimente richteten sich nach den gesetzlichen Bestim­mungen des deutschen Tierschutzes und der ARVO (Association for Research in Vision and Ophthalmology) für das Verwenden von Tieren in der augenheil­kundlichen Forschung und der For­schung auf dem Gebiet des visuellen Systems.

Melanin-assoziiertes Antigen wurde hergestellt wie erstmalig durch Broekhuyse et al. be­schrieben (Broekhuyse und Kuhlmann 1993). Für die Gewinnung des Melaninproteins wurden Rinderaugen aus einem Schlachthof verwendet. Den inner­halb von 5 Stunden gelie­ferten Rinder­augen wurde das vordere Segment entfernt, zusätzlich auch das Cor­pus vitreum und die Retina. Das hintere Segment wurde mit PBS (pH=7,4) gespült, um daraufhin die Choroidea mit anhängendem RPE vorsichtig mit Pinzetten zu entfernen. Die Cho­roidea wurde unter geringer Zugabe von destilliertem Wasser in einem Mörser zerrieben und die entstandene Suspension so oft durch Gaze filtriert, bis sich das choroidale Gewebe grau färbte. Bei 10.000 g und 4 °C wurde das Filtrat 10 Minuten zentrifugiert (Labofuge 400R, Heraeus Instruments GmbH, Hanau, Deutschland), das Sediment mit PBS gewaschen, in 2%ige SDS-Lösung (Sodeumdodecyl­sulfat) gegeben und für 10 Minu­ten im Wasserbad auf 75 °C erhitzt. Anschließend folgte ein weiterer Waschgang, um Reste des SDS zu entfernen. Das Pellet wurde getrocknet (Vaku­umzentrifuge Speed Vac^® Plus SC 110A, Savant; Kältefalle Refrigerated Vapor Trap RVT400, Savant; Vakuumpumpe BZ43+, Pfeiffer-Balzers, Asslar, Deutschland) und bei -80 °C für weitere Verwendung gelagert.

Um die zur Auslösung einer Uveitis nötige Menge an bovinem Melanin-assoziiertem Antigen (BMA) fest­zustellen, wurden 25 µg beziehungsweise 250 µg Melanin-asso­ziiertes Antigen in Emulsion jeweils 5 Tieren zweier Testgruppen intraperitoneal ver­abreicht. Die Emulsion mit einem Gesamt­volumen von 500 µl enthielt 250 µl komplettes Freund-Ad­juvans (CFA, Sigma, Deisenhofen, Deutschland) sowie zusätz­lich 1 µg Per­tussistoxin (PTX, Gibco Life Technologies™, U.S.A.). Unter­suchungen des Augenvorderab­schnittes wurden ab dem 7. Tag bis zum 21.Tag post immuni­sationem (p.i.) mittels Spaltlampe (Carl Zeiss, Jena, Deutschland) durchge­führt. An­schließend wurden die Tiere getötet.

Alle Injektionen wurden unter Etheranästhesie (Asid Bonz GmbH, Böblingen, Deutschland) durch­geführt.

Komplettes Freund-Adjuvans (CFA, bestehend aus Mineralöl und abgetöteten Tuberkulose-Myco­bakterien) und Pertussistoxin (PTX) werden bei Entzündungs­modellen als Immunadjuvantien ver­wendet. Sie enthalten Substanzen, die die Immunantwort qualitativ und quantitativ modulieren. Kostimulatorische Signale werden durch CFA verstärkt, während PTX unspezifisch Lymphozyten stimuliert (McAllister 1986, Munoz 1988).

Nach Bora ist die experimentelle Melanin-induzierte Uveitis auch ohne Ein­satz von kom­plettem Freund-Ad­juvans und Per­tussistoxin auslösbar. Variable systemische Effekte der Adjuvantien kön­nen dadurch aus­geschlossen werden (Bora 1997).

An einer Gruppe von 6 Ratten wurde versucht, eine Uveitis ohne den Einsatz von CFA und PTX zu indu­zieren. Dazu wurden 250 µg Melanin-assoziiertes Antigen in 500 µl 0,9%iger Kochsalzlösung intraperito­neal injiziert und ab dem 8. Tag bis zum 21.Tag p.i. täglich mittels Spaltlampenmikro­skopie auf Hinweise einer sich entwickelnden Uveitis unter­sucht. Die Tiere wurden anschließend getötet.

Protokoll I: Den Tieren (n=24) wurde jeweils eine intraperitoneale Injektion von 250 µg bovinem Melanin-assoziierten Antigen in 500 µl einer Emulsion verabreicht, die im Mischungs­verhältnis von 1:1 PBS und komplettes Freund-Adjuvans enthielt, sowie zusätzlich 1 µg Pertussistoxin in 10 µl [Seite 16↓]0,9%iger Kochsalz­lösung. Hierzu wurden vier Gruppen jeweils am 4., 6., 8. bzw. 10. Tag intravital­mikro­skopisch untersucht [Abb. 3].

Protokoll III : Zwei mit Melaninprotein immunisierte Tiergruppen (n=12) wurden mit liposomalem Clodronat (Clodronat-lip) be­handelt. Den Tieren der ersten Gruppe wurde an den Tagen -2; 1; 4; 6 je 2 ml Clodro­nat-lip intraperitoneal injiziert. Am 8. Tag folgte die intravitalmikroskopische Unter­suchung. Die Tiere der zweiten Gruppe wurden an den Tagen -2; 1; 4; 6; 8 mit je 2 ml Clodronat-lip behandelt. Am 10.Tag schloss sich die intravitalmikroskopische Unter­suchung an [Abb. 3].

Die Präparation multilamellarer Liposomen richtete sich nach der Beschreibung von van Rooijen et al. (van Rooijen und Sanders 1994).

In einem Rundkolben wurden 75 mg Phosphatidylcholin (Lipoid E PC, Lipoid KG, Ludwigshafen, Deutschland) und 11 mg Cholesterol (Carl Roth GmbH + Co., Karls­ruhe, Deutschland) in 10 ml Chloro­form (Carl Roth GmbH + Co., Karlsruhe, Deutschland) gelöst und mittels eines Vakuum­evaporations­systems (Pumpeinheit PC510, Vacubrand GmbH + Co., Wertheim, Deutschland; Wasserbad B480 und Rotationsevaporator R-124, Büchi Labor­techik AG, Flavil, Schweiz) bei 37 °C ge­trocknet. Durch Rotation des Rundkolbens während des Trocknungsvorgangs bildet sich an der Innenwand des Kolbens eine dünne Lipid­schicht. Nach der Zugabe von 2,5 g Cl₂MBP (Dichloro­methylendiphos­phonat, Clodronat, Boehringer, Mannheim, Deutschland) gelöst in 10 ml PBS wurde dieser Lipidfilm für 10 Minuten bei Raum­temperatur zu Liposomen dispergiert. Nach ein- bis zweistündiger Lagerung bei Raumtemperatur wurde die Dispersion in einem Soni­cator (Ultraschall-Desintegrator „Sonifier 250“, Branson Ultrasonics Corporation, U.S.A.) bei 50 Hz für 3 Minuten be­schallt und abermals für ein bis zwei Stunden ge­lagert. In der Suspension enthaltenes freies Clodronat wurde durch ein bis zwei Waschgänge entfernt. Die Sus­pension wurde dazu für 30 Minuten bei 100.000 g und +4 °C zentrifugiert (Sorvall^® Combi Plus, Beckman­rotor 45 TI), der Über­stand abpipet­tiert und der Vorgang unter Zugabe von 10 ml PBS erneut durchgeführt. Im Anschluss an den letzten Zentrifugationsschritt und die Entfernung des Überstandes wurden die Liposomen in 4 ml PBS resuspendiert. Die fertige Suspension enthielt circa 10 mg/ml CL₂MDP.

	Abbildung 2: Fluoreszierende Liposomen. Fluoreszenzfarbstoff: Rhodamin 6G.

Leerliposomen wurden nach gleicher Art und Weise ohne Clodronatzugabe und ohne anschlie­ßende Waschgänge hergestellt. Bis zur weiteren Verwendung der jeweiligen Suspension wurden die Liposomen für maximal 2 bis 3 Tage bei einer Tempe­ratur von +4 ^oC gelagert. Die Morphologie und Größe der Lipo­somen wurde stichprobenweise durch Elektronenmikroskopie oder Fluores­zenzmikroskopie nach Anfär­bung mit Rhodamin 6G kontrolliert [Abb. 2].

Fünf Tiergruppen dienten zur Kontrolle [Abb. 3], um mögliche Einflüsse der Adju­vantien Per­tussis­toxin, komplettes Freund-Ad­juvans oder der Liposomen­bestandteile auf die Entzündungs­reaktion auszuschließen:

Protokoll II: Zwei Gruppen erhielten je Tier (n=12) eine Menge von 500 µl Emulsion aus PBS und CFA im Mischungsverhältnis von 1:1 zusammen mit 1 µg PTX in 10 µl 0,9%iger Kochsalzlösung ohne Melanin-assoziiertem Antigen. Am 8. Tag nach der Immunisation wurden die Tiere der ersten Gruppe intra­vital­mikroskopisch untersucht. Die Augenvorderabschnitte der zweiten Gruppe wurden am 10. Tag mittels Spalt­lampe begutachtet und die Augen nach Tötung der Tiere enukleiert.

Protokoll IV: Weiteren zwei Gruppen wurden je Tier (n=12) 250 µg Melanin-assoziiertes Antigen in 500 µl einer Emulsion aus PBS und CFA (Mischungsverhältnis 1:1) sowie 1 µg PTX injiziert. An den Tagen -2, 1, 4, 6 wurden den Tieren der ersten Gruppe 2 ml Leer-Lipo­somen intraperitoneal appliziert. Am 8. Tag folgte bei dieser Kontrollgruppe die intravitalmikroskopische Untersuchung. Die Tiere der zweiten Gruppe wurden an den Tagen –2, 1, 4, 6, 8 mit je 2 ml Leer-Liposomen be­handelt. Die vitalmikroskopische Untersuchung schloß sich am 10. Tag an.

Für Basalwerte der Leukozyten-Endothel-Interaktion wurde eine weiter Tiergruppe (n=6) im naiven Zustand intravital­mikro­skopisch untersucht. Entsprechend wurden diese Tiere weder immunisiert noch behandelt.

	Abbildung 3: Schema für Immunisation und Behandlung der Tiere.
	Ag - Melanin-assoziiertes Antigen; Adj - Adjuvantien ohne Antigen; IVM – Intravitalfluoreszenzmikroskopie; Enu - Enukleation; Cl2MDP-lip - Dichlormethylendiphosphonat-Liposomen; Leer-lip - Leer-Liposomen

Die Intravitalmikroskopie wurde durchgeführt, wie von Baatz et al. (Baatz 1995) beschrieben.

Zuerst wurden die Tiere mit Nembutal (Pentobarbital 45 mg/kg Körpergewicht, Sanofi Ceva) anäs­thesiert und ein 0,28 x 0,61 mm Katheter (Portex™, Sims, Kent, U.K.) in die zuvor prä­parierte Schwanzarterie eingeführt, um eine kontinuierliche Blutdruckmessung sowie die Zuführung von Rhodamin 6G zu gewährleisten. Der gemessene Blutdruck wurde digital gespeichert (a/d i/o board AX 5411, Axiom Technology Co, Ltd, Taiwan) und anhand eines Computerprogramms für digitale Daten­analyse ausgewertet. Tiere mit einem arteriellen Mitteldruck über 120 mmHg beziehungs­weise unter 80 mmHg wurden nicht in die Studie eingeschlossen.

Das linke Auge der Tiere wurde mit einem Lokalanästhetikum (Novesine™, Dispersa, Gemering, [Seite 18↓]Deutschland) behandelt. Durch die Applikation eines klaren Gels (Vidisic Gel™; Dr. Mann Pharma, Berlin, Deutschland) konnte der Austrocknung der Horn­haut während der Intravitalmikroskopie vorgebeugt und gleichzeitig guter Kontakt zwi­schen Kornea und Objektiv hergestellt werden.

Die Tiere wurden zum Mikroskopieren der Irisgefäße mit dem linken Auge unter dem 20x-Objektiv (Achroplan™ 20 X 0,5w, Zeiss) eines Mikroskops (Axiotech™, Zeiss, Oberkochen, Deutschland) positio­niert.

	Abbildung 4: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus zur intravitalmikroskopischen Darstellung der Leukozyten-Endothelzell-Interaktion am Auge: Die nakotisierten Tiere erhalten intravasal geeignete Fluo­reszenzfarbstoffe (z.B. Rhodamin 6G) zur selektiven Darstellung der Leukozyten. Nachdem die Tiere unter dem Objektiv des Mikro­skops positioniert wurden, können durch eine zusätzlich installierte CCD-Kamera Bildsequen­zen auf einem SVHS-Videorekorder gespeichert werden. Die Auswertung erfolgt über ein System zur digitalen Bildanalyse. Weitere Einzelheiten siehe Text.

Für die Auflichtfluoreszenzmikroskopie wurde eine Quecksilberdampflampe (HBO 100/W2 AttoArc, Zeiss) und ein Zeiss-15-Filter­block (Anregung 534-558, Emission >590nm) ver­wendet. Mit einer am Mik­ro­skop installierten Videokamera (Pieper FK 6990 IQ, Pieper GmbH, Schwerte, Deutsch­land) wurden Einzelbilder aufgenommen und zur weiteren Bearbeitung mit Hilfe eines Videorekor­ders (Sony SVO 9500MDP S-VHS, Sony, Tokyo, Japan) auf Band ge­speichert. Ein Zeitgeber (VTG-33, For-A-Company, Tokyo, Japan) blendete während der Aufnahmen ein Zeitsignal auf dem Bildschirm (PVM-2053MD, Sony, To­kyo, Japan) ein. Mit dieser technischen Ausrüstung betrug die Vergrößerung auf dem Monitor x850 [Abb. 4].

Die Leukozyten der Versuchstiere wurden in vivo durch intraarterielle Bolusgabe von Rhodamin 6G (0,018%, 1ml/kg Körpergewicht, Sigma, Deisenhofen, Deutschland) gefärbt. Mindestens 3 Iris­venolen aus jeweils allen vier Quadranten des linken Auges eines jeden Tieres wurden untersucht. Die Gefäß­durchmesser lagen dabei zwischen 20 und 60 µm. Videobilder von allen 12 Venolen wurden für 30 Se­kunden aufge­nommen, um off-line eine quantitative Analyse der Leukozyten-Endothelzell-Inter­aktion durchführen zu können. Entsprechend der Gruppengröße von n=6 Versuchstiere­n wurden insgesamt 72 Irisgefäße je Gruppe ausgewertet.

Die auf Video gespeicherten Bildsequenzen wurden digitalisiert und unter Verwen­dung eines Computer­systems zur digitalen Bildanalyse (Pentium™ 90 MHz, frame grabber: ITEX IC-VL, Ima­ging Technology Inc., Bedford, MA, U.S.A) ausgewertet.

Der Leukozytenflux je Gefäß wurde durch Zählung aller Leukozyten, die eine durch das Gefäß gesetzte Linie innerhalb von 20 s passierten, bestimmt.

Leukozyten, die während des Zeitraumes von 20 s an der inneren Gefäßwand eines 200 µm mes­senden Gefäßabschnittes haf­teten und sich dabei nicht fortbewegten, wur­den als fest adhärente Zellen definiert und gezählt. Die Zahl der fest adhärenten Zellen wurde auf die jeweilige Endothel­fläche bezogen:

Rollende Leukozyten stellten diejenigen Zellen dar, welche sich im Randstrom wesentlich lang­samer als Leukozyten im Mittelstrom des festgelegten Gefäß­segments bewegten und dabei kurz­zeitig mit der Gefäßwand interagierten. Rollende Leukozyten wurden im Verlauf von 20 s an einer durch den betreffen­den Gefäß­ab­schnitt gesetzten Linie gezählt.

Nach Ablauf der Intravitalmikroskopie wurden mittels Herzpunktion jedem Versuchstier zwei Blut­proben entnommen. Eine der Proben wurde einer automatischen Zell­analyse (Technicon H*1-System) unter­zogen, die andere bei 3.000 g zur Plasma­gewinnung zentrifugiert (Labofuge 400R, Heraeus Instruments GmbH, Hanau, Deutschland). Das Plasma wurde zu Proben a 120 µl aliquo­tiert und bei -20 °C gelagert, um zu einem späteren Zeitpunkt die Mes­sung der Zytokine IFN-γ (Cytoscreen™ Immunoassay Kit, Rat IFN-γ, BioSource Inter­national, Camarillo, U.S.A.) und TNF-α (Rat TNF-α-ELISA-Kit, Diaclone, Besanςon, Frankreich) durchführen zu können.

Die anästhesierten Tiere wurden durch Ausbluten getötet und beide Augen enukleiert. An­schlie­ßend wurde die Kornea mit einer 30 g Nadel vorsichtig punktiert, um jegliche Verletzung der Iris beziehungs­weise der Linsenkapsel zu ver­meiden und ca. 12 µl Kammerwasser aspiriert. Von jedem Auge wurde zweimal 1 µl des entnommenen Kammerwassers mit einer Pipette auf einen mit Poly-L-Lysin beschich­teten Objektträger aufgebracht, luftge­trocknet und 15 Sekunden mit Wright-Färbung (Sigma, Deisen­hofen, Deutschland) behandelt. Vor einem weiteren Trocknungsvorgang wurden Reste der Färbelösung vorsichtig mit destilliertem Wasser von dem Objektträger gespült. Die Zellen wurden unter einem Mikro­skop (Carl Zeiss, Jena, Deutschland) gezählt und aus beiden Zählungen der Mittelwert gebildet.

Das restliche Material wurde bei -20 °C gelagert und zu einem späteren Zeitraum der Proteingehalt nach der Methode von Lowry (D_C Protein Assay, Bio-Rad Labo­ratories GmbH, München, Deutschland) photo­metrisch im ELISA-Reader bestimmt (Microplate Rea­der Model 550, Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Deutschland).

Zum Nachweis der Makrophagendepletion wurde die Milz nach Tötung der Tiere entnommen, in gepuf­fertem 4%igen Paraformaldehyd fixiert und bei +4 °C gelagert. Das Auswaschen von Para­formaldehyd, die Ent­wässerung in Alkoholreihen aufsteigender Konzentration und die Einbettung der Organe in Paraffin erfolgte automatisch (Leica TP1020, Leica Instruments GmbH, Nussloch, Deutschland). Am Mikrotom (Jung HN40, Leica Instruments GmbH, Nussloch, Deutschland) wur­den Paraffinschnitte von 4 µm Stärke angefertigt und auf Objektträger aufgezogen. Die Präparate wurden anschließend in Xylol- und Alkohol­bädern abstei­gender Konzentration entparaffiniert und danach für kurze Zeit in TBS gebadet. Die indi­rekte Peroxidase-Methode (Biotin-Avidin) wurde zur immunhistochemischen Färbung der Paraffinschnitte angewandt. Zuvor wurde die starke endo­gene Peroxidaseaktivität der Milz mit zwei Verfahren blockiert, um die sonst sehr ausgeprägte Hintergrundfärbung der Präpa­rate zu vermeiden: Die Objektträger wurden in einer Lösung aus 100 % Ethanol und konzentrierter Salzsäure (500:1) und nachfolgend in einer Lösung aus Metha­nol und 3 % H₂O₂ (4:1) für jeweils 20 Minuten gebadet und anschließend mit TBS gespült.

Für die eigentliche Immunhistochemie wurde der Dako Ark™-Peroxidase-Kit (DAKO Corp., Car­pinteria, CA, U.S.A.) genutzt, der zur Identifikation primärer Maus-Anti­körper auf Rattengewebe geeignet ist. Für die Detektion der Makrophagen wurde der monoklonale Maus-Antikörper ED1 (Chemicon, Temecula, CA, U.S.A.)verwendet. Dieser Anti­körper ist gegen ein 90-100 kD großes [Seite 20↓]Glycoprotein gerichtet, das intra­zellulär überwiegend von Histiozyten exprimiert wird und daher als pan­spezifischer Marker für Mono­zyten, Makrophagen und dendritische Zellen dient (Dijkstra 1985).

Zum Schluß wurden die Präparate mit Hematoxylin gegengefärbt und eingebettet.

Die während der Experimente digital gespeicherten Blutdruckwerte wurden mit dem Programm Turbolab™ (Bressner Technology, Gröbenzell, Deutschland) ausgewertet.

Die digitale Bildanalyse der Videos erfolgte unter Verwendung der Software Optimas™ (Version 5.2, Optimas Corporation, Bothell, WA, U.S.A.).

Die statistische Prüfung der gewonnen Daten ermöglichte das Computerprogramm SigmaStat™.

Zum Anfertigen dieses Dokuments wurde das Schreibprogramm Word™ genutzt, alle erhobene Daten in Excel™ (Microsoft Corporation,Redmond, WA, U.S.A.) verarbeitet und damit die hier ab­gebildeten Dia­gramme gestaltet.

Alle angegebenen Werte bestehen aus Mittelwert und mittlerem Standardfehler (MW±SF). Zum statisti­schen Vergleich der Gruppen wurde eine Rangsummen-Varianzanalyse nach Kruskal und Wallis (1952) durchgeführt, wobei Unterschiede zwischen einzel­nen Gruppen mit dem Test nach Dunn berechnet wurden. Ergebnisse bei p<0,05 wurden als signifikant angenommen.